Summary
我们克隆和分析生成圆形RNA的记者基因。这些报告基因大于构造，用于分析线性拼接并包含Alu元素。为了研究圆形RNA，构造被转染到细胞中，在去除线性RNA后使用RT-PCR分析产生的RNA。
Abstract
除了线性 mRNA 之外，许多真核基因产生圆形 RNA。大多数圆形RNA是通过将5'拼接位点与上游3'拼接位点在mRNA前结合而生成的，这个过程称为回拼接。这种循环可能得益于mRNA前的二级结构，这些结构使拼接点非常接近。在人类基因中，Alu元素被认为能促进这些二次RNA结构，因为Alu元素非常丰富，并且在mRNA前以相反方向存在时，表现出彼此的基础互补性。在这里，我们描述了大型Alu元素的生成和分析，该元素包含构成圆形RNA的记者基因。通过优化克隆协议，可以生成插入长度高达20kb的分子基因。他们在联合转染实验中的分析可以识别监管因素。因此，该方法可以识别与循环RNA形成有关的RNA序列和细胞成分。
Introduction
循环 RNA
圆形RNA（环RNA）是同价关闭的单滞留RNA，在大多数生物体中表达。它们通过将下游5'拼接站点连接到上游3'拼接站点生成，这个过程称为反拼接（图1A）1。在mRNA前序列，显示基础互补短为30-40nt，使回拼接位点在适当的对齐循环RNA形成2。在人类中，Alu元素1，约占基因组3的11%，由于自身互补4、5，在mRNA前形成广泛的双链RNA结构，从而促进环RNA1的形成。
目前，已经描述了环环境的三大功能。一些环RNA结合微RNA（miRNA），并通过封存行为像miRNA海绵6。循环RNA已涉及转录和后转录调节，通过竞争与线性拼接7或修改转录因子活动8。最后，循环RNA包含短的开放阅读框架和原理证明研究表明，他们可以翻译9，10。然而，大多数环苯A的功能仍然是神秘的。大多数循环RNA已经使用下一代测序方法11检测到。使用有针对性的RT-PCR方法对单个基因进行详细分析后发现，仍有大量圆形RNA有待发现。
使用记者基因分析mRNA前处理
从DNA报告器中提取的mRNA分析构造转染成细胞是研究替代预mRNA拼接的成熟方法，可应用于圆形RNA。一般来说，替代外子、其周围突长和构成外子被放大并克隆成真核表达向量。通常，缩内缩器会缩短。这些结构被转染成真核细胞，通常由RT-PCR13，14进行分析。该方法已被广泛用于绘制监管拼接站点和转效因子在联合转染实验13，15，16，17，18。此外，蛋白质表达微型基因的产生允许筛选改变替代拼接19，20的物质。
该方法已应用于圆形RNA。目前，至少有12个微型基因骨干在文献中进行了描述，并被汇总在表1中。除了基于tRNA的表达系统21，22，他们都依赖于聚合酶II启动子。在这里，我们描述了一种生成人类报告器微基因的方法，以确定循环RNA生成所涉及的cis和跨作用因子。图1显示了使用已发布报告基因23序列的方法的概述。
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Protocol
1. 结构设计
- 使用UCSC基因组浏览器24来识别循环RNA形成所需的重复元素，并将其纳入结构。重要的是，扩增的引素需要超出重复元素。
- 将圆形RNA序列（补充图1是测试序列）粘贴到https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start并选择正确的有机体。提交序列并转到浏览器视图，缩小 1.5 倍或根据需要（图2A）。
注： 搜索序列显示在上一行（图 2A，1）。根据圆形RNA中外子的顺序，BLAT 不会连接所有外子。在此示例中，exon 12（图2A，4）未连接到 11（图 2A，2，3），因为 exon 12 是圆 RNA 序列中 exon 11 的上游（补充图 1）。重复元素位于"重复遮罩"轨道中，由框表示，其中黑色到灰色表示进化保护（图 2A，5）。 - 鼠标悬停重复元素，以在浮动窗口中标识其子类型。Alu元件位于 SINE（短穿插核元件）线中。如果获取了与图 2不同的图片，请使用窗口下方的"默认轨道"按钮重置浏览器。
注：在基因显示中对外子进行修剪会生成一个窗口，其中有计算机生成的外显数字。这些数字与文献中确立的外音编号不对应，并且也在等同之间变化。
2. 选择要在表达式矢量中克隆的序列
- 下载窗口中显示的DNA序列，前往UCSC基因组浏览器顶端的"查看 + DNA"。在"排序格式"选项中，选择"扩展案例/颜色选项"。
- 选择默认大小写为"下部"，然后选择NCBI refseq的切换大小写。为"重复遮罩"选择下划线和粗体和斜体。单击"提交"。将外名作为大写字母，顶号作为小写字母。检查 exon/intron 边框。
- 在此示例中，有一个"ccctttacCTTT"序列，指示浏览器显示反向补数。如果是这种情况，请返回并选择反向补补框，直到看到正确的前子 intron 边框 （agEXONgt），在此示例中为 AAAAAAgaagg。
- 以正确的方向复制文件（内部外显子被 intronic ag...gt） 到文字处理文档中，并突出显示外显子（补充图 2）。
注：在此示例中，包含外子 9-12 的基因组片段约为 24 kb，因此太大，无法从基因组 DNA 中放大。因此，每个被大约 1 kb 的内电子区域包围的外子被单独放大，这四个片段被组装在克隆载体中。 - 选择要放大的片段（exon = 500 nt intron）。确保 intron 不会在重复区域中开始或结束，因为这些区域的引素不会放大特定序列。所选区域如图 2 B所示，其序列显示在补充图 3中。
注： 通常，构造越大，克隆的难度就越大。片段可以进行分步组装（即，exon 9 与矢量结合，在下一步中，exon 10 通过克隆引入此构造，直到所有外子都到位），或者，所有片段同时组装。循序渐进的方法始终有效，但需要更多时间。同时组装并不总是工作，取决于从基因组DNA放大单个片段的多少以及结构的总体大小。因此，我们通常同时从这两种方法开始。
3. 设计克隆入门
- 使用 Web 工具（https://nebuilder.neb.com/#!/） 设计用于克隆的引素。例如，将片段 9、10、11 和 12 以及矢量序列（补充图 3）输入到此工具。
- 对于矢量序列，将插入位点添加为最后一个核苷酸，然后添加片段。由于矢量编号不以给定的插入站点开头，因此位于矢量中的插入位点，并将下游部分置于上游序列的前面。在此示例中，插入直接在 HindIII [AAGCTT] 站点之后开始，并在 pcDNA3.1 的 PmeI [GTTTAAAC] 站点之后直接结束。从cccgctgatcag的顺序...ccgtaaaaaggccgc 粘贴在 pcDNA3.1 序列（gttgctggggttttcc ）的位置 1 前面。
- 如果熔点相距超过 4°C，则调整底漆，因为它们在放大时不起作用。设计的碎片和引漆序列的组装显示在补充图 4中。克隆的引素也可以手动设计25。
4. PCR 和放大酚检测
- 标准 PCR 反应：使反应组合，每次反应的总体积为 50 μL。以下是使用聚合酶 1 进行一次反应的配方：
10 μL 5x 反应缓冲器
1 μL 10 mM dNTP
2.5 μL 10 μM 正向引漆
2.5 μL 10 μM 反向引底剂
0.5 μL 聚合酶 1
32.5 μL 无核酸核酸 H2O- 如果产品 GC 含量高，则选择添加 10 μL 的 5x GC 增强剂;制作一个包含GC增强剂的单独组合，以测试PCR反应。
- 每个反应样品的混合物的阿利quot 49 μL到PCR管中。
- 将1 μL的DNA添加到PCR中，其量范围从10皮克到1纳克。
- 向下旋转样品以去除侧面的残留物，并将其放入 PCR 机器中。优化 PCR 条件时，请使用与机器中的相同点相同的机器。
5. 优化用于不同聚合器的较长DNA片段
- 温度
- 优化远程聚合酶 2。
- 使用较低的变性温度（聚合物酶 1：98 °C，聚合酶 2：94 °C）。
- 使用较长的变性时间（聚合物酶 1：10 s，聚合酶 2：30 s）。
- 使用较长的退火时间（聚合物酶 1：30 s，聚合酶 2：60 s）。
- 使用更长的延长时间（聚合物酶 1：30 s/kb，聚合酶 2：50 s/kb）。
- 使用较低的延长温度（聚合物酶 1：72 °C，聚合酶 2：65 °C）。
- 使用低于底漆 Tm 的 5 °C 的退火温度。
- 优化引底器浓度（比原始底漆浓度低 5 倍到 5 倍）。优化DNA浓度从10 pg到50pg，100 pg，1ng，5 ng，10 ng。
- 作为PCR程序的例子，使用聚合酶2放大15 kb的产品尺寸，在94°C下进行30秒的初始变性，在94°C下进行DNA变性，30秒，随后在58°C下退火30秒，DNA在65°C下延长12分钟30秒。在 65 °C 下执行最终延长 10 分钟，最后保持 4 °C。
注：根据基于网络的温度计算确定的引物的退火温度 （Ta）， 这些温度是每个聚合酶所特有的。如果片段大于 10 kb，扩展时间可能会有所不同，需要优化。
- 优化远程聚合酶 2。
- 延长时间和DNA浓度
- 对于超过 6 kb 的 DNA 片段，使用更长的扩展时间：每 1 kb 1 分钟。较长的片段应该使用更少的DNA。
- 执行DNA稀释，以找到扩增的最佳DNA浓度，通常1 pg至1 ng的质粒或1ng至1μg的基因组DNA。
注：对于大多数克隆使用聚合酶1，通过将Sso7dDNA结合域与专有的热稳定DNA聚合酶26熔化。聚合酶具有低误差率，由于Sso7d域具有高处理性，需要放大大型（10-15 kb）基因组片段。由于这个较大的片段大小，DNA分子27的酶组装用于插入载体，因为这种方法不需要限制性酶。聚合酶1使超过15kb的片段的扩增变得越来越困难。对于大型片段扩增，使用聚合酶2由锥虫球菌制成的，类似隔板的校对聚合酶融合到Sso7d或长距离PCR套件，然而，提供更高的错误率。
6. 用于克隆的PCR产品净化
- 在含有交位核酸染色的1%琼脂糖凝胶上运行一半的PCR产品（例如，1x GelGreen）。在深色读取器转照器上可视化染色凝胶。这种染色的DNA不能照大小运行。
注：GelGreen异化成DNA，类似于溴化铀，但它被大约500nm（青色）的光所激发，这种波长不会损害DNA，这极大地改善了克隆。 - 同时，在1%的凝胶上运行一半的PCR产品，这种凝胶在运行后沾染了溴化乙酸乙酰胺（图3A，B）。
- 从染色凝胶（步骤 6.1）中去除适当尺寸的带，并使用凝胶和 PCR 清理套件分离 DNA。与标准协议不同，在双蒸馏水中仅20μL的DNA，通常DNA浓度较低。
- 在克隆之前，检查琼脂糖凝胶上的分离DNA的浓度和完整性（图3B）。瞄准 2：1 摩尔插入到矢量比。使用多个插入时，比率为 2：2：2：1。
7. DNA组装和克隆检测
注：克隆使用酶DNA组装试剂盒完成，稍作修改。组装在50°C下执行60分钟，通常较低的DNA范围用于组装（20-100 fmol/20 μL反应）。整个反应混合物被添加到化学能力细胞中，整个细胞在6厘米的加盘上镀出。
- 将矢量结合，在 10 μL 的水中插入 1：2 摩尔比（每个 20-500 fmol）。
- 加入10μL的DNA组装主混合。
- 在50°C下孵育样品60分钟。
- 接下来，使用总装配反应转换主管细胞。在这里，使用大肠杆菌菌株1细胞进行较短的构造，或将大肠杆菌菌株2细胞用于更长或不稳定的构造。细胞应为 50 μL 体积。
- 在冰上解冻细胞，将2μL的冷冻组装产品添加到合格细胞中。轻轻轻拂管 4-5 次混合。不要涡流。
- 让混合物在冰上坐30分钟。
- 在 42 °C 下加热冲击 30 s。不要混合。
- 将管子移回冰中 2 分钟。
- 将 950 μL 的室温 SOC 介质添加到管中。
- 在37°C下孵育反应管60分钟。大力摇动（300 rpm）。
- 在37°C孵育期间，使用适当的抗生素加热选择板。
- 通过离心（10，000 x g，30s）将细胞进行颗粒，并在两个选择板上将 1/4 和 3/4 的细胞板挖出，并在 37°C 下孵育过夜。
8. 克隆的验证
- 使用聚落 PCR，使用跨越装配场的 PCR 引漆 （图 1C） 进行检测。
- 取无菌牙签，触摸单个细菌菌群。
- 用有菌落的牙签触摸 PCR 管的底部，然后将牙签条纹在抗生素加盘上，在 37°C 或室温下孵育条纹板，以便一夜之间进行敏感构造。
- 用含有检测底漆的PCR混合物覆盖PCR管与菌群接触。这些是使用引底器3（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）设计的。该程序可以选择使用"[ccc]"符号强制跨定义序列进行引漆设计，以在整个装配结中选择引漆。正菌株的DNA通过测序进行分离和验证。
9. 循环RNA表达报告基因分析
- 为了进行分析，将分源基因转体到真核细胞中。在这里，使用HEK293细胞（ATTC#CRL-1573），因为它们具有高转染效率。为了节省成本，请使用爱德华王子岛（聚乙烯胺）解决方案。
- 对于爱德华王子岛溶液，在低pH2的水中溶解1毫克/m升的线性聚氯二甲胺盐酸（PEI）。将 pH1 与 NaOH 一起提起到 7。带 0.22 μm 过滤器的无菌过滤器，储存在 4 °C。
- 将细胞分成六口（每口约15万个细胞），让细胞在DMEM介质中10%的FBS中过夜生长。
- 在无菌管中对记者基因的1 μg添加200μL的无菌过滤150 mM NaCl。通过涡旋与DNA混合。
- 将 PEI 溶液添加到此混合和涡流中，短暂离心以收集管底的样品。每3μL的爱德华王子岛使用1μg的DNA比。
- 在室温下孵育10分钟，然后直接添加到HEK 293细胞中。
- 在37°C，5%CO2下孵育HEK293细胞，过夜。
- 通过RNA分离试剂盒分离RT-PCR的RNA。
10. RNase R 处理，去除线性 RNA
- 在无Nase管中使用10μg的总RNA。
- 将10 μL的10xRNase R缓冲液（0.2 M三聚三酯-HCl（pH 8.0）、1 M KCl、1 mM MgCl2）添加到RNA中。
- 将RNase R添加到RNA（1μl = 20U）。
- 在RNA中加入1μL乙二醇蓝色，用无菌水使体积高达100μL。
- 在37°C孵育样品30分钟。
- 加入100μL的酚/氯仿和涡旋1分钟。
- 在 21，000 x g下离心 1 分钟，以分离相位。
- 取上清液（水相），加入1体积（约80μL的氯仿）。
- 涡旋1分钟，然后离心1分钟，以分离相。
- 以超清剂为例，加入1：10伏KAc和2.5伏乙醇，并在-20°C沉淀1-4小时。在4°C下全速离心机30分钟（21，000 x g）。底部会有一个小的蓝色颗粒。
- 取出上清液，用80%乙醇清洗。让空气在室温下干燥5分钟，溶解在10μL水中。
11. RT-PCR分析
- 每次RT反应使用1 μg的RNA。
- 使反应混合，每次反应的最终总体积为20μL。对于一次反应，使用 1 μL 的 10 mM dNTP、1 μL 0.1 M 二硫硫醇 （DTT）、4 μL 的 5 x 第一链缓冲液和 0.5 μL 的反向转录酶。
- 将反应混合物的 6.5 μL 注入新的 PCR 管。
- 混合多达 5 个底漆。但是，某些引素可能与 PCR 中的其他引素不匹配（图5）。引漆序列在表2中。我们经常使用基因特异性外子结引质，但使用随机hexamers也是可能的。
- 将 1 μL 的 10 μM 反向引底剂添加到所需的 RT 反应管中。
- 在PCR反应管中加入1μg的RNA。
- 加入无R纳塞H2O，总体积为20μL。
- 向下旋转管，以去除管侧的残留物，并放置在热循环器中。
- 在50°C下在热循环器中运行RT反应50分钟。
- 将 RT cDNA 储存在 -20°C 或继续 PCR 反应。
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Representative Results
报告基因允许确定影响循环RNA形成的调节因子。然而，这些报告基因很大，并且含有经常使DNA构造不稳定等重复性元素。由于其大尺寸，通常需要删除部分的内科，这是通过放大基因组片包含外子和较小的侧翼在电子部分。这些DNA片段是酶组装的，允许结构不受限制的酶。
从微管相关蛋白tau （MAPT） 生成的圆形RNA示例显示了微基因方法分析圆形RNA的应用。本例中使用的tau 9_12微型基因与不同的拼接因子共同转染，RT-PCR检测出这些拼接因子的影响（图6）。不同的转效因子影响循环RNA和线性预mRNA的形成。实验还表明，循环RNA形成所需的所有序列元素在克隆片段中是局部的。
图 1：技术概述。（A） 显示一个假设基因。英特龙是线条，外子是盒子，Alu元素是较小的条纹框。从外子 C 到 A 的背裂会产生一个圆形 RNA。这种圆形RNA的结构显示在面板（E） 中。（B） 为了创建一个报告基因，外子和周围的内特罗（每侧至少 500 nt）被放大。构造应包含重复元素，这些元素通常是人类中的Alu元素。包括exon A的外子，以提供额外的Alu元素。基因组碎片将与其侧翼25个t.重叠。（C） 片段被克隆成表达式向量，由 CMV 分子驱动。成功的重组通过检测引物检测，并通过测序进行验证。（D） 单元格通过此构造进行转染。（E） 圆形RNA是分离的，并且 （F） 使用循环RNA特异性引素，更可取的外子结底漆进行扩增.在PCR扩增期间，线性RNA也可以被放大（G）。（G） 用于检测圆形 RNA 的引素方向。正向引底器处于感觉方向（即，与RNA具有相同的序列），反向引底器处于反感觉方向（即RNA的反向补品）。请注意，与线性 mRNA 的 RT-PCR 不同，反向引底器是正向引底器的上游。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2：选择微基因构造序列。（A）补充图 1中显示的序列使用 BLAT 对人类基因组数据库运行后，浏览器显示。文献外文数字36在基因显示中显示，它们与浏览器给出的数字不同。
1. 对齐的序列显示在"YourSeq"下
2-4. 请注意，由于RNA的圆度，BLAT 不会像线性 RNA 那样将所有外子与线连接。Exons 10 和 11（对应于 2 和 3）已连接，但 exon 12（对应于 4）未连接到 exon 11。
5. Alu元素显示在重复元素轨道中。
（B） 计划构造与基因组DNA之间的序列对齐。
6. 计划构造使用 BLAT 针对数据库运行。
7. 请注意，在构造中包含了几个Alu元素。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：克隆前安培的实例。（A） 优化的 PCR 产品分离在含有 1x 凝胶绿的 1% 琼脂糖凝胶上。各个波段表示将用于酶DNA组装的 PCR 产品。（B） 从 （A） 的带子从凝胶中切出并纯化。纯化PCR产品在1%的琼脂胶上分离，随后沾上了溴化二苯。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：对报告人基因的限制分析。tau 9-12 微型基因用作示例，用指示排除主要重组的限制性酶进行切割。车道 1： 切割与 NcoI 预期尺寸 735 bp， 3345 bp， 6266 bp， 车道 2 切割与 XbaI 预期大小 10346 bp， 车道 3 切割与 HindIII 预期尺寸 3951 bp， 6395 bp， 车道 4 切割与 SmaI 预期尺寸 1168 bp， 1688 bp， 2708 bp， 4782 bp.
图5：引素多路复用和R酶R处理对循环RNA检测的影响。（A） 从人类脑组织中提取的样本A和B的cDNA被放大与圆形RNA底漆环Tauexon12_10反向和环陶exon10_11前进。cDNA 的反向转录是使用线性和圆形 tau RNA 的底漆进行的。与 tau 圆形 RNA 对应的预期带由三角形显示。其他强带是与人类基因组不匹配的工件。（B） 实验在相同的PCR条件下重复进行，但反向转录只使用环Tauexon12_10反向引漆进行。只有预期波段被放大和验证通过测序。（C） RNA 与去除线性RNA的 RNase R 进行处理。循环RNA在治疗后可检测到（左图），而线性RNA不再发出可检测信号（右），请点击此处查看此图形的较大版本。
图6：循环RNA报告基因分析实例。1 μg的tau 9_1237报告基因被转染1μg的拼接因子指示。RNA在转染后分离24小时，并通过RT-PCR进行分析。（A） 线性 tau mRNA 的放大。由于外子的另类拼接 10 两个波段被观察到。由于拼接因子的表达过度，它们的比例发生了变化38，39。（B） 扩增圆 12~10 tau RNA23。注意tau环RNA表达对一些拼接因子的表达的依赖性，尤其是激酶clk2和SR蛋白9G8等cdc2。（C） HIPK3 的圆形RNA用作指示载荷相等的正控制。请点击此处查看此图形的较大版本。
表1：表示循环RNA的当前微型基因列表。请点击此处下载此文件。
| 圆形 HIPK3 控制引漆 | |
| HIPK3 反向 HIPK3 前进 |
TGCTTGTACTTTTTTC TCGGCCAGTATATAAA |
| 线性引素 | |
| 陶埃森 12 反向 陶埃森 9 前锋 |
CCCATCTTACTGACTC TGTCAAGTCCAAGCGGCT |
| 圆形引素 | |
| 环exon12_10反向 circTau exon10_11 前进 |
卡奇塔塔塔塔茨特茨 加格格格格加格特格茨加阿 |
表2：引素列表。
补充图1：Tau圆形RNA测试序列。与MAPT位点的圆形RNA对应的测试序列。不同的外线用下划线、小帽和大写字母表示。请点击此处查看此图形的较大版本。
补充图2：包含计划微基因的基因组序列。Exon 以颜色突出显示，重复元素以下划线、斜体和粗体显示。灰色底化表示可用于生成引物的低复杂性的侧翼区域。请点击此处下载此文件。
补充图3：计划报告人基因的序列。显示了载体序列和计划基因组片段。请点击此处下载此文件。
补充图 4：装配的引版设计。补充图 3 中的序列已输入生成器工具。请点击此处查看此图形的较大版本。
补充图 5：tau 9->12 报告器基因的序列作为示例。请点击此处下载此文件。
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Discussion
一般来说，圆形RNA是低丰1，这使得研究其功能和形成复杂化。与线性RNA13类似，使用报告器微基因可以识别调节圆形RNA形成的cis和跨作用因子。因此，这种方法产生假设，可以使用内源基因进一步测试。
最关键的步骤是记者基因的设计。DNA片段的酶组装（"吉布森克隆"27）有助于这种设计，因为它允许构建独立于限制位点的大型报告基因。
后拼接位点通过侧翼反转重复结合在一起，在记者基因构造时应考虑这一点。重复在基因组浏览器"重复轨道"中进行了说明，选择它们显示它们的方向。请记住，蛋白质还可以强制背拼接位点进入圆形RNA表达28所需的二次结构，并应研究无偏不倚分析1-2 kb的侧翼在电子区域。
为了确保结构的稳定性，一个重要的考虑因素是细菌菌株的类型及其生长条件。对于较短、简单的构造，使用标准克隆细菌，它几乎与 DH5-α （huA2 +（argF-lacZ）U169 phoA glnV44 _80 μ（lacZ）M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 相同。对于包含 6 个以上Alu元素的较长片段， 使用"稳定"能力细胞，缺乏重组酶 （recA） 和内核酶 （endA1） （F' proA_B+ lacIq _（lacZ）M15 zzf：Tn10 （TetR）[（ara-leu） 7697 araD 139 fhuA _lacX74 galK16 galE15 e14- #80dlacZ _M15 recA1 relA1 nupG rpsL （StrR）rph spoT1 （mrr-hsdRMS-mcrBC）。如果重组出现问题（由低转化计数指示），将转化的细菌盘在两个板上，并分别使其生长在30 oC和37 oC。由于微型基因中存在许多重复元素，因此需要使用下一代测序进行完全测序，按 2019 年速率，每粒质大约 150 美元。示例的顺序显示在补充图 5中。此外，常规执行限制片段长度多态性分析，以进行新的较大构造准备。例如，使用切割 1-4 次的站点会产生一个排除重新组合的特征带模式（图 4）。应选择酶，提供可在琼脂胶凝胶上分离的片段的特征带模式。
使用与背注事件重叠的外子结引底器使用 RT-PCR 分析圆形 RNA（图 1F）。由于RNA的循环性质，反向（即反义）底漆是正向（即感觉）引素的上游（图1G）。检测大量表达的正域相互作用蛋白激酶3（HIPK3）循环RNA1的引底剂被用作正控制。HIPK3和微型基因特异性反向引底器反向转录在同一管中，从而允许它们进行比较。PCR 反应使用底漆进行，放大线性 mRNA，以比较圆形和线性前 mRNA 的处理模式。当线性和圆形RNA的引素混合时，我们经常观察到异常带（图5），从而将这些样本的反向转录分开。
圆形RNA的RT-PCR分析具有挑战性，需要仔细控制。虽然敏感和方便，它可以产生独特的圆形RNA29的工件。反向转录酶可以在RNA圆周围移动几次，从而产生串联。大多数循环RNA报告基因产生圆形和线性RNA，可以交叉杂交，导致更多的PCR工体21，30，31。因此，有必要对PCR产品进行测序，并使用使用北印布32或RNase保护23使用不同的技术验证发现。
不明原因的带也可以源于线性RNA的异常扩增。线性RNA可以使用外泌酶RNase R去除，它丰富了圆形RNAAs33（图5C）。RNase R 处理有助于检测引素的初始优化，通常在优化引素后通常可以省略。
替代的背拼接也有助于不明原因的带，因为多个圆形RNA可以从基因组位点34形成。这种替代反拼接通常是由两个以上倒重复元件形成的相互竞争的mRNA前结构的结果。此外，神秘的后拼接场可能发生32，35。根据实验目标，Alu元素可以重复或添加到构造中。反拼接位点的互补区域可短至30-40 nt35，以较短的互补区域替换Alu元素可增加循环RNA形成2，经测试可改善循环RNA形成。一旦确定了导致反拼接的mRNA前序列，就可以缩短循环RNA表达构造，从而在某些情况下提高转染效率。
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Disclosures
没什么可透露的
Acknowledgments
这项工作得到了国防部国防部授予AZ180075的支持。斯特凡·斯塔姆感谢杰奎琳·努南捐赠。安娜·帕卢钦得到了德国学术交流项目DAAD的支持，贾斯汀·韦尔登是肯塔基大学马克斯·斯特克勒奖的获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
| Builder tool | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
| Enzymatic DNA assembly kit | NEB | E2621S | |
| Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9282 | |
| Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 cloning site | Polycloning site | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polymerase |
| Polymerase 2 | Biorad | 1725310 | Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad) |
| Polymerase 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen long range polymerase kit |
| Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18080044 | |
| RNA isolation kit | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
| Stable competent cells | NEB | C3040H | NEB stable cells |
| Standard cloning bacteria | NEB | C2988J | NEB5-alpha competent |
| Web tool to design primers | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Web-based temperature calculations | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
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