Summary
Denne protokollen beskriver etablering av en tumor-bærende mus modell for å overvåke tumorprogresjon og angiogenese i sanntid av dual bioluminesens Imaging.
Abstract
Angiogenese, som en viktig prosess med tumorprogresjon, har blitt et forsknings-hotspot og mål for anti-tumor terapi. Det er imidlertid ingen pålitelig modell for sporing tumorprogresjon og angiogenese samtidig i en visuell og følsom måte. Bioluminesens Imaging viser sin unike overlegenhet i levende Imaging på grunn av sine fordeler med høy følsomhet, sterk spesifisitet, og nøyaktig måling. Presentert her er en protokoll for å etablere en tumor-bærende mus modell ved å injisere en Renilla luciferase-merket murine brystkreft cellelinje 4T1 i transgene mus med Angiogenese-indusert Firefly luciferase uttrykk. Denne musen modell skaffer en kostbar verktøyet å samtidig dataskjerm svulst progresjon og angiogenese inne virkelig-tid av dobbelt bioluminesens tenkelig inne en enkelt musen. Denne modellen kan bli mye brukt i anti-tumor narkotika screening og onkologi forskning.
Introduction
Angiogenese er en viktig prosess i utviklingen av kreft fra små, lokaliserte svulster til større, potensielt metastatisk svulster1,2. Sammenhengen mellom tumor vekst og angiogenese blir en av punktene i vekt på feltet av onkologi forskning. Men tradisjonelle metoder for å måle morfologiske endringer mislykkes i å overvåke tumorprogresjon og angiogenese samtidig i levende dyr ved hjelp av en visualisere tilnærming.
Bioluminesens Imaging (bli) av tumorceller er en spesielt hensiktsmessig eksperimentell metode for å overvåke tumor vekst på grunn av sin ikke-invasiveness, følsomhet, og spesifisitet3,4,5,6 . BLI-teknologi er basert på prinsippet om at luciferase kan katalysere oksidasjon av et bestemt substrat mens emitting bioluminesens. Luciferase uttrykt i implantert tumorceller reagerer med injisert substrat, som kan oppdages av en levende Imaging system, og signaler indirekte reflekterer endringene i celle nummer eller celle lokalisering i vivo6,7.
Med unntak av tumor vekst, kan tumor angiogenese (det kritiske trinnet i kreft progresjon) også bli visualisere gjennom bli-teknologi ved hjelp av Vegfr2-svingninger-KI transgene Mouse8,9,10. Den vaskulære endothelial vekstfaktor (Vegf) reseptor 2 (Vegfr2), en type Vegf reseptor, er stort sett uttrykt i den vaskulære endothelial celler av voksne mus11. I Vegfr2-svingninger-KI transgene mus blir DNA-sekvensen av Firefly luciferase (svingninger) slått inn i den første ekson av den endogene Vegfr2 sekvensen. Som et resultat, svingninger uttrykkes (som vises som BLI-signaler) på en måte som er identisk med nivået av angiogenese i mus. Å vokse utover noen få millimeter i størrelse, den tumor rekrutterer nye vasculatures fra eksisterende blodårer, som svært uttrykker Vegfr2 utløst av vekstfaktorer fra tumorceller1. Dette åpner muligheten for å bruke Vegfr2-svingninger-KI transgene mus til ikke-invasivt overvåke tumor angiogenese av BLI.
I denne protokollen, er en tumor-bærende mus modell etablert for å overvåke tumorprogresjon og angiogenese i en enkelt mus gjennom Firefly luciferase (svingninger) og Renilla luciferase (Rluc) Imaging, henholdsvis (figur 1). En 4T1 cellelinje (4T1-RR) er opprettet som stabilt uttrykker Rluc og rødt fluorescerende protein (RFP) å spore cellevekst ved Rluc Imaging. For ytterligere å undersøke dynamiske endringer av angiogenese i progresjon og regresjon av svulsten, en annen 4T1 cellelinje (4T1-RRT) er opprettet som uttrykker selvmords genet herpes simplex virus avkortet tymidin kinase (HSV-TTK), Rluc, og RFP. Ved administrering av ganciklovir (GCV), HSV-TTK uttrykker celler er selektivt ablated. Basert på disse cellelinjer, en svulst-bærende modell i Vegfr2-svingninger-KI mus er bygget som fungerer som en eksperimentell modell bygge bro tumorprogresjon og tumor angiogenese in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter må være i samsvar med nasjonale og institusjonelle bestemmelser om bruk av dyr til forskningsformål. Tillatelser til å utføre eksperimenter må innhentes. Behandlingen av dyr og eksperimentelle prosedyrer av studien overholder Nankai University Animal Care og bruk komité retningslinjer som samsvarer med retningslinjene for Animal Care godkjent av National Institutes of Health (NIH).
1. LV-Rluc-RFP (RR) og LV-Rluc-RFP-HSV-TTK (RRT) lentiviral emballasje og produksjon
Merk: pLV-RR bærer genet sekvenser av Renilla luciferase (Rluc) og rødt fluorescerende protein (RFP) under arrangøren EF1α, mens pLV-RRT bærer genet sekvenser koding Rluc, RFP og herpes simplex virus avkortet tymidin kinase (HSV-TTK) ( Figur 2).
- Seed 1 x 106 av 293T celler per brønn inn i en 6 brønn plate og kultur overnatter i en fuktet inkubator med 5% co2 ved 37 ° c med Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) inneholder 10% FOSTERETS storfe serum (FBS).
- Forbered liposome suspensjon: Bland 7,5 μL av liposome og 0,25 mL med minimal essensiell medium (MEM) i et 1,5 mL rør etter inkubasjons i 5 min ved romtemperatur (RT) for å spre liposomer likt.
- Forbered DNAs-løsningen (DNAs-RR): separat, tilsett pLV-RR vektor-og hjelpe plasmider til 0,25 mL av MEM i et 1,5 mL rør som beskrevet i tabell 1.
- Skaff liposome/DNAs-RR sammensatte: forsiktig legge til DNAs-RR løsning i forberedt liposome suspensjon dråpe for dråpe og ruge for 20 min ved RT så DNA obligasjoner til lipid membranen.
- Erstatt mediet for 293T-cellene med 1 mL DMEM som inneholder 10% FBS og Legg liposome/DNAs-RR-forbindelsen til mediet for 293T-cellene forsiktig.
- Etter incubating i en fuktet inkubator med 5% CO2 ved 37 ° c for 12 – 16 h, Erstatt liposome/DNAS-RR-forbindelsen som inneholder mediet for 293T-cellene med 1 ml DMEM som inneholder 10% FBS og 100 U/ml penicillin − Streptomycin.
- Fortsett dyrking 293T cellene i fuktet inkubator for 48 h etter transfeksjoner. Deretter samler supernatanten av 293T cellene og sentrifuger mediet på 300 x g i 5 min til pellet de 293T cellene. Overfør lentivirus-RR (LV-RR)-inneholdende supernatanten til 1,5 mL sterile polypropylen lagrings rør og oppbevares ved-80 ° c.
Merk: en biosafety Level 2 (BSL-2) anlegget er nødvendig for å arbeide med rekombinant lentivirus. - Gjentagelse skritt 1.1 – 1.7 og bruk pLV-RRT vektor istedet for pLV-RR vektor inne steg 1,3 å få det lentivirus-RRT (LV-RRT). Oppbevar LV-RRT ved-80 ° c.
Merk: ikke-renset lentiviral lager kan hemme cellevekst i noen tilfeller. Lentiviral lager må kanskje renses. Lentiviral bestandene inneholder LV-RR eller LV-RRT partikler bør deles inn i 1,5 mL rør (1 mL per rør) for lagring for å unngå flere fri-tine sykluser.
2. LV-RR og LV-RRT lentiviral Transduction for genuttrykk i 4T1 celler
- Seed 4T1 celler til en 6-brønn plate (5 x 105 celler/brønn) og kultur med Roswell Park Memorial INSTITUTE (RPMI) 1640 medium som inneholder 10% FBS over natten i en fuktet inkubator med 5% co2 ved 37 ° c.
- Fjern mediet fra kulturen plate og erstatte den med 1 mL frisk RPMI 1640 medium samt 1 mL lentiviral lager (LV-RR eller LV-RRT) til hver brønn. Tilsett 8 μg/mL polybrene og bland forsiktig mediet som inneholder lentiviral partikler ved å pipettering opp og ned.
Merk: Vær oppmerksom på at mediet inneholder lentiviral partikler, som kan overfører menneskelige celler. - Spin Transduction løsning i en sentrifuge på 1 000 × g for 60 min ved RT å bidra til å øke Transduction effektivitet. Etter sentrifugering, kultur 4T1 celler for 4 – 12 h og vedlikeholde i en fuktet inkubator med 5% CO2 ved 37 ° c.
Merk: for noen cellelinjer kan polybrene være giftig for lang tids kultur. Derfor kan inkubasjonstid for transducing av forskjellige celler endres. Kontroller celle statusen flere ganger for å finne passende inkubasjonstid. - Oppdater mediet for transduced 4T1-celler med 2 mL RPMI 1640-medium som inneholder 10% FBS og 100 U/mL penicillin − Streptomycin for å fjerne lentiviral partikler og polybrene.
3. Drug screening og identifisering av LV-RR og LV-RRT transduced 4T1 celler
- Velg transduced celler med medium som inneholder blasticidin (BSD) i henhold til BSD-Resistance genet båret av LV-RR eller LV-RRT som følgende trinn beskrevet.
Merk: Alternativt kan transduced celler som er RFP-positive velges av Flow flowcytometri henhold til RFP genet båret av LV-RR eller LV-RRT. - 48 h etter Transduction, passasje 4T1 celler ved forholdet 1:3 til 1:4 med utvalg medium (RPMI 1640 medium som inneholder 10% FBS, 100 U/mL penicillin − Streptomycin og 5 μg/mL BSD). Endre medium hver 2 eller 3 dager.
Merk: den optimale BSD-konsentrasjonen kan variere fra cellelinje til cellelinje. Derfor bør en pilot eksperiment med Kill kurve utføres for å bestemme den optimale konsentrasjonen av BSD før første eksperiment. - 7 dager etter narkotika screening, observere LV-RR transduced 4T1 celler (4T1-RR) og LV-RRT transduced 4T1 celler (4T1-RRT) under fluorescens invertert fase-kontrast mikroskop. Telle antall RFP+ 4T1 celler og alle 4T1 celler i tre synsfelt for å anslå RFP-positive forholdet, henholdsvis (figur 2).
Merk: Alternativt kan det RFP-positive forholdet mellom transduced 4T1-celler identifiseres ved flyt flowcytometri. - Mål det renilla signaler av 4T1-RR celler og 4T1-RRT celler av benytter en lever tenkelig system å merker det lineær slektskap imellom cellen numrene og renilla signaler (skikkelsen 3).
- Utfolde BSD-skjermet 4T1-RR og 4T1-RRT celler med utvalg medium for up forhold imellom 1:3 og 1:4 og lager cellen Line aksjer inne flytende nitrogen.
4. Vegfr2-svingninger-KI mus og tumor-bærende mus modell
Merk: de transgene Vegfr2-svingninger-KI musene, 6-8 uker gamle og kvinnelige, brukes i dette eksperimentet til ikke-invasivt Monitor angiogenese in vivo av BLI.
- Kultur 4T1-RR celler og 4T1-RRT celler i 60 mm Petri retter i en fuktet inkubator med 5% CO2 ved 37 ° c, hhv. Når cellene er på 80% samløpet, fjerne mediet og skyll med fosfat bufret saltvann (PBS).
- Fjern PBS og tilsett ytterligere 2 mL 0,25% Trypsin-0,53 mM EDTA-løsning. Oppbevar parabolen ved RT (eller ved 37 ° c) til cellene løsner.
- Tilsett 5 – 10 mL friskt medium som inneholder 10% FBS, deretter aspirer og dispensere celler for å resuspend 4T1-RR-og 4T1-RRT-celler i henholdsvis 15 mL sentrifugerør. Telle to typer 4T1 celler ved hjelp av et telle kammer og forberede celle suspensjoner ved en konsentrasjon på 1 x 106 per 100 ΜL i RPMI 1640 medium.
- Bedøve den Vegfr2-svingninger-KI mus med 1%-3% isoflurane i 100% oksygen ved anestesi induksjon kammer med en strømningshastighet på 1 L/min. Overvåk tå klype responsen på musen for å bekrefte status for anestesi. Deretter påfører du øye salve for å unngå dehydrering.
- Fjern musen fra kammer og posisjon i nosecone. Helt fjerne håret på skulderen av musen ved hjelp av elektrisk barbermaskin og hårfjerning krem, som kan gi en god utsikt over operasjonsfeltet og unngå å blokkere BLI signaler i oppfølging eksperimenter.
- Subkutant injiserer 4T1-RR-celler (1 x 106 celler med 100 μL totalt volum) og 4T1-RRT-celler (1 x 106 celler med 100 μL total volum) i venstre og høyre skulder av hver mus, henholdsvis (post som dag 0). Plasser mus i gjenopprettings området med termisk støtte til helt gjenopprettet.
- Etter implantation av 4T1-RR og 4T1-RRT celler, berøre tumor massene for å kontrollere at musene er tumor bærende hver dag (figur S1). På dag 7 etter implantation, intraperitonealt injisere 50 mg/kg ganciklovir (GCV) til tumor-bærende mus to ganger per dag til slutten av eksperimentet.
NOTE tidligere denne eksperiment, cytotoksisk av GCV opp på 4T1-RRT celler burde være oppdaget. Drapet effektiviteten av GCV kan evalueres ved celle telling analysen med ulik konsentrasjon av GCV (figur S2). - På dagen 0, 3, 7, 14 og 21 etter 4T1 implantation, overvåke tumor vekst og angiogenese av tumor-bærende mus og vurdere av både Rluc og svingninger Imaging (Figur 4).
5. dual bioluminesens avbildning av tumor (Rluc) og angiogenese (svingninger)
- Åpne levende Imaging system, initialisere levende tenkelig programvare, og deretter initialisere systemet.
Merk: system initialiseringen vil ta noen minutter å kjøle ned det lade koblet enhets kameraet (CCD) til-90 ° c før du kan starte bildebehandling. Temperaturen vil bli grønn når CCD-kameraet kjøles ned. - Bruk følgende kamerainnstillinger:
Sjekk luminescence og fotografiet.
Kontroller overlegg.
Luminescence innstillinger:
Eksponeringstid angir AUTO under normale forhold.
Binning sett til 8.
F/stopp sett til 1.
Utslipps filter sett åpen.
Fotoinnstillinger:
Binning sett til middels.
F/stopp sett til 8.
IVIS systeminnstillinger:
Synsfelt: C = 1 muse visning, D = 5 mus visning.
Subject høyde sett 1,5 cm. - Veie og fortegnelse det mus og Beregn det kvantum av coelenterazine (CTZ; 2,5 mg/kilos) og D-luciferin (150 mg/kilos) behøvde.
- Bedøve tumor-bærende mus med 1%-3% isoflurane i 100% oksygen ved anestesi induksjon kammer med en strømningshastighet på 1 L/min. Overvåk toe klype respons av musen for å bekrefte status for anestesi. Deretter dispensere en dråpe smøre øye salve på begge øynene for å unngå skader på hornhinnen.
- Injiser 2,5 mg CTZ (3,33 mg/mL) per kilo kroppsvekt i retrobulbar (f.eks. for en 20 g mus, Injiser 15 μL for å levere 50 mikrogram CTZ) ved hjelp av en insulinsprøyte nål.
- Flytt tumor bærende mus inn i kamera kammeret med nesen i anestesi membranen forsiktig og tilegne seg flere bilder av musen rygg umiddelbart å få Rluc signaler fra 4T1 celler til BLI-signalene visne bort.
Merk: halveringstiden av CTZ er svært kort og signalene fra Rluc drop precipitously ~ 30 s. For å sikre at eventuelle gjenværende Rluc-signaler har forsvunnet og intervallet mellom Rluc og svingninger Imaging bør være mer enn 10 min. - Intraperitonealt injisere 150 mg/kg D-luciferin (30 mg/mL) ved bruk av en insulinsprøyte nål (f.eks. for en 20 g mus, Injiser 100 μL for å levere 3 mg D-luciferin). Hold musen på RT i 10 minutter før svingninger bildebehandling.
- Flytt denne musen i kameraet kammer med nesen i anestesi kjegle igjen og tilegne seg flere bilder av musen rygg å få svingninger signaler fra angiogenese.
Merk: svingninger kinetisk skjerm skal utføres for hver mus til signalene når maksimal og deretter visne. - Gjenta fremgangsmåten trinn 5.4 – 5.8 for hver mus.
- Etter bildebehandling, opprettholde mus i et varmt miljø inntil dyrene våkner.
- På ønsket tidspunkt (dag 3, 7, 14 og 21), gjenta over prosedyrer (trinn 5.3-5.10) for å oppdage tumorprogresjon og tumor angiogenese over tid.
- Analysere Rluc og svingninger signaler data for å undersøke forholdet mellom tumor vekst og angiogenese i tumorprogresjon.
Merk: regionene av interesse (ROI) som dekker BLI signalområdet brukes til å analysere dataene. Mål den totale utstråling (fotoner) av AVKASTNINGEN i enheten av fotoner/sekunder/cm2/steradian (p/s/cm2/SR) for hver timepoint. - Analyser Rluc og svingninger signaler om avkastning ved hjelp av grafikkprogramvare (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette eksperimentet ble en brystkreft mus modell etablert ved hjelp av 4T1 celler for å undersøke forholdet mellom tumor vekst og tumor angiogenese (figur 1). For det første ble to lentivirus pakket, som bar gen sekvenser uttrykker Rluc/RFP (LV-RR) og Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), henholdsvis som tidligere rapportert7. Så, to annerledes 4T1 cellen linjer, benevnt 4T1-RR og 4T1-RRT, var skapt av transducing LV-RR og LV-RRT respectively. Etter stoffet screening for 3 dager, 4T1-RR og 4T1-RRT ble observert under et fluorescens mikroskop for å oppdage Transduction effektivitet. Idet vist inne det fluorescens tenkelig, mer enn 99% av det av 4T1-RR eller 4T1-RRT celler var RFP positiv, hvilke foreslo det det 4T1-RR og 4T1-RRT cellen linjer var etablerte av LV-RR og LV-RRT Transduction (skikkelsen 2a, B). I mellomtiden var det ingen forskjeller funnet i celle morfologi og vekst mellom vill-type 4T1 og 4T1-RR eller 4T1-RRT i løpet av kulturen tid. Inne resymé, vi med hell bygget 4T1-RR og 4T1-RRT cellen linjer uten påvirker det cellular fastslår. Heretter, bioluminesens tenkelig (BLI) av 4T1-RR og 4T1-RRT celler var fanget å merker det Rluc signaler. Det BLI profilen avslørte det begge to 4T1-RR og 4T1-RRT celler utsendt kraftig Puerto Mosquito signaler av det likt styrke (skikkelsen 3a). For resten, det lineær forbindelser imellom Rluc signaler og cellen numrene var observert inne begge to 4T1-RR (R2 = 0,9974) og 4T1-RRT celler (r2 = 0,9989), hvilke foreslo det Rluc signaler det kan brukes å speilet det svulst oppblomstringen inne vivo (skikkelsen 3b ).
På grunn av dette, ved hjelp av transgene Vegfr2-svingninger-KI-mus, ble en tumor kulelager mus modell etablert for å undersøke angiogenese som brystkreft vokser. Som et resultat av banket svingninger sekvens i den første ekson av Vegfr2 sekvensen i murine, den svingninger ble uttrykt (som vises som Puerto Mosquito signaler) på en måte identisk med angiogenese i mus under tumorprogresjon. Etter subkutan injeksjon av 4T1-RR og 4T1-RRT celler, cellevekst ble overvåket av Rluc signaler i nærvær av CTZ på dager 0, 3, 7, 14 og 21 (figur 4a). På samme tid ble Angiogenese indusert av tumorveksten evaluert av svingninger signaler i nærvær av D-luciferin i samme mus. På dag 7 post-implantat av 4T1-RR og 4T1-RRT, GCV ble administrert til tumor-bærende mus, som ledet 4T1-RRT celler til å dø. Det BLI profilen avslørte det Rluc signaler av 4T1-RR og 4T1-RRT celler forhøyet for samme pris tidligere GCV handling; Imidlertid, Rluc signaler av 4T1-RRT celler kraftig avtatt stolpe GCV handling. mens Rluc signaler av 4T1-RR fortsatt økt forsiktig. Selvfølgelig eksisterte en betydelig relativitetsteori mellom Rluc signaler og tumor størrelse (figur S1).
I mellomtiden, i henhold til svingninger bilder, svingninger signalene økte i samsvar med Rluc stige og redusert etter Rluc nedgang (figur 4b). Disse resultatene tyder på at det var en direkte sammenheng mellom tumor angiogenese og tumor vekst. Død tumorceller indusert av stoffet GCV kan føre til hemming av tumor angiogenese (figur 4c). Å demonstrere det det svingninger signal var virkelig oppdager det angiogenese innen det svulst, dyrene var ofret etter etterbehandling tenkelig for dag 21 å få histologiske bevis av blodkar. Ifølge bilder av anti-VEGFR2 immunostaining, den mikrovaskulær strukturer i 4T1-RR tumor vev var signifikant mer tydelig enn i 4T1-RRT tumor vev, som var i samsvar med svingninger signaler (figur 5). Oppsummert kan denne doble bioluminesens Imaging strategi brukes til å overvåke tumorprogresjon og angiogenese samt vurdere anti-tumor effekter av ulike rusmidler på tumor vekst og angiogenese i tumor mikromiljøet.
Figur 1: skjematisk kart over dual bioluminesens bilde av tumor vekst og angiogenese. 4T1-cellene transduced av LV-RR og LV-RRT ble implantert i Vegfr2-svingninger-KI transgene mus. Under tumor vekst, BLI av Rluc og svingninger ble samtidig utført i en enkelt mus for å reflektere tumor vekst og angiogenese status, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Skikkelsen 2: Transduction effektiviteten av 4T1-RR og 4T1-RRT celler kjennemerke av fluorescens tenkelig. (A) den diagrammatisk tegning av pLV-RR viste at Rluc og RFP sekvenser ble uttrykt under arrangøren EF1α. Den lyse og fluorescerende bilder av ett synsfelt avslørte at 4T1-RR celler var RFP-positive. (B) diagrammet tegning av PLV-RRT viste at singelen promoter EF1α aktivert RLUC, RFP, og HSV-TTK gener. Det lys og fluorescerende profilen av ettall åker av utsikt avslørte det 4T1-RRT celler var RFP positiv. Scale bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Skikkelsen 3: bioluminesens tenkelig av transduced 4T1-RR og 4T1-RRT celler. (A) bioluminesens Imaging av 4T1-RR og 4T1-RRT celler i nærvær av CTZ. (B) de målte Rluc signalene fra 4T1-RR-og 4T1-RRT-celler opprettholdt en lineær relasjon med celle tall. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: visualisering av dynamiske prosesser av tumor vekst og angiogenese i et levende dyr. (A) Flow diagram av eksperimentet og dual bli deteksjon av Rluc og svingninger. (B) representative Rluc bilder av tumorprogresjon og svingninger bilder av angiogenese under tumor utvikling i en transgene mus. (C) måling av Rluc signaler viste at implantert tumorceller vokste raskt, mens 4T1-RRT celler ble betydelig REGRESSED etter GCV administrasjon. (D) kvantifisering av svingninger signaler viste at angiogenese skjedde etter tumor celle implantation, etter en parallell trend med tumor vekst og død indusert av GCV. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: VEGFR2 immunostaining av 4T1-RR og 4T1-RRT vev på dag 21. Representative bilder av tumor vev seksjoner beiset for VEGFR2 (grønn) på dag 21. Kjernene ble counterstained med DAPI (blå). Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur S1: kurve av tumor størrelse under tumorprogresjon in vivo. Det svulst størrelse av 4T1-RR og 4T1-RRT celler forhøyet etter implantation, bortsett fra det svulst størrelse av 4T1-RRT celler begynte avtagende post-GCV handling. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S2: cytotoksisk effekten av GCV på 4T1-RRT-celler. Det 4T1-RRT celler døde med det opphøyet konsentrasjonen av GCV. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S3: bli bilde av 4T1-RR celler i lungene. Etter hale blodåre injeksjon av 4T1-RR celler, Rluc signal av celler ble oppdaget av BLI. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
| LV-RR og LV-RRT emballasje betingelser | |||
| Komponenter | MEM medium | 3-plasmider system | 4-plasmider system |
| pLV-RR/pLV-RRT vektorA | 0,25 mL | 1,5 μg | 1,5 μg |
| Gag-Pol + rev uttrykk vektorB | 1,0 μg | ||
| Gag-Pol uttrykk vektorC | 0,75 μg | ||
| Rev uttrykket vektorD | 0,3 μg | ||
| VSV-G uttrykk vektorE | 0,5 μg | 0,45 μg | |
| Liposome | 0,25 mL | 7,5 μL | 7,5 μL |
Tabell 1: transfeksjoner forhold av lentiviral pakke system for produksjon av lv-RR og LV-RRT viral aksjer i 293T celler. (A) den pLV-cDNA vektor var pLV-RR og pLV-RRT, henholdsvis. (B) gag-Pol + rev uttrykket vektor kan være enten PCMV-deltar 8.91 (TRC) eller PsPAX2 (Addgene). (C) gag-Pol uttrykk vektor kan velge en av PMDLg/PRRE (Addgene), PLP1 (Invitrogen), og PPACKH1-gag (SBI). (D) rev uttrykk vektor bør være PRSV-rev (Addgene), PLP2 (Invitrogen), eller PPACKH1-rev (SBI). (E) VSV-g uttrykks vektor kan velge PMD. g (TRC), PMD2. g (Addgene), PCMV-VSV-G (Addgene), PVSV-g (SBI) eller PLP/VSVG (Invitrogen). I denne protokollen, det tre-plasmider systemet ble brukt, inkludert psPAX2, pMD2. G, og pLV-RR eller pLV-RRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen er en ikke-invasiv dual BLI-tilnærming beskrevet for overvåking av tumor utvikling og angiogenese. BLI reporter systemet er først utviklet, som inneholder HSV-TTK/GCV selvmords genet for sporing av tumorprogresjon og regresjon i vivo av Rluc Imaging. I mellomtiden er tumor angiogenese vurderes ved hjelp av Vegfr2-svingninger-KI mus via svingninger Imaging. Denne svulst bærende musen modellen er i stand til å gi en praktisk plattform for kontinuerlig og ikke-invasiv sporing tumor utvikling og tumor angiogenese av dual BLI i en enkelt mus med høy relevans, reproduserbarhet, og translatability.
Angiogenese bekymringer langsiktige tumorprogresjon og er dermed av høy viktighet1. Det er nødvendig å studere forholdet mellom tumorprogresjon og angiogenese. Et økende antall anti-angiogenese strategier har blitt undersøkt for kreft behandling, som er avhengig av visualisere overvåke tilnærminger for nøyaktig vurdering av behandlingsresultatene. Videre er neovascularization av tumor vev etter tradisjonell strålebehandling og kjemoterapi et annet populært område av onkologi Research12,13,14. Disse studiene krever en dyr modell som tillater overvåking av tumor vekst og angiogenese i sanntid. Den patologiske forandringer av tumor vev i tradisjonelle dyremodeller er vanligvis avhengig av histopathological undersøkelse, som krever dyreofring. Disse dobbelt BLI musen modeller hjelpe henvende seg problemene av større feilområder og høyere omkostningene fra ofring av dyrene.
I denne doble BLI muse modellen er det mest kritiske trinnet å bruke to typer luciferases, inkludert svingninger og Rluc, til henholdsvis spor celler og angiogenese på samme tid. Underlaget spesifisitet av disse to luciferases gjør det mulig å utføre to typer BLI i en enkelt vert. Dessuten, halveringstiden av coelenterazine (underlaget av Rluc) er svært kort, noe som resulterer i Rluc signalene filtrert bort raskt uten å påvirke den neste svingninger signal deteksjon15. Derfor, i driftsprosessen, bør Rluc Imaging implementeres før svingninger Imaging på grunn av den lengre halveringstiden av D-luciferin (underlaget av svingninger). I tillegg finne ut inkubasjonstid av underlag er nøkkelen til å anskaffe perfekte BLI bilder. Metabolismen av underlag kan endre konsentrasjonen av underlag i Vivo, noe som fører til variasjon i BLI signal intensitet.
Å eie å fremskritt i teknologi, andre Imaging modaliteter for in vivo sporing av visse cellulære og subcellulære hendelser har blitt brukt i prekliniske og kliniske undersøkelser, som fluorescerende Imaging, magnetisk resonans imaging (MRI), og positron utslipp tomografi (pet)16,17. Sammenlignet med disse Imaging strategier, bioluminesens Imaging har høy følsomhet, sterke spesifisitet, og nøyaktig måling, viser sin unike overlegenhet i området levende Imaging studier15. Den Rluc Imaging ansatt tillater tumor vekst og anti-tumor effekter av HSV-TTK/GCV prodrug systemet skal visualisere dynamisk i et levende dyr. Med unntak av overvåking av subkutan vev, har Rluc blitt brukt til å spore celler i lungene ved BLI teknologi i annen forskning. Etter hale blodåre injeksjon av 4T1-RR i en mus, har vi flyttet denne musen inn i levende Imaging system for å oppdage Rluc signaler etter administrering av CTZ. Bildet av Rluc signal viste at injisert celler var hovedsakelig plassert i lungene (figur S3). Som nevnt ovenfor, den Rluc rapporten genet kan spore ulike kreftceller på forskjellige steder, som oppmuntrer til full utnyttelse av denne musen modellen i kreft biologi forskning.
I tillegg til disse fordelene, kan BLI-teknologi brukes til å oppfatte uttrykks nivåene til spesifikke molekyler. Tidligere har fluorophores reporter gener, som uttrykkes under relevante promoterere, blitt brukt til å måle fartøy utvikling i subkutan svulster. Under tumorprogresjon, Vaskulær struktur og molekyler kan observeres gjennom kirurgisk implantert vindu kamre i mus. Men denne metoden har fortsatt begrensninger, inkludert uunngåelig invasjon, fluoroforen slukke, og sterk bakgrunnsstøy. Den tumor-bærende muse modellen etablert i Vegfr2-svingninger-KI musen skaper en ikke-invasiv observasjon av uttrykket nivå av Vegfr2, som er det viktigste molekylet i tumor angiogenese. I mellomtiden vises BLI-bildene store spesifisitet uten støy. Den doble BLI muse modellen kan ha bredere applikasjoner i å studere de potensielle molekylære mekanismene i tumorprogresjon og regresjon.
BLI-teknologi, basert på uttrykk for Rluc (utslipp 480 NM) og svingninger (utslipp 562 NM), har blitt vedtatt i en rekke in vivo sykdom modeller. Den utbredte bruken av BLI-teknologi in vivo har blitt begrenset på grunn av den lave følsomheten til bioluminesens ved bølgelengder under 600 NM i deteksjon av dypt vev. Dette skyldes absorpsjon og spredning av lys, noe som reduserer synlig signal opp til ti-fold per centimeter av vev. For å løse dette spørsmålet, har noen forskere fokusert studier på rød-emitter varianter av svingninger som avgir lys over 600 NM18. Fordi absorpsjon og spredning av lys kan bemerkelsesverdig reduseres ved hjelp av disse variantene av svingninger18,19, anvendelser av luciferase varianter vil forlenge denne protokollen til et større felt av onkologi forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av National Key R & D-programmet i Kina (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation i Kina (81671734), og viktige prosjekter i Tianjin Science and Technology Support program (18YFZCSY00010), grunnleggende Research Funds for de sentrale universitetene (63191155). Vi anerkjenner Gloria vedlikeholds revisjoner, som var verdifulle i å forbedre kvaliteten på manuskriptet vårt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
References
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
- Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
- Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
- Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
- Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
- Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
- Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
- Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
- Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
- Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
- Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
- Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
- Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).
