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ट्यूमर प्रगति और एंजियोजेनेसिस की दोहरी Bioluminescence इमेजिंग

Published: August 1, 2019 doi: 10.3791/59763
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Nankai University School of Medicine, 2State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology and College of Pharmacy, Nankai University

Summary

इस प्रोटोकॉल दोहरी bioluminescence इमेजिंग द्वारा वास्तविक समय में ट्यूमर प्रगति और एंजियोजेनेसिस की निगरानी करने के लिए एक ट्यूमर असर माउस मॉडल की स्थापना का वर्णन करता है।

Abstract

एंजियोजेनेसिस, ट्यूमर प्रगति की एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया के रूप में, एक अनुसंधान हॉटस्पॉट और एंटी ट्यूमर थेरेपी का लक्ष्य बन गया है। हालांकि, ट्यूमर प्रगति और एक दृश्य और संवेदनशील तरीके से एक साथ एंजियोजेनेसिस अनुरेखण के लिए कोई विश्वसनीय मॉडल नहीं है। Bioluminescence इमेजिंग उच्च संवेदनशीलता, मजबूत विशिष्टता, और सटीक माप के अपने फायदे के कारण इमेजिंग रहने में अपनी अनूठी श्रेष्ठता प्रदर्शित करता है. यहाँ प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल के लिए एक Renilla luciferase लेबल murine स्तन कैंसर सेल लाइन 4T1 angiogenesis प्रेरित जुगनू luciferase अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक माउस में इंजेक्शन द्वारा एक ट्यूमर असर माउस मॉडल स्थापित करने के लिए है. इस माउस मॉडल एक साथ एक ही माउस में दोहरी bioluminescence इमेजिंग द्वारा वास्तविक समय में ट्यूमर प्रगति और एंजियोजेनेसिस की निगरानी करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है। इस मॉडल को व्यापक रूप से विरोधी ट्यूमर दवा स्क्रीनिंग और ऑन्कोलॉजी अनुसंधान में लागू किया जा सकता है।

Introduction

एंजियोजेनेसिस छोटे से कैंसर की प्रगति में एक आवश्यक प्रक्रिया है, स्थानीयकृत neoplasms बड़ा करने के लिए, संभावित metastatic ट्यूमर1,2. ट्यूमर के विकास और एंजियोजेनेसिस के बीच सहसंबंध ऑन्कोलॉजी अनुसंधान के क्षेत्र में जोर देने के बिंदुओं में से एक बन जाता है। हालांकि, morphologic परिवर्तन को मापने के पारंपरिक तरीकों ट्यूमर प्रगति और एक साथ रहने वाले जानवरों में एक दृश्य दृष्टिकोण का उपयोग कर एंजियोजेनेसिस की निगरानी करने में विफल।

ट्यूमर कोशिकाओं के Bioluminescence इमेजिंग (BLI) अपनी गैर आक्रामकता, संवेदनशीलता, और विशिष्टता3,4,5,6 की वजह से ट्यूमर के विकास की निगरानी करने के लिए एक विशेष रूप से उपयुक्त प्रयोगात्मक विधि है . BLI प्रौद्योगिकी सिद्धांत है कि luciferase एक विशिष्ट सब्सट्रेट के ऑक्सीकरण उत्प्रेरित कर सकते हैं, जबकि bioluminscence उत्सर्जन पर आधारित है. प्रत्यारोपित ट्यूमर कोशिकाओं में व्यक्त luciferase इंजेक्शन सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया करता है, जो एक जीवित इमेजिंग प्रणाली द्वारा पता लगाया जा सकता है, और संकेत परोक्ष रूप से विवो6,7में सेल संख्या या सेल स्थानीयकरण में परिवर्तन को प्रतिबिंबित .

ट्यूमर के विकास के अलावा, ट्यूमर एंजियोजेनेसिस (कैंसर प्रगति में महत्वपूर्ण कदम) भी Vegfr2-Fluc-KI ट्रांसजेनिक चूहों8,9,10का उपयोग कर BLI प्रौद्योगिकी के माध्यम से कल्पना की जा सकती है। संवहनी endothelial विकास कारक (Vegf) रिसेप्टर 2 (Vegfr2), Vegf रिसेप्टर का एक प्रकार, ज्यादातर वयस्क चूहों11की संवहनी endothelial कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है. Vegfr2-Fluc-KI ट्रांसजेनिक चूहों में, जुगनू ल्यूसिफरेस (Fluc) के डीएनए अनुक्रम अंतर्जात Vegfr2 अनुक्रम के पहले exon में खटखटाया है. नतीजतन, फ्लूक व्यक्त किया जाता है (जो BLI संकेतों के रूप में प्रकट होता है) एक तरीके से है कि चूहों में एंजियोजेनेसिस के स्तर के समान है. आकार में कुछ मिलीमीटर से परे विकसित करने के लिए, ट्यूमर मौजूदा रक्त वाहिकाओं से नए vascualures भर्ती, जो अत्यधिक Vegfr2 ट्यूमर कोशिकाओं से विकास कारकों से ट्रिगर व्यक्त1. यह बीएलआई द्वारा गैर-आक्रामक रूप से ट्यूमर एंजियोजेनेसिस की निगरानी करने के लिए Vegfr2-Fluc-KI ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने की संभावना को खोलता है।

इस प्रोटोकॉल में, एक ट्यूमर असर माउस मॉडल जुगनू luciferase (Fluc) और Renilla luciferase (Rluc) इमेजिंग, क्रमशः (चित्र 1) के माध्यम से एक ही माउस में ट्यूमर प्रगति और एंजियोजेनेसिस की निगरानी करने के लिए स्थापित किया गया है। एक 4T1 सेल लाइन (4T1-आरआर) बनाया गया है कि stably Rluc और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) Rluc इमेजिंग द्वारा सेल विकास का पता लगाने के लिए व्यक्त करता है. आगे ट्यूमर की प्रगति और प्रतिगमन में एंजियोजेनेसिस के गतिशील परिवर्तन की जांच करने के लिए, एक और 4T1 सेल लाइन (4T1-RRT) आत्महत्या जीन दाद सिंप्लेक्स वायरस छोटा थाइमिडीन kinase (HSV-ttk), Rluc, और आरएफपी व्यक्त करता है बनाया गया है। ganciclovir (GCV) के प्रशासन द्वारा, एचएसवी-टीके व्यक्त कोशिकाओं चुनिंदा ablated हैं. इन सेल लाइनों के आधार पर, Vegfr2-Fluc-KI चूहों में एक ट्यूमर असर मॉडल बनाया गया है कि एक प्रयोगात्मक मॉडल ट्यूमर प्रगति और विवो में ट्यूमर एंजियोजेनेसिस ब्रिजिंग के रूप में कार्य करता है.

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Protocol

प्रयोगों को अनुसंधान उद्देश्यों के लिए पशुओं के उपयोग से संबंधित राष्ट्रीय और संस्थागत नियमों का अनुपालन करना चाहिए। प्रयोगों को पूरा करने के लिए अनुमतियाँ प्राप्त की जानी चाहिए। जानवरों के उपचार और अध्ययन की प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं Nankai विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति दिशानिर्देश है कि पशु देखभाल के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) द्वारा अनुमोदित के लिए दिशा निर्देशों के अनुरूप का पालन करें.

1. LV-Rluc-RFP (आरआर) और LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) lentiviral पैकेजिंग और उत्पादन

नोट: PLV-RR प्रमोटर EF1 के तहत Renilla luciferase (Rluc) और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) के जीन दृश्यों किया जाता है, जबकि PLV-RRT जीन दृश्यों को कोडन Rluc, आरएफपी, और हर्पस सिंप्लेक्स वायरस छोटा थाइमिडीन kinase (HSV-ttk) किया जाता है ( चित्र 2)

  1. बीज 1 x 106 293T कोशिकाओं में से एक अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से थाली और संस्कृति में रात भर में एक humidified इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त.
  2. लिपोसोम निलंबन तैयार करें: लिपोसोम के 7.5 डिग्री सेल्सियस और न्यूनतम आवश्यक मध्यम (एमईएम) के 0.25 एमएल को कमरे के तापमान (आरटी) में 5 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद 1.5 एमएल ट्यूब में मिलाएं ताकि लिपोसोम समान रूप से तितर-बितर किए जा सके।
  3. DNAs समाधान (DNAs-RR) को अलग-अलग, PLV-RR वेक्टर और सहायक प्लाज्मिड को 1.5 एमएल ट्यूब में 0.25 एमएल एमईएम में जोड़ें जैसा कि तालिका 1में वर्णित है।
  4. liposome/DNAs-RR यौगिक प्राप्त करें: धीरे से तैयार liposome निलंबन ड्रॉप में DNAs-आरआर समाधान जोड़ें ड्रॉप द्वारा और 20 मिनट के लिए आर टी पर इनक्यूबेट तो डीएनए बांड होंठ झिल्ली के लिए.
  5. DMEM के 1 एमएल के साथ 293T कोशिकाओं के माध्यम को बदलें जिसमें 10% एफबीएस है और 293T कोशिकाओं के माध्यम में liposome/DNAs-RR यौगिक को धीरे से जोड़ें।
  6. 12-16 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटिंग के बाद, 293T कोशिकाओं के माध्यम वाले लिपोसोम/डीएएनएस-आरआर यौगिक को 1 एमएल डीएमईएम के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें 10% एफबीएस और 100 यू/एमएल पेनिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं।
  7. transfection के बाद 48 एच के लिए humidified इनक्यूबेटर में 293T कोशिकाओं culturing जारी रखें। फिर, 293T कोशिकाओं के supernatant इकट्ठा करने और 293T कोशिकाओं गोली के लिए 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर माध्यम centrifuge. lentivirus-RR (LV-RR) को 1.5 एमएल बाँझ पॉलीप्रोपाइलीन स्टोरेज ट्यूब में स्थानांतरित करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: एक Biosafety स्तर 2 (BSL-2) सुविधा रिकॉमबिनेंट lentivirus के साथ काम करने के लिए आवश्यक है.
  8. 1-1-7 चरणों को दोहराएँ तथा pLV-RRT सदिश के स्थान पर pLV-RRT सदिश का चरण 1.3 में उपयोग करें ताकि lentivirus-RRT (LV-RRT) प्राप्त किया जा सके। -80 डिग्री सेल्सियस पर एलवी-आरआरटी को संग्रहीत करें।
    नोट: गैर-शुद्ध मसूरीवायरल स्टॉक कुछ मामलों में सेल वृद्धि को बाधित कर सकता है। Lentiviral स्टॉक शुद्ध करने की आवश्यकता हो सकती है. एलवी-आरआर या एलवी-आरआरटी कणों वाले मसूरीवायरल स्टॉक को भंडारण के लिए 1.5 एमएल ट्यूब (1 एमएल प्रति ट्यूब) में विभाजित किया जाना चाहिए ताकि कई मुक्त-थॉव चक्र से बचा जा सके।

2. 4T1 कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के लिए LV-RR और LV-RRT lentiviral transduction

  1. एक 6 अच्छी तरह से थाली में बीज 4T1 कोशिकाओं (5 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) और Roswell पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) 1640 मध्यम के साथ संस्कृति एक humidified इनक्यूबेटर में रात भर 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर.
  2. संस्कृति की थाली से माध्यम निकालें और इसे 1 एमएल ताजा आरपीएमआई 1640 माध्यम के साथ-साथ प्रत्येक वेल में 1 एमएल मसूरीवायरल स्टॉक (एलवी-आरआर या एलवी-आरआरटी) से बदलें। 8 ग्राम/एमएल पॉलीब्रेन जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा lentiviral कणों युक्त मध्यम मिश्रण।
    नोट: कृपया ध्यान रखें कि माध्यम में lentiviral कण होते हैं, जो मानव कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस कर सकते हैं।
  3. आरटी पर 60 मिनट के लिए 1,000 डिग्री ग्राम पर एक अपकेंद्रण में स्पिन transduction समाधान ट्रांसडक्शन दक्षता बढ़ाने में मदद करने के लिए। अपकेंद्रण के बाद, 4-12 एच के लिए संस्कृति 4T1 कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में बनाए रखने।
    नोट: कुछ सेल लाइनों के लिए, polybrene लंबी अवधि की संस्कृति के लिए विषाक्त हो सकता है. इसलिए, विभिन्न कोशिकाओं ट्रांसड्यूसिंग के लिए ऊष्मायन समय अस्थिर हो सकता है। उपयुक्त ऊष्मायन समय ढूँढने के लिए एकाधिक बार कक्ष स्थिति की जाँच करें।
  4. ट्रांसड्यूस्ड 4T1 कोशिकाओं के माध्यम को आरपीएमआई 1640 माध्यम के साथ ताज़ा करें जिसमें 10% एफबीएस और 100 यू/एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं ताकि मसूरीवायरल कणों और पॉलीब्रेन को हटाया जा सकता है।

3. दवा स्क्रीनिंग और LV-RR और LV-RRT की पहचान 4T1 कोशिकाओं transduced

  1. निम्नलिखित चरणों के रूप में LV-RR या LV-RRT द्वारा किए गए बीएसडी प्रतिरोध जीन के अनुसार blasticidin (BSD) युक्त मध्यम युक्त ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं का चयन करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं जो आरएफपी सकारात्मक हैं एलवी-आरआर या एलवी-आरआरटी द्वारा किए गए आरएफपी जीन के अनुसार प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा चुना जा सकता है।
  2. 48 ज ट्रांसडक्शन के बाद, चयन माध्यम के साथ 1:3 से 1:4 के अनुपात में 4T1 कोशिकाओं को पारित करना (आरपीएमआई 1640 माध्यम जिसमें 10% एफबीएस, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 5 डिग्री/ हर 2 या 3 दिन में माध्यम बदलें।
    नोट: इष्टतम बीएसडी एकाग्रता सेल लाइन से सेल लाइन के लिए भिन्न हो सकते हैं। इसलिए, मारने वक्र का एक पायलट प्रयोग प्रारंभिक प्रयोग से पहले बीएसडी के इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए.
  3. 7 दिनों के बाद दवा स्क्रीनिंग, LV-RR ट्रांसड्यूस्ड 4T1 कोशिकाओं (4T1-आरआर) और LV-RRT ट्रांसड्यूस 4T1 कोशिकाओं (4T1-RRT) फ्लोरोसेंट उल्टे चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करते हैं। RFP+ 4T1 कोशिकाओं और दृष्टि के तीन क्षेत्रों में सभी 4T1 कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए RFP सकारात्मक अनुपात का अनुमान लगाने के लिए, क्रमशः (चित्र2).
    नोट: वैकल्पिक रूप से, ट्रांसड्यूस ्ड 4T1 कोशिकाओं के आरएफपी सकारात्मक अनुपात प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पहचाना जा सकता है।
  4. कोशिका संख्याओं और रेनिला संकेतों के बीच रैखिक संबंध का पता लगाने के लिए जीवित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके 4T1-RR कोशिकाओं और 4T1-RRT कोशिकाओं के रेनिला संकेतों को मापें (चित्र 3)।
  5. 1:3 और 1:4 के बीच विभाजन अनुपात पर चयन माध्यम के साथ बीएसडी-स्क्रीन 4T1-आरआर और 4T1-RRT कोशिकाओं का विस्तार करें और तरल नाइट्रोजन में सेल लाइन स्टॉक स्टोर करें।

4. Vegfr2-Fluc-KI चूहों और ट्यूमर असर माउस मॉडल

नोट: ट्रांसजेनिक Vegfr2-Fluc-KI चूहों, 6-8 सप्ताह पुराने और महिला, इस प्रयोग में उपयोग किया जाता है गैर आक्रामक रूप से BLI द्वारा विवो में एंजियोजेनेसिस की निगरानी.

  1. संस्कृति 4T1-आरआर कोशिकाओं और 4T1-आरआरटी कोशिकाओं में 60 मिमी पेट्री व्यंजन में एक humidified इनक्यूबेटर के साथ 5% सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस पर, क्रमशः। जब कोशिकाओं 80% संगम पर हैं, मध्यम निकालें और फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ कुल्ला.
  2. पीबीएस निकालें और क्रमशः 0.25% trypsin-0.53 m EDTA समाधान का एक अतिरिक्त 2 एमएल जोड़ें। आरटी पर पकवान रखें (या 37 डिग्री सेल्सियस पर) जब तक कोशिकाओं को अलग.
  3. 10% एफबीएस युक्त ताजा माध्यम के 5-10 एमएल जोड़ें, फिर क्रमशः 4T1-RR और 4T1-RRT कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में पुन: असाइन करने के लिए कोशिकाओं को वितरित करें। एक गिनती कक्ष का उपयोग कर 4T1 कोशिकाओं के दो प्रकार की गणना और आरपीएमआई 1640 माध्यम में 1 x 106 प्रति 100 डिग्री सेल्सियस की एकाग्रता पर सेल निलंबन तैयार करते हैं।
  4. 1 L/min. की प्रवाह दर के साथ संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में 100% ऑक्सीजन में 1%-3% isoflurane के साथ Vegfr2-Fluc-KI चूहों Anesthetize. संज्ञाहरण की स्थिति की पुष्टि करने के लिए माउस के चुटकी प्रतिक्रिया की निगरानी करें. फिर, निर्जलीकरण को रोकने के लिए माउस की आंखों में नेत्र मलम लागू करें।
  5. कक्ष और नाक को नकने की स्थिति से माउस निकालें. पूरी तरह से बिजली शेवर और बालों को हटाने क्रीम का उपयोग करके माउस के कंधे के बालों को हटा दें, जो शल्य क्षेत्र का एक अच्छा दृश्य प्रदान कर सकता है और निम्नलिखित प्रयोगों में BLI संकेतों को अवरुद्ध करने से बचें।
  6. उप-cutaneously 4T1-आरआर कोशिकाओं (1 x 106 कोशिकाओं पर एक 100 $L कुल मात्रा) और 4T1-RRT कोशिकाओं (1 x 106 कोशिकाओं को एक 100 $L कुल मात्रा में) प्रत्येक माउस के बाएँ और दाएँ कंधों में इंजेक्ट करें, क्रमशः (दिन 0 के रूप में रिकॉर्ड). थर्मल समर्थन के साथ वसूली क्षेत्र में चूहों प्लेस जब तक पूरी तरह से बरामद.
  7. 4T1-आरआर और 4T1-RRT कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के बाद, चूहों ट्यूमर असर हर दिन कर रहे हैं कि यह जाँच करने के लिए ट्यूमर जनता को छूने (चित्र S1) . दिन में 7 के बाद प्रत्यारोपण, intraperitoneally इंजेक्शन 50 mg/kg ganciclovir (GCV) ट्यूमर असर चूहों को प्रयोग के अंत तक प्रति दिन दो बार.
    नोट: इस प्रयोग से पहले, 4T1-RRT कोशिकाओं पर GCV के cytotoxic का पता लगाया जाना चाहिए. जीसीवी की हत्या दक्षता का मूल्यांकन सीवी की विभिन्न सांद्रता के साथ सेल काउंटिंग परख द्वारा किया जा सकता है (चित्र S2) ।
  8. दिन 0, 3, 7, 14, और 21 4T1 प्रत्यारोपण के बाद, ट्यूमर के विकास और ट्यूमर असर चूहों के एंजियोजेनेसिस की निगरानी और दोनों Rluc और Fluc इमेजिंग द्वारा आकलन (चित्र 4) .

5. ट्यूमर की दोहरी bioluminescence इमेजिंग (Rluc) और एंजियोजेनेसिस (Fluc)

  1. जीवित इमेजिंग सिस्टम खोलें, जीवित इमेजिंग सॉफ्टवेयर को प्रारंभ करें, और फिर सिस्टम को प्रारंभ करें।
    नोट: सिस्टम प्रारंभ करने के लिए चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा -90 डिग्री सेल्सियस के लिए इमेजिंग शुरू करने में सक्षम करने से पहले शांत करने के लिए कुछ मिनट लगेंगे। सीसीडी कैमरा ठंडा है जब तापमान हरे रंग की हो जाएगी.
  2. निम्न कैमरा सेटिंग्स का उपयोग करें:
    Luminscence और फोटो की जाँच करें.
    ओवरले की जाँच करें.
    Luminscence सेटिंग्स:
    एक्सपोजर समय सामान्य स्थितियों में ऑटो सेट करता है।
    Binning सेट करने के लिए 8.
    F/स्टॉप सेट करने के लिए 1.
    उत्सर्जन फ़िल्टर सेट खोलें.
    फोटो सेटिंग्स:
    बाइनिंग मध्यम करने के लिए सेट करता है।
    F/स्टॉप सेट करने के लिए 8.
    IVIS सिस्टम सेटिंग्स:
    देखने के क्षेत्र: सी ] 1 माउस दृश्य, D ]5 चूहों को देखने.
    विषय ऊंचाई 1.5 सेमी सेट करता है।
  3. चूहों का वजन करें और रिकॉर्ड करें और coelenterazine की मात्रा की गणना (सीटीजेड; 2.5 मिलीग्राम/kg) और डी-ल्यूसिफरिन (150 मिलीग्राम/किलोग्राम) की आवश्यकता है।
  4. ट्यूमर असर माउस द्वारा एनेस्थेटाइज़ करें 1%-3% isoflurane में 100% ऑक्सीजन संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में 1 L/min. की प्रवाह दर के साथ माउस के पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया की निगरानी संज्ञाहरण की स्थिति की पुष्टि करने के लिए. फिर, कॉर्निया क्षति से बचने के लिए दोनों आंखों पर चिकनाई नेत्र मरहम की एक बूंद वितरित करें।
  5. माउस के रेट्रोबुलबार में प्रति किलोग्राम शरीर के वजन में 2.5 मिलीग्राम सीटीजेड (3.33 मिलीग्राम/एमएल) इंजेक्शन (उदाहरण के लिए, 20 ग्राम माउस के लिए, इंसुलिन सिरिंज सुई का उपयोग करके 50 डिग्री सेल्सियस के लिए 15 डिग्री सेल्सियस का इंजेक्शन।
  6. धीरे संज्ञाहरण शंकु में अपनी नाक के साथ कैमरा कक्ष में ट्यूमर असर माउस ले जाएँ और BLI संकेतों दूर फीका जब तक 4T1 कोशिकाओं से Rluc संकेतों को पाने के लिए तुरंत माउस पृष्ठीय के कई चित्रों के अधिग्रहण।
    नोट: सीटीजेड का आधा जीवन बहुत कम है और Rluc ड्रॉप के संकेत ों के रूप में $ 30 s. यह सुनिश्चित करने के लिए किसी भी अवशिष्ट Rluc संकेत नष्ट हो गया है और Rluc और Fluc इमेजिंग के बीच अंतराल से अधिक होना चाहिए 10 मिनट.
  7. एक इंसुलिन सिरिंज सुई का उपयोग करके 150 मिलीग्राम/किलोग्राम डी-ल्यूसिफेरिन (30 मिलीग्राम/एमएल) इंजेक्ट करते हुए (उदाहरण के लिए, 20 ग्राम माउस के लिए, 100 डिग्री सेल्सियस इंजेक्ट करने के लिए 3 मिलीग्राम D-luciferin)। Fluc इमेजिंग से पहले 10 मिनट के लिए आरटी पर माउस रखें.
  8. इस माउस को संज्ञाहरण शंकु में अपनी नाक के साथ कैमरे के कक्ष में फिर से ले जाएँ और एंजियोजेनेसिस से फ्लूक संकेतों को प्राप्त करने के लिए माउस पृष्ठीय के कई चित्र प्राप्त करें।
    नोट: प्रवाह गतिज मॉनिटर प्रत्येक माउस के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए जब तक संकेत अधिकतम तक पहुँचने और फिर फीका.
  9. प्रत्येक माउस के लिए 5.4-5.8 क्रियाएँ चरणों को दोहराएँ.
  10. इमेजिंग के बाद, चूहों को गर्म वातावरण में तब तक बनाए रखें जब तक कि जानवर न उठें।
  11. वांछित समय बिंदु पर (दिन 3, 7, 14, और 21), समय के साथ ट्यूमर प्रगति और ट्यूमर angiogenesis का पता लगाने के लिए प्रक्रियाओं (चरण 5.3-5.10) के ऊपर दोहराएँ।
  12. Rluc और Fluc का विश्लेषण ट्यूमर प्रगति में ट्यूमर विकास और एंजियोजेनेसिस के बीच संबंधों की जांच करने के लिए डेटा का संकेत है।
    नोट: ब्याज के क्षेत्रों (ROI) जो BLI संकेत साइट को कवर डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है. प्रत्येक समय बिंदु के लिए फोटॉनों/सेकंड/सेमी2/ स्टेराडियन (p/s/cm2/sr) की इकाई में ROI की कुल चमक (फोटोन) को मापें।
  13. ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ROI के Rluc और Fluc संकेतों का विश्लेषण करें (चित्र 4)।

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Representative Results

इस प्रयोग में, एक स्तन कैंसर माउस मॉडल 4T1 कोशिकाओं का उपयोग कर ट्यूमर विकास और ट्यूमर एंजियोजेनेसिस के बीच संबंधों की जांच करने के लिए स्थापित किया गया था (चित्र 1)। सबसे पहले, दो मसूरी वायरस को पैक किया गया था, जिसमें क्रमशः 7 की सूचना के रूप में Rluc/RFP (LV-RR) और Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT) व्यक्त जीन अनुक्रम किए गए थे। फिर, 4T1-आरआर और 4T1-आरआरटी नाम की दो अलग-अलग 4T1 सेल लाइनें, क्रमशः एलवी-आरआर और एलवी-आरआरटी को ट्रांसड्यूस करके बनाई गई थीं। 3 दिनों के लिए दवा स्क्रीनिंग के बाद, 4T1-आरआर और 4T1-RRT ट्रांसडक्शन दक्षता का पता लगाने के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया। जैसा कि फ्लोरोसेंट इमेजिंग में दिखाया गया है, 4T1-RR या 4T1-RRT कोशिकाओं में से 99% से अधिक आरएफपी सकारात्मक थे, जिसने सुझाव दिया कि 4T1-आरआर और 4T1-आरआरटी सेल लाइनों को एलवी-आरआर और एलवी-आरआरटी ट्रांसडक्शन (चित्र2ए, बी) द्वारा स्थापित किया गया था। इस बीच, वहाँ कोई मतभेद कोशिका आकृति विज्ञान और जंगली प्रकार 4T1 और 4T1-आरआर या 4T1-RRT के बीच विकास संस्कृति के समय के दौरान पाया गया था. सारांश में, हम सफलतापूर्वक सेलुलर राज्यों को प्रभावित किए बिना 4T1-RR और 4T1-RRT सेल लाइनों का निर्माण किया. बाद में, 4T1-आरआर और 4T1-आरआरटी कोशिकाओं के bioluminescence इमेजिंग (BLI) Rluc संकेतों का पता लगाने के लिए कब्जा कर लिया गया था। BLI छवियों से पता चला कि दोनों 4T1-आरआर और 4T1-RRT कोशिकाओं एक ही शक्ति के मजबूत bioluminescent संकेत उत्सर्जित (चित्र 3A). इसके अलावा, Rluc संकेतों और सेल संख्याओं के बीच रैखिक संबंध दोनों 4T1-RR (आर2 $ 0.9974) और 4T1-RRT कोशिकाओं (आर2 $ 0.9989) में देखा गया, जो Rluc संकेतों का सुझाव दिया vivo में ट्यूमर विकास दर्पण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्र3B) ).

इस आधार पर, ट्रांसजेनिक Vegfr2-Fluc-KI चूहों का उपयोग कर, स्तन कैंसर बढ़ता है के रूप में एंजियोजेनेसिस की जांच करने के लिए एक ट्यूमर असर माउस मॉडल स्थापित किया गया था। murine में Vegfr2 अनुक्रम के पहले exon में Fluc अनुक्रम दस्तक का एक परिणाम के रूप में, Fluc व्यक्त किया गया था (जो bioluminescent संकेतों के रूप में प्रकट होता है) ट्यूमर प्रगति के दौरान चूहों में एंजियोजेनेसिस के समान तरीके से. 4T1-आरआर और 4T1-RRT कोशिकाओं के subcutaneous इंजेक्शन के बाद, सेल विकास दिन 0, 3, 7, 14, और 21 में सीटीजेड की उपस्थिति में Rluc संकेतों द्वारा निगरानी की गई थी (चित्र 4A) . एक ही समय में, ट्यूमर के विकास से प्रेरित एंजियोजेनेसिस का मूल्यांकन एक ही माउस में डी-लुसिफेरिन की उपस्थिति में फ्लूक संकेतों द्वारा किया गया था। दिन में 7 के बाद 4T1-आरआर और 4T1-RRT के प्रत्यारोपण, GCV ट्यूमर असर चूहों को प्रशासित किया गया था, जो 4T1-RRT कोशिकाओं को मरने के लिए नेतृत्व किया. BLI छवियों से पता चला कि Rluc संकेत 4T1-आरआर और 4T1-RRT कोशिकाओं के GCV उपचार से पहले एक ही दर पर वृद्धि हुई; हालांकि, 4T1-RRT कोशिकाओं के Rluc संकेत तेजी से पोस्ट जीसीवी उपचार में कमी आई। जबकि 4T1-RR के Rluc संकेत अभी भी धीरे से वृद्धि हुई है. जाहिर है, एक महत्वपूर्ण सापेक्षता Rluc संकेतों और ट्यूमर आकार के बीच अस्तित्व में (चित्र S1) .

इस बीच, Fluc छवियों के अनुसार, Fluc संकेत Rluc वृद्धि के अनुसार वृद्धि हुई है और Rluc गिरावट के बाद कमी आई (चित्र 4B). इन परिणामों का सुझाव है कि ट्यूमर angiogenesis और ट्यूमर के विकास के बीच एक सीधा संबंध था. दवा जीसीवी द्वारा प्रेरित ट्यूमर कोशिकाओं की मृत्यु से ट्यूमर एंजियोजेनेसिस का अवरोध हो सकता है (चित्र 4 सी) . यह प्रदर्शित करने के लिए कि फ्लूक सिग्नल वास्तव में ट्यूमर के भीतर एंजियोजेनेसिस का पता लगा रहा था, जानवरों को vasculature के हिस्टोलॉजिकल सबूत प्राप्त करने के लिए 21 दिन में इमेजिंग खत्म करने के बाद बलिदान कर दिया गया था। विरोधी VEGFR2 इम्यूनोस्टेनिंग की छवियों के अनुसार, 4T1-आरआर ट्यूमर ऊतक में microvascular संरचनाओं काफी अधिक स्पष्ट थे 4T1-RRT ट्यूमर ऊतक, जो फ्लूक संकेतों के साथ संगत थे (चित्र 5) में. सारांश में, इस दोहरी bioluminescence इमेजिंग रणनीति ट्यूमर प्रगति और एंजियोजेनेसिस की निगरानी के रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर के विकास और ट्यूमर microenvironment में एंजियोजेनेसिस पर विभिन्न दवाओं के विरोधी ट्यूमर प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: ट्यूमर विकास और एंजियोजेनेसिस के दोहरी bioluminescence इमेजिंग के Schematic नक्शा. एलवी-आरआर और एलवी-आरआरटी द्वारा ट्रांसड्यूस की गई 4T1 कोशिकाओं को Vegfr2-Fluc-KI ट्रांसजेनिक चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था। ट्यूमर के विकास के दौरान, Rluc और Fluc के BLI एक साथ ट्यूमर विकास और एंजियोजेनेसिस स्थिति को प्रतिबिंबित करने के लिए एक ही माउस में प्रदर्शन किया गया, क्रमशः. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: 4T1-आरआर और 4T1-आरआरटी कोशिकाओं की स्थानांतरण दक्षता फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा पहचान की। (क) पीएलवी-आरआर के आरेखीय आरेखन से पता चला कि प्रवर्तक EF1 के अंतर्गत Rluc और RFP अनुक्रमव्यक्त किए गए थे। देखने के एक क्षेत्र के उज्ज्वल और फ्लोरोसेंट छवियों से पता चला कि 4T1-आरआर कोशिकाओं आरएफपी सकारात्मक थे. (बी) पीएलवी-आरआरटी के आरेख आरेखण से पता चला कि एकल प्रवर्तक EF1] सक्रिय Rluc, आरएफपी, और एचएसवी-टी टी के जीन। देखने के एक क्षेत्र के उज्ज्वल और फ्लोरोसेंट छवियों से पता चला कि 4T1-RRT कोशिकाओं आरएफपी सकारात्मक थे. स्केल बार ] 200 $m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ट्रांसड्यूस्ड 4T1-आरआर और 4T1-आरआरटी कोशिकाओं के Bioluminscence इमेजिंग। (क) सीटीजेड की उपस्थिति में 4T1-RR और 4T1-RRT कोशिकाओं का बायोल्युमिनेसन इमेजिंग। (बी) 4T1-RR और 4T1-RRT कोशिकाओं के मापा Rluc संकेतों सेल संख्या के साथ एक रैखिक संबंध बनाए रखा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एक जीवित जानवर में ट्यूमर के विकास और एंजियोजेनेसिस की गतिशील प्रक्रियाओं का दृश्य। (क) प्रयोग का प्रवाह आरेख और Rluc और Fluc का दोहरे BLI का पता लगाना। (बी) एक ट्रांसजेनिक माउस में ट्यूमर विकास के दौरान ट्यूमर प्रगति और एंजियोजेनेसिस के Fluc छवियों के प्रतिनिधि Rluc छवियों। (सी) Rluc संकेतों के मापन का प्रदर्शन किया है कि प्रत्यारोपित ट्यूमर कोशिकाओं तेजी से वृद्धि हुई है, जबकि 4T1-RRT कोशिकाओं काफी GCV प्रशासन के बाद पीछे हट गए थे. (डी) Fluc संकेतों की मात्रा से पता चला है कि एंजियोजेनेसिस ट्यूमर सेल प्रत्यारोपण के बाद हुई, ट्यूमर विकास और जीसीवी द्वारा प्रेरित मौत के साथ एक समानांतर प्रवृत्ति के बाद. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: VEGFR2 दिन 21 में 4T1-आरआर और 4T1-RRT ऊतकों के इम्यूनोस्टेनिंग। ट्यूमर ऊतकों वर्गों के प्रतिनिधि छवियों VEGFR2 के लिए दाग (हरा) दिन 21 पर. नाभिक DAPI (नीले) के साथ counterstained थे. स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा S1: विवो में ट्यूमर प्रगति के दौरान ट्यूमर आकार का वक्र। 4T1-आरआर और 4T1-RRT कोशिकाओं के ट्यूमर आकार प्रत्यारोपण के बाद वृद्धि हुई है, लेकिन 4T1-RRT कोशिकाओं के ट्यूमर आकार के बाद GCV उपचार कम शुरू कर दिया. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

चित्र S2: 4T1-RRT कोशिकाओं पर GCV के Cytotoxic प्रभाव. 4T1-RRT कोशिकाओं GCV की ऊंचा एकाग्रता के साथ मर गया. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

चित्र S3: फेफड़ों में 4T1-RR कोशिकाओं की BLI छवि. 4T1-आरआर कोशिकाओं की पूंछ नस इंजेक्शन के बाद, कोशिकाओं के Rluc संकेत BLI द्वारा पता लगाया गया था. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

एलवी-आरआर और एलवी-आरआरटी पैकेजिंग शर्तें
घटक एमईएम माध्यम 3-प्लाज़्मिड तंत्र 4-प्लाज़्मिड प्रणाली
पीएलवी-आरआर/पीएलवी-आरआरटी वेक्टरए 0.25 एमएल 1.5 $g 1.5 $g
गैग-पोल + रेव अभिव्यक्ति वेक्टरबी  1.0 $g
गैग-पोल अभिव्यक्ति वेक्टरसी 0.75 डिग्री
रेव अभिव्यक्ति सदिशडी 0.3 $g
VSV-जी अभिव्यक्ति वेक्टरई 0.5 डिग्री 0.45 ग्राम
Liposome 0.25 एमएल 7.5 जेडएल 7.5 जेडएल

तालिका 1: 293T कोशिकाओं में एलवी-आरआर और एलवी-आरआरटी वायरल स्टॉक के उत्पादन के लिए मसूरीवायरल पैकेजिंग प्रणाली की संक्रमण की स्थिति। (क) पीएलवी-सी डी एन ए वेक्टर क्रमशः पीएलवी-आरआर और पीएलवी-आरआरटी था। (बी) गैग-पोल + रेव अभिव्यक्ति वेक्टर या तो पीसीएमवी-डेल्टाR8.91 (टीआरसी) या psPAX2 (एडजीन) हो सकता है। (सी) गैग-पोल अभिव्यक्ति वेक्टर pMDLg/pRRE (Addgene), pLP1 (Invitrogen), और PPACKH1-GAG (एसबीआई) में से किसी एक का चयन कर सकते हैं। (डी) रेव एक्सप्रेशन वेक्टर pRSV-REV (एडजीन), PLP2 (Invitrogen), या PPACKH1-REV (एसबीआई) होना चाहिए। (ई) वीएसवी-जी अभिव्यक्ति वेक्टर pMD.G (TRC), pMD2.G (Addgene), pCMV-VSV-G (Addgene), pVSV-G (एसबीआई), या PLP/VSVG (Invitrogen) का चयन कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, तीन-प्लाज्मिड प्रणाली का उपयोग किया गया था, जिसमें psPAX2, pMD2.G, और PLV-RR या PLV-RRT शामिल हैं।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, एक गैर इनवेसिव दोहरी BLI दृष्टिकोण ट्यूमर के विकास और एंजियोजेनेसिस की निगरानी के लिए वर्णित है. BLI रिपोर्टर प्रणाली पहले विकसित की है, Rluc इमेजिंग द्वारा विवो में ट्यूमर प्रगति और प्रतिगमन पर नज़र रखने के लिए एचएसवी-ttk/GCV आत्महत्या जीन युक्त. इस बीच, ट्यूमर एंजियोजेनेसिस Fluc इमेजिंग के माध्यम से Vegfr2-Fluc-KI चूहों का उपयोग कर मूल्यांकन किया है. इस ट्यूमर असर माउस मॉडल उच्च प्रासंगिकता, reproducibility, और translationability के साथ एक एकल माउस में दोहरी BLI द्वारा सतत और गैर इनवेसिव ट्रैकिंग ट्यूमर विकास और ट्यूमर एंजियोजेनेसिस के लिए एक व्यावहारिक मंच प्रदान करने में सक्षम है।

एंजियोजेनेसिस दीर्घकालिक ट्यूमर प्रगति से संबंधित है और इस प्रकार उच्च महत्व1है। ट्यूमर प्रगति और एंजियोजेनेसिस के बीच संबंधों का अध्ययन करना आवश्यक है। विरोधी angiogenesis रणनीतियों की एक बढ़ती हुई संख्या कैंसर के इलाज के लिए जांच की गई है, जो सही उपचार परिणामों का आकलन करने के लिए कल्पना की निगरानी दृष्टिकोण पर भरोसा करते हैं. इसके अलावा, पारंपरिक रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेपी के बाद ट्यूमर ऊतक का नवसंवहनीकरण ऑन्कोलॉजी अनुसंधान12,13,14का एक अन्य लोकप्रिय क्षेत्र है। इन अध्ययनों के एक पशु मॉडल है कि ट्यूमर के विकास और वास्तविक समय में angiogenesis की निगरानी की अनुमति की आवश्यकता है. पारंपरिक पशु मॉडल में ट्यूमर के ऊतकों के रोग परिवर्तन आमतौर पर हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा पर निर्भर होते हैं, जिसके लिए पशु बलि की आवश्यकता होती है। ये दोहरी BLI माउस मॉडल मदद बड़े त्रुटि पर्वतमाला और जानवरों के बलिदान से उच्च लागत की समस्याओं का समाधान.

इस दोहरी BLI माउस मॉडल में, सबसे महत्वपूर्ण कदम एक ही समय में कोशिकाओं और एंजियोजेनेसिस का पता लगाने के लिए क्रमशः Fluc और Rluc सहित दो प्रकार के luciferases का उपयोग कर रहा है। इन दो luciferases के सब्सट्रेट विशिष्टता यह एक एकल होस्ट में BLI के दो प्रकार के प्रदर्शन करने के लिए संभव बनाता है। इसके अलावा, coelenterazine के आधे जीवन (Rluc के सब्सट्रेट) बहुत कम है, जो Rluc संकेतों में परिणाम जल्दी से दूर लुप्त होती अगले Fluc संकेत का पता लगाने को प्रभावित किए बिना15. इसलिए, ऑपरेटिंग प्रक्रिया में, Rluc इमेजिंग डी-luciferin के लंबे समय तक आधे जीवन के कारण Fluc इमेजिंग से पहले लागू किया जाना चाहिए (Fluc के सब्सट्रेट). इसके अलावा, substrates के ऊष्मायन समय पता लगाना सही BLI छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. substrates के चयापचय विवो में substrates की एकाग्रता को बदल सकते हैं, BLI संकेत तीव्रता में भिन्नता के लिए अग्रणी.

प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति के लिए मालिक, कुछ सेलुलर और subcellular घटनाओं के vivo ट्रैकिंग में के लिए अन्य इमेजिंग रूपरेखा इस तरह के फ्लोरोसेंट इमेजिंग, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), और positron के रूप में पूर्व नैदानिक और नैदानिक शोध में लागू किया गया है उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी)16,17. इन इमेजिंग रणनीतियों के साथ तुलना में, bioluminescence इमेजिंग उच्च संवेदनशीलता है, मजबूत विशिष्टता, और सटीक माप, रहने वाले इमेजिंग अध्ययन के क्षेत्र में अपनी अनूठी श्रेष्ठता दिखा15. Rluc इमेजिंग नियोजित ट्यूमर के विकास और एचएसवी-ttk/GCV प्रोड्रग प्रणाली के विरोधी ट्यूमर प्रभाव के लिए अनुमति देता है एक जीवित जानवर में गतिशील रूप से कल्पना की जा करने के लिए। अधस्त्वक् ऊतकों की निगरानी के अलावा, Rluc अन्य अनुसंधान में BLI प्रौद्योगिकी द्वारा फेफड़ों में कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एक माउस में 4T1-आर आर की पूंछ नस इंजेक्शन के बाद, हम रहने वाले इमेजिंग प्रणाली में इस माउस को स्थानांतरित कर दिया है सीटीजेड के प्रशासन के बाद Rluc संकेतों का पता लगाने के लिए. Rluc संकेत की छवि से पता चला कि इंजेक्शन कोशिकाओं को मुख्य रूप से फेफड़ों में स्थित थे (चित्र S3. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, Rluc रिपोर्ट जीन विभिन्न स्थानों में विभिन्न कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने, जो कैंसर जीव विज्ञान अनुसंधान में इस माउस मॉडल का पूरा उपयोग प्रोत्साहित कर सकते हैं.

इन लाभों के अलावा, BLI प्रौद्योगिकी विशिष्ट अणुओं की अभिव्यक्ति के स्तर को समझ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पहले, फ्लोरोफोर्स रिपोर्टर जीन, जो प्रासंगिक promotors के तहत व्यक्त कर रहे हैं, subcutaneous ट्यूमर में पोत के विकास को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ट्यूमर प्रगति के दौरान, संवहनी संरचना और अणुओं शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित खिड़की कक्षों के माध्यम से चूहों में मनाया जा सकता है. हालांकि, इस विधि अभी भी अपरिहार्य आक्रमण, fluorophore शमन, और मजबूत पृष्ठभूमि शोर सहित सीमाएं हैं. Vegfr2-Fluc-KI माउस में स्थापित ट्यूमर असर माउस मॉडल Vegfr2 की अभिव्यक्ति के स्तर के एक गैर इनवेसिव अवलोकन बनाता है, जो ट्यूमर एंजियोजेनेसिस में सबसे महत्वपूर्ण अणु है। इस बीच, BLI छवियों शोर के बिना महान विशिष्टता प्रदर्शित करते हैं. दोहरी BLI माउस मॉडल ट्यूमर प्रगति और प्रतिगमन में संभावित आणविक तंत्र का अध्ययन करने में व्यापक अनुप्रयोगों हो सकता है.

एलआरआई प्रौद्योगिकी, Rluc की अभिव्यक्ति पर आधारित (उत्सर्जन 480 एनएम) और Fluc (उत्सर्जन 562 एनएम), vivo रोग मॉडल में की एक संख्या में अपनाया गया है. विवो में बीआई प्रौद्योगिकी का व्यापक उपयोग गहरे ऊतकों का पता लगाने में 600 एनएम से नीचे तरंगदैर्ध्य पर bioluminescence की कम संवेदनशीलता के कारण प्रतिबंधित किया गया है. यह प्रकाश के अवशोषण और प्रकीर्णन के कारण होता है, जो ऊतक के दस गुना सेंटीमीटर तक पता लगाने योग्य संकेत को कम करता है। इस सवाल का समाधान करने के लिए, कुछ शोधकर्ताओं ने Fluc के लाल-उत्सर्जक वेरिएंट पर अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया है जो 600 एनएम18से ऊपर प्रकाश का उत्सर्जन करता है। क्योंकि प्रकाश के अवशोषण और प्रकीर्णन उल्लेखनीय Fluc18,19के इन वेरिएंट का उपयोग करके कम किया जा सकता है , luciferase वेरिएंट के आवेदन ऑन्कोलॉजी अनुसंधान के एक बड़े क्षेत्र के लिए इस प्रोटोकॉल का विस्तार होगा।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2017YFA0103200), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81671734), और तियानजिन विज्ञान और प्रौद्योगिकी सहायता कार्यक्रम की प्रमुख परियोजनाओं (18YF]CSY00010), मौलिक अनुसंधान कोष के लिए द्वारा समर्थित किया गया था केन्द्रीय विश्वविद्यालय (63191155)। हम ग्लोरिया Nance संशोधन है, जो हमारी पांडुलिपि की गुणवत्ता में सुधार लाने में मूल्यवान थे स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA Gibco 25200072
1.5 mL Tubes Axygen Scientific MCT-105-C-S
15 mL Tubes Corning Glass Works 601052-50
293T ATCC CRL-3216
4T1 ATCC CRL-2539
60 mm Dish Corning Glass Works 430166
6-well Plate Corning Glass Works 3516
Biosafety Cabinet Shanghai Lishen Scientific Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD) Sigma-Aldrich 15205
Cell Counting Kit-8 MedChem Express HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator Thermo Fisher Scientific 4111
Coelenterazine (CTZ) NanoLight Technology 479474
D-luciferin Potassium Salt Caliper Life Sciences 119222
DMEM Medium Gibco C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS) BIOIND 04-001-1A
Fluorescence Microscope Nikon Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV) Sigma-Aldrich Y0001129
Graphics Software GraphPad Software Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles Becton Dickinson 328421
Isoflurane Baxter 691477H
Lentiviral Packaging System Biosettia cDNA-pLV03
Liposome Invitrogen 11668019
Living Imaging Software Caliper Life Sciences Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System Caliper Life Sciences IVIS Lumina II
MEM Medium Invitrogen 31985-070
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning Glass Works R21031399
Polybrene Sigma-Aldrich H9268-1G
RPMI1640 Medium Gibco C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge Thermo Fisher Scientific Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator Haier DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System XENOGEN Corporation 7293

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References

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Zhang, K., Wang, C., Wang, R., Chen, S., Li, Z. Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (150), e59763, doi:10.3791/59763 (2019).

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