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Genetics

मैमलियन सेल में पूल्ड CRISPR-आधारित जेनेटिक स्क्रीन

Published: September 4, 2019 doi: 10.3791/59780
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2,3
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी ठीक किसी भी सेल प्रकार में स्तनधारी जीनोम को संपादित करने के लिए एक कुशल विधि प्रदान करता है और जीनोम व्यापक आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक उपन्यास का मतलब है का प्रतिनिधित्व करता है। एक विस्तृत प्रोटोकॉल जमा जीनोम चौड़ा CRISPR-Cas9 स्क्रीन के सफल प्रदर्शन के लिए आवश्यक कदम पर चर्चा यहाँ प्रदान की गई है.

Abstract

CRISPR-Cas प्रणाली का उपयोग जीनोम संपादन काफी ठीक विभिन्न जीवों के जीनोम को संपादित करने की क्षमता उन्नत है. स्तनधारी कोशिकाओं के संदर्भ में, यह तकनीक कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन के लिए जीनोम-वाइड आनुवंशिक स्क्रीन करने के लिए एक उपन्यास का अर्थ है। गाइड RNAs के पुस्तकालयों (sgRNA) सभी खुले पढ़ने फ्रेम को लक्षित कोशिकाओं है कि विशिष्ट phenotypes के लिए जांच की जा सकती है की एक पूल में आनुवंशिक क्षोभ के हजारों की सुगम पीढ़ी की अनुमति जीन समारोह और सेलुलर प्रक्रियाओं को फंसाने के लिए एक निष्पक्ष और व्यवस्थित तरीका। CRISPR-Cas स्क्रीन सेलुलर phenotypes के लिए आनुवंशिक ब्लूप्रिंट को उजागर करने के लिए एक सरल, कुशल, और सस्ती विधि के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करते हैं. इसके अलावा, विभिन्न सेल लाइनों में और विभिन्न कैंसर प्रकार से प्रदर्शन स्क्रीन के अंतर विश्लेषण जीन है कि ट्यूमर कोशिकाओं में प्रासंगिक आवश्यक हैं की पहचान कर सकते हैं, विशिष्ट कैंसर विरोधी उपचार के लिए संभावित लक्ष्य ों खुलासा. मानव कोशिकाओं में जीनोम चौड़ा स्क्रीन प्रदर्शन कठिन हो सकता है, क्योंकि यह कोशिकाओं के लाखों लोगों की हैंडलिंग शामिल है और डेटा के बड़े सेट के विश्लेषण की आवश्यकता है. इन स्क्रीन ्स्ड ऑफ सेल लाइन विशेषता, CRISPR लाइब्रेरी विचार, और विश्लेषण के दौरान CRISPR तकनीक की सीमाओं और क्षमताओं को समझने, अक्सर अनदेखी कर रहे हैं। यहाँ प्रदान की जमा जीनोम चौड़ा CRISPR-Cas9 आधारित स्क्रीन के सफल प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है.

Introduction

CRISPR-Cas, संकुल के लिए कम नियमित रूप से अंतराल कम palindromic दोहराता है और CRISPR संबद्ध nuclease, एक सिंथेटिक गाइड आरएनए (sgRNA) के साथ जटिल में एक एकल न्यूक्लीज प्रोटीन (उदाहरण के लिए, Cas9) के होते हैं. इस राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन जटिल एक विशिष्ट जीनोमिक टिड्डी1पर डबल-स्लेड डीएनए ब्रेक को प्रेरित करने के लिए Cas9 एंजाइम को लक्षित करता है। डबल-स्ट्रेंड ब्रेक को होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के माध्यम से मरम्मत किया जा सकता है या, अधिक सामान्यतः, गैर-समजात अंत में शामिल होने के माध्यम से (NHEJ), एक त्रुटि प्रवण मरम्मत तंत्र जिसके परिणामस्वरूप प्रविष्टि और/या विलोपन (INDELS) होता है जो अक्सर जीन फ़ंक्शन को बाधित करता है 1. CRISPR की दक्षता और सादगी जीनोमिक लक्ष्यीकरण के पहले अप्राप्य स्तर को सक्षम बनाती है जो पिछले जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों को पार कर जाती है , जस्ता उंगली न्यूक्लेस (जेडएनएफ) या ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर जैसे प्रभावक न्यूक्लेस ( TALENS), जिनमें से दोनों बढ़ डिजाइन जटिलता से पीड़ित हैं, कम transfection दक्षता, और मल्टीप्लेक्स जीन संपादन2में सीमाओं .

CRISPR एकल गाइड आरएनए आधारित जीनोम संपादन के बुनियादी अनुसंधान आवेदन वैज्ञानिकों कुशलतापूर्वक और सस्ते में व्यक्तिगत जीन और आनुवंशिक बातचीत नेटवर्क के टोपोलॉजी के कार्यों से पूछताछ करने की अनुमति दी है. कार्यात्मक जीनोम चौड़ा स्क्रीन प्रदर्शन करने की क्षमता बहुत CRISPR-कैस प्रणाली के उपयोग से बढ़ाया गया है, खासकर जब आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) और जीन जाल mutagenesis के रूप में पहले आनुवंशिक क्षोभ प्रौद्योगिकियों की तुलना में. विशेष रूप से, RNAi उच्च बंद लक्ष्य प्रभाव और अधूरा दस्तक से ग्रस्त है, कम संवेदनशीलता और CRISPR3,4,5की तुलना में विशिष्टता में जिसके परिणामस्वरूप, जबकि जीन जाल तरीकों अगुणित में ही संभव हैं हानि के समारोह स्क्रीन के लिए कोशिकाओं, सेल मॉडल है कि6पूछताछ की जा सकती है के दायरे को सीमित. CRISPR की क्षमता को पूरा जीन नॉक-आउट उत्पन्न करने के लिए एक और अधिक जैविक रूप से मजबूत प्रणाली उत्परिवर्ती phenotypes पूछताछ करने के लिए प्रदान करता है, कम शोर के साथ, कम से कम बंद लक्ष्य प्रभाव और अभिकर्मकों भर में लगातार गतिविधि5. CRISPR-Cas9 sgRNA पुस्तकालयों कि पूरे मानव जीनोम लक्ष्य अब व्यापक रूप से उपलब्ध हैं, एक ही प्रयोग में जीन नॉक आउट के हजारों की एक साथ पीढ़ी की अनुमति3,7,8,9 .

हम अद्वितीय CRISPR-Cas9 जीनोम चौड़ा sgRNA lentiviral पुस्तकालयों टोरंटो नॉक आउट (TKO) पुस्तकालयों (Addgene के माध्यम से उपलब्ध) कहा जाता है कि कॉम्पैक्ट और अनुक्रम उच्च संकल्प कार्यात्मक जीनोमिक्स स्क्रीन की सुविधा के लिए अनुकूलित कर रहे हैं विकसित किया है। नवीनतम पुस्तकालय, TKOv3, लक्ष्य $ 18,000 मानव प्रोटीन-कोडिंग जीन के साथ 71,090 गाइड अनुभवजन्य डेटा10का उपयोग कर दक्षता संपादन के लिए अनुकूलित. इसके अतिरिक्त, TKOv3 एक एक घटक पुस्तकालय के रूप में उपलब्ध है (LCV2::TKOv3, Addgene आईडी #90294) एक एकल वेक्टर पर Cas9 और sgRNAs व्यक्त, स्थिर Cas9-expressing कोशिकाओं उत्पन्न करने की आवश्यकता को समाप्त करने, जीनोम-वाइड नॉक-आउट को सक्षम करने की एक विस्तृत श्रृंखला में स्तनधारी कोशिका प्रकार. TKOv3 Cas9 के बिना एक वेक्टर में भी उपलब्ध है (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID] 125517) और Cas911व्यक्त करने वाले कक्षों में उपयोग किया जा सकता है।

एक जीनोम चौड़ा CRISPR-Cas9 संपादित सेल आबादी विभिन्न विकास की स्थिति को उजागर किया जा सकता है, अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा निर्धारित समय के साथ sgRNAs की बहुतायत के साथ, ड्रॉप-आउट या ट्रेस करने योग्य आनुवंशिक के साथ कोशिकाओं के संवर्धन का आकलन करने के लिए एक readout प्रदान क्षोभ. CRISPR नॉक-आउट पुस्तकालयों जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि, क्षोभ पर, सेलुलर फिटनेस दोष के कारण, मध्यम दवा संवेदनशीलता (उदाहरण के लिए, संवेदनशील या प्रतिरोधी जीन), प्रोटीन अभिव्यक्ति को विनियमित (उदाहरण के लिए, रिपोर्टर), या एक निश्चित के लिए आवश्यक हैं पथफल और कोशिकीय अवस्था12,13,14. उदाहरण के लिए , कैंसर कोशिका रेखा में अंतर फिटनेस स्क्रीन दोनों कमी या oncogenes और संवर्धन की कमी या ट्यूमर suppressors जीन3,14,15की वृद्धि की पहचान कर सकते हैं . इसी प्रकार चिकित्सीय औषधों की मध्यवर्ती खुराकों का उपयोग करने से औषध प्रतिरोध तथा सुग्राहीकरणजीनोंदोनों को पता चल सकता है.

यहाँ प्रदान की जीनोम पैमाने CRISPR-Cas9 हानि के लिए एक विस्तृत स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल है टोरंटो नॉक-आउट पुस्तकालयों का उपयोग कर समारोह स्क्रीनिंग (TKOv1 या v3) पुस्तकालय पीढ़ी से स्तनधारी कोशिकाओं में, स्क्रीनिंग प्रदर्शन डेटा विश्लेषण करने के लिए. हालांकि इस प्रोटोकॉल टोरंटो नॉक आउट पुस्तकालयों का उपयोग स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया गया है, यह लागू किया जा सकता है और सभी CRISPR sgRNA जमा पुस्तकालयों के लिए स्केलेबल बन जाते हैं.

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Protocol

नीचे दिए गए प्रयोगों को संस्थान के पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा कार्यालय के दिशानिर्देशों का पालन करना चाहिए।

1. पूल्ड CRISPR sgRNA lentiviral पुस्तकालय प्लाज्मिड प्रवर्धन

  1. टीई (उदा., TKOv3) में तैयार किए गए CRISPR sgRNA प्लाज्मिड डीएनए लाइब्रेरी को 50 एनजी/
  2. विद्युत सक्षम कोशिकाओं का उपयोग करके पुस्तकालय को विद्युतविद्युत ित् वित करें। नीचे वर्णित के रूप में चार विद्युत कथन प्रतिक्रियाओं की कुल सेट अप करें।
    1. बर्फ पर पूर्व-चिल्ड cuvettes (1.0 मिमी) के लिए thawed विद्युत सक्षम कोशिकाओं के 25 डिग्री सेल्सियस करने के लिए 50 एनजी / जेडएल टीकेओ पुस्तकालय के 2 $L जोड़ें।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल द्वारा सुझाए गए इष्टतम सेटिंग्स का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेट। पल्स के 10 s के भीतर, वसूली मध्यम (या समाज मध्यम) cuvette करने के लिए 975 $L जोड़ें.
    3. एक संस्कृति ट्यूब करने के लिए विद्युतीकृत कोशिकाओं स्थानांतरण और वसूली मध्यम के 1 एमएल जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए 250 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट ट्यूब।
  3. पुस्तकालय titer और परिवर्तन दक्षता का अनुमान लगाने के लिए एक कमजोर पड़ने प्लेट सेट करें।
    1. बरामद कोशिकाओं के सभी 8 एमएल पूल और अच्छी तरह से मिश्रण. एक 800 गुना कमजोर पड़ने के लिए वसूली मध्यम के 990 $L करने के लिए जमा कोशिकाओं के 10 $L स्थानांतरण और अच्छी तरह से मिश्रण.
    2. प्लेट 20 डिग्री सेल्सियस की एक पूर्व गर्म 10 सेमी एलबी + carbenicillin (100 g/L) agar प्लेट पर कमजोर पड़ने की. यह परिवर्तन दक्षता की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि transformants के एक 40,000 गुना कमजोर पड़ने में परिणाम है।
    3. प्रत्येक प्लेट पर बरामद कोशिकाओं की प्लेट 400 डिग्री सेल्सियस की कुल 20 पूर्व-वार्म्ड 15 सेमी एलबी + कार्बेनिसिलिन एगार प्लेटें। प्लेटों को 30 डिग्री सेल्सियस पर 14-16 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस कम तापमान पर वृद्धि लंबी टर्मिनल दोहराता (LTR)18के बीच पुनर्संयोजन को कम करता है।
    4. परिवर्तन दक्षता की गणना करने के लिए, 40,000 गुना कमजोर पड़ने प्लेट (चरण 1.3.2) पर कालोनियों की संख्या की गणना करें। सभी प्लेटों पर कालोनियों की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए 40,000 द्वारा गिना कालोनियों की संख्या गुणा। यदि कालोनियों की कुल संख्या sgRNA प्रति 200x कालोनियों के न्यूनतम के बराबर एक पुस्तकालय कवरेज का प्रतिनिधित्व करता है (सबसे इष्टतम 500-1000x है) आगे बढ़ें।
      1. उदाहरण के लिए, TKOv3 पुस्तकालय (71,090 sgRNA) के लिए न्यूनतम कॉलोनी संख्या 1.4 x 107है, जो sgRNA प्रति 200x कालोनियों के बराबर है. यदि कॉलोनी प्रतिनिधित्व अपर्याप्त है, तो न्यूनतम पुस्तकालय कवरेज प्राप्त करने के लिए कमजोर पड़ने की थाली पर कालोनियों की संख्या के आधार पर चरण 1.2 में इलेक्ट्रोपोरेशन की संख्या में वृद्धि करें।
  4. नीचे वर्णित के रूप में कालोनियों फसल
    1. प्रत्येक 15 सेमी प्लेट में 7 एमएल एलबी + कार्बेनिकसिलिन (100 ग्राम/एल) माध्यम जोड़ें, फिर कालोनियों को सेल स्प्रेडर के साथ स्क्रैप करें। एक 10 एमएल पिपेट के साथ, एक बाँझ 1 एल शंकु फ्लास्क या बोतल में स्क्रैप की गई कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    2. एक बार फिर एलबी + कार्बेनिसिलिन मध्यम के 5 एमएल के साथ थाली कुल्ला और बोतल के लिए समाधान हस्तांतरण.
    3. एक बाँझ बोतल में 20 प्लेटों से कोशिकाओं पूल करने के लिए सभी प्लेटों के लिए दोहराएँ.
  5. सेल clumps को तोड़ने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 एच के लिए एक हलचल पट्टी के साथ एकत्र कोशिकाओं को मिलाएं। पहले वजन वाली अपकेंद्रण बोतलों और 7,000 x ग्राम पर पेरलेट बैक्टीरिया के लिए अपकेंद्रित्र के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करें, फिर मीडिया को त्यागें।
  6. गीला सेल गोली वजन और अपकेंद्रित्र बोतल के वजन घटाना गीला गोली के अंतिम वजन निर्धारित करने के लिए. जीवाणु गोली की मात्रा के आधार पर एक मैक्सी- या मेगा पैमाने पर प्लाज्मिड शोधन किट का उपयोग कर प्लाज्मिड डीएनए को शुद्ध करें प्रत्येक कॉलम प्रक्रिया कर सकते हैं।

2. बड़े पैमाने पर CRISPR sgRNA पुस्तकालय lentivirus उत्पादन

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड में सभी चरणों एक वर्ग द्वितीय में एक BSL2 + सुविधा में प्रदर्शन कर रहे हैं, प्रकार A2 जैव सुरक्षा कैबिनेट.

  1. वायरस उत्पादन के लिए आवश्यक 15 सेमी प्लेटों की संख्या की गणना अनुमान के आधार पर कि वायरस के 18 एमएल आमतौर पर एक 15 सेमी प्लेट से काटा जाता है।
  2. कम एंटीबायोटिक विकास मीडिया में HEK-293T पैकेजिंग कोशिकाओं बोने के द्वारा transfection के लिए कोशिकाओं को तैयार (DMEM + 10% FBS + वैकल्पिक: 0.1x कलम / 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर रात भर इनक्यूबेट कोशिकाओं । सुनिश्चित करें कि प्लेटकी कोशिकाओं 70%-80% confluent और समान रूप से transfection के क्षण में फैल रहे हैं.
  3. अगले दिन, तीन transfection प्लाज्मिड मिश्रण तैयार के रूप में तालिका 1 में 15 सेमी प्लेटों के लिए उल्लिखित. एक transfection के लिए आवश्यक प्लाज्मिड की मात्रा की गणना और प्लेटों की संख्या के लिए प्लाज्मिड का मिश्रण बनाने के लिए, प्लस एक transfected किया जा करने के लिए।
  4. सारणी 2 में बताए गए प्रत्येक ट्रांसफेक्शन के लिए लिपिड-आधारित ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक तैयार की जा रही है। अलीकोट ने सीरम मीडिया को अलग-अलग 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में कम कर दिया ताकि प्लेटों की संख्या को ट्रांसफेक्टेड किया जा सके। ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक जोड़ें, धीरे मिश्रण, और आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  5. 5 मिनट ऊष्मायन के बाद, डीएनए परिसर के ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के 3:1 अनुपात के लिए ट्रांसफेक्शन रिएजेंट में एक ट्रांसफेक्शन के लिए आवश्यक डीएनए की मात्रा जोड़ें। धीरे मिश्रण और आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट.
    नोट: बाद में transfections पांच या उससे कम के सेट में तैयार किया जा सकता है, 5 मिनट अंतराल के साथ समय के लिए अनुकूलन और अधिक इनक्यूबेशन से बचने के लिए.
  6. ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद, ध्यान से पैकेजिंग कोशिकाओं की प्रत्येक थाली के लिए प्रत्येक transfection मिश्रण हस्तांतरण। सेल मोनोलेयर को परेशान किए बिना एक गोलाकार, वक्र गति में 1 एमएल पिपेट टिप ड्रॉपवार का उपयोग करके पूरे मिश्रण जोड़ें। 5% सीओ2पर 18 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं ।
  7. वायरल फसल मीडिया तैयार करें: DMEM मध्यम के 500 एमएल + 32 एमएल बीएसए स्टॉक (20 ग्राम/100 एमएल, DMEM में भंग, 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के साथ बाँझ फिल्टर) + 100x कलम के 5 एमएल /
  8. 18 ज के बाद, मीडिया को हटा दें (निपटान से पहले 30 मिनट के लिए 1% सोडियम हाइपोक्लोराइट में इनक्यूबेशन जैसे मसूरीवायरस अपशिष्ट का उचित हैंडलिंग का उपयोग करें)। धीरे से प्रत्येक थाली के लिए वायरल फसल मीडिया के 18 एमएल के साथ बदलें। 5% सीओ2पर 18 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं ।
  9. 24 ज के बाद, अच्छा वायरस उत्पादन का एक संकेत के रूप में असामान्य और जुड़े आकृति विज्ञान के लिए पैकेजिंग कोशिकाओं की जाँच करें। फिर, सभी supernatant इकट्ठा करने और एक बाँझ शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करके lentivirus फसल.
  10. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर वायरस युक्त मीडिया स्पिन और पैकेजिंग कोशिकाओं को गोली. अलीकोट एक बाँझ पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में गोली परेशान किए बिना सुपरनेट।
  11. वायरस को छोटी अवधि (1 सप्ताह से कम) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत स्टोर करें। अलीकोट बड़े पैमाने पर वायरस फ्रीज/

3. स्क्रीनिंग के लिए सेल लाइन विशेषता

  1. इच्छित कक्ष पंक्ति का चयन करें.
    1. उपाय और कोशिकाओं के अनुमानित दोहरीकरण समय रिकॉर्ड.
    2. पसंद के एक ऊतक संस्कृति पोत में हर 3-4 सेल दोहरीकरण कोशिकाओं culturing के लिए इष्टतम सेल चढ़ाना घनत्व का निर्धारण (उदाहरण के लिए, 15 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेटें).
  2. इस प्रकार के रूप में puromycin प्रतिरोध मार्कर युक्त TKO पुस्तकालयों के चयन के लिए वांछित सेल लाइन में उपयोग करने के लिए puromycin एकाग्रता का निर्धारण:
    1. 72 एच के बाद संगम तक पहुंचने के लिए आवश्यक घनत्व पर 12 अच्छी प्लेट में बीज कोशिकाएं, फिर रात भर इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)।
    2. अगले दिन, एक मीडिया के लिए परिवर्तन से प्यूरोमाइसिन सांद्रता के एक कमजोर पड़ने रेंज से 10 g/mL करने के लिए, 0.5 g/mL वेतन वृद्धि में. कोशिकाओं को 48 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. 48 ज के बाद, सेल गिनती या alamarBlue धुंधला द्वारा सेल व्यवहार्यता उपाय.
    4. सबसे कम एकाग्रता निर्धारित करें जो 48 ज में 100% कोशिकाओं को मारता है. चरण 4.6 और 5.2.6 में CRISPR लाइब्रेरी ट्रांसड्यूस्ड सेल आबादी के लिए चयन करने के लिए इस एकाग्रता का उपयोग करें।
      नोट: अब दोहरीकरण समय के साथ सेल लाइनों के लिए, puromycin के साथ लंबे समय तक ऊष्मायन सहन किया जा सकता है. इन स्थितियों में, ऊष्मायन समय के लिए आवश्यक के लिए मार वक्र का निर्धारण;3 सेल दोहरीकरण. स्क्रीनिंग के शुरू होने से पहले आवश्यक जीनों के ड्रॉपआउट से बचने के लिए चयन के लिए समय को कम करें।
  3. हेक्साडिमेट्रिन ब्रोमाइड के प्रति संवेदनशीलता के लिए कोशिकाओं की जांच करें (अप करने के लिए 8 g/mL) puromycin संवेदनशीलता को मापने के लिए इस्तेमाल के रूप में एक ही विधि में एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र प्रदर्शन करके (चरण 3.2). यदि विषाक् तता को हेक् साडिमेट्रीन ब्रोमाइड के साथ देखा जाता है, तो इसका उपयोग न करें।

4. MOI के निर्धारण के लिए जमा CRISPR lentivirus पुस्तकालय के कार्यात्मक अनुमापन

  1. पूल्ड CRISPR sgRNA पुस्तकालय lentivirus के एक ताजा alicot था (उदा., LCV2::TKOv3) और बर्फ पर रहते हैं.
  2. 0-2 एमएल (अर्थात, 0 एमएल, 0.25 एमएल, 0.5 एमएल, 1 एमएल, और 2 एमएल) की श्रेणी के बीच परीक्षण करने के लिए वायरस वॉल्यूम की एक श्रृंखला डिज़ाइन करें।
  3. 72 ज में संगम तक पहुंचने के लिए आवश्यक घनत्व पर 15 सेमी प्लेटों में फसल लक्ष्य कोशिकाओं और बीज कोशिकाओं।
  4. प्रत्येक वायरस मात्रा का परीक्षण किया जा करने के लिए, डुप्लिकेट प्लेटें तैयार करते हैं। 20 एमएल के अंतिम खंड में कोशिकाओं, वायरस, हेक्साडिमेट्रीन ब्रोमाइड (8 ग्राम/एमएल) और मीडिया जोड़ें। मिश्रण प्लेटें अच्छी तरह से, इनक्यूबेटर में प्लेटें स्तर बैठते हैं और 24 एच (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)के लिए इनक्यूबेट करते हैं।
  5. 24 घंटे के बाद, मीडिया युक्त वायरस को हटा दें और निपटान करें (लेन्टीवायरस कचरे से निपटने के लिए जैव सुरक्षा सावधानियों का उपयोग करें)। वैकल्पिक रूप से, बाहरी वायरस को दूर करने के लिए प्लेट को गर्म पीबीएस से धीरे धो लें।
  6. प्रत्येक वायरस की स्थिति के लिए, धारा 3 में कोशिकाओं को मारने के लिए निर्धारित एकाग्रता का उपयोग करके प्यूरोमाइसिन युक्त मीडिया के 20 एमएल के साथ बदलें, एक प्रतिकृति प्लेट के लिए। दूसरी प्लेट में, puromycin बिना ताजा मीडिया के 20 एमएल जोड़ें. 48 एच (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)के लिए इनक्यूबेट।
  7. 48 एच के बाद, जांच करें कि सभी असंक्रमित कोशिकाएं (0 एमएल वायरस की स्थिति) प्यूरोमाइसिन के साथ इलाज की जाती हैं। सभी प्लेटों को व्यक्तिगत रूप से फसल और बार-बार कोमल पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को फैलाने।
  8. सभी प्लेटों से कोशिकाओं की गणना करें और puromycin के बिना सेल गिनती करने के लिए सेल गिनती के साथ सेल गिनती की तुलना करके प्रत्येक वायरस की मात्रा के लिए MOI की गणना (यानी, +//- puromycin).
  9. ग्राफ परिणाम वायरस की मात्रा है कि puromycin चयन के साथ 30%-40% सेल अस्तित्व की ओर जाता है निर्धारित करने के लिए बनाम puromycin के बिना. एक ही ऊतक संस्कृति की स्थिति के तहत स्क्रीन के दौरान 0.3-0.4 के एक MOI प्राप्त करने के लिए इस वायरस की मात्रा का उपयोग करें.

5. प्राथमिक स्क्रीन संक्रमण, चयन, और सेल passaging

  1. स्क्रीन भर में बनाए रखा जा करने के लिए CRISPR SgRNA पुस्तकालय कवरेज का चयन करें (200 गुना की सिफारिश की न्यूनतम).
    1. पुस्तकालय कवरेज के आधार पर, प्रति sgRNA इस कवरेज को बनाए रखने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या और MOI 0.3(तालिका 3)में संक्रमण के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं।
    2. संक्रमण स्थापित करने के लिए आवश्यक प्लेटों की संख्या निर्धारित करें (तालिका 4).
  2. CRISPR लायब्रेरी के साथ कक्षों को संक्रमित करना
    1. फसल कोशिकाओं और प्रत्येक 15 सेमी प्लेट के लिए आवश्यक सेल नंबर बीज.
    2. सभी प्लेटों में हेक्साडिमेट्रीन ब्रोमाइड (8 ग्राम/एमएल) जोड़ें।
    3. स्क्रीनिंग और नियंत्रण 2 प्लेटें करने के लिए MOI 0.3 के लिए आवश्यक मात्रा में वायरस जोड़ें. नियंत्रण 1 के लिए, वायरस न जोड़ें, और उस वॉल्यूम को मीडिया से बदलें.
    4. प्लेटों को झुकाव से अच्छी तरह मिला एंबेसी करें। इनक्यूबेटर में प्लेटें रखें, सुनिश्चित करें कि वे स्तर हैं।
      नोट: बैच संक्रमण चढ़ाना से पहले निलंबन में कोशिकाओं के लिए वायरस, मीडिया, और हेक्साडीमेट्रिन ब्रोमाइड के एक मास्टर मिश्रण के संयोजन के द्वारा किया जा सकता है।
    5. मीडिया निकालें और स्क्रीनिंग के लिए चरण 3.2.4 में निर्धारित एकाग्रता में puromycin युक्त ताजा मीडिया के साथ बदलें और वायरस के संक्रमण के बाद 1 प्लेटें 24 एच को नियंत्रित करें। नियंत्रण 2 प्लेट के लिए कोई puromycin के साथ ताजा मीडिया जोड़ें. 48 एच (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    6. 48 ज प्यूरोमाइसिन इसके अलावा के बाद, सुनिश्चित करें कि सभी असंक्रमित कोशिकाएं मृत हैं (नियंत्रण 1) प्यूरोमाइसिन गतिविधि की पुष्टि करने के लिए, फिर संक्रमित कोशिकाओं को काट दें।
  3. संक्रमित सेल आबादी और सेल पासिंग की कटाई
    1. एक बाँझ कंटेनर में सभी स्क्रीनिंग प्लेटों से puromycin चयनित कोशिकाओं फसल. प्रत्येक नियंत्रण प्लेट से कोशिकाओं को अलग से एकत्र करें। कोमल दोहराया पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को तितर-बितर करें।
    2. पूल्ड स्क्रीनिंग कक्षों से कोशिकाओं की गणना करें, 1 नियंत्रित करें, और नियंत्रण 2 को अलग-अलग करें और प्रति 1 एमएल कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    3. एमओआई की गणना करें और निम्नानुसार प्राप्त कवरेज गुना करें:
      Equation 1
      Equation 2
    4. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए चयनित पुस्तकालय कवरेज पर जमा कोशिकाओं से सेल छर्रों के तीन प्रतिकृतिले ले लीजिए। 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। पीबीएस के साथ धोएं। ट्यूब लेबल और फ्रीज-सूखी सेल छर्रों -80 डिग्री सेल्सियस पर (ये T0 संदर्भ नमूने हैं).
    5. संक्रमित कोशिकाओं के पूल को तीन प्रतिकृति समूहों में विभाजित करें (उदा., A को दोहराने, बी को दोहराने, सी को दोहराने), जबकि प्रत्येक प्रतिकृति के भीतर पुस्तकालय कवरेज बनाए रखने। एक ही बीज घनत्व पर बीज कोशिकाओं के रूप में आम तौर पर इस्तेमाल किया जाएगा जब उन्हें विस्तार. प्रत्येक प्रतिकृति प्लेट और प्रतिकृति के बीच कोशिकाओं की एक ही कुल संख्या के लिए कोशिकाओं की एक ही संख्या का उपयोग करें.
    6. कोशिकाओं को पारित करना जारी रखें और ऊपर के रूप में पूल्ड संक्रमित कोशिकाओं के प्रत्येक प्रतिकृति से सेल छर्रों की तीन प्रतिकृति फसल, सेल लाइन के आधार पर हर 3-8 दिन, अप करने के लिए 15-20 सेल दोहरीकरण के लिए. प्रत्येक मार्ग पर, प्रत्येक प्रतिकृति समूह में सभी प्लेटों से कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ फसल (यानी, एक प्लेटों को दोहराने से सभी कोशिकाओं को फिर से मिश्रित कर रहे हैं एक साथ, बी प्लेटों को दोहराने से सभी कोशिकाओं को फिर से मिश्रित कर रहे हैं, आदि).
    7. एक समय (टी) के साथ प्रत्येक गोली लेबल और पदकोप. यह दिन के बाद T0 गोली एकत्र की है की संख्या से मेल खाती है (उदा., T3]A, T3]B, T3 डिग्री सेल्सियस, आदि).
  4. नकारात्मक चयन दवा स्क्रीन के लिए, कोशिकाओं उपचार से पहले T0 के बाद कम से कम एक मार्ग के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. T3 या T6 में, प्रत्येक प्रतिकृति समूह (ए, बी, सी) से कोशिकाओं को दवा उपचार और नियंत्रण आबादी में विभाजित, एक ही बोने के चरण में इस्तेमाल घनत्व का उपयोग कर 5.3.5.
    1. अलग से दवा उपचार समूह में प्रत्येक प्रतिकृति के लिए पुस्तकालय कवरेज के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या पूल. मध्यवर्ती सांद्रता में दवा जोड़ें (आईसी20-आईसी50)। कोशिकाओं को बीज और इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) अगले मार्ग तक।
    2. अलग से वाहन नियंत्रण समूह में प्रत्येक प्रतिकृति के लिए पुस्तकालय कवरेज के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या पूल. दवा के रूप में एक ही मात्रा का उपयोग कर वाहन नियंत्रण जोड़ें (lt;0.5% v/v). कोशिकाओं को बीज और इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) अगले मार्ग तक।
    3. कोशिकाओं को पारित करने और जीनोमिक डीएनए के लिए सेल छर्रों फसल के रूप में कदम 5.3.5 में वर्णित हर 3 दिन के लिए जारी रखें, जबकि प्रत्येक मार्ग पर दवा या वाहन ताज़ा.
  5. सकारात्मक चयन या दवा प्रतिरोध स्क्रीन के लिए, पुस्तकालय कवरेज के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के अनुसार प्रत्येक प्रतिकृति समूह विभाजित. प्रत्येक को दोहराने के लिए आईसी90 दवा सांद्रता जोड़ें. आईसी90में, कोशिकाओं के बहुमत को मार डाला जाएगा. प्रतिरोधी आबादी बढ़ने के लिए और जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए सेल छर्रों (1-2 x 107 कोशिकाओं) इकट्ठा करने के लिए अनुमति दें।

6. CRISPR नमूना तैयारी और अनुक्रमण

  1. जीनोमिक डीएनए शुद्धि
    1. thwing के लिए आरटी में 5-10 मिनट के लिए जमे हुए सेल छर्रों इनक्यूबेट करें।
    2. एक सेल गोली युक्त एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में पीबीएस के 1.4 एमएल जोड़ें। 20 s के लिए भंवर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए और 1 मिनट के लिए आराम. यदि आवश्यक हो, P1000 के साथ pipette 15x शेष सेल clumps को तोड़ने के लिए. यदि कोशिकाओं को 15 एमएल या 1.5 एमएल ट्यूब से स्थानांतरित किया जाता है, तो 1 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं को पुन: स्फूर्त करें, फिर कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और मूल ट्यूब को पीबीएस के 400 डिग्री एल के साथ धो एंटर करें।
    3. पुनः निलंबित कोशिकाओं में न्यूक्लिई Lysis Solution की 5 एमएल जोड़ें। एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग करना, ऊपर और नीचे 5x pipeting द्वारा नमूना मिश्रण.
    4. नाभिकीय lysate में RNase A (20 mg/mL) का 32 $L जोड़ें और नमूने को ट्यूब 5x को उलटकर मिला दें। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण इनक्यूबेट और आर टी पर 10 मिनट के लिए शांत करने के लिए नमूना अनुमति देते हैं।
    5. lysate और भंवर के लिए प्रोटीन वर्षा समाधान के 1.67 एमएल जोड़ें 20 s. छोटे प्रोटीन clumps मिश्रण के बाद दिखाई दे सकता है.
    6. आरटी में 10 मिनट के लिए 4,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    7. एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग करना, supernatant एक 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब isopropanol के 5 एमएल युक्त करने के लिए स्थानांतरण। धीरे से उलटा द्वारा समाधान 10x मिश्रण जब तक डीएनए मनाया जाता है.
      नोट: डीएनए सफेद के रूप में मनाया जा सकता है, धागा की तरह किस्में कि एक दृश्य द्रव्यमान फार्म.
    8. डीएनए गोली करने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए 4,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    9. एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग करना, ध्यान से supernatant को हटाने और डीएनए गोली disloding से बचें. डीएनए के लिए आरटी में 70% इथेनॉल का 5 एमएल जोड़ें। डीएनए गोली और अपकेंद्रित्र ट्यूब के पक्षों को धोने के लिए ट्यूब को धीरे से घुमाएं।
    10. आरटी में 5 मिनट के लिए 4,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    11. एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग करना, ध्यान से 70% इथेनॉल को हटाने और डीएनए गोली disloding से बचें. आरटी में 10 मिनट के लिए एयर-सूखी जीनोमिक डीएनए।
    12. ट्यूब के लिए टीई समाधान के 400 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और डीएनए को 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट करके भंग कर दें। डीएनए को हर 15 मिनट में धीरे से ट्यूब को फ़्लिक करके मिलाएं। यदि डीएनए पूरी तरह से भंग नहीं होता है, तो एक अतिरिक्त 1 एच के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें, जबकि धीरे से ट्यूब को हर 15 मिनट में flicking, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें।
    13. आरटी पर 1 मिनट के लिए 4,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और एक 1.5 एमएल कम बाध्यकारी ट्यूब के लिए जीनोमिक डीएनए हस्तांतरण।
    14. Quantify और दोनों स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर जीनोमिक डीएनए की शुद्धता को मापने (कुल न्यूक्लिक एसिड सामग्री के लिए) और fluorometer (डबल-स्ट्रेंड डीएनए सामग्री के लिए).
  2. वैकल्पिक रूप से, यदि एसडीआरनए के डाउनस्ट्रीम पीसीआर प्रवर्धन के साथ समस्याएं इस प्रकार हैं, तो जीनोमिक डीएनए को कम करें।
    1. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 400 डिग्री एल जीनोमिक डीएनए स्थानांतरण।
    2. 5 एम NaCl के 18 डिग्री एल (अंतिम सांद्रता 0.2 एम) और 95% इथेनॉल के 900 डिग्री एल जोड़ें।
    3. पूरी तरह से मिश्रित जब तक उलटा ट्यूब 10x, तो आरटी पर 10 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    4. ध्यान से supernatant निकालें और डीएनए गोली disloding से बचें. 70% इथेनॉल के 500 $L के साथ डीएनए गोली धो लें। डीएनए गोली धोने के लिए ट्यूब को धीरे से घुमाएं।
    5. आरटी में 5 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    6. ध्यान से supernatant निकालें और डीएनए गोली disloding से बचें. आरटी में 10 मिनट के लिए एयर-सूखी जीनोमिक डीएनए।
    7. 6-1-12 के चरण में वर्णित डीएनए को भंग करने के लिए 300 डिग्री सेल्सियस टीई जोड़ें।
    8. 6-1-14 के खंड में वर्णित जीनोमिक डीएनए की शुद्धता को परिमाणित तथा मापें.
  3. CRISPR अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी
    1. पीसीआर 1 सेट करें जैसा कि तालिका 5 में बताए गए हैं, जिसमें जीनोमिक डीएनए के कुल 100 डिग्री ग्राम का उपयोग किया गया है। 50 डिग्री सेल्सियस प्रति जीनोमिक डीएनए के 3.5 डिग्री ग्राम जोड़ें और वांछित कवरेज प्राप्त करने के लिए समान 50 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रियाओं की स्थापना की। तालिका 6 LCV2 के प्रवर्धन के लिए प्राइमर अनुक्रमों के उदाहरण सूचीबद्ध करता है::TKOv3 अनुक्रमण पुस्तकालयों. तालिका 7 pLCKO2 के प्रवर्धन के लिए प्राइमर अनुक्रमों के उदाहरण सूचीबद्ध करता है::TKOv3 अनुक्रमण पुस्तकालयों.
    2. सारणी 8में बताए गए प्रोग्राम का उपयोग करते हुए थर्मोसाइकिलर में पीसीआर 1 अभिक्रियाओं को बढ़ाना।
    3. पीसीआर 1 प्रवर्धन की जाँच करें एक 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद के 2 $L चल रहा है. पीसीआर 1 600 बीपी का एक उत्पाद पैदावार।
    4. पूल प्रत्येक जीनोमिक डीएनए नमूने के लिए सभी व्यक्तिगत 50 डिग्री एल प्रतिक्रियाओं और भंवर द्वारा मिश्रण.
    5. टेम्पलेट के रूप में पूल किए गए PCR 1 उत्पाद के 5 $L का उपयोग करते हुए तालिका 9 में दिए गए प्रत्येक नमूने के लिए एक PCR 2 प्रतिक्रिया (50 $L) सेट करें. अनुक्रमण लायब्रेरी नमूने के पूलिंग की अनुमति देने के लिए प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के लिए अद्वितीय अनुक्रमण प्राइमर संयोजनका उपयोग करें।
    6. सारणी 10में उल्लिखित कार्यक्रम का उपयोग करते हुए थर्मोसाइकिलर में पीसीआर 2 अभिक्रिया को बढ़ाना ।
    7. एक जेल कास्टिंग से पहले 10 मिनट के लिए 0.1 एन एचसीएल के साथ प्रवर्धित उत्पादों को शुद्ध करने के लिए स्वच्छ agarose जेल उपकरण। पीसीआर 2 प्रवर्धित उत्पादों को शुद्ध करने के लिए डीएनए दाग युक्त एक 2% agarose जेल तैयार करें।
    8. कम वोल्टेज पर 2% agarose जेल पर पीसीआर 2 उत्पाद चलाएँ (1.0-1.5 एच रन). पीसीआर 2 200 बीपी का एक उत्पाद पैदावार।
    9. एक नीले प्रकाश transilluminator पर पीसीआर उत्पादों कल्पना। 200 बीपी बैंड उत्पाद निकालना और एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर agarose जेल टुकड़ा से डीएनए शुद्ध. परिमाणित करें और दोनों स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और fluorometer पर अनुक्रमण पुस्तकालय की शुद्धता को मापने।
      नोट: एक ठेठ जेल शुद्ध अनुक्रमण पुस्तकालय एकाग्रता 5-10 एनजी/जेडएल और 150-300 एनजी की कुल उपज से पर्वतमाला।
  4. उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण
    1. अगली पीढ़ी के अनुक्रमक पर CRISPR अनुक्रमण पुस्तकालयों अनुक्रम।
    2. अनुक्रम संदर्भ टी0 नमूने 400 से 500 गुना पुस्तकालय कवरेज की उच्च पढ़ें गहराई पर. 200 गुना की एक न्यूनतम पढ़ने की गहराई पर ड्रॉप-आउट स्क्रीन के लिए अनुक्रम प्रयोगात्मक timepoint नमूने. मजबूत सकारात्मक चयन स्क्रीन के लिए, 50 गुना कवरेज की पढ़ा गहराई की एक न्यूनतम समृद्ध sgRNAs की पहचान के लिए पर्याप्त है.
      नोट: यह एक विशेष स्क्रीन के लिए पुस्तकालय प्रतिनिधित्व निर्धारित करने के लिए T0 नमूना अनुक्रम करने के लिए महत्वपूर्ण है और समय के साथ sgRNA गुना परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक संदर्भ के रूप में सेवा.

7. डेटा विश्लेषण

  1. अनुक्रम मैप करने के लिए Bowtie जैसे प्रोग्राम्स का उपयोग करअनुक्रम संरेखित करें निम्न पैरामीटर का उपयोग करके संदर्भ लायब्रेरी में पढ़ता है: -v2 (दो बेमेल की अनुमति) और -m1 (लायब्रेरी में एक से अधिक अनुक्रम के लिए मैप किया गया कोई भी पठन को छोड़ दें)।
  2. प्रत्येक sgRNA के लिए प्रत्येक sgRNA के लिए विशिष्ट मैप की गई रीडिंग की संख्या को सामान्य 10 मिलियन प्रति नमूना निम्नानुसार पढ़ता है:
    Equation 3107
  3. प्रत्येक प्रतिवर्धित करने के लिए प्रत्येक sgRNA के log2 गुना परिवर्तन की गणना करें (Tn) T0 नमूना (Tn/T0) की तुलना में. शून्य से discontinuities को रोकने के लिए सभी पठन गणनाओं के लिए 0.5 की एक छद्म गणना जोड़ें। गुना-परिवर्तन गणना और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से T0 नमूने में sgRNAs को शामिल न करें.30 कच्चे पढ़ता है.
  4. जीन अनिवार्यता (BAGEL) एल्गोरिथ्म के Bayesian विश्लेषण के साथ गुना परिवर्तन का विश्लेषण करें;lt;https://github.com/hart-lab/bagel और gt;, जीन अनिवार्यता स्क्रीन केलिए पहले से परिभाषित कोर आवश्यक और गैर जरूरी प्रशिक्षण सेट का उपयोग कर ( अनुपूरक तालिका S1) या दवा [ ] lt;https://github.com/hart-lab/drug] और दवा स्क्रीन के लिए20.
  5. सटीक गणना और बीएफ स्कोर का उपयोग कर स्क्रीन प्रदर्शन मूल्यांकन के लिए याद करते हैं। ऊपर BF स्कोर सबसेट के साथ, अजगर के लिए Scikit-सीखने पुस्तकालय के precision-recall-curve फ़ंक्शन के लिए सही सकारात्मक सूची के रूप में चरण 7.4 से आवश्यक सेट का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, R में PRROC पैकेज का उपयोग कर एक ही कार्य करें।
  6. प्रत्येक जीन के लिए सभी गाइडों के माध्य वलन परिवर्तन की गणना कीजिए। आर या समकक्ष सॉफ्टवेयर में आवश्यक और गैर-जरूरी जीनों के लिए घनत्व भूखंडों उत्पन्न करें (चरण 7.4 देखें)। R में, यदि x.ess एक वेक्टर है जिसमें लॉग फ़ोल्ड परिवर्तन आवश्यक जीनों के परिवर्तन मान होते हैं और x.nonEss में गैर-आवश्यक जीन होते हैं, निम्न आदेश का उपयोग करके प्लॉट:
    भूखंड ( घनत्व ( x.ess ), xlab]"mean logFC",col$"red",lwd ]2 )
    रेखाएँ( घनत्व ( x.nonEss ), col$"नीले", lwd ]2 )
    नोट: अजगर संस्करण विवरण और इस्तेमाल संकुल के लिए, देखें scikit-learn v0.19.1: (Pedregosa एट अल द्वारा प्रकाशितअल. 21).

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Representative Results

जीनोम-स्केल CRISPR स्क्रीनिंग कार्यप्रवाह का ओवरव्यू

चित्र 1 एक एकीकरण घटनाओं और पर्याप्त पुस्तकालय प्रतिनिधित्व सुनिश्चित करने के लिए एक कम MOI पर CRISPR पुस्तकालय lentivirus के साथ लक्ष्य कोशिकाओं के संक्रमण के साथ शुरू, जमा CRISPR स्क्रीनिंग कार्य प्रवाह का ओवरव्यू दिखाता है (आमतौर पर 200- करने के लिए 1000 -fold). संक्रमण के बाद, कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए एंटीबायोटिक प्यूरोमाइसिन के साथ इलाज किया जाता है। चयन के बाद, एक आधारभूत T0 सेल गोली स्क्रीनिंग के शुरू में पुस्तकालय वितरण का आकलन करने के लिए एकत्र किया जाता है। शेष कोशिकाओं, आनुवंशिक क्षोभ की एक विषम आबादी के शामिल, वांछित पुस्तकालय प्रतिनिधित्व में हर 3-4 दिनों में पारित कर रहे हैं 15-20 दोहरीकरण के लिए जीन संपादन और जिसके परिणामस्वरूप प्रभाव प्रकट करने के लिए अनुमति देते हैं. दवा उपचार के साथ स्क्रीन आम तौर पर T3 या T6 में जोड़ रहे हैं के बाद कोशिकाओं वायरस संक्रमण और puromycin चयन से बरामद किया है. कोशिकाओं को वांछित timepoints पर अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा गाइड बहुतायत निर्धारित करने के लिए, जीनोमिक डीएनए के लिए हर मार्ग पर वांछित पुस्तकालय प्रतिनिधित्व पर काटा जाता है।

डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण लायब्रेरी तैयारी चरणों में हो सकता है जो किसी भी विफलता के मामले में एक से अधिक नमूने एकत्रित करने के लिए अनुशंसित है। जमा स्क्रीन आम तौर पर व्यवहार्यता आधारित assays कि या तो सकारात्मक या आवश्यक sgRNAs के नकारात्मक चयन के लिए तैयार कर रहे हैं. सकारात्मक स्क्रीन उन जीनों की पहचान करती हैं जो विशिष्ट चयन दबाव (उदा., दवाओं या उत्परिवर्ती सेल लाइन) के तहत प्रतिरोध दिखाते हैं या जीवित रहने में वृद्धि करते हैं। इस मामले में, सबसे कोशिकाओं के चयन से मर जाएगा, और कोशिकाओं है कि रहने के लिए समृद्ध किया जाएगा sgRNAs जीन है कि दवा या हालत के लिए प्रतिरोधी रहे हैं को लक्षित परीक्षण किया जा रहा है. नकारात्मक चयन स्क्रीन या "ड्रॉप-आउट" स्क्रीन स्क्रीन चयन दबाव के तहत जीवित रहने की बढ़ती संवेदनशीलता या नुकसान के साथ जीन नॉक-आउट की पहचान करते हैं। इस तरह के एक विकास दोष के रूप में एक phenotypic प्रभाव है कि क्षोभ की पहचान करने के लिए, प्रत्येक समय बिंदु पर गाइड बहुतायत अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा परिमाणित है और ड्रॉप-आउट या स्क्रीन के पाठ्यक्रम पर गाइड के संवर्धन का आकलन करने के लिए T0 की तुलना में। विश्लेषण प्लेटफार्मों का उपयोग करना, लॉग-फ़ोल्ड परिवर्तन गाइड के लिए मापा जाता है, और BAGEL जैसे एल्गोरिदम जीन हिट की रैंकिंग सक्षम करने के लिए लागू किया जा सकता है।

पूल्ड CRISPR स्क्रीन में पुस्तकालय प्रवर्तक का प्रवर्धन और रखरखाव

चित्र 2 प्लाज्मिड पुस्तकालय के प्रवर्धन के बाद गाइडों के अपेक्षित वितरण को दर्शाता है। TKOv3 पुस्तकालय जीन प्रति चार sgRNAs के साथ 71,090 sgRNAs के होते हैं, 18,000 प्रोटीन कोडिंग जीन10लक्ष्य. एक आदर्श पुस्तकालय हर एक sgRNA समान मात्रा में प्रतिनिधित्व किया जाना चाहिए. इसलिए, यह अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा प्रवर्धित पुस्तकालय में गाइड के वितरण की पुष्टि करने के लिए सिफारिश की है। यहाँ दिखाया sgRNAs के बहुत तंग वितरण के साथ एक प्रवर्धित पुस्तकालय है, पुष्टि है कि और सभी sgRNAs के 95% 4 गुना वितरण रेंज के भीतर हैं (चित्र 2). SgRNAs की एक व्यापक वितरण से संकेत मिलता है कि पुस्तकालय गाइड की बहुतायत समान रूप से प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं और जमा स्क्रीन में शोर करने के लिए योगदान कर सकते हैं.

स्क्रीन प्रदर्शन का मूल्यांकन

चित्र 3 यह दर्शाता है कि स्क्रीन की निष्पादन गुणवत्ता का मूल्यांकन आवश्यक (684 जीनों) और गैर-जरूरी जीनों (926 जीनों) की स्वर्ण मानक संदर्भ सूची के विरुद्ध सभी SgRNA के गुना परिवर्तन वितरण का मूल्यांकन करके किया जा सकता है और जैसा कि कल्पना की गई है परिशुद्धता-recall घटता10| सोने के मानक संदर्भ सेट का उपयोग करना, Bayes फैक्टर (BF) स्कोर स्क्रीन समापन बिंदु के लिए गणना कर रहे हैं, और सटीक-कॉल घटता साजिश रची जाती है. BF स्कोर ज्ञात आवश्यक और गैर जरूरी गाइड सेट के वितरण की तुलना करने के लिए एक Bayesian ढांचे का उपयोग कर एक जीन को लक्षित सभी गाइड के लिए लॉग गुना परिवर्तन का विश्लेषण करके गणना कर रहे हैं (BAGEL एल्गोरिथ्म पहले वर्णित19). झूठी खोज दर (एफडीआर) अनुभवजन्य एक ही सोने के मानक संदर्भ सेट का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. एक उच्च प्रदर्शन स्क्रीन BF की एक दहलीज पर आवश्यक जीन की एक उच्च संख्या ठीक होना चाहिए ;6 और FDR;lt;5%, के रूप में सबसे घटता में एक तेज "एल्बो" और टर्मिनल बिंदु के लिए एक सीधी रेखा के रूप में चित्रा 3A में नीली रेखा द्वारा दिखाया द्वारा सबूत. आवश्यक और गैर जरूरी जीनों को लक्षित करने वाले गाइडों के ड्रॉपआउट की भी जांच की जानी चाहिए (चित्र 3ख) संदर्भ गैर-जरूरी जीनों को लक्षित करने वाली मार्गदर्शिकाओं को शून्य पर केंद्रित लॉग-फ़ोल्ड परिवर्तनों का काफी हद तक सममित वितरण दिखाना चाहिए, जैसा कि चित्र 3खमें डैश्ड रेखा द्वारा दर्शाया गया है। आवश्यक जीनों को लक्षित करने वाली गाइडों का गुना परिवर्तन वितरण गैर-जरूरी जीनों को लक्षित करने वाली गाइडों के वितरण की सापेक्ष एक मजबूत नकारात्मक बदलाव दर्शाता है, जैसा कि चित्र 3खमें ठोस रेखा द्वारा दर्शाया गया है।

आवश्यक जीन

जमा जीनोम चौड़ा ड्रॉप-आउट स्क्रीन के बुनियादी अनुप्रयोगों में से एक आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए है। आवश्यक जीन, फिटनेस जीन की एक उपश्रेणी, जीन जिसका क्षोभ कोशिका घातकता का कारण बनता है, यह भी प्रसार जीन के रूप में ढीला माना जाता है. कैंसर जीव विज्ञान के संदर्भ में, यह एक विशेष ट्यूमर सेल लाइन के लिए निर्भरता की पहचान करने के लिए संदर्भ-विशिष्ट अनिवार्य की पहचान करने के लिए संभव है। चित्र 4, BAGEL एल्गोरिथ्म से व्युत्पन्न Bayes Factor स्कोर का उपयोग कर आवश्यक जीन के जीन रैंक से पता चलता है. Bayes फैक्टर (BF) एक विश्वास उपाय है कि जीन नॉक आउट एक फिटनेस दोष में परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है. अधिक सकारात्मक स्कोर उच्च विश्वास का संकेत है कि क्षोभ फिटनेस में कमी का कारण बनता है.

सकारात्मक चयन स्क्रीन

जीनोम-वाइड नॉक-आउट पूल को अतिरिक्त दवा एजेंट की उपस्थिति में सुसंस्कृत किया जा सकता है ताकि दमनक/प्रतिरोध जीनों की तलाश की जा सके। यहाँ दिखाया गया है HCT116 कोशिकाओं का एक उदाहरण है थाइमिडीन की उपस्थिति में जांच की G1/S गिरफ्तारी3के suppressors के लिए देखने के लिए . इस स्क्रीन का विवरण पिछले प्रकाशन3में पाया जा सकता है। संक्षेप में, CRISPR पुस्तकालय संक्रमित कोशिकाओं के चयन के 6 दिन बाद, कोशिकाओं को पुस्तकालय कवरेज को बनाए रखने और थाइमिडीन के साथ इलाज की प्रतिकृति में विभाजित किया गया था। कोशिकाओं को दवा की उपस्थिति में पारित कर रहे थे जब तक पर्याप्त प्रतिरोधी कोशिकाओं जीनोमिक डीएनए नमूने के लिए बरामद किए गए. सकारात्मक चयन नकारात्मक स्क्रीन की तुलना में कम कवरेज पर अनुक्रम (पढ़ें गहराई) किया जा सकता है के बाद से केवल गाइड का एक छोटा सा अंश मजबूत चयनात्मक दबाव के कारण रहेगा. इस उदाहरण में, अनुक्रमण कुछ लाख पढ़ता के साथ प्राप्त किया गया था, और 12 sgRNAs के 11 थाइमिडीन kinase (TK1) को लक्षित बरामद किया गया और उम्मीद के रूप में समृद्ध(चित्र 5).

राशि 1:1:1 के मोलर अनुपात के आधार पर निर्धारित की गई थी
घटक 15 सेमी प्लेट प्रति राशि एक
LCV2::TKOv3 pLCKO2::TKOv3
psPAX2 4.8 ग्राम 7.0 डिग्री
पीएमडी2.जी 3.8 $g 4.0 $g
TKOv3बी 8.0 $g 5.0 डिग्री
एक 1:1:1 मोलर अनुपात में TKO लाइब्रेरी के लिए सबसे उत्पादक प्लाज्मिड संयोजन के आधार पर निर्धारित राशि
ख CRISPR पुस्तकालय वेक्टर रीढ़ की हड्डी पर आधारित राशि TKO प्लाज़्मिड। LCV2 सभी में एक वेक्टर [13 kb, गैर Cas9 pLCKO2 वेक्टर ] 7.6 kb

तालिका 1: TKOv3 transfection के लिए प्लास्मिड की अनुशंसित राशि।

घटक 15 सेमी प्लेट प्रति राशि
ऑप्टी-एमईएम 800 जेडएल
ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक 48 डिग्री सेल्सियस

तालिका 2: लिपिड आधारित transfection अभिकर्मक सेट अप.

तह-कवरेज sgRNAb प्रति कोशिकाओं की संख्या  संक्रमणख के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या
(sgRNA पुस्तकालय आकारएक $ गुना कवरेज) (sgRNA पुस्तकालय आकार ] गुना कवरेज ] 0.3 MOI)
200 1.5 x 107 5 x 107
500 3.6 x 107 1.2 x 108
1000 7.1 x 107 2.4 x 108
एक TKOv3 पुस्तकालय आकार के आधार पर $ 71,090 sgRNA
ख संख्याओं को पूर्णांकित किया जाता है

तालिका 3: विभिन्न गुना-कवरेज पर TKOv3 CRISPR पुस्तकालय संक्रमण और सेल चढ़ाना के लिए आवश्यक सेल संख्या का निर्धारण।

उपचार संक्रमण के लिए आवश्यक प्लेटों की संख्या
स्क्रीनिंग प्लेटें वायरस, + प्यूरोमाइसिन (sgRNA पुस्तकालय का आकार ] 200 गुना) ] 0ण्3 MOI ] संक्रमण पर कोशिका बोने घनत्व ] प्लेटों की संख्या की आवश्यकताहै एक
नियंत्रण 1 कोई वायरस, + puromycin (0% अस्तित्व नियंत्रण) 1
नियंत्रण 2 वायरस, + कोई puromycin (100% अस्तित्व नियंत्रण) 1
MOI उतार चढ़ाव और विकास दर के लिए समायोजित करने के लिए अतिरिक्त प्लेटें शामिल करें

तालिका 4: संक्रमण सेट-अप के लिए परिकलन।

अभिकर्मकों 1x प्रतिक्रिया प्रति राशि
2x मास्टर मिक्स 25 जेडएल
10 एमएम पीसीआर 1 एलसीवी2 फॉरवर्ड प्राइमर 2.5 $एल
10 एमएम पीसीआर 1 LCV2 रिवर्स प्राइमर 2.5 $एल
जीनोमिक डीएनए 3.5 डिग्री
आँखों से पानी निकलना या मुँह में पानी भर आना 50 डिग्री सेल्सियस तक
दो या अधिक संख्‍याओं या मात्राओं का योग 50 डिग्री सेल्सियस

तालिका 5: PCR 1 सेट-अप.

तालिका 6: LCV2 के प्रवर्धन के लिए पीसीआर प्राइमर::TKOv3 अनुक्रमण पुस्तकालयों. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 7: pLCKO2 के प्रवर्धन के लिए पीसीआर प्राइमर::TKOv3 अनुक्रमण पुस्तकालयों. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

कहीं जाना तापमान किसी काम के लिए समय मापना
1 98 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
2 98 डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड 25 चक्र (कदम 2 - 4)
3 66 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
4 72 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड
5 72 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
6 10 डिग्री सेल्सियस जलपोत या विमान में सामान रखने का स्‍थान

तालिका 8: PCR 1 चक्र पैरामीटर।

अभिकर्मकों 1x प्रतिक्रिया प्रति राशि
2x मास्टर मिक्स 25 जेडएल
10 एमएम i5 फॉरवर्ड प्राइमर 2.5 $एल
10 एमएम i7 रिवर्स प्राइमर 2.5 $एल
पीसीआर 1 उत्पाद 5 $L
आँखों से पानी निकलना या मुँह में पानी भर आना 15 जेडएल
दो या अधिक संख्‍याओं या मात्राओं का योग 50 डिग्री सेल्सियस

तालिका 9: PCR 2 सेट-अप.

कहीं जाना तापमान किसी काम के लिए समय मापना
1 98 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
2 98 डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड 10 चक्र (चरण 2 - 4)
3 55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
4 65 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड
5 65 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
6 10 डिग्री सेल्सियस जलपोत या विमान में सामान रखने का स्‍थान

तालिका 10: PCR 2 चक्र पैरामीटर.

अनुपूरक तालिका S1. TKO संदर्भ जीन सेट कृपया यहाँ क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए.

Figure 1
चित्र 1: पूलकिए गए स्क्रीनिंग कार्यप्रवाह का Schematic ओवरव्यू. (क)लक्ष्य सेल जनसंख्या कम MOI पर CRISPR पुस्तकालय lentivirus से संक्रमित है यह सुनिश्चित करने के लिए कि ज्यादातर कोशिकाओं को एक वायरल एकीकरण प्राप्त करते हैं और पुस्तकालय प्रतिनिधित्व बनाए रखा है. अलग अलग रंग प्रत्येक वायरल कण में अलग sgRNAs प्रतिनिधित्व करते हैं. आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल पूल का चयन किया जाता है। एक बार चयन पूरा हो गया है, कोशिकाओं T0 संदर्भ के लिए नमूना और क्रमिक रूप से पारित कर रहे हैं. (बी) टी0 के बाद पहले मार्ग पर कोशिकाओं को संक्रमण से ठीक हो गया है और यदि आवश्यक हो तो दवा उपचार जोड़ा जा सकता है। उपचार के बाद, सेल आबादी क्रमिक कई हफ्तों के लिए पारित कर रहे हैं. प्रत्येक मार्ग के दौरान, कोशिकाओं जीनोमिक डीएनए के लिए एकत्र कर रहे हैं और sgRNA पुस्तकालय के आवश्यक गुना कवरेज पर reseeded. (सी) स्क्रीन के दो प्रकार के प्रदर्शन किया जा सकता है: 1) सकारात्मक चयन स्क्रीन, जो उत्परिवर्ती कोशिकाओं है कि प्रतिरोध दिखाने या विशिष्ट चयन दबाव (जैसे, दवाओं या उत्परिवर्ती सेल लाइन) के तहत अस्तित्व में वृद्धि की पहचान, के रूप में वे के दौरान समृद्ध हो जाएगा स्क्रीन; या 2) नकारात्मक चयन स्क्रीन, जो स्क्रीन चयन दबाव के तहत करने के लिए वृद्धि हुई संवेदनशीलता या अस्तित्व के नुकसान के साथ उत्परिवर्ती कोशिकाओं की पहचान, के रूप में वे स्क्रीन के दौरान खो जाएगा. (घ)जीनोमिक डीएनए का टी-बदला जाता है और गाइड क्षेत्रों के लिए समृद्ध करने के लिए पीसीआर-एम्पलीकृत किया जाता है। (ई) गाइड बहुतायत अगली पीढ़ी अनुक्रमण और समृद्ध द्वारा परिमाणित है, या समाप्त गाइड "हिट" पहचान के लिए निर्धारित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रवर्धित CRISPR sgRNA पुस्तकालय की गुणवत्ता. बढ़ा हुआ पुस्तकालय plasmids अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं (अनुशंसित पढ़ता है: 30 लाख पढ़ता है, पुस्तकालय के $ 400 गुना प्रतिनिधित्व करने के लिए इसी). यहाँ दिखाया गया है sgRNAs की तंग वितरण के साथ एक पुस्तकालय है, के साथ gt; एक 4 गुना वितरण रेंज के भीतर सभी sgRNAs के 95%.  कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र ााा्वित 3: सोने के मानक आवश्यक जीन संदर्भ सेटों का उपयोग करके ड्रॉप-आउट स्क्रीन गुणवत्ता का मूल्यांकन। (क)स्क्रीनिंग के परिशुद्धता स्मरण विश्लेषण के परिणामस्वरूप बीएफ की दहलीज पर आवश्यक जीनों की वसूली की जा रही है। उच्च प्रदर्शन स्क्रीन नीली रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं और कम प्रदर्शन स्क्रीन लाल रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. (ख)एसजीआरएनए के परिवर्तन वितरण आवश्यक जीनों (ठोस रेखा) और गैर-जरूरी जीनों (डॉटेड लाइनों) को लक्षित करना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: जीन अनिवार्यता का निर्धारण। जीन की Bayes फैक्टर रैंकिंग अनिवार्य रूप से एक विशेष स्क्रीन में. Bayes फैक्टर (BF) एक विश्वास उपाय है कि जीन नॉक आउट एक फिटनेस दोष में परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है. उच्च Bayes कारक वृद्धि हुई विश्वास से संकेत मिलता है कि जीन नॉक आउट फिटनेस दोष में परिणाम, (लाल डॉट्स). लोअर Bayes फैक्टर स्कोर सुझाव है कि नॉक-आउट विकास लाभ (नीले डॉट्स) प्रदान करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: HCT116 कोशिकाओं में थाइमदीन ब्लॉक के दबाने के लिए सकारात्मक चयन स्क्रीन। T0 पर सभी sgRNAs के लिए सामान्य पढ़ें मायने रखता है मतलब सामान्यीकृत पठन गणना के खिलाफ साजिश रची थाइमिडीन इलाज के नमूने के लिए. सकारात्मक चयन स्क्रीन के लिए (यानी, दवा के एक आईसी90 एकाग्रता का उपयोग कर), क्षोभ है कि दवा के लिए प्रतिरोध प्रदान करेगा की संख्या छोटे होने की उम्मीद है. इस कारण से, पढ़ें गहराई क्या नकारात्मक स्क्रीन के लिए आवश्यक है की तुलना में कम हो सकता है, whch में पुस्तकालय के सबसे प्रतिनिधित्व होने की उम्मीद है. TK1 sgRNAs लाल रंग में घेर रहे हैं. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन3से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

उपयोग और उच्च लचीलाता की अपनी सादगी के कारण, CRISPR प्रौद्योगिकी व्यापक रूप से सटीक जीनोम संपादन के लिए पसंद के उपकरण के रूप में अपनाया गया है. पूल्ड CRISPR स्क्रीनिंग एक ही प्रयोग में आनुवंशिक क्षोभ के हजारों पूछताछ करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। जमा स्क्रीन में, sgRNA पुस्तकालयों आणविक बारकोड के रूप में सेवा, प्रत्येक अनुक्रम अद्वितीय है और लक्षित जीन के लिए मैप किया जाता है के रूप में. कोशिका जनसंख्या से जीनोमिक डीएनए को अलग करके, ब्याज के phenotype के कारण जीन अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा sgRNA बहुतायत की मात्रा निर्धारित करके निर्धारित किया जा सकता है. बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण तरीकों के नमूने में sgRNAs मात्रा में उपयोग किया जाता है, जिसका अर्थ है कि कई स्वतंत्र सेल आबादी लागत को कम करने के लिए एक ही अनुक्रमण लेन में जमा किया जा सकता है.

एक बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग परियोजना शुरू करने से पहले, यह एक अच्छी तरह से विशेषता और तकनीकी रूप से अनुकूलित मॉडल के लिए महत्वपूर्ण है। आनुवंशिक पृष्ठभूमि, विकास दर, और transduction दक्षता महत्वपूर्ण कारक हैं जब स्क्रीनिंग के लिए अपने सेल लाइनों का चयन. उदाहरण के लिए, विकास दर और संपादन दक्षता मॉडल की मापनीयता और तकनीकी उपयुक्तता निर्धारित करेगी। आदेश में पर्याप्त रूप से बड़े sgRNA पुस्तकालयों का प्रतिनिधित्व करने के लिए, कोशिकाओं के लाखों लोगों के दसियों की आवश्यकता है, इसलिए सेल संख्या धीमी दोहरीकरण या लोगों के साथ सेल लाइनों के लिए स्क्रीनिंग व्यवहार्यता में एक सीमित कारक हो सकता है कि अच्छा proliferative क्षमता नहीं है (उदाहरण के लिए, प्राथमिक कोशिकाओं). विकास दर ों के आधार पर, सेल कल्चर की स्थिति जैसे सेल सीडिंग घनत्व और स्क्रीनिंग के लिए प्लेट आकार का चयन तदनुसार किया जाना चाहिए। यह सबसे बड़ा पोत है कि व्यावहारिक और तकनीकी रूप से स्क्रीन के लिए संभव है में संस्कृति कोशिकाओं के लिए सिफारिश की है.

Lentivirus transduction क्षमता कोशिका प्रकार के बीच बदलती हैं, के रूप में कोशिकाओं निहित infectivity में अलग होते हैं. नतीजतन, एक सेल प्रकार में पर्याप्त संक्रमण को प्राप्त करने के लिए आवश्यक वायरस की मात्रा जरूरी दूसरे में एक ही नहीं होगा। इसलिए, यह कार्यात्मक सेल लाइन में उत्पादित lentivirus पुस्तकालय के प्रत्येक बैच के लिए महत्वपूर्ण है पुस्तकालय के पर्याप्त कवरेज सुनिश्चित करने के लिए जांच की और ज्यादातर एक transduction घटनाओं प्रति सेल कम MOIs पर प्रति रूपांतरण द्वारा 0.3 (अनुभाग 4). Transduction क्षमता भी सेल संस्कृति की स्थिति से प्रभावित किया जा सकता है; इसलिए, कार्यात्मक titers स्क्रीन में इस्तेमाल किया जाएगा कि एक ही सेल शर्तों का उपयोग कर निर्धारित किया जाना चाहिए. यही कारण है कि, यह एक ही ऊतक संस्कृति वाहिकाओं, मीडिया घटकों और मात्रा, सेल चढ़ाना घनत्व, और वायरस preps पूर्व thaws के बिना उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. विभिन्न स्वरूपों या शर्तों में किए गए माप मज़बूती से स्क्रीनिंग प्रारूप करने के लिए पैमाने पर नहीं होगा।

इस तरह के LCV2 के रूप में सभी में एक CRISPR-Cas9 गाइड पुस्तकालयों का उपयोग करने के लाभ के बावजूद:TKOv3, जीन एन्कोडिंग Cas9 काफी बड़ा है, यह मुश्किल वायरल कणों में पैकेज करने के लिए (105-106 TU/ कम lentiviral titers उद्धार सेल लाइनों है कि ट्रांसड्यूस करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं के लिए एक सीमा हो सकती है, के रूप में वे सभी एक CRISPR पुस्तकालयों के साथ और भी अधिक कठिनाई होगी. इसे कम करने के लिए, Cas9 अग्रिम में सेल लाइन में व्यक्त किया जाना चाहिए, CRISPR पुस्तकालयों के वितरण के बाद केवल sgRNAs युक्त (जैसे, pLCKO2::TKOv3), जो बहुत अधिक titers पर बनाया जा सकता है (107-108 TU/ एक सेल लाइन के गुणित ादोजी भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह लक्ष्य लोकी की संख्या निर्धारित करता है जिसे संशोधित करने की आवश्यकता है। अगुणित कोशिकाओं में पूर्ण नॉक-आउट उत्पन्न करने की क्षमता किसी दिए गए जीन की एकाधिक प्रतियों वाली कोशिकाओं की तुलना में अधिक कुशल है। इसलिए, अगुणित कोशिकाओं में स्क्रीन अधिक संवेदनशील हो सकती है और द्विगुणित या एयुपलॉयड सेल लाइनों6में निष्पादित स्क्रीन की तुलना में उच्च गुणवत्ता वाले डेटा की उपज हो सकती है। परीक्षण ज्ञात जीन है कि phenotype से जुड़े हुए हैं में मदद मिलेगी एक सेल लाइन मॉडल की स्क्रीन की क्षमता का निर्धारण. उदाहरण के लिए, अनिवार्यता स्क्रीन के लिए, 26S proteasome, PSMD1 (Addgene: plasmid #74180), एक कोर आवश्यक जीन की एक उपइकाई को लक्षित गाइड, संपादन दक्षता और सेल लाइनों की infectibility परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, PSMD1 के क्षोभ के रूप में सेल मौत में परिणाम होगा.

जमा स्क्रीन की मजबूती अत्यधिक sgRNA प्रतिनिधित्व पर निर्भर करता है. यह एक महत्वपूर्ण मीट्रिक है जो स्क्रीन के दौरान लाइब्रेरी प्रदर्शन और हिट की पहचान करने की क्षमता निर्धारित करता है. पुस्तकालय विविधता प्रत्येक sgRNA के प्रतिनिधित्व में पक्षपाती है; इसलिए, कोशिकाओं की संख्या की जांच और विश्लेषण किया जाना चाहिए पर्याप्त रूप से बड़ी होनी चाहिए ताकि कम प्रतिनिधित्व वाले एसजीआरएनए6पर कब्जा सुनिश्चित किया जा सके। प्रत्येक sgRNA के 1000 गुना प्रतिनिधित्व के लिए विशिष्ट कवरेज है कि प्रकाशित स्क्रीन में इस्तेमाल किया गया है (यानी, 200-1000 कोशिकाओं प्रति sgRNA)10,15. इस प्रतिनिधित्व बनाए रखा जाना चाहिए जब पुस्तकालय प्लाज्मिड बढ़ाना (अनुभाग 1) और स्क्रीन भर में संक्रमित और आवश्यक सेल संख्या passaging द्वारा (अनुभाग 5) वांछित पुस्तकालय कवरेज का प्रतिनिधित्व करने के लिए और अनुक्रमण पुस्तकालय के दौरान तैयारी (प्रोटोकॉल 6), प्रोटोकॉल भर में वर्णित के रूप में. उदाहरण के लिए, TKOv3 पुस्तकालय के $ 200 गुना कवरेज प्राप्त करने के लिए चयन और 15 लाख संक्रमित कोशिकाओं के passaging की आवश्यकता है. अनुक्रमण के दौरान, यह मानते हुए कि द्विगुणित मानव जीनोम में डीएनए का 7.2 pg और जीनोम प्रति 1 sgRNA होता है, जीनोम डीएनए के कुल 100 डिग्री ग्राम के लिए अनुक्रमण पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है 15 मिलियन अनुक्रम पढ़ता है. कवरेज का निर्णय पुस्तकालय के आकार पर निर्भर करेगा, क्योंकि बड़े पुस्तकालयों के कवरेज के लिए बड़ी संख्या में कोशिकाओं को बनाए रखने की आवश्यकता होगी जो बनाए रखने में मुश्किल हो सकते हैं और तकनीकी रूप से व्यावहारिक नहीं हो सकते हैं। 200 गुना कवरेज की एक न्यूनतम TKOv3 पुस्तकालयों के साथ सिफारिश की है, के रूप में 200 गुना कोशिकाओं की बड़ी संख्या स्क्रीनिंग के रसद और सीमित के साथ सच जैविक sgRNA ड्रॉप-आउट का पता लगाने के लिए पर्याप्त गतिशील रेंज को बनाए रखने के बीच एक इष्टतम संतुलन प्रदान करता है यादृच्छिक अवक्षयों से शोर22,23. उच्च गुना पुस्तकालय प्रतिनिधित्व में सुधार reproducibility में परिणाम होगा और विशेष रूप से नकारात्मक चयन के लिए sgRNA बहुतायत में परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त खिड़की सुनिश्चित करते हैं. ऋणात्मक स्क्रीनों की एक सीमित विशेषता यह है कि क्षोभ केवल उस सीमा तक समाप्त हो जाता है जब यह प्रारंभिक पुस्तकालय24में मौजूद था . इसके बाद, सकारात्मक चयन स्क्रीन की गतिशील सीमा बहुत बड़ी है, क्योंकि वे कोशिकाओं के संवर्धन पर भरोसा करते हैं, और अंतिम जनसंख्या23के 100% को समृद्ध कर सकते हैं। इसलिए, सकारात्मक चयन स्क्रीन के लिए (उदाहरण के लिए दवा प्रतिरोध स्क्रीन), पुस्तकालय कवरेज और पढ़ने की गहराई को कम किया जा सकता है 50 करने के लिए 100 गुना प्रतिनिधित्व के बाद से केवल एक छोटे सेल आबादी जीवित रहने की उम्मीद है.

यहाँ वर्णित अनुक्रमण लाइब्रेरी प्रोटोकॉल एक द्वि-चरणीय PCR है जो दोनों वेक्टर बैकों में TKOv3 CRISPR लाइब्रेरीज़ के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है और Illumina अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म पर अनुक्रमित है. इन अनुक्रमण पुस्तकालयों भी एक पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है, हार्ट एट अल में वर्णित है कि इसी के समान3. अन्य तैयार पुस्तकालयों के लिए, उन पुस्तकालयों के लिए प्रदान की प्राइमर और अनुक्रमण प्रोटोकॉल से परामर्श किया जाना चाहिए। जीनोमिक डीएनए और पीसीआर नमूने तैयार करते समय, संदूषण सावधानियों के विचारशील होना आवश्यक है। उदाहरण के लिए, जीनोमिक डीएनए शुद्धि के लिए एक समर्पित क्षेत्र अत्यधिक की सिफारिश की है. यह भी शारीरिक रूप से जीवाणु प्लाज्मिड preps से अलग होना चाहिए, जो सामान्य contaminants जीनोमिक डीएनए नमूनों में पाया जाता है. पीसीआर प्रतिक्रियाओं एक समर्पित पीसीआर हुड में स्थापित किया जाना चाहिए, क्योंकि यह plasmids और अन्य अनुक्रमण पुस्तकालयों से संदूषण कम से कम होगा. अच्छा अभ्यास के लिए, PCR संदूषण के लिए मॉनिटर में मदद करने के लिए कोई नहीं-टेम्पलेट नकारात्मक नियंत्रण शामिल किया जा सकता है।

स्क्रीन से अनुक्रमण का अनुवाद करने के लिए डेटा विश्लेषण इन डेटासेट के आकार और विविधता को देखते हुए एक गैर-त्रिस्तरीय कार्य है। एक बार अनुक्रम पढ़ता गठबंधन किया गया है और सामान्यीकृत, कई bioinformatic उपकरण स्क्रीन प्रदर्शन के मूल्यांकन के साथ सहायता करने के लिए उपलब्ध हैं (चित्र 3) और हिट पहचान (चित्र 4). BAGEL इस प्रोटोकॉल में डेटा विश्लेषण के लिए कुंजी उपकरण के रूप में वर्णन किया गया है। BAGEL एक जीन को लक्षित सभी गाइड के लॉग गुना परिवर्तन करने के लिए ज्ञात आवश्यक और गैर जरूरी जीन सेट के वितरण की तुलना करने के लिए एक Bayesian ढांचे का उपयोग करता है. इस विधि हार्ट एट अल3में विस्तार से वर्णित है. BAGEL के अलावा, इस तरह के MAGeCK25 के रूप में दोनों समृद्ध और समाप्त sgRNAs, की पहचान करने के लिए डिज़ाइन अन्य एल्गोरिदम भी इस्तेमाल किया जा सकता है. दवा स्क्रीन के लिए, यह दोनों synergistic और दबाने रासायनिक आनुवंशिक बातचीत की पहचान करने के लिए दवा एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. औषध ी को एक उपचारित जनसंख्या में एसजीआरएन के सापेक्ष बहुतायत की तुलना उसी समय20की एक अनुपचारित जनसंख्या में sgRNA के सापेक्ष बहुतायत से करने के लिए डिजाइन किया गया था .

CRISPR स्क्रीन की एक सीमा यह है कि Cas9 हमेशा एक दस्तक बाहर करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है, के रूप में वहाँ हमेशा एक संभावना है कि बनाया indels में फ्रेम उत्परिवर्तन कर रहे हैं, जीन समारोह बरकरार13छोड़ने . यह एक मिश्रित आबादी में परिणाम है, स्क्रीन "शोर" और डेटा की व्याख्या चुनौतीपूर्ण बना रही है. एक जीन को लक्षित कई स्वतंत्र sgRNAs का उपयोग कर अतिरेक में निर्माण कर सकते हैं, कम गतिविधि के साथ sgRNAs के प्रभाव को कम करने. CRISPR अध्ययन के लिए एक अतिरिक्त चेतावनी Cas9 nuclease द्वारा बनाई गई डबल किनारा टूट जाता है, जो लक्षित किया जा रहा जीन से स्वतंत्र सेलुलर घातकता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं का प्रभाव है. यह प्रति-प्रजननप्रभाव लक्ष्य साइट प्रति संख्या के साथ बढ़ता है, जिससे अत्यधिक प्रवर्धित क्षेत्रों26के भीतर जीनों की झूठी सकारात्मक पहचान होती है। प्रतिलिपि संख्या प्रभाव27के लिए सही करने के लिए CERES जैसे संगणकीय विधियों को विकसित किया गया है। ये कार्यप्रवाह नॉक-आउट-आधारित अनिवार्यता स्क्रीन में जीन निर्भरता स्तर का अनुमान लगाने के लिए प्रतिलिपि संख्या प्रभाव पर विचार करते हैं. प्रवर्धित क्षेत्रों में हिट जीनों के जीनोमिक स्थानों की सावधानीपूर्वक जांच करने से गलत सकारात्मक ताक यह पता लगाने में मदद मिल सकती है कि कटिंग प्रभावों की बहुलता के कारण13. प्राथमिक स्क्रीन केवल संभावित हिट की पहचान कर सकती हैं. हिट को मान्य करने और लक्ष्य पर लक्ष्य को ऑफ-टार्गेट प्रभावों से अलग करने, गलत सकारात्मकों को बाहर निकालने और अप्रभावी क्षोभ के कारण कमजोर स्कोर करने वाले जीनों को सुनिश्चित करने के लिए द्वितीयक स्क्रीन या प्रोटोकॉल के साथ अनुवर्ती कार्रवाई करना महत्वपूर्ण है, जो गलत के रूप में पीछे नहीं छोड़ा जाता है नकारात्मक23|

इस प्रोटोकॉल व्यवहार्यता आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण पर केंद्रित है, जिसमें अध्ययन की स्थिति एक प्रसार दोष या कोशिकाओं की मौत के लिए नेतृत्व करना चाहिए. उन प्रक्रियाओं के लिए जो सेल्युलर व्यवहार्यता में परिवर्तन नहीं करती हैं, व्यवहार्यता-आधारित पूल्ड स्क्रीनिंग विधि प्रतिबंधात्मक हो सकती है। एक विकल्प के लिए रिपोर्टर या मार्कर आधारित परख और फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) दृष्टिकोण द्वारा संवर्धन का उपयोग कर स्क्रीन प्रदर्शन है. मार्कर-आधारित चयन स्क्रीनों में, फीनोटाइप उत्परिवर्तनों पर आधारित होता है जो कोशिका स्वास्थ्य13,23के बजाय मार्कर जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करते हैं। Arrayed CRISPR प्रारूप भी अच्छी तरह से स्क्रीनिंग प्रति एक जीन के लिए उपलब्ध हैं. Arrayed स्वरूप जटिल या माइक्रोस्कोपी-आधारित पठन बहिष्कार ों के लिए अधिक अनुकूल हैं। हालांकि, सरणी स्वरूप स्वचालित उपकरण और अभिकर्मकों की बड़ी मात्रा की आवश्यकताहै 28.

यहाँ चर्चा की स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल एस pyogenes Cas9 nuclease का उपयोग करता है नल alleles बनाने के लिए, जो सबसे व्यापक रूप से आनुवंशिक स्क्रीन के लिए प्रयोग किया जाता है और जिसके लिए कई पुस्तकालयों उपलब्ध हैं (Addgene: पूल पुस्तकालय). नॉक आउट पुस्तकालयों के लिए वैकल्पिक विकल्प भी उपलब्ध हैं, जो एक उत्प्रेरक मृत dCas9 क्रोमैटिन संशोधक प्रोटीन को बाधित करने के लिए tethered का उपयोग करें (CRISPRi) या सक्रिय (CRISPRa) जीन के प्रतिलेखन. RNAi के लिए इसी तरह, CRISPRi विभिन्न जीन खुराक और आवश्यक जीन है कि पूरी तरह से नॉक आउट बर्दाश्त नहीं कर सकता पर phenotypic प्रभाव का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करता है, जबकि CRISPRa लाभ के कार्य स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन प्रौद्योगिकियों में से प्रत्येक अपने फायदे हैं, लेकिन सामान्य रूप में, CRISPR नॉक आउट दृष्टिकोण सबसे विकसित है. यह कम शोर के साथ अच्छी तरह से प्रदर्शन करने के लिए सिद्ध किया गया है, कम से कम बंद लक्ष्य प्रभाव, और प्रयोगात्मक स्थिरता, विशेष रूप से घातक आधारित आवश्यक जीन स्क्रीन में, जब दस्तक नीचे या तो CRISPRi और shRNAs5का उपयोग कर दृष्टिकोण की तुलना में. तारीख करने के लिए अपनी व्यापक प्रयोज्यता के बावजूद, CRISPR स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी अपने प्रारंभिक चरण में बनी हुई है. CRISPR के बुनियादी घटकों से नए उपकरण बनाए जा रहे हैं। इनमें संयोजी जीन संपादन कार्यनीतियां शामिल हैं जो कई जीनोमिक लोसी, ऑर्थोगोनल कैस एंजाइमों के अनुकूलन, और Cas9 गतिविधियों में विविधता लाने के लिए क्रोमैटिन कार्यात्मक डोमेन के साथ संशोधनों को लक्षित कर सकती हैं। के रूप में CRISPR प्रौद्योगिकी विकसित करने के लिए जारी है, आनुवंशिक स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के लिए अपने युग्मन आनुवंशिकी में कार्यात्मक खोज के लिए एक शक्तिशाली मंच के रूप में काम करेंगे.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं.

Acknowledgments

यह काम जीनोम कनाडा, ओंटारियो अनुसंधान कोष, और स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा के संस्थानों (MOP-142375, PJT-148802) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaCl Promega V4221
50X TAE buffer BioShop TAE222.4
6 N Hydrochloric acid solution BioShop HCL666.500
95% Ethanol
Alamar blue ThermoFisher Scientific DAL1025
Blue-light transilluminator ThermoFisher Scientific G6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade Bioshop ALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles Medium Life Technologies 11995-065 Cel culture media
Electroporation cuvettes BTX 45-0134
Electroporator BTX 45-0651
Endura electrocompetent cells Lucigen 90293
Fetal Bovine Serum GIBCO 12483-020
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216 recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) Sigma H9268 Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladder New England Biolabs N3233S
Nanodrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544L
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media
Plasmid maxi purification kit Qiagen 12963
pMD2.G (envelope plasmid) Addgene Plasmid #12259 lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid) Addgene Plasmid #12260 lentiviral system
Puromycin Wisent 400-160-UG
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
Qubit dsDNA BR assay ThermoFisher Scientific Q32853
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33226
RNAse A Invitrogen 12091021
S.O.C recovery medium Invitrogen 15544034
SYRB Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included Addgene Addgene ID #90203 Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 Addgene Addgene ID #125517 Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agarose ThermoFisher Scientific 16500500
Wizard genomic DNA purification kit Promega A1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 06 365 809 001 Lipid based transfection reagent

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References

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जेनेटिक्स अंक 151 CRISPR-Cas9 sgRNA पुस्तकालयों टोरंटो-नॉक-आउट जीनोम-वाइड CRISPR स्क्रीनिंग जमा ड्रॉप-आउट स्क्रीन कार्यात्मक जीनोमिक्स आवश्यक जीन सेल फिटनेस प्रसार
मैमलियन सेल में पूल्ड CRISPR-आधारित जेनेटिक स्क्रीन
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Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K.… More

Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (151), e59780, doi:10.3791/59780 (2019).

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