Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Функциональные и физиологические методы оценки медианной регенерации нервов у крысы

Published: April 18, 2020 doi: 10.3791/59767
Automatic Translation
*1,2, *3, 4,5, 1, 6, 7, 7, 7, 7, 7, 3, 4,5, 1
1Anatomy Department, NOVA Medical School, 2Plastic and Reconstructive Surgery Department and Burn Unit, Centro Hospitalar de Lisboa Central, 3Physics Department, Faculty of Sciences and Technology, LIBPhys, 4Glycoimmunology, CEDOC, NOVA Medical School, 5UCIBIO, Life Sciences Department, Faculty of Sciences and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 6Tissue Repair Unit, CEDOC, NOVA Medical School, 7Pathology Department, Centro Hospitalar de Lisboa Central
* These authors contributed equally

Summary

Представлен протокол для производства различных типов среднего нерва (MN) поражений и ремонта у крысы. Кроме того, протокол показывает, как оценить функциональное восстановление нерва с помощью нескольких неинвазивных поведенческих тестов и физиологических измерений.

Abstract

Основная цель этого исследования заключается в том, чтобы показать, как создать и восстановить различные типы средних поражений нерва (MN) у крысы. Кроме того, представлены различные методы имитации послеоперационной физиотерапии. Для оценки двигательного и сенсорного восстановления используются различные стандартизированные стратегии с использованием модели MN периферического поражения и ремонта нерва, что позволяет легко сравнивать результаты. Несколько вариантов включены для обеспечения послеоперационной физиотерапии, как окружающая среда для крыс, которые подверглись травмам MN. Наконец, в документе представлен метод оценки восстановления MN с помощью нескольких неинвазивных тестов (т.е. схватка тест, контактный укол тест, лестница ступенька ходьба тест, веревочные альпинистские тест, и ходьба трек анализа), а также физиологические измерения (инфракрасная термография, электронейромиография, оценка силы сгибания, и сгибатель карпи радиалис определение веса мышцы). Таким образом, эта модель представляется особенно уместной для воспроизведения клинического сценария, облегчающего экстраполяцию результатов на человеческий вид.

Хотя седалищный нерв является наиболее изученным нервом в периферических исследованиях нерва, анализ крысы MN представляет различные преимущества. Например, в исследованиях на орезыни елей МН наблюдается снижение частоты совместных контрактур и автомутации пораженной конечности. Кроме того, MN не покрывается мышечной массы, что делает его вскрытие легче, чем у седалищного нерва. Кроме того, восстановление MN наблюдается раньше, потому что МН короче, чем седалищее нерв. Кроме того, MN имеет параллельный путь к локтевого нерва в руке. Таким образом, локтевого нерва можно легко использовать в качестве нервного трансплантата для ремонта травм MN. Наконец, MN у крыс находится в передний конечности, сродни верхней конечности человека; у людей, верхняя конечность является местом большинства периферических поражений нерва.

Introduction

Периферических нервных поражений происходят регулярно в результате травмы, инфекции, васкулит, аутоиммунные заболевания, злокачественности, и / или лучевой терапии1,2. К сожалению, периферийный ремонт нерва продолжает представлять клинически непредсказуемые и часто разочаровывающие результаты3,4. Существует широко распространенный консенсус, что значительные основные и трансляционные исследования по-прежнему необходимы для улучшения перспективы пострадавших4,5,6,7.

Крыса MN показывает большое сходство с людьми8,9 (Рисунок 1). Возникая из брахиального сплетения в подмышечной области, этот нерв опускается в медиальной аспект руки, достигая локтя, и разветвления до большинства мышц в брюшной отсек предплечья. MN достигает руки, где он innervates thenar мышц и первых двух люмбрикальных мышц, а также часть кожи рукикрысы 9 (Рисунок 1).

Используя крысу MN, можно адекватно воспроизвести периферических нервных поражений у людей10,,11,,12. Этот нерв имеет несколько потенциальных преимуществ исследования по отношению к обычно используемому седалическому нерву. Потому что MN расположен в переднюю часть крыс (сродни человеческим верхним конечностям), он может быть поврежден экспериментально с гораздо меньшим воздействием на благополучие крысы, по сравнению с седалищного нерва, который innervates значительную часть тазовой конечности13. Кроме того, у людей большинство клинических поражений происходит в верхней конечности, что соответствует передний конечностикрысы 10,11,,12,14,15,16.

В этой статье показано, как производить различные типы поражений MN у крыс. Кроме того, представлены различные способы имитации послеоперационной физиотерапии. Наконец, описаны тесты для оценки функционального восстановления MN. Существует несколько стандартизированных стратегий для оценки двигательного и сенсорного восстановления с использованием модели MN поражения и ремонта периферического нерва, что позволяет легко сравнивать результаты. Модель MN особенно подходит для воспроизведения клинического сценария, способствуя экстраполяции результатов на человеческий вид.

Protocol

Все процедуры, связанные с предметами животного происхождения, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию и этическим комитетом при Медицинской школе Университета Нова, Лиссабон, Португалия (08/2012/CEFCM).

1. Медианная хирургия нерва

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте асептической техники во время операции. Используйте инструменты индивидуальной защиты (PPE) и носить стерильное хирургическое платье17. Автоклав все необходимые хирургические инструменты до операции (см. Таблицу материалов).

  1. Используйте 12-недельных крыс Wistar. Предоставьте им ад либитум пищи и воды с 12 ч светло-темных циклов 7 дней до операции. Перед анестезией, взвесьте крысу, чтобы определить количество анестезии требуется.
  2. Анестезия крысы с интраперитонеальной инъекции смеси кетамина (40-80 мг/кг массы тела) и ксилазин (5-10 мг/кг массы тела). Проверьте глубину анестезии на отсутствие реакции на щепотку ног и путем наблюдения скорости дыхания на протяжении всей процедуры18,19. Обеспечить дополнительную обезболивающую, если частота дыхания более 110 циклов / мин или двигатель ответ на носщивания наблюдается18,20.
  3. Вводят 1 мг/кг мелковиногоподогома, чтобы обеспечить упреждающую анальгезию20,21.
  4. Чтобы избежать ссадсии роговицы во время операции, нанесите офтальмологический гель на оба глаза.
  5. Используйте крем для удаления волос по сравнению с медиальной стороной справа. После этого, мыть с теплым сольным раствором, чтобы удалить крем17.
  6. Положите крысу в положение на спине на грелку. Нанесите на оперативный участок хирургический скраб на основе йода или хлоргексидина. Оставьте его, по крайней мере 15 с, а затем протрите этанолом. Повторите приложение 3x. Убедитесь, что скраб находится в контакте с кожей, по крайней мере 2 мин до начала операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свяжитесь с органом инфекционного контроля в вашем исследовательском подразделении для альтернативных протоколов для предотвращения хирургической инфекции сайта19.
  7. Drape хирургической области17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все процедуры в строгих асептических условиях19.
  8. Разрезать кожу в медиальной аспект правой руки и грудной области в глубокой фасциальной плоскости, используя номер 15 скальпель лезвие. Тщательно прижмите любые кровоточащие сосуды с помощью электрической каутерии.
  9. Тщательно разделить брахиальной фасции, которая представляет собой беловатый оболочки, покрывающие мышцы, используя термокаутер или пару тупых ножниц, заботясь, чтобы не повредить сосудистые и нервные структуры в медиальных аспект руки.
  10. Откройте ножницы прямо под терминальной вставкой pectoralis основной мышцы, для того, чтобы дразнить эту мышцу от основной подмышечной артерии и вены, а также от терминала ветви брахиального сплетения.
  11. Разделите вставку pectoralis основные мышцы с электрической каутерии. Разоблачить и сечееpec pectoralis незначительные мышцы.
  12. Грубо вскрыть MN от брахиальных сосудов и от локтевого нерва, начиная от подмышечной области до локтя. Это позволяет подвергатьвоздействию различные терминальные ветви брахиального сплетения, а именно медиану, локтю, радиальный, подмышечный и мускулококутанные нервы(рисунок 2).
  13. Отдельные экспериментальные группы, как описано ниже.
    1. Создайте группу Шам, только вскрывая MN.
    2. Создайте группу Crush путем сжатия MN в средней части руки в течение 15 с с помощью ряда 5 микрохирургических щиптов, или аналогичного инструмента22,23.
    3. Создайте группу Эксцесион, используя ножницы микрохирургии, чтобы вырезать 10-миллиметровый сегмент из центральной части MN в руке. Ligate проксимальный пень нерва с 8/0 Нейлона шов для предотвращения аксонального роста.
    4. Создайте группу Graft, используя 10-мм-сегмент MN, описанный на последнем этапе, и вращая его на 180 градусов. Шов проксимальных и дистальных пней разделимых MN к нервному трансплантату с помощью прерванных 10/0 нейлоновых швов.
  14. Закрыть рану кожи с помощью прерванных 5/0Нейлонастежки 10,24.
  15. Обеспечить послеоперационную обезболивающее с 7 мл вишневого ароматом ацетаминофен смешивается с 43 мл водопроводной воды25 для получения концентрации 4,48 мг/мл в 50 мл пластиковых бутылок с водой доступны для крыс объявление libitum в течение 3 дней25.

2. жилищное строительство и физиотерапия

  1. Разрешить крыс иметь контакт с физиотерапевтическими аппаратами 2-4 недель до операции, для того, чтобы обеспечить проще и быстрее адаптации к осуществлению настройки. Выполните упражнения, следуя описанным ниже процедурам.
  2. Один раз в день поместите каждую крысу в индивидуальную физиотерапевтическую сферу, а затем поместите сферу в комнату с несколькими препятствиями. Пусть крыса ambulate и изучить комнату свободно в течение получаса.
  3. Дом крыс индивидуально в одиночных клетках с включены работает колеса, чтобы помочь им осуществлять.
  4. Формируйте группы из 4-5 животных и размещайте эти группы в персонализированных клетках. Персонализизировать клетки, включая лестницы, веревки, ходовые колеса и другие экологические обогащающие элементы.
  5. Вернуть отдельных крыс в персонализированные клетки на следующий день после операции.
  6. Возобновить физиотерапевтические упражнения через 3 дня после операции.

3. Функциональные тесты

  1. За неделю до начала выполнения функциональных тестов, ознакомить крыс с пищей лечит, которые будут использоваться в качестве положительного подкрепления. Обеспечить это подкрепление после успешного завершения каждого теста, до и после операции. После начального периода обучения 3 недели, возобновить все тесты через неделю после операции.
  2. Проведите тесты вечером, когда крысы, естественно, более активны. Возобновление тестов через неделю после операции.
  3. Выполните Grasping Test, поместив крысу на сетку и поднимите ее за хвост, позволяя ей захватить сетку с передними лапами11,26. Назначайте "Позитивный" счет, если крыса может захватить сетку с обеих передних лап. Назначайте "Отрицательный" счет, если крыса не может захватить сетку с поврежденной лапой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положительный тест показывает, что двигательный компонент MN функционирует16,,27.
  4. Выполните Pin Prick Test28,29.
    1. Сделать пластиковую платформу с 4 мм х 4 мм квадратный узор сетки. Обеспечьте поддержку этой сетки с металлическим каркасом длиной 21 см.
    2. Поместите крысу на платформу и накройте сетку прозрачной пластиковой коробкой 15,5 см х 15,5 см х 11 см. Подождите несколько минут, пока нормальная деятельность (например, исследовательская и основные уходом) утихнет.
    3. Начните тест, когда крыса неподвижна и стоит на четырех лапах.
    4. С помощью зеркала вставьте астезиометр (например, волосы No4 фон Фрей с изгибом силы 25 г) через сетку и совать палмарный аспект переднего лапы на территории кожи МН(рисунок 1). Повторите оценку 5x на каждом передний лапе в качестве альтернативы, ожидая несколько секунд после каждой оценки.
    5. Проверьте наличие изгиба нити фон Фрея30 для правильной оценки. Оценка вывода ответов следующим образом: "0" без ответа вывода, "1", если крыса медленно удаляет лапу из нити, "2", если крыса быстро реагирует на стимул и удаляет лапу или лижет лапу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если амбуляция и кусаться нити наблюдаются повторить стимул, потому что они считаются неоднозначными ответами.
  5. Тренировки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поезд крыс ежедневно в течение 3 недель, прежде чем выполнять операции в вечернее время в условиях низкой освещенности. Тренировки рекомендуются специально для веревочного восхождения, лестницы и пешеходных дорожек. Это может быть сделано в порядке, представленном ранее, начиная с веревочного альпинистского теста, лестницы ступенька, и, наконец, пешеходные дорожки испытания. Разрешить же животное за несколько минут отдыха до нового теста.
    1. В течение первой недели поместите крысу на последнюю треть лестницы/веревки/коридора, близко к входу в коробку. Состояние животного, чтобы двигаться к открытию коробки, мягко касаясь и / или потянув кончик хвоста. Предоставьте крысе пищевое лакомство, как только она входит в коробку, что позволяет ей несколько секунд отдыха перед повторением теста. Повторите это 5x каждый день в течение 5 дней.
    2. В течение второй недели поместите животное на вторую треть лестницы/веревки/коридора Повторите шаги в 3.5.1.
    3. В течение третьей недели поместите крысу на дно лестницы/веревки/коридора, на противоположную сторону входа в окно. Повторите шаги в 3.5.1, но вознаградите животное только тогда, когда оно завершит тест правильно.
  6. Выполните тест Лестница Rung.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест используется для оценки прочности передних конечностей, шагая, размещения и координации31.
    1. Поместите крысу в нижней части лестницы (120 см х 9 см х 2 см с 18 шагами толщиной 1,5 см, расположенный на 4 см друг от друга) и осторожно коснитесь хвоста крысы. Убедитесь, что лестница находится на наклоне 10 "и приводит к 13,20 см х 11 см открытия на темной деревянной 31,5 см х 35 см х 35 см поле.
    2. Запустите таймер, как только крыса начинает восхождение по лестнице и остановить таймер, как только мрака мониста пересекает вход в коробку.
    3. Запишите время и повторите тест 3x, каждый из которых разделен по крайней мере на 1 мин интервал.
  7. Веревка Восхождение
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест используется для оценки силы захвата, которая зависит от восстановления MN32.
    1. Положите крысу на дно веревки и убедить его подняться, нежно касаясь хвоста. Запустите таймер, как только животное начинает восхождение и остановить его момент, когда мрот крыс пересекает вход платформы.
    2. Для каждого теста, запись времени, затрачиваемого на восхождение на платформу и количество скользит по поврежденной лапы в то время как крыса поднимается вверх по веревке. Считайте тест действительным, если животное не стесняется во время выполнения задания или не прекращает восхождение. Обеспечьте крысу закуской после правильного выполнения задания.
    3. Запишите время и повторите тест 3x, каждый из которых разделен по крайней мере на 1 минутный интервал.
  8. Пешеходные дорожки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест используется для оценки восстановления двигателя передних конечностей33,34.
    1. Настройка аппарата, состоящего из ограниченной дорожки 16,5 см в высоту х 8,7 см в ширину х 43 см в длину. Убедитесь, что это приводит к прямоугольной 8,8 см х 8,2 см открытия в одной из стен черного деревянных 23 см х 36 см х 28 см поле. Включите вертикальную раздвижную дверь, чтобы закрыть вход в коробку быстро. Включите съемный верх, который будет использоваться для извлечения крысы33,34.
    2. Поместите лист графовой бумаги на пол коридора. Возьмите крысу за хвост и дайте ей провести кисть, пропитанную метиленовым синим цветом. Позиция крысы у входа в коридор, чтобы сделать его ходить внутри коробки. Снимите графовую бумагу с пола коридора и повторите тест до тех пор, пока не будет получено хорошее репрезентативное впечатление от обоих передних лап.
    3. Из полученных отпечатков, выберите один с четкими последовательными отпечатками передних, сфотографировать их в формате tiff или jpeg, и измерить следующие параметры с помощью программного обеспечения открытого доступа FIJI35.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во-первых, откалибровать каждое изображение с помощью маркировки в графе бумаги (Анализ Установить масштаб) Во-вторых, преобразовать каждое изображение в 8-битный формат (Изображение Тип (тип) 8-битный). Впоследствии используйте инструмент прямоугольного выбора для выбора отпечатка лапы. Обрезать эту часть изображения(Изображение Урожай). На каждом изображении выделите отпечатки лап и удалите фон, заменяя изображение(изображение Отрегулируйте (англ.) Порог).
      1. Измерьте фактор позиции путем измерять зону впечатления лапы. Используйте инструмент прямоугольного выбора, чтобы выбрать печать лапы и нажмите Контроль M.
      2. Измерьте коэффициент длины печати, измеряя длинную длину впечатления от лапы (для шагов 3.8.3.2-3.8.3.6, используйте инструмент выбора прямой линии для выбора двух самых удаленных точек и нажатия Control M).
      3. Измерьте фактор распространения пальца, измеряя широчайшую ширину впечатления от лапы.
      4. Измерьте промежуточный фактор распространения пальца, измеряя широчайшую ширину между вторым и третьим пальцами.
      5. Измерьте длину шага, измеряя расстояние между гомологичными точками последовательных впечатлений лап на данной стороне.
      6. Измерьте основание опоры путем измерения перпендикулярного расстояния между центральной частью впечатления от лапы и направлением движения29,,33,,36.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните последние два измерения в двух парах представительных последовательных двусторонних показов лап33.

4. Физиологические измерения

  1. Инфракрасная термография (IRT)37,38,39.
    1. Убедитесь, что температура в помещении, где будут проводиться измерения, составляет от 18 до 25 градусов по Цельсию с помощью обычного цифрового гидротермометра с тепловым разрешением 0,1 градуса по Цельсию. Убедитесь, что нет значительных источников тепла (например, компьютеров или холодильников).
    2. Акклиматизировать крыс, приведя их в комнату оценки 2 ч до оценки. Перед началом эксперимента, анестезируйте крысу, как описано выше (шаги 1.3-1.6) или следуя протоколу учреждения. Проверьте отсутствие ответа на щепотку утраты перед началом эксперимента.
    3. Включите инфракрасную термографическую камеру за 15 минут до приобретения и не выключайте ее во время оценок. Установите параметр эмиссивности камеры, чтобы соответствовать, что из кожи крысы (no 0.98)37,40,41.
    4. Поместите крысу на ее сон на чистую и стабильную поверхность с полиэтиленовой губкой. Убедитесь, что нет светоотражающих материалов и других возможных источников артефактов. Закрепите его передние лапы тщательно в супинации с двойной клей лица ленты. Вставьте цифровой термометр 2 см внутри прямой кишки, чтобы контролировать центральную температуру крысы во время всех оценок.
    5. Держите термографическую камеру под углом 90 градусов и расстоянием 30 см от крысы. Сосредоточьте камеру на теле всего животного. Получить три инфракрасных термографии изображения расположены 30 с друг от друга.
    6. Перенесите приобретенные термограммы на компьютер и проанализируйте их с помощью аналитического программного обеспечения. Определите температуру подошвеной поверхности обеих передних лап с помощью фиксированной прямоугольной области интереса (например, 9 х 11 пикселей) на подошвеной территории MN, например, в центре первой метакарпальной подножки(рисунок 1). Используя бесплатное программное обеспечение FLIR Tools, выберите термографию, нажав на него дважды. На левой панели инструментов выберите кнопку «Добавите инструмент измерения коробки»и нарисуйте прямоугольник в 9–11 пикселей над подошвальной областью обоих передних лап. При регулировке прямоугольника его размер в пикселях может быть подтвержден. Выполните его на обоих передних лапах. На правой стороне изображения найдите максимальную, минимальную и среднюю температуру.
    7. За ранее нарисованную рентабельность инвестиций, нажмите правой кнопкой мыши и выберите экспорт. Средние, максимальные и минимальные температуры, а также матрицы температур рентабельности инвестиций затем экспортируются в документ .csv. Эти данные позже можно изучить с помощью программного обеспечения для анализа данных.
  2. Электронейромиографическая (ENMG) Оценка
    1. Настройка электрического стимулятора. Лента пару одноразовых игл иглоукалывание (0,25 мм х 25 мм) с незначительным impedance »lt;1 ) и 25 мм между ними для создания электродов для стимуляции. Теперь подключите стимулятор и электрод к блоку сбора данных, чтобы принимать входящие сигналы и преобразовывать их в цифровые сигналы, которые могут быть обработаны с помощью компьютерного программного обеспечения.
    2. Выполните оценки в одной комнате, и всегда при тех же контролируемых условиях окружающей среды42,,43,,44. Pinch переднюю лапу, чтобы убедиться, что крысы глубоко обезвлечивание перед началом сбора данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глубокая анестезия имеет первостепенное значение для сведения к минимуму изменчивости, связанной с спонтанными добровольными и/или непроизвольными движениями крыс43.
    3. Разоблачите MN с обеих сторон под хирургическим микроскопом, как описано в шагах 1.8-1.13. Используйте лезвие скальпеля номер 15, чтобы продлить разрезы брахиала в предплечья с вентральным разрезом средней линии.
    4. Разоблачить поверхностный аспект сгибателя digitorum сублимные мышцы, прямо отделяя надлежащую антебрахиальную фасцию с помощью ножниц радужной оболочки. Вставьте наземную иглу в четырехглавой мышце фемориса левой задней конечности, чтобы соединить плагин сигнальной земли.
    5. Начните с правой передний лапы и поместите записи электродов в сгибатель digitorum сублимировать мышечный живот передних лап и стимуляции электрода проксимальна к месту поражения в MN. Смочите эти электроды сольистым раствором.
    6. Убедитесь, что программное обеспечение настроено следующим образом: ввод канала порт 1 (CH1) - стимулятор 0-10 V; и канал ввода порт 2 (CH2) - Эмг до 30-1000 Гц. Начните с выбора стимуляции амплитуда 10 мВт и запишите соединения потенциалов мышечного действия CMAPs частота образца 50 кГц в течение 40000 мс. Постепенно увеличивайте амплитуду стимуляции в 10 мВ. Повторите то же самое для левой лапы42,43,44.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал усиливается до 1000x и фильтруется с помощью диапазона 30-1000 Гц. Выход стимуляции установлен для одного импульса с продолжительностью 1 мс42,43,,44.
    7. Откройте записанный файл в программном обеспечении записывающего аппарата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По умолчанию, экран будет отображать буксировки окна сверху красным, стимулятор импульсов, а ниже синим рекордером ENMGs. Раздвижние горизонтальной панели прокрутки под временной шкалой позволяет визуализировать полную запись. Два основных инструмента, Зум инструмент и I-Beam инструмент, находятся в нижней правой части панели. С помощью инструмента Увеличить , можно оптимизировать визуализацию CMAPs и изучить графику. Чтобы гарантировать хорошую установку на экране визуализации, может потребоваться настроить дисплей после масштабирования. Для этого выберите Display Автомасштабные формы волн. Инструмент I-beam позволяет подбирать определенные области графиков и производительность желаемых измерений. Поверх графиков есть три небольших окна, где отображаются измерения. P-P показывает среднее значение амплитуды выбранной области в вольтах (как в записи стимулятора, так и в ENMGs), в то время как Delta-T показывает временной интервал этого выбора.
    8. Измерьте параметры от потенциала соединения мышечного действия (CMPAs, описанного в таблице 1) с помощью одноименных инструментов измерения из программного обеспечения плагинва в "Toolbox для неконтролируемой классификации MUAPs и потенциалов действий в EMG"45.
    9. Для каждой крысы, определить минимальное значение напряжения стимуляции, после чего амплитуда CMAPs не увеличивается дальше. Начните с 0,05 мВ стимул, и дать последовательный увеличение стимулов в дополнительных напряжениях 0,05 мВ.
    10. Применить стимул 20% выше этого напряжения для того, чтобы получить надмаксимальную стимуляцию значение.
    11. После определения последнего значения и применения соответствующего стимула запишите следующие параметры CMAPs.
  3. Оценка силы сгибания
    1. Используйте тот же стимулятор и электроды стимуляции, чтобы электрически стимулировать MN, как в шаге 4.2. Установите вхотворный канал CH1 в качестве стимулятора (0-10 V) и выходные настройки для раздражителей продолжительностью 30 с импульсами продолжительности 1 мс и частотой 1 Гц. Свяжите динамометр с разрешением d 0.001 N к компьютеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация данных в реальном времени может быть получена путем создания участка силы за время (N/s) с помощью программного обеспечения, ранее установленного на компьютере и связанного с динамометром46.
    2. Поместите крысу, как описано в шаге 4.1.4. Поместите 5/0 шелковый шов петли через второе промежуточное пространство обоих передних лап. Прикрепите шовную петлю к крюку динамометра и переднюю лапу, выровненную с динамометром, не напрягая лишнюю линию шва.
    3. Исправьте контралатеральную лапу спомощьей, чтобы избежать ложных помех движения в показаниях динамометра.
    4. Установите динамометр до нуля, нажав на кнопку «Зеро».
    5. Отрегулируйте стимулятор к стимуляции супрамаксимальной амплитуды 1,5 В, регулируя узел напряжения.
    6. На ПК, откройте программное обеспечение AFH-01. Откройте сепаратор "Устройство" и выберите устройство FH5. Создайте новый файл("Измерения1"- это имя, данное по умолчанию) и переименуйте файл.
    7. Поместите электрод на проксимальной части MN, нажмите на игру в нижней части программы, запишите тягу на динамометр е 30 с.
    8. Импортировать значения, полученные в программное обеспечение для анализа данных. Рассчитайте максимальные и средние значения силы и область под кривой (AUC) для графика времени силы x для каждой оценки.
    9. Повторите для левой передней лапы.
  4. Мышечный вес
    1. Эвтаназия крыс под общим наркозом путем exsanguination47,48.
    2. Урожай сгибателя карпи радиалис мышцы из обоих предплечья, рассекая мышцы от его происхождения до его дистального сухожилия вставки, используя номер 15 скальпель лезвие.
    3. Взвесьте мышцы с точной шкалой9,49.

Representative Results

В общей сложности 34 крысы были случайным образом разделены на следующие группы: Шам (n No 17), Иссечение (n No 17) и нервный графт (n No 10) для операции. Все крысы пережили операцию и послеоперационный период без происшествий. Через неделю после операции и в течение последующих 100 дней все животные проходили описанные выше функциональные тесты один раз в неделю. Репрезентативные результаты каждого из этих тестов описаны ниже.

Проверка захвата

Процент крыс с положительным откликом в схватчике тест был самым высоким для группы Шам. Это значение постепенно увеличилось с течением времени у крыс из групп Crush и Nerve Graft (рисунок 3).

Pin-Prick Тест

Крысы из группы Шам были лучшие результаты в кумулятивном тесте pin prick по отношению к крысам из группы нервного графта. Оба имели лучшие оценки, чем крысы в группе эксцизионов (Рисунок 4).

Тест на бег по лестнице

Скорость крыс в тесте на бег по лестнице была самой высокой в группе Шам, чем у крыс, представленных на увечение МН. Среди последних, время для запуска лестницы, как правило, уменьшается с течением времени, параллельно MN восстановления(рисунок 5).

Испытание веревки

Как и в тесте на бег по лестнице, время, которое крысы взяли, чтобы подняться на веревку, было короче в группе Шама по сравнению с группами, в которых Был ранен MN. Скорость крыс в этом тесте увеличилась, когда MN было разрешено восстановить(Рисунок 6).

Анализ пешеходного следа

Анализ пешеходных дорожек, как правило, показывают изменения в морфологии отпечатков лап(рисунок 7). Эти изменения часто были более выраженными в сокрушительных травм, чем в сегментальных поражений нерва50.

Инфракрасная термография

Термография была полезна при изучении температурных различий между передними лапами в первые 30 дней после операции. Разница в температуре была более заметна у крыс с более тяжело поврежденным МН, например, у крыс из группы Excision (рисунок 8 и рисунок 9).

Электронейромиография

В таблице 1 кратко излагается биологическая важность измерений электронейромиографии, обеспечивая репрезентативные результаты для различных экспериментальных групп. Различные закономерности наблюдались с электронейромиографией. Нормальный CMAP был типичным для крысы из группы Шам, в то время как полифазатический CMAP был связан с переменной степенью поражения MN, как в Давке и в группах нервного графта (рисунок 10). В группе Эксцизионне не наблюдалось КМАПов.

Сила сгибания запястья

Учитывая, что сгибание запястья в основном зависит от MN, этот тест был использован для оценки восстановления двигателя на территории этого нерва. Сила сгибания запястья была ближе всего к нормальной, когда восстановление было максимальным(рисунок 11).

Мышечный вес и морфология

Вес и морфология мышцы сгибателя карписа радиалиса зависели от восстановления MN, так как эта мышца иннервируется исключительно MN9,10. Таким образом, нормальный вес и морфология наблюдались в группе Шам. Потеря веса и мышечного трофиза наблюдалась в Давке, Нервный трансплантат, и иссечение групп(рисунок 12).

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление анатомии медианного нерва крысы.
(1) Происхождение и прекращение медианного нерва в мозге крысы (зеленая зона - первичная область двигателя; синяя область - первичная сенсорная область). (2) Поперечная секция спинного мозга на уровне сегмента C7; (3) Подмышечный нерв; (4) Мышечный нерв; (5)Радиальный нерв; (6) Медианный нерв; (7)Ульнар ный нерв; (8) Медиальковые кожные ветви руки; (9) Медиальная кожная ветвь предплечья; (10) Подмышечная артерия; (11) Брахиальная артерия; (12) Средняя артерия; (13) Поверхностная радиальная артерия; (14)Ульнарная артерия; (15) Моторная ветвь медианного нерва к мышце pronator teres; (16) Моторная ветвь медианного нерва к мышце радиалиса карписа сгибателя; (17) Моторная ветвь медианного нерва к мышце поверхностного сгибателя digitorum; (18) Моторная ветвь медианного нерва к мышце profundus сгибателя digitorum; (19) Сенсорная ветвь медианного нерва к thenar зоне; (20) Общая пальмовая артерия первого межзомного пространства; (21)Радиальная palmar цифровая артерия первой цифры; (22) Моторная ветвь медианного нерва к мышцам thenar; (23) Пальмарская артериальная арка; (24) Радиальный palmar цифровой нерв первой цифры; (25) Ульнар palmar цифровой нерв первой цифры; (26) Общая пальмовая артерия третьего межзовливого пространства; (27) Моторные ветви терминального деления медианного нерва до первых трех люмбрикальных мышц; (28)Ульнарский palmar цифровых нервов второй, третьей и четвертой цифр; (29)Ульнарский palmar цифровых артерий к четвертой и пятой цифр; (30)Радиальные palmar цифровые нервы второй, третьей и четвертой цифр; (31)Радиальная palmar цифровая артерия пятой цифры; (32)Территория кожи медианного нерва в передней лапе (сине-затененная область). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Фотография правой передний конечности крысы, показывающая хирургическую анатомию медианного нерва в области рук остылки и подмышечных.
Cr, черепные; Я, медиаль Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Процент крыс с положительным тестом в различных экспериментальных группах в течение 100 дней после операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Оценка ноцицепции с использованием кумулятивного теста pin prick в прооперированном переднего лапо нормализовалось до контралатеральной лапы в различных экспериментальных группах.
Вертикальные бары представляют 95% доверительных интервалов. Горизонтальные линии в верхней части рисунка указывают на статистически значимые различия между экспериментальными группами, qp'lt;0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Средняя скорость в тесте на лестницу в различных экспериментальных группах.
Вертикальные бары представляют 95% доверительных интервалов. Звездочки в верхней части рисунка указывают на статистически значимые различия между группами, Зрп/001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Средняя скорость восхождения в веревочных тестах в группах Шам и Иссисион.
Вертикальные бары представляют 95% доверительных интервалов. Звездочки в верхней части рисунка показывают статистически значимые различия между группами, Зрп/0,05; Злэт;0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Параметры пешеходной дорожки в различных экспериментальных группах.
Значения на прооперированной конечности выражаются в процентах средств, нормализованных к контралатеральной конечности. (A) Фактор позиции; (B) Длина печати; (C) Фактор спреда пальцев; (D) Промежуточный фактор распространения пальца; (E) Длина шага; (F) База поддержки. Вертикальные бары представляют 95% доверительных интервалов. Горизонтальные линии в верхней части рисунка указывают на статистически значимые различия между экспериментальными группами. D30, D60, D90 - 30, 60 и 90 дней после операции, Зрп/0,05; Квёльт;0,01; p'lt;0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Средняя разница температур, зарегистрированная инфракрасной термографией.
Участки коробки представляют разницу температур между областью palmar медианного нерва на эксплуатируемых сторонах (правая сторона) и contralateral стороной (слева) в Группах Sham (n no 17) и Excision (n no 17) групп, qp'lt;0.05; Злэт;0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: Типичная инфракрасная термография животного из группы иссечения в течение первых 45 дней после операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 10
Рисунок 10: Типичные модели соединения мышечной потенциала действий (CMAPs) от животного из Шам и нервной трансплантата группы 90 дней после операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 11
Рисунок 11: Оценка прочности сгибания запястья на обоих передних лапах 90 дней после операции в различных экспериментальных группах.
Сила сгибания запястья была оценена с использованием области под кривой (AUC) в течение периода времени 30 с и с использованием супратетанической стимуляции. Вертикальные линии обозначают 95% доверительных интервалов. Горизонтальные линии в верхней части рисунка подчеркивают статистически значимые различия между группами, Зрпзлт;0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 12
Рисунок 12: Flexor carpi радиалис мышечной массы и макроскопической внешности 100 дней после операции.
(A) Коробка участков с изображением нормализованного сгибателя карпи радиалис мышечной массы в различных экспериментальных группах, qp'lt;0.01; p'lt;0.001. (B) Фотографии мышц на правой и левой сторонах в Шам и Эксцизион экспериментальных групп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Параметр Значение параметра Шам группа Группа эксцизионов NG группа
Порог неврологической стимуляции (%) Оценка регенерации нерва, так как существует минимальное количество нервных волокон, необходимых для производства cMAP или видимого сокращения мышц12 281,63 и 271,65 5359.98 - 3466.52 2108.12 и 2115.13
Порог стимуляции двигателя (%) Оценка регенерации нерва, так как существует минимальное количество нервных волокон, необходимых для производства cMAP или видимого сокращения мышц12 462.52 - 118.91 1694.10 - 503.24 1249.50 - 503.24
Задержка (%) Оценка скорости нервной проводимости в самых быстрых нервных волокнах, то есть самых больших миелинированных волокон44 113,55 и 25,04 N/A 132.80 и 69.95
Скорость нервно-мышечной трансдукции (%) Оценка скорости нервной проводимости в самых быстрых нервных волокнах, то есть самых больших миелинированных волокон44 92.01 и 20.88 N/A 91.30 и 26.51
Амплитуда CmAPs (%) Оценка количества восстановленных моторных агрегатов34 110,63 й45,66 N/A 41,60 и 24,84
Длительность ЦМАПов (%) Оценка синхронности мышечной иннервации, которая зависит от степени ренерневорства мышц и миелинации иннерватирующих волокон44,,45 101.12 и 23.92 N/A 151,06 и 54,52
НГ, нервный трансплантат
CMAPs, сложный потенциал мышечного действия.
N/A, неприменимое
Все параметры выражены в процентах от средних контратеральных значений.
Числовые переменные выражаются как среднее отклонение и стандартное отклонение.

Таблица 1: Электронейромиографическая оценка в конце эксперимента.

Discussion

В этом документе представлен протокол для создания различных типов поражений MN и ремонта у крыс. Кроме того, он иллюстрирует, как оценить функциональное восстановление этого нерва с помощью нескольких неинвазивных поведенческих тестов и физиологических измерений.

Примечательно, что некоторые из функциональных тестов, описанных в этой работе, а именно Лестница Бег испытаний и веревки испытаний, в значительной степени зависит от готовности крысы для выполнения задачи в надежде на получение продовольственной награды51,52,53. Следует отметить, что некоторые штаммы крыс более поддаются обучению и выполнению воспроизводимых в этом типе тестов51,,52,,53. Например, Крысы Льюиса плохо работают в этих тестах как на этапеобучения,так и в51,52,,53.

Крыса жилья должны позволить достаточно свободы передвижения в соответствии с их естественным поведением разведки, в дополнение к позволяя экспериментальных животных, чтобы ознакомиться с некоторыми из элементов, присутствующих в функциональных тестов19. Таким образом, показаны различные формы жилья, позволяющие более высокую свободу передвижения. Большие клетки персонализированы с элементами обогащения, которые позже используются в функциональных тестах (например, веревки и лестницы).

Возможно, эти обогащающие элементы, а также клетки с включенными ходячими колесами и индивидуальными тренировочными сферами обеспечивают форму послеоперационной физиотерапии, аналогичную той, которая предлагается пациентам, работающим на периферической нервной системе10.

Примечательно, что, хотя некоторые авторы выступают врассекая подкожные ткани и мышечные фасции прямо или путем чистой резки с скальпелем номер 15, использование термокаутерии при вскрытии этих структур рекомендуется, чтобы свести к минимуму риск послеоперационной гематомы.

Следует отметить, что многочисленные тесты были разработаны для проверки различных аспектов периферического восстановления нерва у крысы, а именно аксональной регенерации, реиннервации цели, и функциональное восстановление, некоторые из которых выходят за рамки этого исследования29,54,55,56. Например, кинематический анализ29,,36,,55 и гистоморфеметрическая оценка29,,36,,57 широко используются несколькими авторами. Кроме того, некоторые из этих тестов включают вариации для максимизации эффективности и/или воспроизводимости54. Например, механическая алгиземетрия (т.е. оценка реакции на механические болезненные стимулы) может быть оценена качественно с помощью данной нити фон Фрея, как описано в настоящей работе, или полуколичественно используя последовательно более сильные нити фон Фрея, или даже количественно с помощью электронных устройств, которые применяют растущее давление до тех пор, пока ответ на вывод не наблюдается30,54.

Аналогичным образом, хотя некоторые авторы используют анализ пешеходных дорожек для оценки восстановления предплеки нерва у крысы, другие авторы утверждают, что одно поражения MN часто не производят воспроизводимые изменения в отпечатках лап10,58,59. Кроме того, некоторые из них заявили, что эти изменения не могут быть пропорциональны восстановлению мышц10,60. Принимая это в виду, некоторые исследователи выступали за использование анализа пешеходных дорожек в передний план главным образом при оценке восстановления после дробления неве поражений, а не после сегментальной реконструкции нерва10,50,61.

Grasping Test широко используется для оценки восстановления моторики мышц, контролируемых MN16,27. Для обеспечения единообразия и воспроизводимости данных, полученных с помощью этого теста, рекомендуется применять тест grasping Test с использованием устоявшейся методологии, предложенной Bertelli et al.16. Тем не менее, текущий протокол отличаетсятем,что он обычно не обездвижить контралатеральную лапу, чтобы предотвратить неоправданный стресс11,27. Следует также отметить, что другие авторы, после обездвиживания невредимой лапы, количественно оценить Grasping Test с помощью динамометра или шкалы27,56. Тем не менее, эта количественная оценка может зависеть от силы исследователь относится к хвостукрысы 26. Кроме того, трудно отличить силу, генерируемую цифровыми мышцами сгибателя (единственно invated MN в крысы и объект Grasping Test9) от силы, производимой запястья сгибатели, которые включают сгибатель карпи локтевой, который получает его innervation от локтевой нерв9,10,27. Для того, чтобы попытаться обойти эти потенциальные предубеждения, этот протокол использует порядковую шкалу, похожую на шкалу Медицинского научно-исследовательского совета, обычно используемую для оценки мышечной силы у людей10,11,62. Кроме того, другие авторы описали подробную оценку захвата с помощью видео-анализа и видео-системы скоринга11,63.

Потенциальным недостатком использования MN по сравнению с седалищем нервом является то, что большее количество информации имеется в отношении последнего нерва. Это, в свою очередь, может сделать сравнение данных, полученных с MN с предыдущими экспериментальными работами сложнее46,48,64. Кроме того, меньший размер MN по сравнению с седалиса цирващение делает хирургические манипуляции болеесложными8,12,27,56,65.

Вопреки методологии, описанной в настоящей статье, электронейромиография оценки может быть выполнена с помощью транскожных монополярных электродов, помещенных в руку и thenar регионов51. Несмотря на то, что менее инвазивным, этот метод несет в себе риск потенциальной путаницы из-за возможности костимуляции локтевого нерва в области рук9,51.

Большинство авторов согласны с тем, что не все тесты, используемые в крысы обеспечивают соответствующие результаты, как периферийный ремонт нерва зависит от комплекса факторов, включающих выживаемость нейронов, аксональной удлинение и обрезка, синаптогенез, успешный захват отрицательных органов чувств и моторных единиц, и пластика мозга7,10,50,66.67

Наконец, следует отметить, что значительное предостережение моделей грызунов заключается в том, что крысиные периферийные нервы гораздо ближе к своим конечным органам и имеют гораздо меньшие поперечные участки, чем гомологичные человеческие структуры. Тем не менее, эта разница в размерах гарантирует более быстрые экспериментальные данные у грызунов, и лучшие общие результаты у крыс по сравнению с людьми следует ожидать68. Действительно, некоторые авторы предупреждают, что помощь должна быть использована при попытке экстраполировать экспериментальные данные, полученные в периферических нерва ремонт с использованием грызунов для людей7,69. Модели Primate считаются более сопоставимыми70. Тем не менее, их использование связано с досадными этическими, материально-техническими и бюджетными ограничениями71.

Несмотря на то, что седалищный нерв является наиболее часто используемым нервом в периферических исследованиях нерва, крыса MN представляет множество преимуществ. Например, поражения MN связаны с меньшей частотой совместных контрактур и автомутации пораженной лапы11,,12,,16,,56. Примечательно, что автотомия после седалищного нерва транссекции поражает 11-70% крыс. Это может сделать текущие оценки, как седалитарный индекс невозможно14. Это, в свою очередь, делает оценку количества животных, необходимых для получения данной статистической мощности громоздким15.

Кроме того, так как МН короче седалищего нерва, восстановление нерва наблюдается раньше58,,72,,73,,74,,75,76. Кроме того, MN не покрывается мышечной массы, что делает его вскрытие технически легче, чем у седалищного нерва16. Кроме того, MN имеет параллельный путь к локтевом умыслу в руке. Таким образом, локтевой нерв может быть легко использован в качестве нервного трансплантата для ремонта травм MN. Наконец, у людей, большинство периферических поражений нерва происходят в верхней конечности, что еще больше поддерживает использование этого нерва в крысы77,78.

Возможно, грызуны являются экспериментальными животными, наиболее часто используемыми в области периферического ремонта нерва48,79. Как показано на рисунке, крыса MN является удобной моделью поражения периферического нерва и ремонта. В самом деле, Есть несколько стандартизированных стратегий, доступных для оценки двигателя и сенсорного восстановления, что позволяет легче сравнение результатов36,46,60,80,81,82. Многие из этих методов являются неинвазивными, что позволяет ежедневно оценивать.

Кроме того, физиотерапия является частью стандарта ухода за пациентами, восстанавливающимися после травм периферических нервов. Как показано в этой работе, Есть несколько стратегий, чтобы обеспечить послеоперационной физиотерапии, как окружающая среда для крыс, представленных на Травмы MN4,5. Таким образом, эта модель особенно подходит для репликации клинического сценария, облегчая экстраполяцию результатов на человеческий вид12,,27,,48,56,58,83.

Как показано в настоящем документе, доступны несколько стандартизированных стратегий для оценки двигательного и сенсорного восстановления в модели MN крысы. Большинство из них являются неинвазивными процедурами, позволяющими проводить частую оценку. Кроме того, поскольку большинство периферических поражений нерва у человеческого вида происходят в верхней конечности, упомянутые экспериментальные настройки физиотерапии могут более метко имитировать восстановление в клиническом контексте. Возможно, это может способствовать экстраполяции результатов для человеческого вида, дальнейшее подтверждение использования этого нерва в крысы.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Диого Казаль получил грант от Программы дополнительного медицинского образования, которая спонсируется Фондом Калусте Гульбенкяном, Фандао Шампалимо, Министерио да Сааде-е Фанмансиа-пара-Кьенсия-е Tecnologia, Португалия. Авторы очень благодарны г-н Филипе Франко за иллюстративный рисунок на рисунке 1. Авторы хотели бы поблагодарить техническую помощь г-на Альберто Северино в съемках и редактировании видео. Наконец, авторы хотели бы поблагодарить г-жу Сару Маркес за ее помощь во всех материально-технических аспектах, относящихся к приобретению и содержанию животных.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetaminophen Amazon https://www.amazon.com/Childrens-Tylenol-grape-flavor-ages/dp/B0051VVVZG
Acland clamps Fine Science Tools 00398 V http://www.merciansurgical.com/aclandclamps.pdf
Acland Single Clamps B-1V (Pair) Fine Science Tools 396 http://www.merciansurgical.com
Biogel Surgical Gloves Medex Supply 30465 https://www.medexsupply.com
BSL Analysis BIOPAC Systems https://www.biopac.com/
Castroviejo needle holders Fine Science Tools 12565-14 http://s-and-t.ne
Clamp applicator Fine Science Tools CAF-4 http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf
Constante voltage stimulator BIOPAC Systems STM200 https://www.biopac.com/product/constant-voltage-stimulator-unipolar-pulse/
Cutasept skin disinfectant Bode Chemie http://www.productcatalogue.bode-chemie.com/products/skin/cutasept_f.php
Dafilon 10-0 G1118099 http://www.bbraun.com/cps/rde/xchg/bbraun-com/hs.xsl/products.html?prid=PRID00000816
Derf Needle Holders 12 cm TC Fine Science Tools 703DE12 http://www.merciansurgical.com
Dry heat sterilizer Quirumed 2432 http://www.quirumed.com/pt/material-de-esterilizac-o/esterilizadores
Dynamometer SAUTER FH5 https://www.sauter.eu/shop/en/measuring-instruments/force-measurement/FH-S/
Electroneuromiography setup BIOPAC Systems MP36 https://www.biopac.com/product/biopac-student-lab-basic-systems/
Ethilon 5-0 W1618 http://www.farlamedical.co.uk/
FLIR Software FLIR
Graeffe forceps 0.8 mm tips curved Fine Science Tools 11052-10 http://www.finescience.de
Graph paper Ambar
Heat Lamp HL-1 Harvard Apparatus 727562 https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613
Heparin Sodium Solution (Heparin LEO 10000IU/ml) Universal Drugstore http://www.universaldrugstore.com/medications/Heparin+LEO/10000IU%2Fml
High-Temperature Cautery Fine Science Tools AA03 http://www.boviemedical.com/products_aaroncauteries_high.asp
Homeothermic Blanket System with Flexible Probe Harvard Apparatus 507220F https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613
Infrared camera FLIR E6 http://www.flir.eu/instruments/e6-wifi/
Instrapac - Adson Toothed Forceps (Extra Fine) Fine Science Tools 7973 http://www.millermedicalsupplies.com
Iris Scissors 11.5 cm Curves EASY-CUT Fine Science Tools EA7613-11 http://www.merciansurgical.com
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution Sigma- Aldrich K113 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/k113?lang=pt&region=PT
Lacri-lube Eye Ointment 5g Express Chemist LAC101F http://www.expresschemist.co.uk/lacri-lube-eye-ointment-5g.html
Mayo Scissors 14 cm Straight Chamfered Blades EASY-CUT Fine Science Tools EA7652-14 http://www.merciansurgical.com
Meloxicam Recropharma Mobic https://www.recropharma.com/product-pipeline/meloxicam
Methylene Blue solution Sigma- Aldrich https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product
Micro Jewellers Forceps 11 cm straight 00108 Fine Science Tools JF-5 http://www.merciansurgical.com
Micro Jewellers Forceps 11cm angulated 00109 Fine Science Tools JFA-5b http://www.merciansurgical.com
Micro retractor Fine Science Tools RS-6540 http://www.finescience.de
Micro Scissors Round Handles 15 cm Straight Fine Science Tools 67 http://www.merciansurgical.com
Micro-vessel dilators 11 cm 0.3 mm tips 00124 Fine Science Tools D-5a.2 http://www.merciansurgical.com
Monosyn 5-0 15423BR http://www.mcfarlanemedical.com.au/15423BR/SUTURE-MONOSYN-5_or_0-16MM-70CM-(C0023423)-BOX_or_36/pd.php
Normal saline for irrigation Hospira, Inc. 0409-6138-22 http://www.hospira.com/en/search?q=sodium+chloride+irrigation%2C+usp&fq=contentType%3AProducts
Operating microscope Leica Surgical Microsystems http://www.leica-microsystems.com/products/surgical-microscopes/
Skin Skribe Surgical Skin Marker Moore Medical 31456 https://www.mooremedical.com/index.cfm?/Skin-Skribe-Surgical-Skin-Marker/&PG=CTL&CS=HOM&FN=ProductDetail&PID=1740&spx=1
Snacks Versele-Laga Complete Crock-Berry http://www.versele-laga.com/en/complete/products/complete-crock-berry
Straight mosquito forcep Fine Science Tools 91308-12 http://www.finescience.de
Surgical drapes Barrier 800430 http://www.molnlycke.com/surgical-drapes/
Veet Sensitive Skin Hair Removal Cream Aloe Vera and Vitamin E 100 ml Veet http://www.veet.co.uk/products/creams/creams/veet-hair-removal-cream-sensitive-skin/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lad, S. P., Nathan, J. K., Schubert, R. D., Boakye, M. Trends in median, ulnar, radial, and brachioplexus nerve injuries in the United States. Neurosurgery. 66 (5), 953-960 (2010).
  2. Murovic, J. A. Upper-extremity peripheral nerve injuries: a Louisiana State University Health Sciences Center literature review with comparison of the operative outcomes of 1837 Louisiana State University Health Sciences Center median, radial, and ulnar nerve lesions. Neurosurgery. 65 (4), Suppl 11-17 (2009).
  3. Dy, C. J., Isaacs, J. American Society for Surgery of the Hand surgical anatomy: nerve reconstruction Vol. 1. Dy, C. J., Isaacs, J. , American Society for Surgery of the Hand. (2017).
  4. Trehan, S. K., Model, Z., Lee, S. K. Nerve Repair and Nerve Grafting. Hand Clinics. 32 (2), 119-125 (2016).
  5. Boyd, K. U., Fox, I. K. Nerve surgery Vol. 1. Mackinnon, S. E. , Thieme. Ch. 4 75-100 (2015).
  6. Geuna, S., et al. Update on nerve repair by biological tubulization. Journal of Brachial Plexius Peripheral Nerve Injury. 9 (1), 3 (2014).
  7. Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner Journal. 13 (1), 100-108 (2013).
  8. Angelica-Almeida, M., et al. Brachial plexus morphology and vascular supply in the wistar rat. Acta Medica Portuguesa. 26 (3), 243-250 (2013).
  9. Bertelli, J. A., Taleb, M., Saadi, A., Mira, J. C., Pecot-Dechavassine, M. The rat brachial plexus and its terminal branches: an experimental model for the study of peripheral nerve regeneration. Microsurgery. 16 (2), 77-85 (1995).
  10. Casal, D., et al. Reconstruction of a 10-mm-long median nerve gap in an ischemic environment using autologous conduits with different patterns of blood supply: A comparative study in the rat. PLoS One. 13 (4), 0195692 (2018).
  11. Stößel, M., Rehra, L., Haastert-Talini, K. Reflex-based grasping, skilled forelimb reaching, and electrodiagnostic evaluation for comprehensive analysis of functional recovery-The 7-mm rat median nerve gap repair model revisited. Brain and Behavior. 7 (10), 00813 (2017).
  12. Manoli, T., et al. Correlation analysis of histomorphometry and motor neurography in the median nerve rat model. Eplasty. 14, 17 (2014).
  13. Ronchi, G., et al. The Median Nerve Injury Model in Pre-clinical Research - A Critical Review on Benefits and Limitations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 288 (2019).
  14. Weber, R. A., Proctor, W. H., Warner, M. R., Verheyden, C. N. Autotomy and the sciatic functional index. Microsurgery. 14 (5), 323-327 (1993).
  15. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  16. Bertelli, J. A., Mira, J. C. The grasping test: a simple behavioral method for objective quantitative assessment of peripheral nerve regeneration in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 58 (1-2), 151-155 (1995).
  17. Casal, D., et al. A Model of Free Tissue Transfer: The Rat Epigastric Free Flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
  18. Bertens, A. P. M. G., et al. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zuthphen, L. F., Baumas, V., Beymen, A. C., et al. , Elsevier. 277-311 (2001).
  19. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
  20. Lee-Parritz, D. Analgesia for rodent experimental surgery. Israel Journal of Veterinary Medicine. 62 (3), 74 (2007).
  21. Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. European Journal of Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
  22. Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606 (2012).
  23. Ronchi, G., et al. Functional and morphological assessment of a standardized crush injury of the rat median nerve. Journal of Neuroscience Methods. 179 (1), 51-57 (2009).
  24. Matsumine, H., et al. Vascularized versus nonvascularized island median nerve grafts in the facial nerve regeneration and functional recovery of rats for facial nerve reconstruction study. Journal of Reconstructive Microsurgery. 30 (2), 127-136 (2014).
  25. Mickley, A. G., Hoxha, Z., Biada, J. M., Kenmuir, C. L., Bacik, S. E. Acetaminophen Self-administered in the Drinking Water Increases the Pain Threshold of Rats (Rattus norvegicus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 45 (5), 48-54 (2006).
  26. Mandillo, S., et al. Reliability, robustness, and reproducibility in mouse behavioral phenotyping: a cross-laboratory study. Physiological Genomics. 34 (3), 243-255 (2008).
  27. Papalia, I., Tos, P., Stagno d'Alcontres, F., Battiston, B., Geuna, S. On the use of the grasping test in the rat median nerve model: a re-appraisal of its efficacy for quantitative assessment of motor function recovery. Journal of Neuroscience Methods. 127 (1), 43-47 (2003).
  28. Costa, L. M., Simoes, M. J., Mauricio, A. C., Varejao, A. S. Chapter 7: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part IV-kinematic gait analysis to quantify peripheral nerve regeneration in the rat. International Reviews in Neurobiology. 87, 127-139 (2009).
  29. Geuna, S., Varejao, A. S. Evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration. Journal of Neurosurgery. 109 (2), author reply 362 360-362 (2008).
  30. Howard, R. F., Hatch, D. J., Cole, T. J., Fitzgerald, M. Inflammatory pain and hypersensitivity are selectively reversed by epidural bupivacaine and are developmentally regulated. Anesthesiology. 95 (2), 421-427 (2001).
  31. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  32. Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature Neuroscience. 1 (2), 124-131 (1998).
  33. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a Sciatic Function Index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  34. Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Science. 25 (2), 171-179 (1979).
  35. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 155-161 (2012).
  36. Dijkstra, J. R., Meek, M. F., Robinson, P. H., Gramsbergen, A. Methods to evaluate functional nerve recovery in adult rats: walking track analysis, video analysis and the withdrawal reflex. Journal of Neuroscience Methods. 96 (2), 89-96 (2000).
  37. Ludwig, N., Formenti, D., Gargano, M., Alberti, G. Skin temperature evaluation by infrared thermography: Comparison of image analysis methods. Infrared Physics & Technology. 62, 1-6 (2014).
  38. Bennett, G. J., Ochoa, J. L. Thermographic observations on rats with experimental neuropathic pain. Pain. 45 (1), 61-67 (1991).
  39. Wakisaka, S., Kajander, K. C., Bennett, G. J. Abnormal skin temperature and abnormal sympathetic vasomotor innervation in an experimental painful peripheral neuropathy. Pain. 46 (3), 299-313 (1991).
  40. Muntean, M. V., et al. Using dynamic infrared thermography to optimize color Doppler ultrasound mapping of cutaneous perforators. Medical Ultrasonography. 17 (4), 503-508 (2015).
  41. Shterenshis, M. Challenges to Global Implementation of Infrared Thermography Technology: Current Perspective. Central Asian Journal of Global Health. 6 (1), 289 (2017).
  42. Wilbourn, A. J. Nerve surgery Vol. 1. Mackinnon, S. E. , Thieme. 59-74 (2015).
  43. Wu, Y., Martínez, M. ÁM., Balaguer, P. O. Electrodiagnosis in New Frontiers of Clinical Research. Turker, H. , InTech. Ch. 01 (2013).
  44. Werdin, F., et al. An improved electrophysiological method to study peripheral nerve regeneration in rats. Journal of Neuroscience Methods. 182 (1), 71-77 (2009).
  45. Sedghamiz, H., Santonocito, D. Unsupervised Detection and Classification of Motor Unit Action Potentials in Intramuscular Electromyography Signals. 2015 E-health and Bioengineering Conference IEEE. , 1-6 (2015).
  46. Hadlock, T. A., Koka, R., Vacanti, J. P., Cheney, M. L. A comparison of assessments of functional recovery in the rat. Journal of the Peripheral Nervous System. 4 (3-4), 258-264 (1999).
  47. Carstens, E., Moberg, G. P. Recognizing pain and distress in laboratory animals. Ilar Journal. 41 (2), 62-71 (2000).
  48. Tos, P., et al. Chapter 4: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part I-experimental models. International Reviews in Neurobiology. 87, 47-79 (2009).
  49. Galtrey, C. M., Fawcett, J. W. Characterization of tests of functional recovery after median and ulnar nerve injury and repair in the rat forelimb. Journal of the Peripheral Nervous System. 12 (1), 11-27 (2007).
  50. Giusti, G., et al. Return of motor function after segmental nerve loss in a rat model: comparison of autogenous nerve graft, collagen conduit, and processed allograft (AxoGen). Journal of Bone and Joint Surgery American. 94 (5), 410-417 (2012).
  51. Stossel, M., Rehra, L., Haastert-Talini, K. Reflex-based grasping, skilled forelimb reaching, and electrodiagnostic evaluation for comprehensive analysis of functional recovery-The 7-mm rat median nerve gap repair model revisited. Brain and Behavior. 7 (10), 00813 (2017).
  52. Nikkhah, G., Rosenthal, C., Hedrich, H. J., Samii, M. Differences in acquisition and full performance in skilled forelimb use as measured by the 'staircase test' in five rat strains. Behavioral Brain Research. 92 (1), 85-95 (1998).
  53. Whishaw, I. Q., Gorny, B., Foroud, A., Kleim, J. A. Long-Evans and Sprague-Dawley rats have similar skilled reaching success and limb representations in motor cortex but different movements: some cautionary insights into the selection of rat strains for neurobiological motor research. Behavioral Brain Research. 145 (1-2), 221-232 (2003).
  54. Navarro, X. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview. European Journal of Neuroscience. 43 (3), 271-286 (2016).
  55. Costa, L. M., Simões, M. J., Maurício, A. C., Varejão, A. S. P. International Review of Neurobiology. 87, Academic Press. 127-139 (2009).
  56. Ronchi, G., et al. Functional and morphological assessment of a standardized crush injury of the rat median nerve. Journal of Neuroscience Methods. 179 (1), 51-57 (2009).
  57. Raimondo, S., et al. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Reviews in Neurobiology. 87, 81-103 (2009).
  58. Bontioti, E. K. M., Dahlin, L. B. Regeneration and functional recovery in the upper extermity of rats after various types of nerve injuries. Journal of the Peripheral Nervous System. 8, 159-168 (2003).
  59. Schönfeld, L. M., Dooley, D., Jahanshahi, A., Temel, Y., Hendrix, S. Evaluating rodent motor functions: Which tests to choose. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 83, 298-312 (2017).
  60. Urbancheck, M. S. Rat walking tracks do not reflect maximal muscle force capacity. Journal of Reconstructive Microsurgery. 15 (2), 143-149 (1999).
  61. Cudlip, S. A., Howe, F. A., Griffiths, J. R., Bell, B. A. Magnetic resonance neurography of peripheral nerve following experimental crush injury, and correlation with functional deficit. Journal of Neurosurgery. 96 (4), 755-759 (2002).
  62. Wang, Y., Sunitha, M., Chung, K. C. How to measure outcomes of peripheral nerve surgery. Hand Clinics. 29 (3), 349-361 (2013).
  63. Wang, H., Spinner, R. J., Sorenson, E. J., Windebank, A. J. Measurement of forelimb function by digital video motion analysis in rat nerve transection models. Journal of the Peripheral Nervous System. 13 (1), 92-102 (2008).
  64. Yanase, Y. Experimental and Clinical Reconstructive Microsurgery. Tamai, S., Usui, M., Yoshizu, T. , Springer-Verlag. Ch. 2 44-51 (2004).
  65. Barton, M. J., et al. Morphological and morphometric analysis of the distal branches of the rat brachial plexus. Italian Journal of Anatomy and Embryology. 121 (3), 240-252 (2016).
  66. Vincent, R. Adult and obstetrical brachial plexus injuries. Peripheral Nerve Surgery: Practical applications in the upper extremity. Slutsky, D. J., Hentz, V. R. , Churchill Livingstone. 299-317 (2006).
  67. Dahlin, L. B. Peripheral Nerve Surgery: Practical Applications in the Upper Extremity. Slutsky, D. J., Hentz, V. R. , Elsevier. Ch. 1 1-22 (2006).
  68. Vargel, I., et al. A comparison of various vascularization-perfusion venous nerve grafts with conventional nerve grafts in rats. Journal of Reconstructive Microsurgery. 25 (7), 425-437 (2009).
  69. Grinsell, D., Keating, C. Peripheral nerve reconstruction after injury: a review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 698256 (2014).
  70. Wang, D., et al. A simple model of radial nerve injury in the rhesus monkey to evaluate peripheral nerve repair. Neural Regeneration Research. 9 (10), 1041-1046 (2014).
  71. Casal, D., et al. Unconventional Perfusion Flaps in the Experimental Setting: A Systematic Review and Meta-Analysis. Plastic Reconstructive Surgery. 143 (5), 1003-1016 (2019).
  72. Bontioti, E. End-to-side nerve repair. A study in the forelimb of the rat. , PhD thesis, Lund (2005).
  73. Bodine-Fowler, S. C., Meyer, R. S., Moskovitz, A., Abrams, R., Botte, M. J. Inaccurate projection of rat soleus motoneurons: a comparison of nerve repair techniques. Muscle Nerve. 20 (1), 29-37 (1997).
  74. Valero-Cabre, A., Navarro, X. H reflex restitution and facilitation after different types of peripheral nerve injury and repair. Brain Research. 919 (2), 302-312 (2001).
  75. Wall, P. D., et al. Autotomy following peripheral nerve lesions: experimental anaesthesia dolorosa. Pain. 7 (2), 103-111 (1979).
  76. Bertelli, J. A., Taleb, M., Saadi, A., Mira, J. C., Pecot-Dechavassine, M. The rat brachial plexus and its terminal branches: an experimental model for the study of peripheral nerve regeneration. Microsurgery. 16, 77-85 (1995).
  77. Wood, M. J., Johnson, P. J., Myckatyn, T. M. Nerve Surgery Vol. 1. Mackinnon, S. E., Yee, A. , Thieme. Ch. 1 1-40 (2015).
  78. Rosberg, H. E. Epidemiology of hand injuries in a middle-sized city in southern Sweden - a retrospective study with an 8-year interval. Scandinavian Journal of Plastic and Reconstructive Surgery and Hand Surgery. 38, 347-355 (2004).
  79. Gordon, T., Borschel, G. H. The use of the rat as a model for studying peripheral nerve regeneration and sprouting after complete and partial nerve injuries. Experimental Neurology. 287, Pt 3 331-347 (2017).
  80. Bertelli, J. A., Ghizoni, M. F. Concepts of nerve regeneration and repair applied to brachial plexus reconstruction. Microsurgery. 26 (4), 230-244 (2006).
  81. Bertelli, J. A., Mira, J. C. Behavioural evaluating methods in the objective clinical assessment of motor function after experimental brachial plexus reconstruction in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 46, 203-208 (1993).
  82. Bertelli, J. A., Mira, J. C. The grasping test: a simple behavioral method for objective quantitative assessment of peripherla nerve regeneration in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 58 (1-2), 151-155 (1995).
  83. Ronchi, G., et al. Standardized crush injury of the mouse median nerve. Journal of Neuroscience Methods. 188 (1), 71-75 (2010).

Tags

Медицина Выпуск 158 средний нерв регенерация нерва периферическая нервная система ремонт крыса экспериментальная модель хирургия функциональные тесты
Функциональные и физиологические методы оценки медианной регенерации нервов у крысы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Casal, D., Mota-Silva, E., Iria, I., … More

Casal, D., Mota-Silva, E., Iria, I., Pais, D., Farinho, A., Alves, S., Pen, C., Mascarenhas-Lemos, L., Ferreira-Silva, J., Ferraz-Oliveira, M., Vassilenko, V., Videira, P. A., Goyri-O'Neill, J. Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat. J. Vis. Exp. (158), e59767, doi:10.3791/59767 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter