Summary
פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של המודל הנושא הגידול העכבר כדי לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בזמן אמת על ידי הדמיה ביולומינציה כפול.
Abstract
אנגיוגנזה, כתהליך מכריע של התקדמות הגידול, הפך נקודה חמה מחקר היעד של טיפול נגד הגידול. עם זאת, אין מודל אמין לעקיבה אחר התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בו באופן חזותי ורגיש. הדמיה ביולומינסנציה מציגה את עליונותה הייחודית בהדמיית חיים בשל יתרונותיה של רגישות גבוהה, ספציפיות ומדידה מדויקת. הציג כאן הוא פרוטוקול כדי להקים מודל הנושא הגידול העכבר על ידי הזרקת Renilla לוציפראז התווית מורטין סרטן השד קו 4T1 לתוך העכבר טרנסגניים עם המושרה אנגיוגנזה הבעה לוציפראז. מודל זה של העכבר מספק כלי יקר ערך בו לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בזמן אמת על ידי הדמיה ביולומינציה כפול בעכבר בודד. מודל זה עשוי להיות נרחב להחיל הקרנת תרופות נגד הגידול ואונקולוגיה מחקר.
Introduction
אנגיוגנזה הוא תהליך חיוני בהתקדמות של סרטן מ קטן, ניפלאמים מקומיים לגדול, פוטנציאל גידולים גרורות1,2. הקורלציה בין צמיחת הגידול והאנגיוגנזה הופכת לאחת מנקודות ההדגשה בתחום המחקר האונקולוגי. עם זאת, שיטות מסורתיות של מדידת שינויים מורפולוגיים לא לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בו זמנית בחיות חיים באמצעות גישה דמיינו.
ביולומינסנציה הדמיה (בלי) של תאים סרטניים היא שיטה ניסויית המתאימה במיוחד כדי לפקח על צמיחת הגידול בגלל החלטיות שלה לא פולשני, רגישות, וספציפיות3,4,5,6 . טכנולוגיית בלי מבוססת על העיקרון כי לוציפראז יכול לזרז חמצון של מצע ספציפי תוך פליטת ביולומינציה. ללוציפראז הביע בתאי הגידול מושתל מגיב עם המצע מוזרק, אשר ניתן לזהות על ידי מערכת הדמיה חיה, אותות בעקיפין לשקף את השינויים מספר התא או לוקליזציה תא ב vivo6,7.
למעט צמיחת הגידול, הגידול אנגיוגנזה (הצעד הקריטי בהתקדמות הסרטן) יכול גם להיות מדמיין דרך הטכנולוגיה בלי להשתמש בעכבר Vegfr2-fluc-KI הטרנסגניים8,9,10. מקדם הצמיחה של כלי הדם (הקולטן) 2 (Vegfr2), סוג אחד של קולטן, מתבטא בעיקר בתאי כלי הדם של עכברים למבוגרים11. ב-Vegfr2-Fluc-KI העכברים, רצף ה-DNA של גחלילית לוציפראז (Fluc) הוא דפק לתוך האקסון הראשון של הרצף האנדודוגני Vegfr2. כתוצאה מכך, ה-Fluc מתבטא (המופיעה כאותות בלי מלים) באופן זהה לרמת האנגיוגנזה בעכברים. כדי לצמוח מעבר כמה מילימטרים בגודל, הגידול מגייס ואסיקולטרים חדשים מכלי הדם הקיימים, אשר מאוד לבטא את Vegfr2 המופעל על ידי גורמי גדילה מתאי הגידול1. זה פותח את האפשרות של שימוש Vegfr2-Fluc-KI העכברים הטרנסגניים כדי שאינו פולשני לפקח על אנגיוגנזה הגידול על ידי בלי.
בפרוטוקול זה, מודל העכבר נושאת הגידול הוא הוקם כדי לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בעכבר אחד באמצעות לוציו גחלילית (fluc) ו renilla ללוציפראז (rluc) הדמיה, בהתאמה (איור 1). קו תא 4T1 (4T1-RR) נוצר באופן מאוד מבטא Rluc וחלבון פלורסנט אדום (RLUC) כדי לעקוב אחר צמיחת תאים על ידי הדמיה Rluc. כדי לחקור עוד יותר את השינויים הדינמיים של אנגיוגנזה בהתקדמות ורגרסיה של הגידול, קו תא 4t1 נוסף (4t1-rrt) נוצר כי המבטא התאבדות גן הרפס וירוס מעוגל תימידין קינאז (HSV-ttk), rrt, ו-rrt. על-ידי המינהל של ganciclovir (GCV), את HSV-ttk המבטא תאים הם באופן סלקטיבי הקשורים. בהתבסס על קווי תאים אלה, מודל הנושאת גידול בעכברים Vegfr2-Fluc-KI בנוי המשמש כמודל ניסיוני גישור התקדמות הגידול והגידול אנגיוגנזה בvivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים חייבים לעמוד בתקנות לאומיות ומוסדיים הנוגעות לשימוש בבעלי חיים לצורכי מחקר. יש להשיג הרשאות לביצוע ניסויים. הטיפול בבעלי חיים והליכים ניסיוניים של המחקר לדבוק באוניברסיטאות Nankai טיפול בעלי חיים והנחיות הוועדה להשתמש הנחיות ההנחיות לטיפול בבעלי חיים אושרה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH).
1. LV-Rluc-RLUC (RR) ו-LV-Rluc-RLUC-HSV-ttk (RLUC) האריזה והפקה של ויראלי
הערה: plv-RR נושאת את רצפי הגנים של renilla ללוציפראז (rluc) וחלבון פלורסנט אדום (rluc) תחת EF1α היזם, ואילו plv-rluc נושאת את רצפי הגנים קידוד rluc, rluc, וירוס הרפס מעוגל תימידין קינאז (HSV-ttk) ( איור 2).
- זרע 1 x 106 של תאים 293t לתוך הצלחת 6 היטב ותרבות לילה בחממה מחולל לחות עם 5% CO2 ב 37 ° c עם מדיום הנשר שונה של DULBECCO (dmem) המכיל 10% סרום העוברי (fbs).
- להכין את ליפוכמה ההשעיה: לערבב 7.5 μL של ליפוכמה ו 0.25 mL של בינוני חיוני מינימלי (לזכור) לתוך שפופרת של 1.5 mL בעקבות דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לפזר ליפוזומים באופן שווה.
- הכן את הפתרון DNAs (DNAs-RR): בנפרד, הוסף את ה-pLV-RR וקטור מסייע ל-0.25 mL של מחבר הרכבת בצינור 1.5 mL כמתואר בטבלה 1.
- השג את מתחם ליפוחלק/DNAs-RR: בעדינות להוסיף את הפתרון DNAs-RR לתוך ליפוף מוכן ירידה ההשעיה על ידי ירידה ו דגירה עבור 20 דקות ב RT כך את קשרי ה-DNA לקרום השומנים.
- החלף את המדיום של התאים 293T עם 1 mL של DMEM המכיל 10% FBS ולהוסיף את התרכובת ליפוחלק/Dmem-RR למדיום של התאים 293T בעדינות.
- לאחר הדגירה של החממה מחולל לחות עם 5% CO2 ב 37 ° צ' עבור 12-16 h, להחליף את המתחם ליפוחלק/DNAS-RR המכיל בינוני של התאים 293t עם 1 מ ל של dnas המכיל 10% fbs ו 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין.
- המשך לשאת את התאים 293T בחממה לחות 48 h לאחר הזיהום. לאחר מכן, לאסוף את supernatant של תאים 293T ו צנטריפוגה את המדיום ב 300 x g עבור 5 דקות כדי הגלולה 293t תאים. העבר את ה-וירוס-RR (LV-RR)-המכיל supernatant לתוך 1.5 mL סטרילי צינורות אחסון פוליפרופילן וחנות ב-80 ° c.
הערה: מתקן Biosafety טיחות ברמה 2 (BSL-2) נדרש על מנת לעבוד עם רקומביננטי, וירוס. - חזור על שלבים 1.1 – 1.7 ולהשתמש pLV-RRT וקטור במקום pLV-RR וקטור בשלב 1.3 כדי לקבל את הנגיף-RRT (LV-RRT). אחסן את ה-LV-RRT ב-80 ° c.
הערה: במקרים מסוימים, המניה האנטי-ויראלית שאינה מטוהרים עלולה לעכב את צמיחת התאים. ייתכן שיהיה צורך לטהר את המניה הננגיפית. את המניות מכיל LV-RR או LV-RRT חלקיקים צריך להיות מחולק לצינורות 1.5 mL (1 mL לכל צינור) עבור אחסון כדי למנוע מחזורי הפשרה מרובים ללא תשלום.
2. LV-RR ו-LV-RRT התמרה ויראלית לביטוי גנים ב 4T1 תאים
- זרעי הזרע 4T1 לתוך צלחת 6-הבאר (5 x 105 תאים/טוב) ותרבות עם מכון הזיכרון ברוזוול פארק (RPMI) 1640 בינוני המכיל 10% fbs לילה בחממה לחות עם 5% CO2 ב 37 ° c.
- הסר את המדיום מלוח התרבות ולהחליף אותו עם 1 mL טריים RPMI 1640 בינוני, כמו גם 1 mL של מניות העדשה (LV-RR או LV-RRT) לכל טוב. הוסף 8 μg/mL polybrene ולמזג בעדינות את המדיום המכיל חלקיקים לנטינגיי על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
הערה: שימו לב כי המדיום מכיל חלקיקים מיונגיליים, שיכולים להתאים את התאים האנושיים. - התמרה פתרון ספין בצנטריפוגה ב 1,000 × g עבור 60 דקות ב-RT כדי לסייע להגדיל את היעילות התמרה. לאחר צנטריפוגה, התרבות 4T1 תאים עבור 4-12 h ולשמור על החממה לחות עם 5% CO2 ב 37 ° c.
הערה: עבור קווי תאים מסוימים, polybrene עשוי להיות רעיל לתרבות ארוכת טווח. לכן, זמן הדגירה לצורך העברת התמרה של תאים שונים עשוי להיות הפכפך. בדוק את מצב התא פעמים מרובות כדי למצוא זמן הדגירה המתאים. - לרענן את המדיום של תאים 4T1 התמרה עם 2 מ ל של RPMI 1640 בינונית המכילה 10% FBS ו 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין כדי להסיר את החלקיקים להסרת העור polybrene.
3. הקרנת סמים וזיהוי של LV-RR ו-LV-RRT התמרה תאים 4T1
- בחרו בתאים שעברו התמרה (BSD) על פי גן ההתנגדות של BSD שנישא על ידי LV-RR או LV-RRT כמתואר בצעדים הבאים.
הערה: לחילופין, התאים המתמרים אשר RFP-חיוביים ניתן לבחור על ידי הcy, לנסות על פי הגן RFP שנישא על ידי LV-RR או LV-RFP. - 48 h לאחר התמרה, מעבר תאים 4T1 ביחס של 1:3 אל 1:4 עם בינוני בחירה (RPMI 1640 בינוני המכיל 10% FBS, 100 U/mL פניצילין לסטרפטומיצין, ו-5 μg/mL BSD). . שינוי בינוני כל יומיים או שלושה
הערה: הריכוז האופטימלי של BSD עשוי להשתנות מקו התאים לקו התאים. לכן, ניסוי פיילוט של עקומת להרוג צריך להתבצע כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של BSD לפני הניסוי הראשוני. - 7 ימים לאחר ההקרנה התרופה, לבחון את LV-RR 4T1 תאים (4T1-RR) ו-LV-RRT התמרה תאים 4T1 (4T1-RRT) תחת מיקרוסקופ שלב הפוך פלואורסצנטית. לספור את מספר התאים RFP+ 4t1 ואת כל 4t1 תאים בשלושה שדות של חזון להעריך את היחס rfp-חיוביים, בהתאמה (איור 2).
הערה: לחלופין, היחס RFP-חיוביים של תאים 4T1 התמרה הדרגתית ניתן לזהות על ידי הזרמת cy, try. - למדוד את האותות renilla של 4T1-RR ו 4T1-RRT תאים באמצעות מערכת הדמיה חיה כדי לזהות את הקשר הליניארי בין מספרי התאים ואותות renilla (איור 3).
- הרחב הוקרן BSD 4T1-RR ו 4T1-RRT תאים עם בינונית בחירה ביחס מפוצל בין 1:3 ו 1:4 ולאחסן את המניות קו התא בחנקן נוזלי.
4. Vegfr2-Fluc-KI עכברים הנושאת גידול מודל העכבר
הערה: עכברים Vegfr2-Fluc-KI הטרנסגניים, בני 6-8 שבועות ונקביים, משמשים בניסוי זה כדי לנטר באופן בלתי פולשני את האנגיוגנזה בvivo על ידי בלי.
- תרבות 4T1-RR ו-4T1-RRT תאים ב 60 מ"מ מנות פטרי בתוך החממה מחולל לחות עם 5% CO2 ב 37 ° c, בהתאמה. כאשר התאים הם ב 80% המפגש, להסיר את המדיום ולשטוף עם מלח מאגור פוספט (PBS).
- הסר את ה-PBS והוסף 2 מ"ל נוספים של 0.25% טריפסין-0.53 מ"מ פתרון EDTA בהתאמה. שמור את המנה ב-RT (או בשעה 37 ° c) עד שהתאים מתנתק.
- הוסף 5 – 10 מ ל של בינוני טרי המכיל 10% FBS, ולאחר מכן לחלק את התאים לוותר על השעיית מחדש 4T1-RR ו 4T1-RRT תאים לתוך 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה, בהתאמה. ספירה שני סוגים של תאים 4T1 באמצעות תא ספירה ולהכין את השעיות התא בריכוז של 1 x 106 לכל 100 ΜL ב RPMI 1640 בינונית.
- מורדם בVegfr2-Fluc-KI עכברים עם 1% – 3% isof, ב 100% חמצן בחדר אינדוקציה הרדמה עם קצב הזרימה של 1 L/min. לפקח על התגובה צביטה הבוהן של העכבר כדי לאשר את מצבה של הרדמה. ואז, להחיל משחה אופטלמולוגית על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות.
- להסיר את העכבר מתא ומיקום nosecone. לחלוטין להסיר את השיער של הכתף של העכבר באמצעות מכונת גילוח חשמלי וקרם הסרת שיער, אשר יכול לספק תצוגה טובה של שדה כירורגי ולהימנע חסימת אותות בלי לעשות ניסויים בעקבות.
- תת-עורי להזריק 4T1-RR (1 x 106 תאים בנפח μl הכולל 100) ו 4T1-rrt תאים (1 x 106 תאים בנפח 100 μl כולל) בכתפיים שמאל וימין של כל עכבר, בהתאמה (רשומה כיום 0). המקום עכברים באזור ההתאוששות עם תמיכה תרמית עד התאושש באופן מלא.
- לאחר השרשה של 4T1-RR ו 4T1-RRT תאים, לגעת מיסות הגידול כדי לבדוק את העכברים הם הנושאת גידול כל יום (איור S1). ביום 7 לאחר ההשתלה, intraperitoneally להזריק 50 mg/kg ganciclovir (GCV) לעכברים נושאת הגידול פעמיים ביום עד סוף הניסוי.
הערה: לפני ניסוי זה, ציטוטוקסיי של GCV בתאים 4T1-RRT צריך להיות מזוהה. יעילות ההריגה של GCV יכול להיות מוערך על ידי שיטת ספירת התאים עם ריכוז שונה של GCV (איור S2). - ביום 0, 3, 7, 14, ו 21 לאחר השרשה 4T1, לפקח על צמיחת הגידול ואנגיוגנזה של עכברים נושאת הגידול ולהעריך על ידי שניהם Rluc ו Fluc הדמיה (איור 4).
5. הדמיה ביולומינציה כפולה של גידול (Rluc) ואנגיוגנזה (Fluc)
- פתח את מערכת ההדמיה החי, אתחל את תוכנת הדימות החי ולאחר מכן אתחל את המערכת.
הערה: אתחול המערכת ייקח כמה דקות כדי לצנן את המכשיר מצמידים מטען (CCD) מצלמה ל-90 ° צ' לפני היכולת להתחיל הדמיה. הטמפרטורה תהפוך ירוק כאשר מצלמת CCD מקורר. - השתמש בהגדרות הבאות של המצלמה:
. תבדקו את הלומינסנציה והצילומים
בדוק שכבת-על.
הגדרות לומינסנציה:
זמן חשיפה מגדיר אוטומטית בתנאים נורמליים.
. באנינג מגדיר ל -8
מערכות F/Stop מסדרות ל-1.
מסנן הפליטה מגדיר את הפתיחה.
הגדרות צילום:
ביננינג מגדיר למדיום.
F/Stop מגדיר ל-8.
הגדרות מערכת IVIS:
שדה תצוגה: C = 1 להציג עכבר, D = 5 להציג עכברים.
גובה הנושא קובע 1.5 ס מ. - לשקול ולהקליט את העכברים ולחשב את עוצמת הקול של קומרכאזין (CTZ; 2.5 מ"ג/ק"ג) ו D-לluciferin (150 מ"ג/ק"ג) הדרושים.
- באמצעות הגידול בעכבר על ידי 1% – 3% isof, ב 100% חמצן בחדר אינדוקציה הרדמה עם קצב זרימה של 1 L/min. הצג את התגובה צביטה הבוהן של העכבר כדי לאשר את מצבה של הרדמה. אז, לחלק טיפה של משחה עין סיכה על שתי העיניים כדי למנוע נזק הקרנית.
- הכנס 2.5 mg CTZ (3.33 mg/mL) לכל קילוגרם משקל הגוף לתוך retrobulbar של העכבר (למשל, עבור 20 g העכבר, להזריק 15 μL כדי לספק 50 μg של CTZ) באמצעות מחט מזרק אינסולין.
- הזז את העכבר הנושאת הגידול לתוך חדר המצלמה עם אפו בקונוס ההרדמה בעדינות לרכוש מספר תמונות של העכבר מייד כדי לקבל את האותות Rluc מתאי 4T1 עד האותות בלי לדעוך.
הערה: מחצית החיים של CTZ קצר מאוד והאותות של Rluc ירידה באופן מקוצר ~ 30 s. כדי להבטיח כל אות Rluc השאריות התפוגג ואת המרווח בין Rluc ו Fluc הדמיה צריך להיות יותר מ 10 דקות. - Intraperitoneally להזריק 150 מ"ג/ק"ג D-לluciferin (30 מ"ג/mL) באמצעות מחט מזרק אינסולין (למשל, עבור 20 g עכבר, להזריק 100 μL כדי לספק 3 מ ג של D-לluciferin). לשמור את העכבר על RT עבור 10 דקות לפני הדמיה Fluc.
- להזיז את העכבר לתוך חדר המצלמה עם אפו בקונוס ההרדמה שוב לרכוש כמה תמונות של העכבר הקדמי כדי לקבל את אותות Fluc מן אנגיוגנזה.
הערה: צג הקינטי Fluc צריך להתבצע עבור כל עכבר עד האותות להגיע למקסימום ולאחר מכן דוהה. - חזור על ההליכים שלבים 5.4 – 5.8 עבור כל עכבר.
- לאחר הדמיה, לשמור על העכברים בסביבה חמה עד בעלי חיים מתעוררים.
- בנקודת הזמן הרצויה (יום 3, 7, 14, ו 21), חזור על הליכים לעיל (שלב 5.3 – 5.10) כדי לזהות את התקדמות הגידול ואנגיוגנזה הגידול לאורך זמן.
- לנתח את Rluc ו Fluc אותות נתונים כדי לחקור את הקשר בין צמיחת הגידול ואנגיוגנזה בהתקדמות הגידול.
הערה: אזורי הריבית (ROI) המכסה את אתר האיתותים של בלי משתמשים כדי לנתח את הנתונים. למדוד את הזוהר הכולל (פוטונים) של ROI ביחידה של פוטונים/שניות/cm2/הסטרדיאן (p/s/cm2/sr) עבור כל נקודת זמן. - לנתח את האותות Rluc ו Fluc של ROI באמצעות תוכנה גרפית (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסוי זה, סרטן השד מודל העכבר הוקמה באמצעות תאים 4T1 כדי לחקור את הקשר בין גידול גידול והגידול אנגיוגנזה (איור 1). ראשית, שני הנגיף היו ארוזים, אשר נשאו רצפי גנים המבטא Rluc/RLUC (LV-RR) ו Rluc/RLUC/HSV-ttk (LV-RLUC), בהתאמה, כפי שדווח בעבר7. לאחר מכן, שני שונים תא 4T1 קווי, בשם 4T1-RR ו 4T1-RRT, נוצרו על ידי התמרה LV-RR ו-LV-RRT בהתאמה. לאחר הקרנת התרופה 3 ימים, 4T1-RR ו 4T1-RRT נצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לזהות את היעילות התמרה. כפי שמוצג הדמיה פלואורסצנטית, יותר מ 99% של התאים 4T1-RR או 4T1-RRT היו RRT חיובי, אשר הציע 4T1-RR ו-4T1-RRT התאים הוקמו על ידי LV-RR ו-LV-RRT התמרה (איור 2A, B). בינתיים, לא היה הבדלים במבנה התא ובצמיחה בין מסוג פראי 4T1 ו-4T1-RR או 4T1-RRT בזמן התרבות. לסיכום, הבנו בהצלחה 4T1-RR ו-4T1-RRT קווי תאים מבלי להשפיע על מדינות הסלולר. לאחר מכן, הדמיה ביולומינסנציה (בלי) של תאים 4T1-RR ו-4T1-RRT שנתפסו כדי לזהות את האותות Rrt. התמונות בלי לגלות כי הן 4T1-RR ו 4T1-RRT תאים הנפלטים אותות ביולומילטיות חזק של אותו חוזק (איור 3A). חוץ מזה, היחסים הליניארית בין אותות Rluc ומספרי תאים נצפו הן 4T1-RR (R2 = 0.9974) ו 4T1-rluc תאים (r2 = 0.9989), אשר הציע אותות rluc יכול לשמש כדי לשקף את צמיחת הגידול ב Vivo (איור 3b ).
על בסיס זה, באמצעות העכבר הטרנסגניים Vegfr2-Fluc-KI, מודל הנושאת הגידול הנושא הוקם כדי לחקור את האנגיוגנזה כמו סרטן השד גדל. כתוצאה הדפיקה רצף Fluc לתוך האקסון הראשון של הרצף Vegfr2 ב מוריין, Fluc ביטא (אשר מופיע כאותות biלומיאנטיות) באופן זהה אנגיוגנזה של עכברים במהלך התקדמות הגידול. לאחר הזרקה תת עורית של 4T1-RR ו 4T1-RRT תאים, צמיחת התאים היה מפוקח על ידי אותות Rrt בנוכחות של CTZ בימים 0, 3, 7, 14, ו 21 (איור 4A). במקביל, אנגיוגנזה הנגרמת על ידי גידול הגידול הוערך על ידי אותות Fluc בנוכחות של D-לluciferin באותו עכבר. ביום 7 לאחר השרשה של 4T1-RR ו 4T1-RRT, GCV היה מנוהל עכברים נושאת הגידול, אשר הובילו את התאים 4T1-RRT למות. תמונות בלי לגלות כי אותות Rluc של 4T1-RR ו 4T1-RLUC תאים גדל באותו קצב לפני הטיפול GCV; עם זאת, אותות Rluc התאים 4T1-RLUC ירד בחדות לאחר הטיפול GCV. בעוד שאותות Rluc של 4T1-RR עדיין מוגברים בעדינות. ברור, תורת היחסות המשמעותית התקיימה בין אותות Rluc ואת גודל הגידול (איור S1).
בינתיים, על פי תמונות Fluc, אותות Fluc עלה בהתאם לעלייה Rluc וירד בעקבות הירידה Rluc (איור 4B). תוצאות אלה מרמזות כי היתה קורלציה ישירה בין אנגיוגנזה הגידול וצמיחת הגידול. מותם של תאים סרטניים הנגרמת על ידי התרופה GCV עלול להוביל לעיכוב של אנגיוגנזה הגידול (איור 4C). כדי להדגים כי האות Fluc אכן מזהה את האנגיוגנזה בתוך הגידולים, בעלי החיים הוקרב לאחר לסיים הדמיה ביום 21 כדי לקבל ראיות היסטולוגית של vascuלטורה. על פי התמונות של anti-VEGFR2 מכתים, מבנים microvascular ברקמת גידול 4T1-RR היו באופן משמעותי יותר ברור מאשר ברקמת הגידול 4T1-RRT, אשר היו עקביים עם אותות Fluc (איור 5). לסיכום, זו אסטרטגיה כפולה ביולומינציה הדמיה ניתן להשתמש כדי לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה כמו גם להעריך את ההשפעות נגד הגידול של תרופות שונות על גידול הגידול ואנגיוגנזה ב מיקרוסביבה הגידול.
איור 1: מפת סכמטית של הדמיה ביולומינציה כפולה של גידול ואנגיוגנזה. התאים 4T1 התמרה על ידי LV-RR ו-LV-RRT הושתל ב-Vegfr2-Fluc-KI העכברים הטרנסגניים. במהלך צמיחת הגידול, מבלי Rluc ו Fluc בוצעו בו בעכבר אחד כדי לשקף את צמיחת הגידול ומצב אנגיוגנזה, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התמרה יעילות של תאים 4T1-RR ו-4T1-RRT המזוהים על ידי הדמיה של הקרינה הפלואורסצנטית. (א) הציור השרטוט של pLV-RR הראה כי Rluc ו-RLUC רצפים היו ביטא תחת היזם EF1α. התמונות בהירות ופלורסנט של שדה אחד של השקפה חשף כי התאים 4T1-RR היו RFP-חיובית. (ב) ציור השרטוט של plv-rrt הראו כי היזם בודד EF1α הפעיל RRT, rrt, ו HSV-ttk גנים. התמונות בהירות ופלורסנט של שדה אחד של השקפה חשף כי תאים 4T1-RRT היו RRT חיובי. סרגל קנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיה ביולומינסנציה של התמרה 4T1-RR ו-4T1-rrt תאים. (א) ביולומינסנציה הדמיה של תאים 4T1-RR ו-4T1-rrt בנוכחות של ctz. (ב) אותות rluc שנמדדו של תאים 4T1-RR ו-4T1-rluc החזיקו בקשר ליניארי עם מספרי תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ויזואליזציה של התהליכים הדינמיים של צמיחת הגידול והאנגיוגנזה בבעלי חיים חיים. (א) תזרים הזרימה של הניסוי וזיהוי מבלי הוראות של רילוק ופלוג. (ב) נציג rluc תמונות של התקדמות הגידול ותמונות fluc של אנגיוגנזה במהלך התפתחות הגידול בעכבר טרנסגניים. (ג) מדידה של אותות rluc הפגינו כי תאים סרטניים מושתל גדל מהר, בעוד התאים 4T1-rluc היה מאוד בנסיגה באופן משמעותי לאחר הממשל gcv. (ד) הקוונפיקציה של אותות fluc הראו כי אנגיוגנזה התרחשה לאחר השתלת תא הגידול, בעקבות מגמה מקבילה עם גידול ומוות הנגרמת על ידי gcv. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: VEGFR2 חיסוני של 4T1-RR ו 4T1-RRT רקמות ביום 21. תמונות מייצגות של רקמות הגידול סעיפים מוכתם עבור VEGFR2 (ירוק) ביום 21. הגרעינים היו מוכתמים נגד DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור S1: עיקול גודל הגידול במהלך התקדמות הגידול ב vivo. גודל הגידול של 4T1-RR ו 4T1-RRT תאים גדל לאחר השרשה, אבל גודל הגידול של התאים 4T1-RRT התחיל להקטין את הטיפול post-GCV. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור S2: השפעה ציטוטוקסיים של GCV על 4T1-RRT תאים. התאים 4T1-RRT מתו עם ריכוז מוגבר של GCV. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
S3 דמות: התמונה בלי להתאים של 4T1-RR בריאה. לאחר הזרקת וריד הזנב של תאים 4T1-RR, האות Rluc של תאים זוהה על-ידי בלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
| LV-RR ו-LV-התנאים אריזה | |||
| רכיבים | הגברת מדיום | 3-פלמיד מערכת | 4-פלמיד מערכת |
| וקטור pLV-RR/pLV-RRT | 0.25 מ ל | 1.5 μg | 1.5 μg |
| מחסום-פול + ביטוי Rev וקטורB | 1.0 μg | ||
| וקטור ביטוי מחסום-פול | 0.75 μg | ||
| וקטור ביטוי הפוךD | 0.3 μg | ||
| VSV-G ביטוי וקטורE | 0.5 μg | 0.45 μg | |
| ליפוזום | 0.25 מ ל | 7.5 מיקרומטר | 7.5 מיקרומטר |
טבלה 1: תנאי החצייה של מערכת אריזה ויראלית להפקת lv-RR ו-LV-rrt ויראלי מניות בתאי 293t. (א) הוקטור pLV-cDNA היה plv-RR ו pLV-RRT, בהתאמה. (ב) וקטור ביטוי מחסום-פול + Rev יכול להיות pcmv-deltar 8.91 (trc) או PsPAX2 (addgene). (ג) ביטוי מחסום-פול יכול לבחור כל אחד של pMDLg/prre (הוספה), pLP1 (מוזמנים), ו-pPACKH1-מחסום (sbi). (ד) Rev וקטור הביטוי צריך להיות PRSV-Rev (addgene), pLP2 (מוזמנים), או PPACKH1-REV (sbi). (ה) Vsv-G ביטוי וקטור יכול לבחור pmd. g (trc), PMD2. g (addgene), PCMV-Vsv-G (הוספה), Pvsv-g (sbi), או plp/vsv (מוזמנים). בפרוטוקול זה, נעשה שימוש במערכת שלושת הפלמיד, כולל psPAX2, pMD2 G, ו-pLV-RR או pLV-RRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, הגישה ללא פולשני כפול מתואר מחוץ לתחום הפיתוח של הגידול והאנגיוגנזה. מערכת העיתונאי בלי להיות מפותח לראשונה, המכיל את הגן HSV-ttk/GCV התאבדות עבור מעקב התקדמות הגידול ורגרסיה ב vivo ידי Rluc הדמיה. בינתיים, הגידול אנגיוגנזה מוערך באמצעות Vegfr2-Fluc-KI עכברים באמצעות הדמיה Fluc. זה הגידול מודל העכבר הנושאת הוא מסוגל לספק פלטפורמה מעשית עבור רציפה ולא פולשנית התפתחות הגידול והגידול אנגיוגנזה על ידי כפול בלי בעכבר בודד עם רלוונטיות גבוהה, הנוזלות, ו translatability.
אנגיוגנזה נוגע התקדמות הגידול ארוכת טווח, ובכך הוא בעל חשיבות גבוהה1. יש צורך ללמוד את הקשר בין התקדמות הגידול ואנגיוגנזה. מספר גדל והולך של אסטרטגיות נגד אנגיוגנזה נחקרו לטיפול בסרטן, אשר להסתמך על גישות צג דמיינו במדויק להעריך את תוצאות הטיפול. יתר על כן, ניאוואסקולריזציה של רקמת הגידול לאחר הקרנות מסורתיות כימותרפיה היא עוד אזור פופולרי של מחקר אונקולוגיה12,13,14. מחקרים אלה דורשים מודל בעלי חיים המאפשרים ניטור של צמיחת הגידול ואנגיוגנזה בזמן אמת. השינויים הפתולוגיים של רקמות הגידול במודלים של בעלי חיים מסורתיים תלויים בדרך כלל בבדיקה היפואתולוגית, הדורשת הקרבת בעלי חיים. אלה מודלים כפול העכבר מבלי לעזור לטפל בבעיות של טווחי שגיאה גדולים יותר ועלויות גבוהות יותר מהקרבה של בעלי חיים.
במודל העכבר הכפול, הצעד הקריטי ביותר הוא באמצעות שני סוגים של הלוציסים, כולל Fluc ו-Rluc, לתאי מעקב בהתאמה ואנגיוגנזה באותו זמן. המצע הספציפיות של שני הוצינים האלה מאפשר לבצע שני סוגים של בלי היגיון בפונדקאי יחיד. חוץ מזה, מחצית החיים של קופלאזין (המצע של Rluc) הוא קצר מאוד, אשר התוצאות האותות Rluc מתפוגג במהירות מבלי להשפיע על גלאי האותות הבאים Fluc15. מכאן, בתהליך הפעולה, הדמיה Rluc צריך להיות מיושם לפני Fluc הדמיה על חשבון של מחצית חיים ארוכה יותר של D-לluciferin (המצע של Fluc). בנוסף, להבין את זמן הדגירה של הסובסטרציה היא המפתח לרכישת תמונות בלי מושלמים. חילוף החומרים של מצעים יכול לשנות את הריכוז של מצעים בvivo, המוביל וריאציה בעוצמת האות מבלי.
הבעלות על החידושים בטכנולוגיה, שיטות הדמיה אחרות עבור במעקב vivo של אירועים סלולריים מסוימים subcellular הוחלו מחקרים פרה-קליניים וקליניים, כגון דימות פלורסנט, תהודה מגנטית הדמיה (MRI), ו פוזיטרון טומוגרפיה פליטה (PET)16,17. לעומת אסטרטגיות אלה הדמיה, הדמיה biלומינסנציה יש רגישות גבוהה, ספציפיות ומדידה מדויקת, מראה עליונותה הייחודית בתחום הדמיה חיים מחקרים15. הדמיה Rluc המועסקים מאפשר צמיחת הגידול והשפעות נגד הגידול של HSV-ttk/GCV מערכת התרופות להיות דמיינו באופן דינאמי בחיה חיה. למעט ניטור רקמות תת עורית, Rluc שימש לעקוב אחר התאים בריאות על ידי טכנולוגיית בלי במחקר אחר. לאחר הזרקת וריד הזנב של 4T1-RR לתוך עכבר, העברנו את העכבר לתוך מערכת הדמיה חיה כדי לזהות את אותות Rluc לאחר המינהל של CTZ. התמונה של האות Rluc הראה כי תאים מוזרק היו ממוקמים בעיקר בריאה (הדמות S3). כפי שהוזכר לעיל, הגן דוח Rluc יכול לעקוב אחר תאים סרטניים שונים במיקומים שונים, אשר מעודדת את ניצול מלא של מודל זה העכבר במחקר ביולוגיה של סרטן.
בנוסף ליתרונות אלה, ניתן להשתמש בטכנולוגיית בלי לחוש את רמות הביטוי של מולקולות ספציפיות. בעבר, fluorophores כתבת גנים, אשר מבוטא תחת קידום מקדם רלוונטי, השתמשו כדי למדוד את התפתחות הספינה בגידולים תת עורית. במהלך התקדמות הגידול, מבנה כלי הדם ומולקולות ניתן לצפות דרך חדרי החלון בניתוח מושתל בעכברים. עם זאת, שיטה זו עדיין יש מגבלות, כולל הפלישה בלתי נמנעת, fluorophore מקוצ'ינג, ורעש רקע חזק. מודל העכבר נושאת הגידול הוקמה בעכבר Vegfr2-Fluc-KI יוצר תצפית לא פולשנית של רמת הביטוי של Vegfr2, שהיא המולקולה החשובה ביותר באנגיוגנזה הגידול. בינתיים, התמונות ללא הפרעות מציגות בפירוט רב וללא רעש. מודל מבלי העכבר הכפולה עשויה להיות בעלי יישומים רחבים יותר בלימוד המנגנונים המולקולריים הפוטנציאליים בהתקדמות הגידול והרגרסיה.
בלי הטכנולוגיה, מבוסס על הביטוי של Rluc (פליטה 480 nm) ו Fluc (פליטה 562 nm), אומצה במספר מודלים vivo המחלה. השימוש הנרחב בטכנולוגיית בלי הvivo הוגבלה בשל הרגישות הנמוכה של הביולומינציה באורכי גל מתחת 600 ננומטר בזיהוי רקמות עמוקות. זה נגרם על ידי קליטת ופיזור של אור, אשר מפחית את האות לזיהוי עד עשר קיפול לסנטימטר של רקמות. כדי לטפל בשאלה זו, חלק מהחוקרים יש מחקרים ממוקדים על גרסאות פולט אדום של Fluc הפולטים אור מעל 600 ננומטר18. בגלל ספיגת ופיזור של אור יכול להיות מופחת במידה ניכרת באמצעות גרסאות אלה של fluc18,19, היישומים של גרסאות לוציפראז יהיה להאריך את פרוטוקול זה לשדה גדול יותר של מחקר אונקולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מפתח לאומי R & D של סין (2017YFA0103200), הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (81671734), ופרויקטים מרכזיים של טיינג'ין המדע וטכנולוגיה תוכנית תמיכה (18YFZCSY00010), קרנות המחקר הבסיסי עבור האוניברסיטאות המרכזיות (63191155). אנו מכירים בשינויים של גלוריה נאנס, שהיו יקרי ערך בשיפור איכות כתב היד שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
References
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
- Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
- Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
- Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
- Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
- Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
- Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
- Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
- Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
- Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
- Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
- Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
- Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).
