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Genetics

Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères

Published: September 4, 2019 doi: 10.3791/59780
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2,3
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

La technologie CRISPR-Cas9 fournit une méthode efficace pour modifier précisément le génome des mammifères dans n'importe quel type de cellule et représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome. Un protocole détaillé discutant des étapes requises pour la réussite des écrans CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome sont fournis ici.

Abstract

L'édition du génome à l'aide du système CRISPR-Cas a considérablement avancé la capacité d'éditer avec précision les génomes de divers organismes. Dans le contexte des cellules de mammifères, cette technologie représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome pour des études de génomique fonctionnelle. Les bibliothèques d'ARN guides (sgRNA) ciblant tous les cadres de lecture ouverts permettent la génération facile de milliers de perturbations génétiques dans un seul pool de cellules qui peuvent être dépistés pour des phénotypes spécifiques pour impliquer la fonction génique et les processus cellulaires dans un impartiale et systématique. Les écrans CRISPR-Cas fournissent aux chercheurs une méthode simple, efficace et peu coûteuse pour découvrir les plans génétiques des phénotypes cellulaires. En outre, l'analyse différentielle des écrans exécutés dans diverses lignées cellulaires et de différents types de cancer peut identifier des gènes qui sont contextuellement essentiels dans les cellules tumorales, révélant des cibles potentielles pour des thérapies anticancéreuses spécifiques. L'exécution d'écrans à l'échelle du génome dans les cellules humaines peut être intimidante, car cela implique la manipulation de dizaines de millions de cellules et nécessite l'analyse de grands ensembles de données. Les détails de ces écrans, tels que la caractérisation des lignées cellulaires, les considérations de bibliothèque CRISPR, et la compréhension des limites et des capacités de la technologie CRISPR au cours de l'analyse, sont souvent négligés. Fourni ici est un protocole détaillé pour la performance réussie des écrans à base de génome regroupés À l'échelle du génome CRISPR-Cas9.

Introduction

CRISPR-Cas, abrégé pour les répétitions palindromic courtes régulièrement interspatiales et les nucléases associées au CRISPR, se compose d'une seule protéine nucléase (p. ex. Cas9) en complexe avec un ARN guide synthétique (sgRNA). Ce complexe de ribonucléoprotéines cible l'enzyme Cas9 pour induire des ruptures d'ADN à double brin à un locus génomique spécifique1. Les pauses à double brin peuvent être réparées par l'intermédiaire d'une réparation dirigée par homologie (HDR) ou, plus généralement, par l'assemblage de fin non homologue (NHEJ), un mécanisme de réparation sujet aux erreurs qui entraîne une insertion et/ou des suppressions (INDELS) qui perturbent fréquemment la fonction génique. 1. L'efficacité et la simplicité de CRISPR permettent un niveau de ciblage génomique jusque-là inaccessible qui dépasse de loin les technologies précédentes d'édition du génome [c.-à-d. les nucléases de doigts de zinc (ZNF) ou les nucléases effectrices de type activateur de transcription ( TALENS), qui souffrent tous deux d'une complexité de conception accrue, d'une efficacité de transfection plus faible et de limitations dans l'édition de gènes multiplex2].

L'application de recherche fondamentale de l'édition du génome à base d'ARN à guide unique CRISPR a permis aux scientifiques d'interroger efficacement et à peu de frais les fonctions des gènes individuels et la topologie des réseaux d'interaction génétique. La capacité d'effectuer des écrans fonctionnels à l'échelle du génome a été grandement améliorée par l'utilisation du système CRISPR-Cas, en particulier par rapport aux technologies de perturbation génétique antérieures telles que l'interférence de l'ARN (ARNi) et la mutagénèse piège à gènes. En particulier, l'ARNi souffre d'effets hors cible élevés et d'un renversement incomplet, ce qui entraîne une sensibilité et une spécificité plus faibles par rapport à CRISPR3,4,5, tandis que les méthodes de piège à gènes ne sont réalisables que dans les haploïdes cellules pour les écrans de perte de fonction, limitant la portée des modèles cellulaires qui peuvent être interrogés6. La capacité de CRISPR à générer des éliminations génétiques complètes fournit un système plus biologiquement robuste pour interroger les phénotypes mutants, avec un faible bruit, des effets minimes hors cible et une activité constante entre les réactifs5. CrispR-Cas9 sgRNA bibliothèques qui ciblent l'ensemble du génome humain sont maintenant largement disponibles, permettant la génération simultanée de milliers de gènes knock-outs dans une seule expérience3,7,8,9 .

Nous avons mis au point des bibliothèques de lentilles sgRNA à l'échelle du génome CRISPR-Cas9 uniques appelées bibliothèques Toronto Knock-out (TKO) (disponibles par l'entremise d'Addgene) qui sont compactes et optimisées pour faciliter les écrans de génomique fonctionnelle à haute résolution. La dernière bibliothèque, TKOv3, cible 18 000 gènes de codage des protéines humaines avec 71 090 guides optimisés pour l'efficacité de l'édition à l'aide de données empiriques10. En outre, TKOv3 est disponible en tant que bibliothèque à un composant (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) exprimant Cas9 et sgRNAs sur un seul vecteur, allégeant la nécessité de générer des cellules stables exprimant Cas9, permettant à l'échelle du génome knock-out à travers un large éventail de types de cellules de mammifères. TKOv3 est également disponible dans un vecteur sans Cas9 (pLCKO2:TKOv3, Addgene ID 125517) et peut être utilisé dans les cellules qui expriment Cas911.

Une population cellulaire éditée par LE CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome peut être exposée à différentes conditions de croissance, l'abondance de sgARN au fil du temps étant quantifiée par le séquençage de la prochaine génération, fournissant une lecture pour évaluer le décrochage ou l'enrichissement des cellules ayant une génétique traçable perturbations. Les bibliothèques KNOCK-out CRISPR peuvent être exploitées pour identifier les gènes qui, lors d'une perturbation, causent des défauts de forme physique cellulaire, une sensibilité modérée aux médicaments (p. ex., des gènes sensibles ou résistants), régulent l'expression des protéines (p. ex., journaliste) ou sont nécessaires pour un certain fonction de voie et état cellulaire12,13,14. Par exemple, les écrans différentiels de forme physique dans une ligne de cellules cancéreuses peuvent identifier l'épuisement ou la réduction des oncogènes et de l'enrichissement ou une augmentation des gènes de suppresseurs de tumeur3,14,15. De même, l'utilisation de doses intermédiaires de médicaments thérapeutiques peut révéler à la fois la résistance aux médicaments et les gènes de sensibilisation16,17.

Il s'agit ici d'un protocole de dépistage détaillé pour le dépistage de la perte de fonction CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome à l'aide des bibliothèques Knock-out de Toronto (TKOv1 ou v3) dans les cellules des mammifères, de la génération de bibliothèques, du rendement du dépistage à l'analyse des données. Bien que ce protocole ait été optimisé pour le dépistage à l'aide des bibliothèques Knock-out de Toronto, il peut être appliqué et devenir évolutif dans toutes les bibliothèques regroupées CRISPR sgRNA.

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Protocol

Les expériences décrites ci-dessous devraient suivre les lignes directrices du Bureau de la santé et de la sécurité environnementales de l'Institut.

1. Amplification plasmique de plasmide de la bibliothèque lentimique DE CRISPR

  1. Diluer la bibliothèque d'ADN plasmique de CRISPR prête à l'emploi à 50 ng/L en TE (p. ex. TKOv3).
  2. Électropoler la bibliothèque à l'aide de cellules électrocompétentes. Mettre en place un total de quatre réactions d'électroporation comme décrit ci-dessous.
    1. Ajouter 2 'L de 50 ng/L bibliothèque TKO à 25 'L de cellules électrocompétentes décongelées aux cuvettes pré-réfrigérées (1,0 mm) sur la glace.
    2. Électroporate en utilisant des réglages optimaux suggérés par le protocole du fabricant. Dans un rayon de 10 s de l'impulsion, ajouter 975 l de moyen de récupération (ou soC moyen) à la cuvette.
    3. Transférer les cellules électroporated dans un tube de culture et ajouter 1 ml de milieu de récupération. Incuber les tubes dans un incubateur secouant à 250 tr/min pour 1 h à 37 oC.
  3. Installez une plaque de dilution pour titer la bibliothèque et estimez l'efficacité de la transformation.
    1. Mettre en commun les 8 ml de cellules récupérées et bien mélanger. Transférer 10 l des cellules mises en commun à 990 oL de milieu de récupération pour une dilution de 800 fois et bien mélanger.
    2. Plaque de 20 l de la dilution sur une plaque d'agar préréchauffée de 10 cm LB et carbenicilline (100 g/L). Il en résulte une dilution de 40 000 fois des transformateurs qui seront utilisés pour calculer l'efficacité de la transformation.
    3. Plaque de 400 l de cellules récupérées sur chaque plaque sur un total de 20 plaques d'agar de 15 cm de LB pré-chauffées. Incuber les assiettes de 14 à 16 h à 30 oC.
      REMARQUE : La croissance à cette température plus basse minimise la recombinaison entre les répétitions à long terminal (LTR)18.
    4. Pour calculer l'efficacité de la transformation, comptez le nombre de colonies sur la plaque de dilution de 40 000 fois (étape 1.3.2). Multipliez le nombre de colonies comptées par 40 000 pour obtenir le nombre total de colonies sur toutes les plaques. Procéder si le nombre total de colonies représente une couverture de bibliothèque équivalente à un minimum de 200x colonies par sgRNA (le plus optimal est 500-1000x).
      1. Par exemple, le nombre minimal de colonies pour la bibliothèque TKOv3 (71 090 sgRNA) est de 1,4 x 107, ce qui équivaut à 200 x colonies par sgRNA. Si la représentation des colonies est insuffisante, augmenter le nombre d'électroporations à l'étape 1.2 en fonction du nombre de colonies sur la plaque de dilution afin d'atteindre la couverture minimale de la bibliothèque.
  4. Récolte des colonies telles que décrites ci-dessous
    1. À chaque plaque de 15 cm, ajouter 7 ml de lb et de carbenicilline (100 g/L) moyen, puis gratter les colonies avec un épandeur de cellules. À l'' abri d'une pipette de 10 ml, transférer les cellules grattées dans un flacon ou une bouteille stérile de 1 L.
    2. Rincer une fois de plus la plaque avec 5 ml de LB et de carbenicilline moyen et transférer la solution à la bouteille.
    3. Répétez l'opération pour toutes les assiettes pour mettre en commun les cellules de 20 assiettes dans une bouteille stérile.
  5. Mélanger les cellules collectées avec une barre d'agitation pendant 1 h à température ambiante (RT) pour briser les amas cellulaires. Transférer les cellules dans des bouteilles de centrifugeuses pré-pesées et une centrifugeuse à 7 000 x g de bactéries à granulés, puis jeter les supports.
  6. Peser la pastille de cellules humides et soustraire le poids de la bouteille de centrifugeuse pour déterminer le poids final de la pastille humide. Purifie l'ADN plasmide à l'aide d'un kit de purification du plasmide à l'échelle maxi ou méga-échelle en fonction de la quantité de granule bactérienne que chaque colonne peut traiter.

2. Production de lentivirus de bibliothèque de SgRNA à grande échelle

REMARQUE : Toutes les étapes de cette section du protocole sont effectuées dans une installation BSL2MD dans un cabinet de biosécurité de classe II de type A2.

  1. Calculez le nombre de plaques de 15 cm nécessaires à la production de virus en fonction de l'estimation selon laquelle 18 ml de virus sont généralement récoltés à partir d'une plaque de 15 cm.
  2. Préparer les cellules à la transfection en ensemenceant les cellules d'emballage HEK-293T dans des supports de croissance à faible teneur en antibiotiques (DMEM - 10 % FBS - optionnel : 0,1x stylo/strep) à 8 x 106 cellules par plaque de 15 cm dans 20 ml de support. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 oC, 5 % de CO2. Assurez-vous que les cellules plaquées sont des confluents de 70 % à 80 % et qu'elles sont réparties uniformément au moment de la transfection.
  3. Le lendemain, préparer trois plasmides de transfection comme indiqué dans le tableau 1 pour les plaques de 15 cm. Calculez la quantité de plasmide nécessaire pour une transfection et faites un mélange de plasmides pour le nombre de plaques, plus un à transfecter.
  4. Préparer un réactif de transfection à base de lipides pour chaque transfection tel qu'indiqué dans le tableau 2. Aliquot a réduit le support sérique en tubes individuels de microcentrifuge de 1,5 ml pour le nombre de plaques à transpercer. Ajouter le réactif transfection, mélanger délicatement et incuber pendant 5 min à RT.
  5. Après 5 min d'incubation, ajouter la quantité d'ADN requise pour une transfection au réactif de transfection pour un rapport de 3:1 de réactif de transfection-à-g de complexe d'ADN. Mélanger délicatement et incuber pendant 30 min à RT.
    REMARQUE : Les transfections ultérieures peuvent être préparées en cinq ensembles ou moins, avec des intervalles de 5 minutes pour optimiser le temps et éviter la surincubation.
  6. Après 30 min d'incubation, transférer soigneusement chaque mélange de transfection dans chaque assiette de cellules d'emballage. Ajouter le mélange entier à l'aide d'une pointe de pipette de 1 ml dans le sens de la chute dans un mouvement circulaire en zigzag sans déranger la monocouche cellulaire. Incuber les cellules à 37 oC pendant 18 h à 5 % CO2.
  7. Préparer les supports de récolte virales : 500 ml de milieu DMEM , 32 ml de bouillon BSA (20 g/100 ml, dissous dans le DMEM, filtre stérilisé avec un filtre de 0,22 m) et 5 ml de stylo/streptocoque 100x.
  8. Après 18 h, retirer les supports (utiliser la manipulation appropriée des déchets de lentivirus comme l'incubation dans 1 % d'hypochlorite de sodium pendant 30 min avant l'élimination). Remplacer délicatement par 18 ml de média de récolte virale à chaque assiette. Incuber les cellules à 37 oC pendant 18 h à 5 % CO2.
  9. Après 24 h, vérifiez les cellules d'emballage pour la morphologie anormale et fusionnée comme indication de la bonne production de virus. Puis, récolter le lentivirus en recueillant tous les supernatants et en le transférant dans un tube conique stérile de centrifugeuse.
  10. Faites tourner le support contenant le virus à 300 x g pendant 5 min et pelletent les cellules d'emballage. Aliquot le supernatant dans un tube stérile de polypropylène sans déranger la boulette.
  11. Conserver le virus à 4 oC pendant de courtes périodes (moins d'une semaine) ou immédiatement à -80 oC pour un stockage à long terme. Aliquot se prépare à utiliser des volumes à usage unique pour le stockage à long terme afin d'éviter le gel/dégel.

3. Caractérisation de la ligne cellulaire pour le dépistage

  1. Sélectionnez la ligne cellulaire désirée.
    1. Mesurer et enregistrer le temps de doublement approximatif des cellules.
    2. Déterminer la densité optimale de placage cellulaire pour la culture des cellules chaque doublement de cellules de 3 à 4 dans un vaisseau de culture tissulaire de choix (p. ex., plaques de culture tissulaire de 15 cm).
  2. Déterminer la concentration de puromycine à utiliser dans la ligne cellulaire souhaitée pour la sélection des bibliothèques TKO contenant le marqueur de résistance à la puromycine comme suit :
    1. Cellules de graines dans une plaque de 12 puits à la densité requise pour atteindre la confluence après 72 h, puis incuber pendant la nuit (37 oC, 5 % CO2).
    2. Le lendemain, passer à un support contenant une plage de dilution des concentrations de puromycine de 0 g/mL à 10 g/mL, par incréments de 0,5 g/mL. Incuber les cellules pendant 48 h.
    3. Après 48 h, mesurez la viabilité cellulaire par comptage cellulaire ou coloration alamarBlue.
    4. Déterminer la plus faible concentration qui tue 100 % des cellules en 48 h. Utilisez cette concentration pour sélectionner pour la bibliothèque CRISPR des populations de cellules transdulées dans les étapes 4.6 et 5.2.6.
      REMARQUE : Pour les lignées cellulaires avec des temps de doublement plus longs, des incubations plus longues avec de la puromycine peuvent être tolérées. Dans ces situations, déterminez la courbe de mise à mort pour le temps d'incubation requis pour les doubles de cellules de l'ilt;3. Réduire au minimum le temps de sélection afin d'éviter le décrochage des gènes essentiels avant le début du dépistage.
  3. Vérifier la sensibilité des cellules au bromure d'hexadimethrine (jusqu'à 8 g/mL) en appliquant une courbe de réponse à la dose selon la même méthode que celle utilisée pour mesurer la sensibilité à la puromycine (étape 3.2). Si l'on observe une toxicité avec 8 g/mL de bromure d'hexadimethrine, ne l'utilisez pas.

4. Titration fonctionnelle de la bibliothèque de lentivirus CRISPR mise en commun pour la détermination de MOI

  1. Décongeler un nouvel aliquot de lentivirus de bibliothèque DEGRNA mis en commun (p. ex., LCV2::TKOv3) et rester sur la glace.
  2. Concevoir une série de volumes de virus à tester entre la plage de 0 à 2 ml (c.-à-d. 0 ml, 0,25 ml, 0,5 ml, 1 ml et 2 ml).
  3. Récoltez les cellules cibles et les cellules de semences dans des plaques de 15 cm à la densité requise pour atteindre la confluence en 72 h.
  4. Pour que chaque volume de virus soit testé, préparez des plaques en double. Ajouter les cellules, le virus, le bromure d'hexadimethrine (8 g/mL) et les médias à un volume final de 20 ml. Mélanger les assiettes à fond, asseoir le niveau des plaques dans un incubateur et incuber pendant 24 h (37 oC, 5 % CO2).
  5. Après 24 h, retirer le virus contenant des médias et éliminer (utiliser des précautions de biosécurité pour la manipulation des déchets de lentivirus). Optionnellement, lavez doucement la plaque avec du PBS chaud pour éliminer le virus extraterrestre.
  6. Pour chaque condition virale, remplacer par 20 ml de support contenant de la puromycine en utilisant la concentration déterminée à tuer les cellules dans la section 3, à une plaque de répétition. Dans l'autre assiette, ajouter 20 ml de média frais sans puromycine. Incuber pendant 48 h (37 oC, 5 % CO2).
  7. Après 48 h, vérifiez que toutes les cellules non infectées (0 mL d'affection virale) traitées à la puromycine sont mortes. Récoltez toutes les plaques individuellement et dispersez les cellules par pipetage doux répété.
  8. Comptez les cellules de toutes les plaques et calculez le MOI pour chaque volume de virus en comparant les numérations cellulaires avec la sélection de la puromycine aux numérations cellulaires sans puromycine (c.-à-d. la puromycine).
  9. Graphique des résultats pour déterminer le volume du virus qui mène à 30%-40% de survie cellulaire avec la sélection de la puromycine par rapport à sans puromycine. Utilisez ce volume de virus pour atteindre un MOI de 0,3 à 0,4 pendant l'écran dans les mêmes conditions de culture tissulaire.

5. Infection primaire d'écran, sélection, et passaging de cellules

  1. Sélectionnez la couverture de la bibliothèque SgRNA DE CRISPR à maintenir tout au long de l'écran (minimum recommandé de 200 fois).
    1. En fonction de la couverture de la bibliothèque, déterminer le nombre de cellules nécessaires pour maintenir cette couverture par ardendan et le nombre de cellules requises pour l'infection au MOI 0.3 (tableau 3).
    2. Déterminer le nombre de plaques nécessaires à la mise en place de l'infection (tableau 4).
  2. Infecter les cellules avec la bibliothèque CRISPR
    1. Récoltez les cellules et ensemencez le numéro de cellule requis à chaque plaque de 15 cm.
    2. Ajouter le bromure d'hexadimethrine (8 g/mL) dans toutes les assiettes.
    3. Ajoutez le virus au volume requis pour MOI 0.3 au criblage et aux plaques de contrôle 2. Pour le contrôle 1, n'ajoutez pas de virus et remplacez ce volume par des supports.
    4. Mélanger les assiettes à fond en inclinant. Placez les assiettes dans un incubateur, en vous assurant qu'elles sont de niveau.
      REMARQUE : Les infections par lots peuvent être causées en combinant un mélange maître de virus, de médias et de bromure d'hexadimethrine aux cellules en suspension avant le placage.
    5. Retirez les médias et remplacez-les par des supports frais contenant de la puromycine à la concentration déterminée à l'étape 3.2.4 au criblage et contrôlez 1 plaques 24 h après l'infection virale. Ajouter le support frais sans puromycine à la plaque de commande 2. Incuber les cellules pendant 48 h (37 oC, 5 % CO2).
    6. 48 h après l'addition de puromycine, s'assurer que toutes les cellules non infectées sont mortes (contrôle 1) pour confirmer l'activité de puromycine, puis moissonner les cellules infectées.
  3. Récolte de la population cellulaire infectée et de la passaging cellulaire
    1. Récoltez les cellules sélectionnées par la puromycine de toutes les plaques de criblage dans un récipient stérile. Recueillir les cellules de chaque plaque de contrôle séparément. Disperser les cellules par un tuyauterie à répétition douce.
    2. Compter les cellules à partir des cellules de criblage regroupées, contrôler 1, et contrôler 2 séparément et calculer le nombre de cellules par 1 ml.
    3. Calculer la couverture MOI et plier réalisée comme suit :
      Equation 1
      Equation 2
    4. Recueillir trois répliques de granulés cellulaires à partir des cellules mises en commun à la couverture de la bibliothèque sélectionnée pour l'extraction de l'ADN génomique. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min. Laver avec du PBS. Étiqueter les tubes et lyophiliser les granulés cellulaires à -80 oC (ce sont des échantillons de référence T0).
    5. Divisez le pool de cellules infectées en trois groupes de repli (p. ex., répliquer A, reproduire B, reproduire C), tout en maintenant la couverture de la bibliothèque dans chaque réplique. Les cellules de semence à la même densité d'ensemencement que ce qui serait normalement utilisé lors de leur expansion. Utilisez le même nombre de cellules pour chaque plaque répliquée use et le même nombre total de cellules entre les répliques.
    6. Continuer à passer les cellules et récolter trois répliques de granulés cellulaires de chaque réplique de cellules infectées mises en commun comme ci-dessus, tous les 3 à 8 jours selon la lignée cellulaire, pour un nombre allant jusqu'à 15 à 20 doubles cellulaires. À chaque passage, récoltez les cellules de toutes les plaques de chaque groupe de repli (c.-à-d. que toutes les cellules des plaques De repli A sont remélangées, toutes les cellules des plaques De repli B sont remélangées, etc.).
    7. Étiquetez chaque granule avec un temps (T) et reproduisez la désignation. Cela correspond au nombre de jours après T0 que la pastille est collectée (par exemple, T3-A, T3-B, T3-C, etc.).
  4. Pour les tests de sélection négative, permettre aux cellules de récupérer pendant au moins un passage après T0 avant le traitement. À T3 ou T6, divisez les cellules de chaque groupe répliqué (A, B, C) en populations de traitement et de contrôle de la drogue, en utilisant la même densité d'ensemencement utilisée à l'étape 5.3.5.
    1. Mettre en commun séparément le nombre de cellules requises pour la couverture de la bibliothèque pour chaque réplique dans le groupe de traitement de la drogue. Ajouter le médicament à des concentrations intermédiaires (IC20-IC50). Ensemencer les cellules et incuber (37 oC, 5 % CO2) jusqu'au prochain passage.
    2. Mettre en commun séparément le nombre de cellules requises pour la couverture de la bibliothèque pour chaque réplique dans le groupe témoin du véhicule. Ajoutez le contrôle du véhicule en utilisant le même volume que le médicament (0,5 % v/v). Ensemencer les cellules et incuber (37 oC, 5 % CO2) jusqu'au passage suivant.
    3. Continuer à passer les cellules et récolter les granulés cellulaires pour l'ADN génomique tous les 3 jours comme décrit à l'étape 5.3.5, tout en rafraîchissant le médicament ou le véhicule à chaque passage.
  5. Pour les écrans de sélection positive ou de résistance aux médicaments, divisez chaque groupe de repli en fonction du nombre de cellules requises pour la couverture de la bibliothèque. Ajoutez des concentrations de médicaments IC90 à chaque réplique. À IC90, une majorité de cellules seront tuées. Permettre aux populations résistantes de croître et de recueillir des granulés cellulaires (1/2 x 107 cellules) pour l'extraction de l'ADN génomique.

6. Préparation et séquençage de l'échantillon CRISPR

  1. Purification de l'ADN génomique
    1. Incuber les granulés de cellules congelés pendant 5 à 10 min à RT pour la décongélation.
    2. Ajouter 1,4 ml de PBS à un tube de centrifugeuse de 50 ml contenant une pastille cellulaire. Vortex pendant 20 s pour resuspendre les cellules et se reposer pendant 1 min. Si nécessaire, pipette 15x avec P1000 pour briser les amas de cellules restants. Si vous transférez les cellules d'un tube de 15 ml ou de 1,5 ml, resuspendles les cellules avec 1 ml de PBS, puis transférez les cellules dans un tube de 50 ml et rincez le tube d'origine avec 400 l de PBS.
    3. Ajouter 5 ml de solution de lyse nucléée aux cellules suspendues. À l'aide d'une pipette de 10 ml, mélanger l'échantillon en faisant monter et descendre 5 fois.
    4. Ajouter 32 oL de RNase A (20 mg/mL; pour obtenir une concentration finale de 100 g/mL) au lysate nucléaire et mélanger l'échantillon en inversant le tube 5x. Incuber le mélange à 37 oC pendant 15 min et laisser refroidir l'échantillon pendant 10 min à RT.
    5. Ajouter 1,67 ml de solution de précipitation protéique au lysate et le vortex vigoureusement pendant 20 s. De petits amas de protéines peuvent être visibles après le mélange.
    6. Centrifugeuse à 4 500 x g pendant 10 min à RT.
    7. À l'aide d'une pipette de 10 ml, transférer le supernatant dans un tube de centrifugeuse de 50 ml contenant 5 ml d'isopropanol. Mélanger délicatement la solution 10x par inversion jusqu'à ce que l'ADN soit observé.
      REMARQUE : L'ADN peut être observé sous forme de brins blancs ressemblant à des fils qui forment une masse visible.
    8. Centrifugeuse à 4500 x g pendant 5 min à RT pour granuler l'ADN.
    9. À l'aide d'une pipette de 10 ml, retirez soigneusement le supernatant et évitez de déloger la pastille d'ADN. Ajouter 5 ml d'éthanol à 70 % à RT à l'ADN. Faites pivoter doucement le tube pour laver la pastille d'ADN et les côtés du tube de centrifugeuse.
    10. Centrifugeuse à 4 500 x g pendant 5 min à RT.
    11. À l'aide d'une pipette de 10 ml, retirer soigneusement l'éthanol à 70 % et éviter de déloger le granule d'ADN. ADN génomique séché à l'air pendant 10 min à RT.
    12. Ajouter 400 L de solution TE au tube et laisser l'ADN se dissoudre en couve à 65 oC pendant 1 h. Mélanger l'ADN en faisant glisser doucement le tube toutes les 15 minutes. Si l'ADN ne se dissout pas complètement, incubez le tube à 65 oC pendant 1 h de plus tout en faisant glisser doucement le tube toutes les 15 minutes, et laissez-le à 4 oC pendant la nuit.
    13. Centrifugeuse à 4 500 x g pendant 1 min à RT et transfert de l'ADN génomique dans un tube à faible liaison de 1,5 ml.
    14. Quantifier et mesurer la pureté de l'ADN génomique sur le spectrophotomètre (pour la teneur totale en acide nucléique) et le fluoromètre (pour la teneur en ADN à double brin).
  2. Optionnellement, précipitez l'ADN génomique s'il y a des problèmes avec l'amplification en aval de PCR de l'ARScomme suit.
    1. Transférer l'ADN génomique de 400 L dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
    2. Ajouter 18 oL de 5 M NaCl (concentration finale de 0,2 M) et 900 l d'éthanol à 95 %.
    3. Inverser le tube 10x jusqu'à ce qu'il soit bien mélangé, puis centrifugeà 16 000 x g pendant 10 min à RT.
    4. Retirez soigneusement le supernatant et évitez de déloger la pastille d'ADN. Laver le granule d'ADN avec 500 l d'éthanol à 70 %. Faites pivoter doucement le tube pour laver la pastille d'ADN.
    5. Centrifugeuse à 16 000 x g pendant 5 min à RT.
    6. Retirez soigneusement le supernatant et évitez de déloger les granules d'ADN. ADN génomique séché à l'air pendant 10 min à RT.
    7. Ajouter 300 L de TE pour dissoudre l'ADN tel que décrit dans les étapes 6.1.12.
    8. Quantifier et mesurer la pureté de l'ADN génomique tel que décrit à l'étape 6.1.14.
  3. Préparation de la bibliothèque de séquençage CRISPR
    1. Configurez le PCR 1 tel qu'il est décrit dans le tableau 5 à l'aide d'un total de 100 g d'ADN génomique. Ajouter 3,5 g d'ADN génomique par réaction de 50 L et configurer des réactions identiques de 50 L pour atteindre la couverture souhaitée. Le tableau 6 énumère des exemples de séquences d'apprêt pour l'amplification des bibliothèques de séquençage LCV2::TKOv3. Le tableau 7 énumère des exemples de séquences d'apprêt pour l'amplification des bibliothèques de séquençage pLCKO2::TKOv3.
    2. Amplifiez les réactions PCR 1 dans un thermocycleur à l'aide du programme décrit dans le tableau 8.
    3. Vérifier l'amplification de PCR 1 en exécutant 2 'L du produit PCR sur un gel d'agarose de 1%. PCR 1 produit un produit de 600 pb.
    4. Regroupez toutes les réactions individuelles de 50 L pour chaque échantillon d'ADN génomique et mélangez par vortex.
    5. Configurez une réaction PCR 2 (50 l) pour chaque échantillon tel qu'indiqué dans le tableau 9 à l'aide de 5 L du produit PCR 1 mis en commun comme modèle. Utilisez des combinaisons d'apprêt d'index uniques pour chaque échantillon individuel afin de permettre la mise en commun d'échantillons de bibliothèque de séquençage.
    6. Amplifiez la réaction PCR 2 dans un thermocycleur à l'aide du programme décrit dans le tableau 10.
    7. Nettoyer l'équipement de gel d'agarose pour purifier les produits amplifiés avec 0.1 N HCl pendant 10 min avant de jeter un gel. Préparer un gel d'agarose de 2% contenant de la tache d'ADN pour purifier les produits amplifiés PCR 2.
    8. Exécutez le produit PCR 2 sur le gel agarose de 2% à basse tension (1,0 à 1,5 h d'exécution). PCR 2 produit un produit de 200 pb.
    9. Visualisez les produits PCR sur un transilluminateur de lumière bleue. Accise la bande de 200 pb et purifier l'ADN de la tranche de gel d'agarose à l'aide d'un kit d'extraction de gel. Quantifier et mesurer la pureté de la bibliothèque de séquençage sur le spectrophotomètre et le fluoromètre.
      REMARQUE : La concentration typique d'une bibliothèque de séquençage purifiée par le gel varie de 5 à 10 ng/L et un rendement total de 150 à 300 ng.
  4. Séquençage à haut débit
    1. Séquencez les bibliothèques de séquençage CRISPR sur les séquenceurs de nouvelle génération.
    2. Séquence de référence T0 échantillons à une profondeur de lecture plus élevée de 400 à 500 fois la couverture de la bibliothèque. Séquencer des échantillons de temps expérimentaux pour les écrans de décrochage à une profondeur de lecture minimale de 200 fois. Pour les écrans de sélection positifs forts, un minimum de profondeur de lecture de 50 fois la couverture est suffisant pour l'identification des sgRNAs enrichis.
      REMARQUE : Il est essentiel de séquencer l'échantillon T0 pour déterminer la représentation de la bibliothèque pour un écran particulier et servir de référence pour les changements de pli sgRNA déterminants au fil du temps.

7. Analyse des données

  1. Aligner la séquence à l'aide de programmes tels que Bowtie pour cartographier les lectures de séquence s'alument à la bibliothèque de référence en utilisant les paramètres suivants : -v2 (permettant deux décalages) et -m1 (en rejetant toute lecture qui a cartographié à plus d'une séquence dans la bibliothèque).
  2. Normalisez le nombre de lectures cartographiées de façon unique pour chaque sgRNA pour un échantillon donné à 10 millions de lectures par échantillon comme suit :
    Equation 3107 Annonces
  3. Calculez le changement de pli log2 de chaque sgRNA pour chaque réplique à chaque point de temps (Tn) par rapport à l'échantillon T0 (Tn/T0). Ajoutez un pseudo nombre de 0,5 lecture à tous les comptes de lecture pour éviter les discontinuités des zéros. Exclure les sgRNAs avec des lectures brutes de l'échantillon T0 du calcul des changements de pliage et de l'analyse en aval.
  4. Analyser les changements de pli avec l'algorithme Bayesian Analysis of Gene Essentiality (BAGEL) 'lt;https://github.com/hart-lab/bagel'gt;, en utilisant les ensembles de formation essentiels et non essentiels définis précédemment19 pour les écrans d'essentialité génique ( Tableau supplémentaire S1) ou DrugZ 'lt;https://github.com/hart-lab/drugZ'gt; pour les écrans de drogue20.
  5. Calculez la précision et le rappel pour l'évaluation des performances de l'écran à l'aide des scores BF. Utilisez l'ensemble essentiel de l'étape 7.4 comme véritable liste positive pour la fonction de précision-rappel-courbe de la bibliothèque Scikit-learn pour Python, ainsi que le sous-ensemble de score BF ci-dessus. Alternativement, effectuez la même chose en utilisant le paquet PRROC en R.
  6. Calculez le changement moyen de pli de tous les guides pour chaque gène. Générer des parcelles de densité pour les gènes essentiels et non essentiels (voir l'étape 7.4) dans un logiciel R ou équivalent. Dans R, si x.ess est un vecteur contenant les valeurs de changement de pli de journal des gènes essentiels et x.nonEss contiennent des gènes non essentiels, tracez en utilisant la commande suivante :
    plot( densité ( x.ess ), xlabMD"mean logFC",col"rouge", lwd-2 )
    lignes ( densité ( x.nonEss ), col'"bleu",lwd '2 )
    REMARQUE: Pour les détails de la version Python et les paquets utilisés, voir scikit-learn v0.19.1: (publié par Pedregosa et al.21).

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Representative Results

Aperçu du flux de travail de dépistage CRISPR à l'échelle du génome

La figure 1 illustre un aperçu du flux de travail de dépistage CRISPR mis en commun, en commençant par l'infection des cellules cibles avec le lentivirus de la bibliothèque CRISPR à un faible NIVEAU de VIE afin d'assurer des événements d'intégration unique et une représentation adéquate de la bibliothèque (généralement de 200 à 1 000 -plier). Après l'infection, les cellules sont traitées avec la puromycine antibiotique pour sélectionner pour les cellules cédées. Après la sélection, une pastille de base de cellules T0 est recueillie pour évaluer la distribution de la bibliothèque au début du dépistage. Les cellules restantes, composées d'une population hétérogène de perturbations génétiques, sont passages à la représentation désirée de bibliothèque tous les 3-4 jours pour 15-20 doubles pour permettre l'édition de gène et les effets résultants de se manifester. Les écrans avec des traitements médicamenteux sont généralement ajoutés à T3 ou T6 après que les cellules se sont rétablies de l'infection par le virus et de la sélection de la puromycine. Les cellules sont récoltées à la représentation souhaitée de la bibliothèque à chaque passage pour l'ADN génomique, afin de déterminer l'abondance du guide par le séquençage de la prochaine génération aux points de temps souhaités.

Il est recommandé de prélever plusieurs échantillons en cas de défaillances qui pourraient survenir dans les étapes de préparation de la bibliothèque de séquençage en aval. Les écrans mis en commun sont généralement des essais basés sur la viabilité qui sont conçus pour une sélection positive ou négative des sgARN essentiels. Les tests positifs identifient les gènes qui présentent une résistance ou augmentent la survie sous une pression de sélection spécifique (p. ex., médicaments ou lignée cellulaire mutante). Dans ce cas, la plupart des cellules mourront de la sélection, et les cellules qui restent seront enrichies pour les sgRNAs ciblant les gènes qui sont résistants pour le médicament ou l'état testé. Les écrans de sélection négatifs ou les écrans de « décrochage » identifient les éliminations génétiques avec une sensibilité accrue ou une perte de survie sous la pression de sélection de l'écran. Pour identifier les perturbations qui ont un effet phénotypique comme un défaut de croissance, l'abondance du guide à chaque point temporel est quantifiée par le séquençage de la prochaine génération et comparée à T0 pour évaluer le décrochage ou l'enrichissement des guides au cours de l'écran. À l'aide de plates-formes d'analyse, les modifications de la pliage des journaux sont mesurées pour les guides, et des algorithmes tels que le BAGEL peuvent être appliqués pour permettre le classement des visites génétiques.

Amplification et entretien de la bibliothèque dans les écrans CRISPR mis en commun

La figure 2 illustre la distribution prévue des guides après l'amplification de la bibliothèque plasmide. La bibliothèque TKOv3 se compose de 71 090 sgARN avec quatre sgRNAs par gène, ciblant 18 000 gènes codants protéiques10. Une bibliothèque idéale devrait avoir chaque sgRNA unique représenté à des quantités similaires. Par conséquent, il est recommandé de confirmer la distribution des guides dans la bibliothèque amplifiée par le séquençage de la prochaine génération. Montré ici est une bibliothèque amplifiée avec une distribution très serrée de sgRNAs, confirmant que 'gt;95% de tous les sgRNAs sont dans la gamme de distribution 4 fois (Figure 2). Une plus grande distribution des sgRNAs indiquera que l'abondance des guides de bibliothèque ne sont pas également représentées et peut contribuer au bruit dans les écrans mis en commun.

Évaluation des performances de l'écran

La figure 3 illustre que la qualité de performance d'un écran peut être évaluée en évaluant la répartition de changement de pli de tous les sgRNA par rapport à une liste de référence de référence de l'étalon-or des gènes essentiels (684 gènes) et non essentiels (926 gènes) et visualisée comme courbes de rappel de précision10. À l'aide des ensembles de référence de référence de référence, les scores Bayes Factor (BF) sont calculés pour le point de terminaison de l'écran, et les courbes de rappel de précision sont tracées. Les scores BF sont calculés en analysant la modification de la pliage des journaux pour tous les guides ciblant un gène à l'aide d'un cadre bayésien (l'algorithme BAGEL décrit précédemment19) pour comparer les distributions d'ensembles de guides essentiels et non essentiels connus. Les faux taux de découverte (FDR) sont dérivés empiriquement en utilisant les mêmes ensembles de référence de l'étalon-or. Un écran performant devrait récupérer un nombre élevé de gènes essentiels à un seuil de BF 'gt;6 et FDR 'lt;5%, comme en témoigne un "coude" tranchant dans la plupart des courbes et une ligne droite vers le point terminal comme le montre la ligne bleue dans la figure 3A. L'abandon des guides ciblant les gènes essentiels et non essentiels devrait également être examiné (figure 3B). Les guides ciblant les gènes non essentiels de référence doivent montrer une distribution largement symétrique des changements de plide-rond centrés à zéro, comme le montre la ligne pointillée de la figure 3B. La distribution de la variation des plis des guides ciblant les gènes essentiels montre un fort changement négatif par rapport à la distribution de guides ciblant les gènes non essentiels, comme le montre la ligne solide de la figure 3B.

Gènes essentiels

L'une des applications de base des écrans de décrochage à l'échelle du génome est d'identifier les gènes essentiels. Les gènes essentiels, une sous-catégorie de gènes de remise en forme, sont des gènes dont la perturbation provoque la létalité cellulaire, également considérée vaguement comme des gènes de prolifération. Dans le contexte de la biologie du cancer, il est possible d'identifier des éléments essentiels spécifiques au contexte afin d'identifier les dépendances pour une lignée cellulaire tumorale particulière. Figure 4, montre le rang génétique des gènes essentiels à l'aide des scores Bayes Factor, dérivés de l'algorithme BAGEL. Bayes Factor (BF) représente une mesure de confiance que le gène knock-out entraîne un défaut de forme physique. Des scores plus positifs indiquent une plus grande confiance que la perturbation provoque une diminution de la condition physique.

Écran de sélection positif

Les pools de knock-out à l'échelle du génome peuvent être cultivés en présence d'un agent médicamenteux excédentaire pour rechercher des gènes suppresseurs/résistances. Montré ici est un exemple de cellules HCT116 examinés en présence de thymidine à la recherche de suppresseurs de G1 / S arrestation3. Les détails de cet écran peuvent être trouvés dans une publication précédente3. En bref, 6 jours après la sélection des cellules infectées par la bibliothèque CRISPR, les cellules ont été divisées en répliques maintenant la couverture de la bibliothèque et traitées avec de la thymidine. Des cellules ont été passages en présence du médicament jusqu'à ce que des cellules résistantes suffisantes aient été récupérées pour l'échantillonnage génomique d'ADN. Les sélections positives peuvent être séquencées (lire la profondeur) à une couverture inférieure à celle des écrans négatifs puisque seule une petite fraction des guides restera due à la forte pression sélective. Dans cet exemple, le séquençage a été obtenu avec quelques millions de lectures, et 11 des 12 sgRNAs ciblant la kinase thymidine (TK1) ont été récupérés et enrichis comme prévu (figure 5).

Les montants ont été déterminés en fonction du ratio molaire de 1:1:1
composant Montant par plaque de 15 cm a (en)
LCV2::TKOv3 pLCKO2::TKOv3
psPAX2 (en) 4,8 g 7,0 g
pMD2.G 3,8 g 4,0 g
TKOv3b 8,0 g 5,0 g
a (en) Montants déterminés en fonction de la combinaison de plasmide la plus productive pour la bibliothèque TKO à 1:1:1 ratio molaire
b (en) Montant Plasmide TKO basé sur l'épine dorsale vectorielle de la bibliothèque CRISPR. LCV2 tout-en-un vecteur 13 kb, non-Cas9 pLCKO2 vector 7,6 kb

Tableau 1 : Quantité recommandée de plasmide pour la transfection tKOv3.

composant Montant par plaque de 15 cm
Opti-MEM (en) 800 l
Réactif de transfection 48 l

Tableau 2 : Configuration du réactif de transfection à base de lipides.

Couverture de pliage Nombre de cellules par sgRNAb  Nombre de cellules requises pour l'infectionb
(taille de bibliothèque de sgRNAune couverture de pli) (taille de la bibliothèque de l'ARNde et couverture des plis 0,3 MOI)
200 1,5 x 107 5 x 107
500 3,6 x 107 1,2 x 108
1000 7,1 x 107 2,4 x 108
a (en) D'après la taille de la bibliothèque TKOv3, 71 090 sgRNA
b (en) Les numéros sont arrondis

Tableau 3 : Détermination des numéros de cellules requis pour l'infection de la bibliothèque TKOv3 CRISPR et le placage cellulaire à divers plis.

traitement Nombre de plaques requises pour l'infection
Plaques de criblage Virus, puromycine (taille de la bibliothèque de l'ARNde : 200 fois) - 0,3 MOI - densité d'ensemencement cellulaire à l'infection - nombre de plaques requispar
Contrôle 1 Aucun virus, puromycine (0% de contrôle de survie) 1
Contrôle 2 Virus, pas de puromycine (contrôle de survie à 100%) 1
a Inclure des plaques supplémentaires pour tenir compte des fluctuations du MOI et des taux de croissance

Tableau 4 : Calcul de la configuration de l'infection.

Réactifs Montant par réaction 1x
2x Master Mix 25 l
10 mM PCR 1 Amorce avant LCV2 2,5 l
10 mM PCR 1 Amorce inverse LCV2 2,5 l
ADN génomique 3,5 g
eau jusqu'à 50 L
total 50 l

Tableau 5 : Configuration PCR 1.

Tableau 6 : Amorces PCR pour l'amplification des bibliothèques de séquençage LCV2::TKOv3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 7 : Amorces PCR pour l'amplification des bibliothèques de séquençage pLCKO2::TKOv3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

pas température temps
1 98oC 30 sec
2 98oC 10 sec 25 cycles (étape 2 à 4)
3 66oC 30 sec
4 72oC 15 sec
5 72oC 2 min
6 10oC tenir

Tableau 8 : Paramètres du cycle PCR 1.

Réactifs Montant par réaction 1x
2x Master Mix 25 l
Amorce avant de 10 mM i5 2,5 l
10 mM i7 amorce inversée 2,5 l
PcR 1 produit 5 ll
eau 15 l
total 50 l

Tableau 9 : Configuration PCR 2.

pas température temps
1 98oC 30 sec
2 98oC 10 sec 10 cycles (étape 2 à 4)
3 55oC 30 sec
4 65oC 15 sec
5 65oC 5 min
6 10oC tenir

Tableau 10 : Paramètres du cycle PCR 2.

Table supplémentaire S1. TKO ensembles de gènes de référence S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu schématique du flux de travail de dépistage mis en commun. (A) La population de cellules cibles est infectée par le lentivirus de la bibliothèque CRISPR à faible NIVEAU de moi pour s'assurer que la plupart des cellules reçoivent une intégration virale et que la représentation de la bibliothèque est maintenue. Les différentes couleurs représentent différentes sgRNAs dans chaque particule virale. Des pools de cellules génétiquement modifiées sont sélectionnés. Une fois la sélection terminée, les cellules sont échantillonnées pour référence T0 et traduites en série. (B) Au premier passage après T0, les cellules se sont rétablies de l'infection et des traitements médicamenteux peuvent être ajoutés, si nécessaire. Après le traitement, les populations cellulaires sont traduites en série pendant plusieurs semaines. Pendant chaque passage, les cellules sont rassemblées pour l'ADN génomique et réensemables à la couverture de pli agerequise requise de la bibliothèque sgRNA. (C) Deux types d'écrans peuvent être effectués : 1) des écrans de sélection positifs, qui identifient les cellules mutantes qui présentent une résistance ou une survie accrue sous la pression de sélection spécifique (p. ex., médicaments ou lignée cellulaire mutante), car ils seront enrichis au cours de la écran; ou 2) les écrans de sélection négatifs, qui identifient les cellules mutantes avec une sensibilité accrue ou une perte de survie sous la pression de sélection de l'écran, car ils seront perdus pendant l'écran. (D) L'ADN génomique est récolté et amplifié PCR pour enrichir pour les régions guides. (E) L'abondance des guides est quantifiée par le séquençage de la prochaine génération et les guides enrichis, ou les guides appauvris sont déterminés pour l'identification « frappée ». Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Qualité de la bibliothèque CRISPR sgRNA amplifiée. Les plasmides de bibliothèque amplifiés sont analysés par séquençage de nouvelle génération (lectures recommandées : 30 millions de lectures, ce qui correspond à une représentation de la bibliothèque multipliée par 400). Montré ici est une bibliothèque avec une distribution serrée de sgRNAs, avec 'gt;95% de tous les sgRNAs dans une gamme de distribution à 4 fois.  Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Évaluation de la qualité de l'écran de décrochage à l'aide d'ensembles de référence génétiques essentiels de référence de référence de référence de l'étalon-or. (A) Analyse de rappel de précision des résultats de dépistage dans la récupération des gènes essentiels à un seuil de BF 'gt;6 et FDR de 5%. L'écran à haute performance est représenté par la ligne bleue et les écrans à faible rendement sont représentés par la ligne rouge. (B) Plier la distribution de changement de sgRNA ciblant les gènes essentiels (ligne solide) et les gènes non essentiels (lignes pointillées). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Détermination de l'essentiel génétique. Bayes Factor classement du gène essentiellement dans un écran particulier. Bayes Factor (BF) représente une mesure de confiance que le gène knock-out entraîne un défaut de forme physique. Les facteurs bayes plus élevés indiquent une confiance accrue que le gène knock-out entraîne un défaut de forme physique, (points rouges). Les scores inférieurs de Bayes Factor suggèrent que le knock-out offre un avantage de croissance (points bleus). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Écran de sélection positif pour suppresseur de bloc de thymidine dans les cellules HCT116. Comptes de lecture normalisés pour tous les sgRNAs à T0 tracés par rapport à la moyenne normalisée des comptes de lecture pour les échantillons traités à la thymidine. Pour les écrans de sélection positifs (c.-à-d. à l'aide d'une concentration ic90 de drogue), le nombre de perturbations qui conféreront une résistance au médicament devrait être faible. Pour cette raison, la profondeur de lecture peut être inférieure à ce qui est nécessaire pour les écrans négatifs, dans whch la plupart de la bibliothèque devrait être représenté. Les sgARN TK1 sont encerclés en rouge. Ce chiffre a été modifié à partir d'une publication précédente3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

En raison de sa simplicité d'utilisation et de sa grande souplesse, la technologie CRISPR a été largement adoptée comme outil de choix pour l'édition précise du génome. Le dépistage CRISPR mis en commun fournit une méthode pour interroger des milliers de perturbations génétiques dans une seule expérience. Dans les écrans mis en commun, les bibliothèques sgRNA servent de codes-barres moléculaires, car chaque séquence est unique et est cartographiée selon le gène ciblé. En isolant l'ADN génomique de la population cellulaire, les gènes à l'origine du phénotype d'intérêt peuvent être déterminés en quantifiant l'abondance de l'ARNrs par séquençage de la prochaine génération. Des méthodes de séquençage massivement parallèles sont utilisées pour quantifier les sgRNAs dans les échantillons, ce qui signifie que plusieurs populations cellulaires indépendantes peuvent être regroupées dans la même voie de séquençage afin de minimiser les coûts.

Avant de se lancer dans un projet de dépistage à grande échelle, il est important d'avoir un modèle bien caractérisé et techniquement optimisé. Le contexte génétique, le taux de croissance et l'efficacité de la transduction sont des facteurs importants dans le choix de vos lignées cellulaires pour le dépistage. Par exemple, les taux de croissance et l'efficacité de l'édition détermineront l'évolutivité et l'adéquation technique du modèle. Afin de représenter adéquatement les grandes bibliothèques sgRNA, des dizaines de millions de cellules sont nécessaires, c'est pourquoi le nombre de cellules pourrait être un facteur limitant dans la faisabilité du dépistage des lignées cellulaires dont les doublons sont plus lents ou qui n'ont pas une bonne capacité de prolifération (p. ex., cellules primaires). En fonction des taux de croissance, les conditions de culture cellulaire, comme la densité d'ensemencement des cellules et la taille des plaques pour le dépistage, devraient être choisies en conséquence. Il est recommandé aux cellules de culture dans le plus grand récipient qui est pratique et techniquement faisable pour l'écran.

L'efficacité de la transduction du lentivirus varie d'un type de cellules à l'autre, car les cellules diffèrent en infectivité inhérente. Par conséquent, le volume de virus requis pour atteindre une infection suffisante dans un type de cellule ne sera pas nécessairement le même dans un autre. Par conséquent, il est essentiel de mettre en veilleuse fonctionnellement chaque lot de bibliothèque de lentivirus produit dans la lignée cellulaire pour être examiné afin d'assurer une couverture suffisante de la bibliothèque et surtout des événements de transduction unique par cellule en transduisant à des MOI inférieurs autour de 0,3 (section 4). L'efficacité de la transduction peut également être influencée par les conditions de culture cellulaire; par conséquent, les titers fonctionnels doivent être déterminés en utilisant les mêmes conditions cellulaires qui seront utilisées dans l'écran. C'est-à-dire qu'il est important d'utiliser les mêmes vaisseaux de culture tissulaire, les constituants et le volume des médias, la densité de placage cellulaire et les préparations de virus sans dégel préalable. Les mesures effectuées dans différents formats ou conditions ne seront pas fiables à l'échelle du format de présélection.

Malgré l'avantage d'utiliser tout-en-un CRISPR-Cas9 bibliothèques de guidage tels que LCV2::TKOv3, le gène codant Cas9 est assez grand, ce qui rend difficile d'emballer efficacement dans les particules virales (105-106 TU/mL). L'acheminement de titres lentiviraux plus bas peut être une limitation pour les lignées cellulaires qui sont difficiles à produire, car elles auront encore plus de difficulté avec les bibliothèques tout-un-CRISPR. Pour atténuer cela, Cas9 devrait être exprimé dans la ligne cellulaire à l'avance, suivie par la livraison de bibliothèques CRISPR ne contenant que des sgRNAs (p.p., pLCKO2::TKOv3), qui peuvent être faites à des titers beaucoup plus élevés (107-108 TU/mL). La ploidy d'une lignée cellulaire est également importante, car elle détermine le nombre de loci cibles qui doivent être modifiés. La capacité de générer des knock-outs complets dans les cellules haploïdes est plus efficace que dans les cellules avec plusieurs copies d'un gène donné. Par conséquent, les écrans dans les cellules haploïdes peuvent être plus sensibles et produire des données de meilleure qualité que les écrans effectués dans les lignées cellulaires diploïdes ou anéuploides6. L'essai des gènes connus qui sont liés au phénotype aidera à déterminer la capacité d'écran d'un modèle de lignée cellulaire. Par exemple, pour les écrans d'essentialité, les guides ciblant une sous-unité du protéasome 26S, PSMD1 (Addgene: plasmid #74180), un gène essentiel de base, peuvent être utilisés pour tester l'efficacité et l'infectibilité de l'édition des lignées cellulaires, comme perturbation de PSMD1 entraînera la mort cellulaire.

La robustesse des écrans mis en commun dépend fortement de la représentation de l'ARNm. Il s'agit d'une mesure importante qui détermine les performances de la bibliothèque au cours d'un écran et la capacité d'identifier les hits. La diversité des bibliothèques est biaisée dans la représentation de chaque sgRNA; par conséquent, la population de cellules à dépister et à analyser devrait être suffisamment importante pour assurer la capture des sgARN sous-représentés6. La représentation de 200 à 1000 fois de chaque sgRNA est la couverture typique qui a été utilisée dans les écrans publiés (c.-à-d., 200-1000 cellules par sgRNA)10,15. Cette représentation doit être maintenue lors de l'amplification du plasmide de la bibliothèque (section 1) et tout au long de l'écran en infectant et en passant le numéro de cellulaire requis (section 5) pour représenter la couverture de la bibliothèque désirée et pendant le séquençage de la bibliothèque. (protocole 6), tel que décrit tout au long du protocole. Par exemple, pour atteindre une couverture de 200 fois la bibliothèque TKOv3 nécessite la sélection et la passage de 15 millions de cellules infectées. Pendant le séquençage, en supposant qu'un génome humain diploïde contienne 7,2 pg d'ADN et 1 sgRNA par génome, un total de 100 g d'ADN génomique est nécessaire pour générer la bibliothèque de séquençage pour 15 millions de lectures de séquence. La décision de la couverture dépendra de la taille de la bibliothèque, car la couverture des grandes bibliothèques exigera la culture d'un plus grand nombre de cellules qui peuvent être difficiles à entretenir et non techniquement pratiques. Une couverture d'au moins 200 fois est recommandée avec les bibliothèques TKOv3, car 200 fois offre un équilibre optimal entre la logistique du dépistage d'un grand nombre de cellules et le maintien d'une plage dynamique suffisante pour détecter les véritables abandons biologiques de l'ARNc avec des bruit des épuisements aléatoires22,23. Des représentations plus élevées des bibliothèques de plis se traduiront par une meilleure reproductibilité et assureront une fenêtre suffisante pour la détection des changements dans l'abondance de l'ARSG, en particulier pour les sélections négatives. Une caractéristique limitative des écrans négatifs est que la perturbation n'est épuisée que dans la mesure où elle était présente dans la bibliothèque de départ24. En comparaison, la gamme dynamique des écrans de sélection positifs est beaucoup plus grande, car ils reposent sur l'enrichissement des cellules, et pourrait enrichir à 100% de la population finale23. Par conséquent, pour les écrans de sélection positifs (p. ex. les écrans de résistance aux médicaments), la couverture des bibliothèques et la profondeur de lecture peuvent être réduites à une représentation de 50 à 100 fois puisque seule une petite population de cellules devrait survivre.

Le protocole de bibliothèque de séquençage décrit ici est un PCR en deux étapes optimisé pour les bibliothèques TKOv3 CRISPR dans les deux colonnes vertébrales vectorielles et séquencé sur la plate-forme de séquençage Illumina. Ces bibliothèques de séquençage peuvent également être générées à l'aide d'un protocole PCR unique, semblable à celui décrit dans Hart et al.3. Pour les autres bibliothèques prêtes à l'emploi, les amorces et les protocoles de séquençage prévus pour ces bibliothèques devraient être consultés. Lors de la préparation d'échantillons d'ADN génomique et de PCR, il est essentiel d'être attentif aux précautions de contamination. Par exemple, une zone dédiée à la purification de l'ADN génomique est fortement recommandée. Il devrait également être physiquement distinct des préparations bactériennes de plasmide, qui sont des contaminants communs trouvés dans les échantillons génomiques d'ADN. Les réactions PCR doivent être installées dans un capot PCR dédié, car cela permettra de minimiser la contamination par les plasmides et autres bibliothèques de séquençage. Pour les bonnes pratiques, un contrôle négatif sans modèle peut être inclus pour aider à surveiller la contamination par les PCR.

L'analyse des données pour traduire les lectures de séquençage à partir d'écrans est une tâche non négligeable, compte tenu de la taille et de la diversité de ces ensembles de données. Une fois que les lectures de séquence s'est harmonisées et normalisées, plusieurs outils bioinformatiques sont disponibles pour aider à évaluer les performances de l'écran (figure 3) et l'identification par coup (figure 4). BAGEL est décrit dans ce protocole comme l'outil clé pour l'analyse des données. BAGEL utilise un cadre bayésien pour comparer les distributions d'ensembles de gènes essentiels et non essentiels connus au changement de pli de journal de tous les guides ciblant un gène. Cette méthode est décrite en détail dans Hart et al3. En plus de BAGEL, d'autres algorithmes conçus pour identifier les sgRNAs enrichis et épuisés, tels que MAGeCK25 peuvent également être utilisés. Pour les écrans de drogue, il est recommandé d'utiliser l'algorithme DrugZ pour identifier les interactions génétiques chimiques synergiques et suppresseurs. DrugZ a été conçu pour comparer l'abondance relative de l'ARSf dans une population traitée à l'abondance relative de l'ARSg dans une population non traitée au même moment20.

Une limitation des écrans CRISPR est que Cas9 ne conduit pas toujours à un knock-out, car il ya toujours une possibilité que les indels créés sont des mutations dans le cadre, laissant la fonction du gène intacte13. Il en résulte une population mixte, ce qui rend l'écran «bruyant» et l'interprétation des données difficile. L'utilisation de plusieurs sgARN indépendants ciblant un gène peut créer une redondance, ce qui réduit l'effet des sgRNAs à faible activité. Une mise en garde supplémentaire aux études CRISPR est l'effet des ruptures de double brin créées par la nucléase Cas9, qui peut conduire à la létalité cellulaire indépendamment du gène ciblé. Cet effet anti-prolifération augmente avec le numéro de copie du site cible, conduisant à une fausse identification positive des gènes dans les régions fortement amplifiées26. Des méthodes de calcul comme CERES ont été développées pour corriger les effets de numéro de copie27. Ces flux de travail tiennent compte de l'effet du numéro de copie pour estimer les niveaux de dépendance génétique dans les écrans d'essentialité basés sur le knock-out. Un examen minutieux des emplacements génomiques des gènes touchés dans les régions amplifiées peut aider à déterminer les faux positifs qui sont dus à la multiplicité des effets de coupe13. Les écrans primaires ne peuvent identifier que les coups potentiels. Il est important de faire un suivi avec un écran ou un protocole secondaire pour valider les coups et distinguer les effets hors cible, éliminer les faux positifs et s'assurer que les gènes qui ont obtenu une note faible en raison de perturbations inefficaces ne sont pas laissés pour compte comme faux. négatifs23.

Ce protocole met l'accent sur les approches de dépistage fondées sur la viabilité, dans lesquelles l'état de l'étude devrait conduire à un défaut de prolifération ou la mort des cellules. Pour les processus qui n'entraînent pas de changement dans la viabilité cellulaire, la méthode de dépistage en commun fondée sur la viabilité peut être restrictive. Une alternative consiste à effectuer des écrans à l'aide d'essais de reporter ou de marqueur et d'enrichissement par des approches de tri cellulaire activépar par fluorescence (FACS). Dans les écrans de sélection à base de marqueurs, le phénotype est basé sur des mutations qui régulent l'expression des gènes marqueurs plutôt que sur la santé cellulaire13,23. Des formats CRISPR arrayés sont également disponibles pour un seul gène par puits de dépistage. Les formats à rayons sont plus propices aux sorties de lecture complexes ou basées sur la microscopie. Cependant, les formats de tableau nécessitent un équipement automatisé et de grandes quantités de réactifs28.

Le protocole de dépistage discuté ici utilise s. pyogenes Cas9 nucléase pour créer des allèles nuls, qui est le plus largement utilisé pour les écrans génétiques et pour lequel de nombreuses bibliothèques sont disponibles (Addgene: Bibliothèques mises en commun). D'autres options pour les bibliothèques knock-out sont également disponibles, qui utilisent un dCas9 catalytiquement mort attaché à la chromatine modificateur protéines pour inhiber (CRISPRi) ou activer (CRISPRa) transcription des gènes. Semblable à l'ARNi, CRISPRi offre la possibilité d'étudier les effets phénotypiques à différentes doses de gènes et gènes essentiels qui ne peuvent pas tolérer le knock-out complet, tandis que CRISPRa peut être utilisé pour effectuer des écrans de gain de fonction. Chacune de ces technologies a ses avantages, mais en général, l'approche CRISPR knock-out est la plus développée. Il a été prouvé qu'il fonctionne bien avec un faible bruit, des effets hors cible minimes, et la cohérence expérimentale, en particulier dans les écrans de gènes essentiels basés sur la létalité, par rapport aux approches knock-down en utilisant soit CRISPRi et shRNAs5. Malgré son applicabilité étendue à ce jour, la technologie de dépistage CRISPR en est encore à ses débuts. De nouveaux outils continuent d'être construits à partir des composants de base de CRISPR. Il s'agit notamment de stratégies d'édition de gènes combinatoires qui peuvent cibler plusieurs loci génomiques, l'optimisation des enzymes orthogonales Cas, et des modifications avec des domaines fonctionnels de chromatine pour diversifier les activités Cas9. À mesure que la technologie CRISPR continue de croître, son couplage avec des approches de dépistage génétique servira de plate-forme puissante pour la découverte fonctionnelle en génétique.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Ces travaux ont été appuyés par Génome Canada, le Fonds de recherche de l'Ontario et les Instituts de recherche en santé du Canada (MOP-142375, PJT-148802).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaCl Promega V4221
50X TAE buffer BioShop TAE222.4
6 N Hydrochloric acid solution BioShop HCL666.500
95% Ethanol
Alamar blue ThermoFisher Scientific DAL1025
Blue-light transilluminator ThermoFisher Scientific G6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade Bioshop ALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles Medium Life Technologies 11995-065 Cel culture media
Electroporation cuvettes BTX 45-0134
Electroporator BTX 45-0651
Endura electrocompetent cells Lucigen 90293
Fetal Bovine Serum GIBCO 12483-020
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216 recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) Sigma H9268 Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladder New England Biolabs N3233S
Nanodrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544L
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media
Plasmid maxi purification kit Qiagen 12963
pMD2.G (envelope plasmid) Addgene Plasmid #12259 lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid) Addgene Plasmid #12260 lentiviral system
Puromycin Wisent 400-160-UG
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
Qubit dsDNA BR assay ThermoFisher Scientific Q32853
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33226
RNAse A Invitrogen 12091021
S.O.C recovery medium Invitrogen 15544034
SYRB Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included Addgene Addgene ID #90203 Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 Addgene Addgene ID #125517 Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agarose ThermoFisher Scientific 16500500
Wizard genomic DNA purification kit Promega A1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 06 365 809 001 Lipid based transfection reagent

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References

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Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères
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Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (151), e59780, doi:10.3791/59780 (2019).

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