Summary
Crispr Cas9-technologie biedt een efficiënte methode om het genoom van zoogdieren in elk celtype nauwkeurig te bewerken en vertegenwoordigt een nieuw middel om genoom-brede genetische schermen uit te voeren. Hier vindt u een gedetailleerd protocol over de stappen die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van gepoolde CRISPR Cas9 schermen.
Abstract
Genoom bewerking met het crispr-CAS-systeem heeft de mogelijkheid om de genomen van verschillende organismen nauwkeurig te bewerken enorm uitgebreid. In de context van zoogdiercellen vertegenwoordigt deze technologie een nieuw middel om Genome-brede genetische schermen voor functionele genomics-onderzoeken uit te voeren. Bibliotheken van Guide RNAs (sgRNA) gericht op alle open Lees frames toestaan de facile generatie van duizenden genetische verstoringen in een enkele pool van cellen die kunnen worden gescreend voor specifieke fenotypes om de genfunctie en cellulaire processen in een zonder vooringenomen en systematische wijze. CRISPR-CAS schermen bieden onderzoekers een eenvoudige, efficiënte en goedkope methode om de genetische blauwdrukken voor cellulaire fenotypes te achterhalen. Bovendien kan differentiële analyse van schermen uitgevoerd in verschillende cellijnen en van verschillende kankersoorten genen identificeren die contextueel essentieel zijn in tumorcellen, waardoor potentiële doelen voor specifieke therapieën tegen kanker worden onthuld. Het uitvoeren van genoom-brede schermen in menselijke cellen kan ontmoedigend zijn, omdat dit de behandeling van tientallen miljoenen cellen inhoudt en een analyse van grote gegevenssets vereist. De details van deze schermen, zoals de karakterisering van de cellijn, overwegingen van CRISPR Library en het begrijpen van de beperkingen en mogelijkheden van CRISPR-technologie tijdens de analyse, worden vaak over het hoofd gezien. Hier is een gedetailleerd protocol voor de succesvolle prestaties van gegroepeerde genoom-Wide CRISPR Cas9 gebaseerde schermen.
Introduction
CRISPR-CAS, kort voor geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen en CRISPR-geassocieerde nuclease, bestaat uit een enkelvoudig Nuclease eiwit (bijv. Cas9) in complex met een synthetische gids RNA (sgRNA). Dit RiboNucleoProteïne complex richt zich op het Cas9 enzym om dubbel gestrande DNA-onderbrekingen te induceren bij een specifieke genomische Locus1. Dubbel-gestrande pauzes kunnen worden gerepareerd via homologie gerichte reparatie (HDR) of, meer in het algemeen, door niet-homologeuze end-aansluiting (NHEJ), een foutgevoelig reparatie mechanisme dat resulteert in inbrengen en/of verwijderingen (INDELS) die vaak de genfunctie verstoren 1. de efficiëntie en eenvoud van crispr maakt een eerder onbereikbaar niveau van genomische targeting mogelijk dat ver overtreft eerdere genoom bewerkings technologieën [d.w.z. zink vinger nucleasen (znf) of transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen ( TALENS), die beide lijden aan een verhoogde ontwerp complexiteit, lagere transfectie-efficiëntie en beperkingen in multiplex Gene Editing2].
De basis onderzoekstoepassing van CRISPR single-Guide RNA-gebaseerde genoom Editing heeft wetenschappers toegestaan om de functies van individuele genen en de topologie van genetische interactie netwerken efficiënt en voordelig te ondervragen. De mogelijkheid om functionele genoom-brede schermen uit te voeren is sterk verbeterd door het gebruik van het CRISPR-CAS systeem, vooral in vergelijking met eerdere genetische perturbatie technologieën zoals RNA interferentie (RNAi) en Genval mutagenese. In het bijzonder lijdt RNAi aan hoge doel effecten en onvolledige knockdown, wat resulteert in een lagere gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met crispr3,4,5, terwijl gentrap methoden alleen haalbaar zijn in haploïde cellen voor verlies-van-functie schermen, beperking van het bereik van celmodellen die kunnen worden verhoord6. Het vermogen van CRISPR om volledige genknock-out te genereren biedt een meer biologisch robuust systeem om Mutante fenotypes te ondervragen, met weinig ruis, minimale off-target effecten en consistente activiteit over reagentia5. Crispr Cas9 sgrna-bibliotheken die het hele menselijke genoom targeten, zijn nu algemeen beschikbaar, waardoor gelijktijdige opwekking van duizenden genknock-outs in een enkel experiment3,7,8,9 .
We hebben unieke CRISPR-Cas9 Genome-wide sgRNA lentivirale bibliotheken ontwikkeld, de Toronto knock-out (TKO) bibliotheken (beschikbaar via Addgene) die compact en sequence-geoptimaliseerd zijn om functionele genomics schermen met hoge resolutie te faciliteren. De nieuwste bibliotheek, TKOv3, richt zich op ~ 18.000 humane eiwit codering genen met 71.090 gidsen geoptimaliseerd voor het bewerken van efficiëntie met empirische data10. Daarnaast is TKOv3 beschikbaar als een bibliotheek met één component (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294) die Cas9 en sgRNAs uitdrukken op een enkele vector, waardoor de noodzaak voor het genereren van stabiele Cas9-uitstellende cellen wordt verlicht, zodat het genoom-brede knock-out over een breed scala aan celtypen van zoogdieren. TKOv3 is ook beschikbaar in een vector zonder Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) en kan worden gebruikt in cellen die Cas911uitdrukken.
Een genoom-brede CRISPR Cas9 bewerkte celpopulatie kan worden blootgesteld aan verschillende groeiomstandigheden, waarbij de overvloed aan Sgrna's in de tijd wordt gekwantificeerd door de volgende generatie sequencing, waardoor een uitlezen wordt gegeven om de drop-out of verrijking van cellen te beoordelen met traceerbare genetische Verstoringen. CRISPR knock-out bibliotheken kunnen worden aangewend om genen te identificeren die, na perturbatie, cellulaire fitness defecten veroorzaken, matige geneesmiddel gevoeligheid (bijv. gevoelige of resistente genen), eiwit expressie reguleren (bijv., reporter), of zijn vereist voor een bepaalde Pathway functie en cellulaire toestand12,13,14. Differentiële fitness schermen in een kankercel lijn kunnen bijvoorbeeld zowel de uitputting als de reductie van oncogenen en verrijking of een toename van de tumor suppressors genen3,14,15identificeren. Evenzo kan het gebruik van tussenliggende doses therapeutische geneesmiddelen zowel de resistentie van de drug en sensibilisatie genen16,17onthullen.
Hier is een gedetailleerd screening protocol voor CRISPR-Cas9 verlies-van-functie screening met behulp van de Toronto knock-out libraries (TKOv1 of v3) in zoogdiercellen van bibliotheek generatie, screening van prestaties tot gegevensanalyse. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor screening met behulp van de Toronto knock-out Bibliotheken, het kan worden toegepast en schaalbaar te worden tot alle CRISPR sgRNA gepoolde bibliotheken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hieronder beschreven experimenten moeten de richtlijnen van het Instituut voor milieu gezondheid en veiligheid volgen.
1. gepoolde CRISPR sgRNA lentivirale bibliotheek plasmide versterking
- Verdun de kant-en-klare CRISPR sgRNA plasmide DNA-bibliotheek tot 50 ng/μL in TE (bijv. TKOv3).
- Electroporate de bibliotheek met behulp van elektrocompetente cellen. Stel in totaal vier elektroporation reacties in zoals hieronder beschreven.
- Voeg 2 μL 50 ng/μL TKO-bibliotheek toe aan 25 μL ontdooide elektrocompetente cellen voor voorgekoelde cuvettes (1,0 mm) op ijs.
- Elektroporate met behulp van optimale instellingen voorgesteld door het Protocol van de fabrikant. Voeg binnen 10 s van de puls 975 μL van het Herstelmedium (of het SOC-medium) toe aan de Cuvette.
- Breng elektroporated cellen over naar een kweek buis en voeg 1 mL herstel medium toe. Incuberen buisjes in een schud incubator bij 250 rpm gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Stel een verdunnings plaat in om de bibliotheek te titer en bereken de efficiëntie van de transformatie.
- Pool alle 8 mL herstelde cellen en meng goed. Breng 10 μL van de gepoolde cellen over naar 990 μL terugwinnings medium voor een 800-voudige verdunning en meng goed.
- Plaat 20 μL van de verdunning op een voorverwarmde 10 cm LB + carbenicillaire (100 μg/L) agar plaat. Dit resulteert in een 40.000-voudige verdunning van de transformanten die zal worden gebruikt om de transformatie-efficiëntie te berekenen.
- Plaat 400 μL van herstelde cellen op elk plaatje over een totaal van 20 voorverwarmde 15 cm LB + carbenicillaire agar platen. Inbroed de platen voor 14 – 16 uur bij 30 °C.
Opmerking: groei bij deze lagere temperatuur minimaliseert de recombinatie tussen Long-terminale herhalingen (LTR)18. - Om de transformatie-efficiëntie te berekenen, telt u het aantal kolonies op de 40.000-voudige verdunnings plaat (stap 1.3.2). Vermenigvuldig het aantal kolonies geteld met 40.000 om het totale aantal kolonies op alle platen te verkrijgen. Ga verder als het totale aantal kolonies een bibliotheek dekking vertegenwoordigt die overeenkomt met minimaal 200x kolonies per sgRNA (meest optimale is 500-1000x).
- Het minimale kolonie nummer voor TKOv3 Library (71.090 sgRNA) is bijvoorbeeld 1,4 x 107, wat overeenkomt met 200x kolonies per sgrna. Als de kolonie vertegenwoordiging onvoldoende is, verhoog dan het aantal elektroporaties in stap 1,2 op basis van het aantal kolonies op de verdunnings plaat om de minimale dekking van de bibliotheek te bereiken.
- Oogst de kolonies zoals hieronder beschreven
- Aan elke 15 cm plaat, voeg 7 mL LB + carbenicillin (100 μg/L) medium, dan schrait de kolonies af met een cel strooier. Breng met een pipet van 10 mL de geschuurd cellen over in een steriele erlenmeyer van 1 L of een fles.
- Nogmaals spoel de plaat met 5 mL LB + carbenicillin medium en breng de oplossing op de fles.
- Herhaal dit voor alle platen om cellen te pool van 20 platen in een steriele fles.
- Meng verzamelde cellen met een roerstaaf voor 1 uur bij kamertemperatuur (RT) om celklonters te breken. Breng cellen over naar vooraf gewogen centrifuge flessen en centrifugeer op 7.000 x g naar pellet bacteriën en gooi vervolgens de media weg.
- Weeg de natte celkorrel af en trek het gewicht van de centrifuge fles af om het uiteindelijke gewicht van de natte pellet te bepalen. Reinig plasmide DNA met behulp van een Maxi-of Mega schaal plasmide reinigingsset, afhankelijk van de hoeveelheid bacteriële pellet die elke kolom kan verwerken.
2. grootschalige CRISPR sgRNA Library lentivirus productie
Opmerking: alle stappen in dit gedeelte van het protocol worden uitgevoerd in een BSL2 + faciliteit in een klasse II, type a2 bioveiligheid Cabinet.
- Bereken het aantal platen van 15 cm dat nodig is voor de virus productie op basis van de schatting dat 18 mL van het virus meestal wordt geoogst van 1 15 cm plaat.
- Maak cellen voor transfectie door het zaaien van HEK-293T verpakkings cellen in low-antibiotische groeimedia (DMEM + 10% FBS + optioneel: 0.1 x pen/STREP) bij 8 x 106 cellen per 15 cm plaat in 20 ml media. Incuberen cellen 's nachts bij 37 °C, 5% CO2. Zorg ervoor dat de vergulde cellen 70% – 80% Confluent Health zijn en gelijkmatig worden verspreid op het moment van transfectie.
- Volgende dag, bereid drie transfectie plasmiden mengsel zoals beschreven in tabel 1 voor 15 cm platen. Bereken de hoeveelheid plasmide die nodig is voor één trans fectie en maak een mix van plasmiden voor het aantal platen, plus één om te worden getransffecteerd.
- Bereid een lipide-gebaseerde transfectie reagens voor elke trans fectie zoals beschreven in tabel 2. Aliquot verlaagde serum media in afzonderlijke micro centrifugebuizen van 1,5 mL voor het aantal te transfeen platen. Voeg transfectie reagens toe, meng zachtjes en inbroed gedurende 5 minuten bij RT.
- Voeg na 5 minuten incubatie de hoeveelheid DNA toe die nodig is voor één trans fectie naar het transfectie-reagens voor een 3:1-verhouding tussen reagens-tot-μg-DNA-complex. Meng zachtjes en inincuberen gedurende 30 min bij RT.
Opmerking: daaropvolgende transfecties kunnen worden bereid in sets van vijf of minder, met 5 minuten intervallen om te optimaliseren voor tijd en te voorkomen dat overmatige incubatie. - Breng na 30 minuten incubatie elke transfectiemix zorgvuldig over naar elke plaat van de verpakkings cellen. Voeg de hele mix toe met een 1 ml pipetpunt druppelsgewijs in een cirkelvormige, zigzagbeweging zonder de celmonolayer te verstoren. Incuberen cellen bij 37 °C gedurende 18 uur bij 5% CO2.
- Bereid virale oogst media voor: 500 mL DMEM medium + 32 mL BSA kolf (20 g/100 mL, opgelost in DMEM, filter gesteriliseerd met 0,22 μm filter) + 5 mL 100x pen/STREP.
- Verwijder na 18 uur de media (gebruik de juiste behandeling van lentivirusafval zoals incubatie in 1% natriumhypochloriet gedurende 30 minuten voor verwijdering). Vervang voorzichtig met 18 mL virale oogst media naar elke plaat. Incuberen cellen bij 37 °C gedurende 18 uur bij 5% CO2.
- Controleer na 24 uur de verpakkings cellen op abnormale en gesmolten morfologie als indicatie van een goede virus productie. Oogst dan het lentivirus door alle supernatant te verzamelen en over te brengen naar een steriele conische centrifugebuis.
- Draai de media met virus op 300 x g gedurende 5 minuten en pellet de verpakkings cellen. Aliquot het supernatant in een steriele polypropyleen buis zonder de pellet te verstoren.
- Bewaar het virus gedurende korte perioden bij 4 °C (minder dan 1 week) of onmiddellijk bij-80 °C voor langdurige opslag. Aliquot grootschalige virus Preps voor eenmalig gebruik volumes voor lange termijn opslag om te voorkomen dat bevriezen/ontdooien.
3. cellijn karakteriseren voor screening
- Selecteer de gewenste cellijn.
- Meet en noteer de geschatte verdubbelingstijd van de cellen.
- Bepaal de optimale celplating dichtheid voor het kweken van cellen elke 3 – 4 Cell doublings in een weefselkweek vaartuig naar keuze (bijv., 15 cm weefselkweek platen).
- Bepaal de puromycine concentratie te gebruiken in de gewenste cellijn voor selectie van TKO bibliotheken met puromycine resistentie marker als volgt:
- Zaadcellen in een 12-put plaat bij de dichtheid die nodig is om de samenvloeiing te bereiken na 72 h, vervolgens inincuberen 's nachts (37 °C, 5% CO2).
- De volgende dag, verandering in een medium met een verdunnings bereik van puromycine concentraties van 0 μg/mL tot 10 μg/mL, in stappen van 0,5 μg/mL. Inincuberen de cellen voor 48 h.
- Na 48 h, meet de levensvatbaarheid van de cel door celtelling of alamarBlue kleuring.
- Bepaal de laagste concentratie die 100% van de cellen in 48 h doodt. Gebruik deze concentratie te selecteren voor CRISPR Library getransduceerde celpopulaties in stappen 4,6 en 5.2.6.
Opmerking: voor cellijnen met langere Verdubbelings tijden kunnen langere incubaties met puromycine worden getolereerd. Bepaal in deze situaties de Kill-curve voor de incubatietijd die nodig is voor < 3-cel doublings. Minimaliseer de tijd voor selectie om uitval van essentiële genen voor aanvang van de screening te voorkomen.
- Controleer cellen op gevoeligheid voor hexadimethrine bromide (tot 8 μg/mL) door een dosisrespons curve uit te voeren in dezelfde methode als gebruikt voor het meten van de gevoeligheid van puromycine (stap 3,2). Indien toxiciteit wordt waargenomen met < 8 μg/mL hexadimethrine bromide, niet gebruiken.
4. functionele titratie van gepoolde CRISPR lentivirusbibliotheek voor de bepaling van MOI
- Ontdooi een vers aliquot van de gepoolde CRISPR sgRNA Library lentivirus (bijv. LCV2:: TKOv3) en blijf op ijs.
- Ontwerp een reeks virus volumes om te testen tussen het bereik van 0 – 2 mL (d.w.z. 0 mL, 0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL en 2 mL).
- Oogst doelcellen en zaadcellen in 15 cm platen bij de dichtheid die nodig is om de samenvloeiing te bereiken in 72 h.
- Voor elk virus volume dat moet worden getest, bereidt u dubbele platen voor. Voeg cellen, virus, hexadimethrine bromide (8 μg/mL) en media toe aan een eindvolume van 20 mL. Meng platen grondig, zitten platen niveau in incubator en incuberen voor 24 h (37 °C, 5% CO2).
- Na 24 uur, verwijder Virus met media en gooi (gebruik bioveiligheid voorzorgsmaatregelen voor de behandeling van lentivirus afval). Reinig desgewenst de plaat voorzichtig met een warme PBS om het virus te verwijderen.
- Voor elke virus aandoening, vervangen door 20 mL media met puromycine met behulp van de concentratie bepaald om cellen te doden in sectie 3, op één replicaatplaat. Voeg aan de andere plaat 20 mL verse media toe zonder puromycine. Inincuberen voor 48 h (37 °C, 5% CO2).
- Na 48 h, Controleer dat alle niet-geïnfecteerde cellen (0 mL virus aandoening) behandeld met puromycine zijn dood. Oogst alle platen afzonderlijk en dispergeer de cellen door herhaalde zachte pipetteren.
- Tel cellen van alle platen en bereken de MOI voor elk virus volume door het vergelijken van celtellingen met puromycine selectie naar celtellingen zonder puromycine (dat wil zeggen, +/-puromycine).
- Grafiek resultaten om te bepalen van het virus volume dat leidt tot 30% – 40% overleving van de cel met puromycine selectie versus zonder puromycine. Gebruik dit virus volume om een MOI van 0,3 – 0,4 te bereiken tijdens het scherm onder dezelfde weefselcultuur omstandigheden.
5. primaire scherm infectie, selectie en celpassaging
- Selecteer de CRISPR sgRNA bibliotheek dekking moet worden gehandhaafd op het hele scherm (aanbevolen minimum van 200-fold).
- Bepaal op basis van de bibliotheek dekking het aantal cellen dat nodig is om deze dekking per sgRNA te behouden en het aantal cellen dat nodig is voor infectie bij MOI 0,3 (tabel 3).
- Bepaal het aantal platen dat nodig is om de infectie in te stellen (tabel 4).
- Het infecteren van de cellen met CRISPR Library
- Oogst cellen en zaai het vereiste celnummer op elke 15 cm plaat.
- Voeg hexadimethrine bromide (8 μg/mL) toe aan alle platen.
- Voeg het virus toe op het volume dat nodig is voor MOI 0,3 om te screenen en de controle 2 platen. Voor het besturingselement 1 voegt u geen virus toe en vervangt u dat volume door media.
- Meng de platen grondig door te kantelen. Plaats de platen in de incubator en zorg dat ze een niveau hebben.
Opmerking: batch infecties kunnen worden gedaan door het combineren van een Master mix van virus, media, en hexadimethrine bromide aan cellen in suspensie voor het beplating. - Verwijder media en vervang met verse media die puromycine bevatten bij de concentratie bepaald in stap 3.2.4 tot de screening en controle 1 platen 24 h na virus infectie. Voeg verse media zonder puromycine toe aan de Control 2-plaat. Inincuberen van cellen voor 48 h (37 °C, 5% CO2).
- 48 h na toevoeging van puromycine, ervoor te zorgen dat alle niet-geïnfecteerde cellen zijn dood (controle 1) om te bevestigen puromycine activiteit, dan oogst de geïnfecteerde cellen.
- Het oogsten van geïnfecteerde celpopulatie en celpassaging
- Oogst de puromycine-geselecteerde cellen van alle zeef platen in één steriele container. Verzamel de cellen van elke regel plaat afzonderlijk. Dispergeer cellen door voorzichtig herhaald pipetteren.
- Tel cellen van gegroepeerde screening cellen, Control 1 en Control 2 afzonderlijk en bereken het aantal cellen per 1 mL.
- Bereken MOI en fold dekking als volgt bereikt:
- Verzamel drie replicaten van celpellets uit de samengevoegde cellen in de geselecteerde bibliotheek dekking voor genomische DNA-extractie. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 min. was met PBS. Label de buizen en Vries droog de celpellets bij-80 °C (dit zijn T0 referentiemonsters).
- Splits de groep geïnfecteerde cellen in drie replicaatgroepen (bijvoorbeeld repliceer A, repliceer B, repliceer C), terwijl de bibliotheek dekking binnen elke replicaat behouden blijft. Zaadcellen met dezelfde zaaien dichtheid als normaal zou worden gebruikt bij het uitbreiden. Gebruik hetzelfde aantal cellen voor elke replicaatplaat en hetzelfde totale aantal cellen tussen replicaten.
- Doorgaan om cellen te passeren en oogst drie replicaten van celpellets uit elke repliceren van gepoolde cellen zoals hierboven, elke 3 – 8 dagen afhankelijk van de cellijn, voor maximaal 15 – 20 cel doublings. Oogst bij elke passage de cellen van alle platen in elke replicaatgroep met elkaar (d.w.z. alle cellen van een replicaat worden samen opnieuw gemengd, alle cellen van repliceer B-platen worden opnieuw gemengd, enz.).
- Label elke pellet met een tijd (T) en repliceer de benaming. Dit komt overeen met het aantal dagen na T0 dat de pellet wordt verzameld (bijv. T3_A, T3_B, T3_C, enz.).
- Voor de negatieve selectie drug schermen, toestaan cellen te herstellen voor ten minste één passage na T0 vóór de behandeling. Bij T3 of T6, splitst u de cellen van elke replicaatgroep (A, B, C) in medicamenteuze behandeling en controle populaties, met behulp van dezelfde zaaien dichtheid gebruikt in stap 5.3.5.
- Apart pool het aantal cellen dat is vereist voor de dekking van de bibliotheek voor elke replicatie in de groep medicamenteuze behandeling. Voeg de drug in tussenliggende concentraties (IC20-IC50). Zaai de cellen en incuberen (37 °C, 5% CO2) tot de volgende passage.
- Apart pool het aantal cellen dat is vereist voor de dekking van de bibliotheek voor elke replicatie in de controlegroep voertuig. Voeg de voertuigbesturing toe met hetzelfde volume als het medicijn (< 0,5% v/v). Zaai de cellen en incuberen (37 °C, 5% CO2) tot aan de volgende passage.
- Blijf de cellen passeren en oogst de celpellets voor genomisch DNA elke 3 dagen zoals beschreven in stap 5.3.5, terwijl het medicijn of voertuig bij elke passage wordt verversen.
- Voor de schermen positieve selectie of drug resistentie splitst u elke replicaatgroep op basis van het aantal cellen dat is vereist voor bibliotheek dekking. IC90 drug concentraties toevoegen aan elke replicatie. Bij IC90wordt een meerderheid van de cellen gedood. Laat resistente populaties groeien en verzamel celpellets (1 – 2 x 107 cellen) voor GENOMISCHE DNA-extractie.
6. CRISPR monstervoorbereiding en sequentiëren
- Genomische DNA-zuivering
- Inbroed de bevroren celpellets gedurende 5 – 10 minuten bij RT voor ontdooien.
- Voeg 1,4 mL PBS toe aan een centrifugebuis van 50 mL die een celpellet bevat. Vortex voor 20 s om de cellen te hervatten en rust gedurende 1 minuut. Pipetteer 15x met P1000 indien nodig om de resterende celklonten op te splitsen. Als u cellen overbrengt van een tube van 15 mL of 1,5 mL, hervat de cellen dan met 1 mL PBS, breng vervolgens cellen over naar een buis van 50 mL en spoel de originele buis met 400 μL PBS.
- Voeg 5 mL nuclei Lysisoplossing toe aan de geresuspendeerde cellen. Gebruik een pipet van 10 mL om het monster te mengen door 5x op en neer te pipetteren.
- Voeg 32 μL RNase A (20 mg/mL; om een eindconcentratie van 100 μg/mL) aan het nucleaire lysaat te verkrijgen en meng het monster door de buis 5x te inverteren. Inbroed het mengsel gedurende 15 minuten bij 37 °C en laat het monster gedurende 10 minuten afkoelen bij RT.
- Voeg 1,67 mL eiwit precipitatie oplossing toe aan het lysaat en Vortex krachtig gedurende 20 sec. kleine eiwit klonten kunnen zichtbaar zijn na het mengen.
- Centrifugeer bij RT 4.500 x g gedurende 10 minuten.
- Breng met een pipet van 10 mL de supernatant over in een centrifugebuis van 50 mL die 5 mL isopropanol bevat. Meng voorzichtig de oplossing 10x door inversie totdat het DNA wordt waargenomen.
Opmerking: DNA kan worden waargenomen als witte, draadachtige strengen die een zichtbare massa vormen. - Centrifugeer op 4.500 x g gedurende 5 minuten bij RT om het DNA te pellet.
- Verwijder met een pipet van 10 mL voorzichtig het supernatant en Vermijd het afwerken van de DNA-pellet. Voeg 5 mL 70% ethanol toe aan RT naar het DNA. Draai de buis voorzichtig om de DNA-pellet en de zijkanten van de centrifugebuis te wassen.
- Centrifugeer op 4.500 x g gedurende 5 minuten bij RT.
- Verwijder met een pipet van 10 mL voorzichtig de 70% ethanol en Vermijd het afwerken van de DNA-pellet. Air-Dry genomisch DNA gedurende 10 minuten bij RT.
- Voeg 400 μL te oplossing toe aan de buis en laat het DNA oplossen door gedurende 1 uur bij 65 °C te broeien. Meng het DNA door zachtjes elke 15 min de buis te wrijven. Als het DNA niet volledig oplost, inbroed de buis bij 65 ° c voor een extra 1 h terwijl zachtjes het buisje elke 15 min, en laat het bij 4 °C 's nachts.
- Centrifugeer bij RT 4.500 x g gedurende 1 minuut en breng GENOMISCH DNA over naar een 1,5 ml-laag bindende buis.
- Kwantificeer en meet de zuiverheid van genomisch DNA op zowel de spectrofotometer (voor het totale gehalte aan nucleïnezuur) als op een fluor meter (voor dubbel-streng DNA-gehalte).
- (Optioneel) neerslaan genomisch DNA als er problemen met downstream PCR-amplificatie van de sgRNA als volgt zijn.
- Breng 400 μL genomisch DNA over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
- Voeg 18 μL van 5 M NaCl (eindconcentratie van 0,2 M) en 900 μL 95% ethanol toe.
- Inverteer buis 10x tot grondig gemengd, vervolgens Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 10 min bij RT.
- Verwijder voorzichtig de supernatant en Vermijd het afstaan van de DNA-pellet. Was de DNA-pellet met 500 μL van 70% ethanol. Draai de buis voorzichtig om de DNA-pellet te wassen.
- Centrifugeer op 16.000 x g gedurende 5 minuten bij RT.
- Verwijder voorzichtig de supernatant en Vermijd het loskomen DNA pellet. Air-Dry genomisch DNA gedurende 10 minuten bij RT.
- Voeg 300 μL te toe om het DNA op te lossen zoals beschreven in stap 6.1.12.
- Kwantificeer en meet de zuiverheid van genomisch DNA zoals beschreven in stap 6.1.14.
- Voorbereiding van de bibliotheek CRISPR-sequencing
- Stel PCR 1 in zoals beschreven in tabel 5 met een totaal van 100 μg GENOMISCH DNA. Voeg 3,5 μg genomisch DNA per 50 μL-reactie toe en stel identieke 50 μL-reacties in om de gewenste dekking te bereiken. Tabel 6 bevat voorbeelden van primer sequenties voor versterking van LCV2:: TKOv3 sequencing bibliotheken. Tabel 7 bevat voorbeelden van primer sequenties voor de versterking van pLCKO2:: TKOv3 sequencing bibliotheken.
- De PCR 1-reacties in een Thermocycler versterken met behulp van het programma dat wordt beschreven in tabel 8.
- Controleer PCR 1 amplificatie door 2 μL van het PCR-product op een 1% agarose gel te draaien. PCR 1 levert een product van 600 BP.
- Pool alle individuele 50 μL reacties voor elk genomisch DNA monster en meng door vortexing.
- Stel één PCR-2-reactie (50 μL) in voor elk monster, zoals aangegeven in tabel 9 , waarbij 5 μL van het gepoolde PCR-1-product als template wordt gebruikt. Gebruik unieke index primer combinaties voor elk afzonderlijk voorbeeld om het groeperen van sequentiëren bibliotheek voorbeelden toe te staan.
- Versterk de PCR 2-reactie in een Thermocycler met behulp van het programma dat wordt beschreven in tabel 10.
- Reinig de agarose-gelapparatuur voor het zuiveren van versterkte producten met 0,1 N HCl gedurende 10 minuten voorafgaand aan het gieten van een gel. Bereid een 2% agarose gel met DNA vlek voor het zuiveren van PCR 2 versterkte producten.
- Voer het PCR 2-product uit op de 2% agarose-gel bij laag voltage (1,0 – 1,5 uur run). PCR 2 levert een product van 200 BP.
- Visualiseer de PCR-producten op een blauw licht transverlichter. Accijns de 200 BP band en zuiver DNA van de agarose gel Slice met behulp van een gel extraction Kit. Kwantificeer en meet de zuiverheid van de sequentiebibliotheek op zowel de spectrofotometer als de fluor meter.
Opmerking: een typische gel-gezuiverde sequentie wisselaar varieert van 5 – 10 ng/μL en een totale opbrengst van 150 – 300 ng.
- Sequentiëren met hoge doorvoer
- Volg de CRISPR sequencing-bibliotheken op de volgende generatie sequencers.
- Sequentie referentie T0 samples met een hogere Lees diepte van 400-tot 500-fold bibliotheek dekking. Volgorde experimentele tijdpunt monsters voor drop-out schermen met een minimale Lees diepte van 200-fold. Voor sterke positieve selectie schermen is een minimale Lees diepte van 50-voudige dekking voldoende voor de identificatie van verrijkte Sgrna's.
Opmerking: het is van cruciaal belang om het T0-monster te sequenties om de bibliotheek representatie voor een bepaald scherm te bepalen en als referentie te dienen voor het bepalen van sgRNA-vouw wijzigingen in de loop van de tijd.
7. gegevensanalyse
- Volg de reeks met behulp van Programma's zoals bowtie voor het toewijzen van reeks leesbewerkingen aan de referentie bibliotheek met behulp van de volgende parameters:-v2 (twee mismatches toestaan) en-M1 (alle gelezen die zijn toegewezen aan meer dan één reeks in de bibliotheek verwijderen).
- Normaliseer het aantal unieke in kaart gebrachte leesbewerkingen voor elke sgRNA voor een gegeven steekproef tot 10.000.000 leesbewerkingen per sample als volgt:
107
- Bereken de LOG2 fold verandering van elke sgRNA voor elke replicaat op elk tijdpunt (TN) in vergelijking met het T0 monster (TN/T0). Voeg een pseudo Count van 0,5 leesbewerkingen toe aan alle gelezen tellingen om te voorkomen dat er onderbrekingen van nullen. Sluit Sgrna's uit met < 30 RAW-leesbewerkingen in het T0-monster, van de berekening en downstream analyse van de vouw-Change.
- Analyseer vouw veranderingen met de Bayesiaanse analyse van Gene essentie (bagel) algoritme < https:///hart-Lab/bagel >, met behulp van de essentiële en niet-essentiële trainings sets die eerder zijn gedefinieerd19 voor genessentialiteits schermen ( Aanvullende tabel S1) of drugz < https://-github.com/hart-Lab/DRUGZ > voor drug screens20.
- Bereken de precisie en terugroepen voor scherm prestatiebeoordeling met behulp van BF scores. Gebruik de essentiële set van stap 7,4 als de echte positieve lijst voor de functie precision_recall_curve van de bibliotheek Scikit-Learn voor python, samen met de bovenstaande subset van de BF-Score. U ook hetzelfde uitvoeren met het PRROC-pakket in R.
- Bereken de gemiddelde vouw verandering van alle geleiders voor elk gen. Genereer dichtheids percelen voor de essentiële en niet-essentiële genen (zie stap 7,4) in R of gelijkwaardige software. In R, als x. ESS is een vector die de log fold verandering waarden van essentiële genen en x. nonEss bevatten niet-essentiële genen, plot met behulp van de volgende opdracht:
plot (dichtheid (x. ESS), xlab = "Mean logFC", Col = "rood", lwd = 2)
lijnen (dichtheid (x. nonEss), Col = "blauw", lwd = 2)
Opmerking: voor python versiedetails en pakketten gebruikt, zie scikit-Learn v 0.19.1: (gepubliceerd door Pedregosa et al.21).
107
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overzicht van de CRISPR-screening-workflow voor genoom schaal
Afbeelding 1 illustreert een overzicht van de gepoolde crispr-screening-werkstroom, beginnend met infectie van doelcellen met crispr Library lentivirus bij een lage Moi om te zorgen voor enkelvoudige integratie gebeurtenissen en adequate bibliotheek representatie (meestal 200-tot 1000 -fold). Na infectie worden cellen behandeld met het antibioticum puromycine om te selecteren voor getransduceerde cellen. Na selectie wordt een baseline T0 celpellet verzameld om de distributie van de bibliotheek aan het begin van de screening te beoordelen. De overgebleven cellen, bestaande uit een heterogene populatie genetische verstoringen, worden elke 3-4 dagen door de gewenste bibliotheek weergeven voor 15-20 doublings om genbewerking en de daaruit voortvloeiende effecten te manifesteren. Schermen met medicamenteuze behandelingen worden meestal toegevoegd aan T3 of T6 nadat de cellen zijn hersteld van virus infectie en puromycine selectie. Cellen worden geoogst in de gewenste bibliotheek representatie bij elke passage voor genomisch DNA, om de gids overvloed te bepalen door de sequentiëren van de volgende generatie op de gewenste tijdspunten.
Het wordt aanbevolen voor het verzamelen van meerdere voorbeelden in het geval van fouten die zich kunnen voordoen in de downstream sequentiëren bibliotheek voorbereiding stappen. Gepoolde schermen zijn meestal op levensvatbaarheid gebaseerde testen die zijn ontworpen voor een positieve of negatieve selectie van essentiële Sgrna's. Positieve schermen identificeren genen die resistentie vertonen of de overleving onder specifieke selectiedruk verhogen (bijv. drugs of Mutant cellijn). In dit geval zullen de meeste cellen sterven uit de selectie, en cellen die blijven worden verrijkt voor sgRNAs targeting genen die resistent zijn voor de drug of aandoening wordt getest. Negatieve selectie schermen of "drop-out" schermen identificeren genknock-outs met verhoogde gevoeligheid voor of verlies van overleving onder de scherm selectiedruk. Om verstoringen te identificeren die een fenotypische werking hebben zoals een groei fout, wordt de gids overvloed op elk tijdpunt gekwantificeerd door de volgende generatie sequencing en vergeleken met T0 om de drop-out of verrijking van gidsen in de loop van het scherm te beoordelen. Met behulp van analyse platforms, log-fold wijzigingen worden gemeten voor gidsen, en algoritmen zoals de BAGEL kan worden toegepast om het rangschikken van genhits mogelijk te maken.
Bibliotheek versterking en onderhoud van bibliotheek representatie in gepoolde CRISPR schermen
Figuur 2 illustreert de verwachte verdeling van gidsen na versterking van de plasmide bibliotheek. TKOv3 Library bestaat uit 71.090 Sgrna's met vier Sgrna's per gen, gericht op ~ 18.000 proteïne Coding genes10. Een ideale bibliotheek moet elke enkele sgRNA vertegenwoordigd in vergelijkbare hoeveelheden hebben. Daarom is het raadzaam om de distributie van gidsen in de versterkte bibliotheek te bevestigen door de volgende generatie sequencing. Hier is een versterkte bibliotheek met een zeer strakke verdeling van sgRNAs, die bevestigt dat > 95% van alle Sgrna's binnen 4-voudige distributie bereik liggen (Figuur 2). Een bredere verdeling van sgRNAs geeft aan dat de overvloed aan bibliotheek gidsen niet even vertegenwoordigd is en kan bijdragen aan het lawaai in gepoolde schermen.
Evaluatie van de schermprestaties
Figuur 3 illustreert dat de prestatie kwaliteit van een scherm kan worden geëvalueerd door de fold-Change verdeling van alle sgRNA te beoordelen tegen een gouden standaard referentielijst van essentiële (684 genen) en niet-essentiële genen (926 genen) en gevisualiseerd als nauwkeurige curven10. Met behulp van de goud-standaard referentie sets, Bayes factor (BF) scores worden berekend voor het scherm eindpunt en precisie-terugroepen curven worden uitgezet. BF scores worden berekend door het analyseren van de log-fold verandering voor alle gidsen gericht op een gen met behulp van een Bayesian kader (de BAGEL algoritme beschreven eerder19) om distributies van bekende essentiële en niet-essentiële gids sets te vergelijken. False Discovery rates (FDR) worden empirisch afgeleid met dezelfde gouden standaard referentie sets. Een hoog presterende scherm moet een groot aantal essentiële genen herstellen bij een drempel van BF > 6 en FDR < 5%, zoals blijkt uit een scherpe "elleboog" in de meeste bochten en een rechte lijn naar het eindpunt, zoals aangegeven door de blauwe lijn in Figuur 3a. Ook de uitval van gidsen gericht op essentiële en niet-essentiële genen moet worden onderzocht (Figuur 3b). Gidsen die gericht zijn op de referentie-niet-essentiële genen moeten een grotendeels symmetrische verdeling van log-fold veranderingen vertonen gecentreerd op nul, zoals getoond door de onderbroken lijn in Figuur 3b. De fold Change verdeling van gidsen gericht op essentiële genen toont een sterke negatieve verschuiving ten opzichte van de verspreiding van gidsen die zich richten op niet-essentiële genen, zoals blijkt uit de ononderbroken lijn in Figuur 3b.
Essentiële genen
Een van de basistoepassingen van gegroepeerde genoom-brede drop-out schermen is het identificeren van essentiële genen. Essentiële genen, een subcategorie van fitness-genen, zijn genen waarvan de perturbatie veroorzaakt celletaliteit, ook als losjes als proliferatie genen beschouwd. In de context van Kankerbiologie, is het mogelijk om context-specifieke Essentials te identificeren om afhankelijkheden voor een bepaalde tumor cellijn te identificeren. Figuur 4, toont de genrang van essentiële genen met behulp van Bayes-factor scores, afgeleid van het bagel-algoritme. Bayes factor (BF) vertegenwoordigt een betrouwbaarheids maatregel die het gen knock-out resulteert in een fitness defect. Positievere scores geven een hoger vertrouwen aan dat de perturbatie een afname van de conditie veroorzaakt.
Positief selectiescherm
Genoom-Wide knock-out zwembaden kunnen worden gekweekt in de aanwezigheid van overtollige drug agent op zoek naar suppressor/resistentiegenen. Hier is een voorbeeld van HCT116 cellen gescreend in de aanwezigheid van thymidine om te zoeken naar suppressors van G1/S arrestatie3. Details van dit scherm u vinden in een vorige publicatie3. Kort, 6 dagen na selectie van CRISPR Library geïnfecteerde cellen, cellen werden opgesplitst in replicaties behoud van bibliotheek dekking en behandeld met thymidine. Cellen werden in aanwezigheid van geneesmiddel doorgangen totdat er voldoende resistente cellen werden teruggewonnen voor genomische DNA-bemonstering. Positieve selecties kunnen worden gesequentieerd (Lees diepte) bij lagere dekking dan negatieve schermen, omdat slechts een klein deel van de gidsen zal blijven door de sterke selectieve druk. In dit voorbeeld werd sequentiëren verkregen met een paar miljoen leesbewerkingen en 11 van de 12 Sgrna's gericht op thymidine kinase (TK1) werden teruggewonnen en verrijkt zoals verwacht (Figuur 5).
| De bedragen werden bepaald op basis van de molaire verhouding van 1:1:1 | ||
| Component | Bedrag per plaat van 15 cm een heel | |
| LCV2::TKOv3 | pLCKO2::TKOv3 | |
| psPAX2 | 4,8 μg | 7,0 μg |
| pMD2. G | 3,8 μg | 4,0 μg |
| TKOv3b | 8,0 μg | 5,0 μg |
| een heel Bedragen bepaald op basis van de meest productieve plasmide combinatie voor TKO Library bij 1:1:1 molaire ratio | ||
| b Bedrag TKO plasmide op basis van CRISPR Library vector backbone. LCV2 all-in-One vector = 13 KB, niet-Cas9 pLCKO2 vector = 7,6 KB | ||
Tabel 1: aanbevolen hoeveelheid plasmide voor TKOv3 transfectie.
| Component | Bedrag per plaat van 15 cm |
| Opti-MEM | 800 μL |
| Transfection reagens | 48 μL |
Tabel 2: transfectie-reagens op basis van lipide-opstelling.
| Fold-dekking | Aantal cellen per sgRNAb | Aantal cellen dat nodig is voor infectieb |
| (sgRNA Library groottea × fold dekking) | (sgRNA Library grootte × fold dekking ÷ 0,3 MOI) | |
| 200 | 1,5 x 107 | 5 x 107 |
| 500 | 3,6 x 107 | 1,2 x 108 |
| 1000 | 7,1 x 107 | 2,4 x 108 |
| een heel Gebaseerd op TKOv3 Library size = 71.090 sgRNA | ||
| b Getallen worden naar boven afgerond | ||
Tabel 3: bepaling van de celnummers die nodig zijn voor TKOv3 CRISPR Library infectie en celplating bij verschillende vouwen-dekking.
| Behandeling | Aantal benodigde platen voor infectie | |
| Zeef platen | Virus, + puromycine | (sgRNA Library size × 200-fold) ÷ 0,3 MOI ÷ celseeding dichtheid bij infectie = aantal platen vereisteen |
| Controle 1 | Geen virus, + puromycine (0% overlevings controle) | 1 |
| Controle 2 | Virus, + geen puromycine (100% overlevings controle) | 1 |
| a inclusief extra platen om de schommelingen en groeipercentages van Moi te accommoderen | ||
Tabel 4: berekening voor infectie opstelling.
| Reagentia | Hoeveelheid per 1x-reactie |
| 2x Master Mix | 25 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 voorwaartse primer | 2,5 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 reverse primer | 2,5 μL |
| Genomisch DNA | 3,5 μg |
| Water | tot 50 μL |
| Totale | 50 μL |
Tabel 5: PCR 1-opstelling.
Tabel 6: PCR-primers voor versterking van LCV2:: TKOv3 volgorde bibliotheken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Tabel 7: PCR-primers voor versterking van pLCKO2:: TKOv3 volgorde bibliotheken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Stap | Temperatuur | Tijd | |
| 1 | 98 °C | 30 sec | |
| 2 | 98 °C | 10 sec | 25 cycli (stap 2 – 4) |
| 3 | 66 °C | 30 sec | |
| 4 | 72 °C | 15 sec | |
| 5 | 72 °C | 2 min. | |
| 6 | 10 °C | Houden |
Tabel 8: PCR 1 cyclus parameters.
| Reagentia | Hoeveelheid per 1x-reactie |
| 2x Master Mix | 25 μL |
| 10 mM i5 voorwaartse primer | 2,5 μL |
| 10 mM i7 reverse primer | 2,5 μL |
| PCR 1 product | 5 μL |
| Water | 15 μL |
| Totale | 50 μL |
Tabel 9: PCR 2-opstelling.
| Stap | Temperatuur | Tijd | |
| 1 | 98 °C | 30 sec | |
| 2 | 98 °C | 10 sec | 10 cycli (stap 2 – 4) |
| 3 | 55 °C | 30 sec | |
| 4 | 65 °C | 15 sec | |
| 5 | 65 °C | 5 min. | |
| 6 | 10 °C | Houden |
Tabel 10: PCR 2 cyclus parameters.
Aanvullende tabel S1. TKO Reference Gene sets Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de gegroepeerde screening-workflow. A) de beoogde celpopulatie is geïnfecteerd met crispr Library lentivirus bij lage Moi om ervoor te zorgen dat de meeste cellen één virale integratie krijgen en dat de bibliotheek representatie wordt gehandhaafd. De verschillende kleuren vertegenwoordigen verschillende Sgrna's in elk virale deeltje. Er zijn genetisch gemodificeerde celpools geselecteerd. Zodra de selectie is voltooid, worden cellen bemonsterd voor T0-referentie en doorgangen. B) bij de eerste passage na T0 zijn cellen hersteld van infectie en kunnen, indien nodig, medicamenteuze behandelingen worden toegevoegd. Na de behandeling worden de celpopulaties gedurende enkele weken met de serie gepassaerd. Tijdens elke passage worden cellen verzameld voor genomisch DNA en herplaatst bij de vereiste vouw dekking van de sgRNA-bibliotheek. (C) twee soorten schermen kunnen worden uitgevoerd: 1) positieve selectie schermen, die Mutante cellen identificeren die weerstand of toegenomen overleving vertonen onder de specifieke selectiedruk (bijv. drugs of Mutant cellijn), omdat ze zullen worden verrijkt tijdens de flatscreen of 2) negatieve selectie schermen, die Mutant cellen identificeren met verhoogde gevoeligheid voor of verlies van overleving onder de scherm selectiedruk, omdat ze verloren zullen gaan tijdens het scherm. (D) GENOMISCH DNA wordt geoogst en PCR-versterkt om de geleidings gebieden te verrijken. (E) de gids overvloed wordt gekwantificeerd door de volgende generatie sequencing en verrijkt, of verarmd gidsen worden bepaald voor "hit" identificatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: kwaliteit van versterkte CRISPR sgRNA bibliotheek. Versterkte bibliotheek plasmiden worden geanalyseerd door de volgende generatie sequencing (aanbevolen leest: 30.000.000 leest, overeenkomend met ~ 400-fold representatie van de bibliotheek). Hier is een bibliotheek met een strakke verdeling van Sgrna's, met > 95% van alle Sgrna's binnen een 4-voudige distributie Range. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: evaluatie van de drop-out schermkwaliteit met behulp van goud-standaard essentiële gen referentie sets. A) onderzoek naar de analyse van de nauwkeurigheid van de screening resulteert in het herstellen van essentiële genen aan een drempel van BF > 6 en FDR van 5%. Hoog presterende scherm worden vertegenwoordigd door blauwe lijn en slecht presterende schermen worden vertegenwoordigd door rode lijn. B) de spreiding van de verandering van sgRNA gericht op essentiële genen (ononderbroken lijn) en niet-essentiële genen (gestippelde lijnen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: bepaling van de genen essentialiteit. Bayes factor ranking van gen in wezen in een bepaald scherm. Bayes factor (BF) vertegenwoordigt een betrouwbaarheids maatregel die het gen knock-out resulteert in een fitness defect. Hogere Bayes-factoren duiden op meer vertrouwen dat genknock-out resulteert in fitness defect, (rode stippen). Lagere Bayes factor scores suggereren knock-out biedt groei voordeel (blauwe stippen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 5: positief selectiescherm voor suppressor van thymidine blok in HCT116 cellen. Genormaliseerde Lees tellingen voor alle Sgrna's op T0 uitgezet tegen gemiddelde genormaliseerde Lees tellingen voor thymidine behandelde monsters. Voor positieve selectie schermen (d.w.z., met behulp van een IC90 concentratie van geneesmiddel), het aantal perturbaties die resistentie aan het geneesmiddel zal verlenen wordt verwacht dat klein. Om deze reden kan Lees diepte lager zijn dan wat nodig is voor negatieve schermen, in Powernet wordt verwacht dat het grootste deel van de bibliotheek wordt weergegeven. TK1 sgrnas zijn rood omcirkeld. Dit cijfer is gewijzigd van een vorige publicatie3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege de eenvoud van gebruik en hoge buigbaarheid, is CRISPR-technologie op grote schaal goedgekeurd als het instrument van keuze voor precieze genoom bewerking. Gepoolde CRISPR-screening biedt een methode om duizenden genetische verstoringen te ondervragen in één experiment. In gepoolde schermen dienen sgRNA-bibliotheken als moleculaire barcodes, omdat elke sequentie uniek is en wordt toegewezen aan het beoogde gen. Door het genomisch DNA van de celpopulatie te isoleren, kunnen genen die het fenotype van belang veroorzaken, worden bepaald door de overvloed aan sgRNA te kwantificeren door de sequentiëring van de volgende generatie. Massaal parallelle sequencing methoden worden gebruikt om te kwantificeren sgRNAs in monsters, wat betekent dat meerdere onafhankelijke celpopulaties kunnen worden samengevoegd in de dezelfde volgorde Lane om kosten te minimaliseren.
Alvorens een grootschalig screening project te beginnen, is het belangrijk om een goed gekarakteriseerd en technisch geoptimaliseerd model te hebben. Genetische achtergrond, groeisnelheid en transductie-efficiëntie zijn belangrijke factoren bij het kiezen van uw cellijnen voor screening. Groeipercentages en bewerkings efficiëntie bepalen bijvoorbeeld de schaalbaarheid en de technische geschiktheid van het model. Om grote sgRNA-bibliotheken adequaat te vertegenwoordigen, zijn tientallen miljoenen cellen vereist, waardoor het celnummer een beperkende factor kan zijn bij het screenen van de haalbaarheid voor cellijnen met langzamere doublings of degenen die geen goede proliferatieve capaciteit hebben (bijv. primaire cellen). Op basis van de groeipercentages moeten celkweek condities zoals celseeding dichtheid en plaatgrootte voor screening dienovereenkomstig worden geselecteerd. Het wordt aanbevolen om cellen in het grootste vaartuig te kweken dat praktisch en technisch haalbaar is voor het scherm.
Lentivirus transductie-efficiëntie varieert tussen celtypen, omdat cellen verschillen in inherente infectiviteit. Als gevolg hiervan zal het volume van het virus dat nodig is om een voldoende infectie te bereiken in één celtype niet noodzakelijkerwijs hetzelfde zijn in een andere. Daarom is het van cruciaal belang om functioneel titer elke partij linvirusbibliotheek geproduceerd in de cellijn te screenen om voldoende dekking van de bibliotheek en voornamelijk enkelvoudige transductie-gebeurtenissen per cel te verzekeren door te transduceren bij lagere MOIs rond 0,3 (rubriek 4). Transductie-efficiëntie kan ook worden beïnvloed door de celkweek omstandigheden; Daarom moeten functionele Antilichaamtiters worden bepaald aan de hand van dezelfde celcondities die in het scherm zullen worden gebruikt. Dat wil doen, het is belangrijk om dezelfde weefselkweek vaten, mediabestand delen en volume, celplating dichtheid en virus Preps zonder voorafgaande ontdoows te gebruiken. Metingen in verschillende formaten of voorwaarden zullen niet betrouwbaar worden geschaald naar het screening formaat.
Ondanks het voordeel van het gebruik van alles-in-één CRISPR Cas9 gids bibliotheken zoals LCV2:: TKOv3, het gen coderen Cas9 is vrij groot, waardoor het moeilijk is om efficiënt te verpakken in virale deeltjes (105-106 TU/ml). Het leveren van lagere lentivirale Antilichaamtiters kan een beperking zijn voor cellijnen die moeilijk te transduce zijn, omdat ze nog meer moeite zullen hebben met de all-one-CRISPR-bibliotheken. Om dit te verzachten, moet Cas9 in de cellijn van tevoren worden uitgedrukt, gevolgd door de levering van CRISPR-bibliotheken die alleen sgRNAs bevatten (bijv. pLCKO2:: TKOv3), die bij veel hogere Antilichaamtiters kan worden gemaakt (107-108 TU/ml). De ploïdie van een cellijn is ook belangrijk, omdat het het aantal doel loci bepaalt dat moet worden gewijzigd. De mogelijkheid om volledige knock-outs in haploïde cellen te genereren is efficiënter dan in cellen met meerdere kopieën van een bepaald gen. Daarom kunnen schermen in haploïde cellen gevoeliger zijn en hogere kwaliteitsgegevens opleveren dan schermen die worden uitgevoerd in diploïde-of aneuploïde cellijnen6. Het testen van bekende genen die aan het fenotype zijn gekoppeld, helpt bij het bepalen van de scherm capaciteit van een cellijn model. Bijvoorbeeld, voor essentialiteits schermen kunnen gidsen die gericht zijn op een subeenheid van de 26S proteasome, PSMD1 (addgene: plasmide #74180), een kern essentieel gen, worden gebruikt om de bewerkings efficiëntie en de infectibiliteit van cellijnen te testen, als perturbatie van PSMD1 zal resulteren in celdood.
De robuustheid van gepoolde schermen is sterk afhankelijk van de weergave van sgRNA. Dit is een belangrijke statistiek die de prestaties van de bibliotheek bepaalt tijdens een scherm en de mogelijkheid om hits te identificeren. Diversiteit in bibliotheken is bevooroordeeld in de representatie van elke sgRNA; Daarom moet de populatie van cellen die moeten worden gescreend en geanalyseerd voldoende groot zijn om ervoor te zorgen dat de ondervertegenwoordigde sgRNAs6wordt gevangen. 200-tot 1000-voudige representatie van elke sgrna is de typische dekking die is gebruikt in gepubliceerde schermen (d.w.z. 200-1000 cellen per sgrna)10,15. Deze vertegenwoordiging moet worden gehandhaafd bij het versterken van de bibliotheek plasmide (sectie 1) en het hele scherm door het infecteren en het doorgeven van het vereiste celnummer (sectie 5) om de gewenste bibliotheek dekking en tijdens sequentiëren bibliotheek weer te geven voorbereiding (protocol 6), zoals beschreven in het hele protocol. Bijvoorbeeld, om te bereiken ~ 200-fold dekking van de TKOv3 bibliotheek vereist selectie en passage van 15.000.000 geïnfecteerde cellen. Tijdens de sequencing, uitgaande van een diploïde menselijk genoom bevat ~ 7,2 pg van DNA en 1 sgRNA per genoom, een totaal van 100 μg genomisch DNA is vereist voor het genereren van de sequentiëren bibliotheek voor 15.000.000 sequentie leest. De beslissing van de dekking zal afhangen van de grootte van de bibliotheek, als dekking van grotere bibliotheken zal vereisen het kweken van groter aantal cellen die moeilijk te onderhouden en niet technisch praktisch kan zijn. Een minimum van 200-voudige dekking is aan te bevelen bij TKOv3-Bibliotheken, omdat 200-fold een optimaal evenwicht biedt tussen de logistiek van het screenen van groot aantal cellen en het behoud van voldoende dynamisch bereik om echte biologische sgRNA-drop-outs te detecteren met beperkte ruis van willekeurige depleties22,23. Hogere bibliotheek representaties resulteren in verbeterde reproduceerbaarheid en zorgen voor voldoende venster voor de detectie van veranderingen in de overvloed aan sgRNA, vooral voor negatieve selecties. Een beperkende eigenschap van negatieve schermen is dat de perturbatie alleen uitgeput is in de mate dat deze aanwezig was in de start bibliotheek24. Ter vergelijking, het dynamische bereik van positieve selectie schermen is veel groter, omdat ze afhankelijk zijn van verrijking van cellen, en kan verrijken tot 100% van de eind populatie23. Daarom kunnen voor positieve selectie schermen (bijv. weergave van de resistentie van de drug) de dekking van de bibliotheek en de Lees diepte worden gereduceerd tot 50-tot 100-voudige representatie, aangezien slechts een kleine celpopulatie naar verwachting kan overleven.
De sequentiëren Library protocol hier beschreven is een twee-stappen PCR geoptimaliseerd voor TKOv3 crispr bibliotheken in zowel vector wervels en geordend op de Illumina sequencing platform. Deze sequencing bibliotheken kunnen ook worden gegenereerd met behulp van een enkel PCR-Protocol, vergelijkbaar met dat beschreven in hart et al.3. Voor andere kant-en-klare bibliotheken moeten de voor deze bibliotheken voorziene primers en sequentie protocollen worden geraadpleegd. Bij de bereiding van genomisch DNA en PCR-samples is het essentieel om rekening te moeten worden met voorzorgsmaatregelen bij verontreiniging. Een specifiek gebied voor genomische DNA-zuivering wordt bijvoorbeeld sterk aanbevolen. Het moet ook fysiek worden onderscheiden van bacteriële plasmide Preps, die gemeenschappelijke verontreinigingen zijn gevonden in genomische DNA-monsters. PCR-reacties moeten worden ingesteld in een speciale PCR-kap, omdat dit de besmetting van plasmiden en andere sequentierings bibliotheken minimaliseert. Voor een goede praktijk kan een negatieve controle zonder sjabloon worden opgenomen om PCR-besmetting te monitoren.
Gegevensanalyse voor het vertalen van sequentiëren leesbewerkingen van schermen is een niet-triviale taak, gezien de grootte en de diversiteit van deze gegevenssets. Zodra de sequentie leesbewerkingen zijn uitgelijnd en genormaliseerd, zijn verschillende bioinformatische gereedschappen beschikbaar om te helpen bij het evalueren van de schermprestaties (Figuur 3) en de treffer identificatie (Figuur 4). BAGEL wordt in dit protocol beschreven als het belangrijkste hulpmiddel voor gegevensanalyse. BAGEL gebruikt een Bayesiaans kader om de distributies van bekende essentiële en niet-essentiële gensets te vergelijken met de log-fold verandering van alle gidsen gericht op een gen. Deze methode wordt gedetailleerd beschreven in hart et al3. Naast BAGEL kunnen ook andere algoritmen worden gebruikt die zijn ontworpen om zowel verrijkte als uitgeputte Sgrna's te identificeren, zoals MAGeCK25 . Voor drug screens wordt aanbevolen om het DrugZ-algoritme te gebruiken om zowel synergetische als suppressor chemische genetische interacties te identificeren. DrugZ werd ontworpen om de relatieve overvloed van sgRNA in een behandelde populatie te vergelijken met de relatieve overvloed van sgRNA in een onbehandelde populatie op hetzelfde tijdspunt20.
Een beperking van CRISPR-schermen is dat Cas9 niet altijd leidt tot een knock-out, omdat er altijd een mogelijkheid is dat de gecreëerde indels in-frame mutaties zijn, waardoor de genen functie13intact blijft. Dit resulteert in een gemengde populatie, waardoor het scherm "luidruchtig" en interpretatie van gegevens uitdagend. Het gebruik van meerdere onafhankelijke Sgrna's gericht op een gen kan redundantie opbouwen, waardoor het effect van sgRNAs met lage activiteit wordt verminderd. Een bijkomend voorbehoud voor CRISPR studies is het effect van de dubbele strand pauzes gecreëerd door Cas9 nuclease, wat kan leiden tot cellulaire letaliteit onafhankelijk van het gen dat wordt getarget. Dit anti-proliferatieve effect neemt toe met het Kopieer nummer van de doelsite, wat leidt tot valse positieve identificatie van genen binnen sterk versterkte gebieden26. Computationele methoden zoals CERES zijn ontwikkeld om te corrigeren voor kopieer nummer effecten27. Deze werkstromen beschouwen het Kopieer nummer effect om de genafhankelijkheids niveaus in te schatten in op knock-out gebaseerde essentialiteits schermen. Zorgvuldige onderzoek van genomische locaties van hit-genen in versterkte regio's kan helpen bij het bepalen van valse positieven die te wijten zijn aan veelheid van snij effecten13. Primaire schermen kunnen alleen potentiële hits identificeren. Het is belangrijk om follow-up met een secundair scherm of protocol om de hits te valideren en te onderscheiden op-target van off-target effecten, het wieden van valse positieven en ervoor te zorgen dat genen die zwak scoren als gevolg van ineffectieve verstoringen niet achterblijven als False negatieven23.
Dit protocol richt zich op op levensvatbaarheid gebaseerde screening benaderingen, waarbij de conditie van studie moet leiden tot een proliferatie defect of de dood van cellen. Voor processen die niet leiden tot een verandering in de levensvatbaarheid van de cellulaire, kan de op levensvatbaarheid gebaseerde gepoolde screeningmethode restrictief zijn. Een alternatief is het uitvoeren van schermen met behulp van Reporter of marker gebaseerde assays en verrijking door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) benaderingen. In op marker gebaseerde selectie schermen is het fenotype gebaseerd op mutaties die de genexpressie van markers reguleren in plaats van de celgezondheid13,23. Arrayed CRISPR formaten zijn ook beschikbaar voor One-gen per well screening. Indelingen zijn meer vatbaar voor complexe of microscopie gebaseerde Lees-outs. Voor de indeling van de indelingen zijn echter geautomatiseerde apparatuur en grote hoeveelheden reagentia vereist28.
Het hier besproken screening protocol gebruikt S. pyogenes Cas9 Nuclease om nulallelen te maken, wat de meest gebruikte is voor genetische schermen en waarvoor veel bibliotheken beschikbaar zijn (addgene: gepoolde bibliotheken). Alternatieve opties voor knock-out bibliotheken zijn ook beschikbaar, die gebruik maken van een katalytisch dode dCas9 vastgebonden aan chromatine modifier eiwitten te remmen (CRISPRi) of activeren (CRISPRa) transcriptie van genen. Net als bij RNAi biedt CRISPRi de mogelijkheid om fenotypische effecten te bestuderen bij verschillende gendoses en essentiële genen die geen volledige knock-out kunnen tolereren, terwijl CRISPRa kan worden gebruikt om gain-of-function-schermen uit te voeren. Elk van deze technologieën hebben hun voordelen, maar in het algemeen, de CRISPR knock-out aanpak is de meest ontwikkelde. Het is bewezen goed presteren met weinig ruis, minimale off-target effecten, en experimentele consistentie, vooral in op letaliteit gebaseerde essentiële genschermen, in vergelijking met een knock-down benaderingen met behulp van CRISPRi en shRNAs5. Ondanks de uitgebreide toepasbaarheid tot nu toe, blijft CRISPR screenings technologie in zijn vroege stadia. Nieuwe tools worden nog steeds opgebouwd uit de basiscomponenten van CRISPR. Deze omvatten combinatorische genbewerkingsstrategieën die meerdere genomische loci kunnen targeten, optimalisatie van orthogonale CAS-enzymen en modificaties met chromatische functionele domeinen om Cas9-activiteiten te diversifiëren. Omdat de CRISPR-technologie blijft groeien, zal de koppeling naar genetische screening benaderingen dienen als een krachtig platform voor functionele ontdekking in de genetica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door Genome Canada, het Ontario Research Fund en de Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
References
- Jiang, F., Doudna, J. A.
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
- Pedregosa, F. V., G,, et al.
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
