Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Объединенные ГЕНЕТИЧЕСКИе экраны на основе CRISPR в клетках млекопитающих

Published: September 4, 2019 doi: 10.3791/59780
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2,3
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Технология CRISPR-Cas9 обеспечивает эффективный метод точного редактирования генома млекопитающих в любом типе клеток и представляет собой новое средство для выполнения генетических экранов генома. Здесь представлен подробный протокол, в котором обсуждаются шаги, необходимые для успешного выполнения объединенных экранов CRISPR-Cas9, в масштабах всего генома.

Abstract

Редактирование генома с помощью системы CRISPR-Cas значительно повысило способность точно редактировать геномы различных организмов. В контексте клеток млекопитающих, эта технология представляет собой новое средство для выполнения генома всей генетические экраны для функциональных исследований геномики. Библиотеки направляющих РНК (sgRNA), ориентированные на все открытые кадры чтения, позволяют легкому поколению тысяч генетических возмущений в одном пуле клеток, которые могут быть проверены на конкретные фенотипы для вовлечения функции гена и клеточных процессов в беспристрастной и систематической образом. Экраны CRISPR-Cas предоставляют исследователям простой, эффективный и недорогой метод раскрытия генетических чертежей клеточных фенотипов. Кроме того, дифференциальный анализ экранов, выполняемых в различных клеточных линиях и из различных типов рака, может определить гены, которые имеют контекстуально важное значение в опухолевых клетках, выявляя потенциальные цели для конкретных противоопухолевых методов лечения. Выполнение геномных экранов в клетках человека может быть сложной задачей, так как это предполагает обработку десятков миллионов клеток и требует анализа больших наборов данных. Детали этих экранов, такие как характеристика клеточной линии, соображения библиотеки CRISPR и понимание ограничений и возможностей технологии CRISPR в ходе анализа, часто упускаются из виду. Приведен ный подробный протокол для успешного выполнения объединенных экранов на основе CRISPR-Cas9 в масштабах всего генома.

Introduction

CRISPR-Cas, сокращение от кластерных регулярно межпространственных коротких палиндромных повторов и связанных с CRISPR нуклеаза, состоит из одного белка nuclease (например, Cas9) в комплексе с синтетической направляющей РНК (sgRNA). Этот комплекс рибонуклеопротеинов нацелен на фермент Cas9, чтобы вызвать двухцепочечные разрывы ДНК при специфическом геномном локусе1. Двухцепочечные перерывы могут быть отремонтированы с помощью гомологии направленного ремонта (HDR) или, чаще всего, через негомологическую конечную присоединение (NHEJ), механизм ремонта, подверженный ошибкам, который приводит к вставке и/или удалению (INDELS), которые часто нарушают функцию гена 1. Эффективность и простота CRISPR позволяет ранее недостижимый уровень геномного таргетинга, что намного превосходит предыдущие технологии редактирования генома, т.е. цинковый палец nucleases (ЗНФ) или транскрипции активатор-как эффектор nucleases ( TALENS), оба из которых страдают от повышенной сложности конструкции, более низкой эффективности трансфекции, и ограничения в мультиплексном редактированиигенов 2.

Основное исследовательское применение однонаправного редактирования генома на основе РНК позволило ученым эффективно и недорого изучить функции отдельных генов и топологию генетических сетей взаимодействия. Способность выполнять функциональные экраны генома была значительно расширена с помощью системы CRISPR-Cas, особенно по сравнению с более ранними генетическими технологиями возмущения, такими как РНК-интерференция (РНК) и мутагенез генной ловушки. В частности, RNAi страдает от высоких вне цели эффекты и неполный нокдаун, в результате чего более низкая чувствительность и специфичность по сравнению с CRISPR3,4,5, в то время как методы генной ловушки являются возможными только в гаплоидных ячейки для экранов потери функций, ограничивающих область клеточных моделей, которые могут быть допрошены6. Способность CRISPR генерировать полный выбив из генов обеспечивает более биологически надежную систему для допроса мутантных фенотипов, с низким уровнем шума, минимальными эффектами вне цели и последовательной активностью реагентов5. CRISPR-Cas9 sgRNA библиотеки, которые ориентированы на весь геном человека в настоящее время широко доступны, что позволяет одновременное поколение тысяч генов нокаутов в одном эксперименте3,7,8,9 .

Мы разработали уникальные библиотеки scgRNA по всей геному CRISPR-Cas9, называемые библиотеками Toronto Knock-out (TKO) (доступны через Addgene), которые компактны и оптимизированы последовательность для облегчения функционального геномики высокого разрешения экранов. Последняя библиотека, TKOv3, ориентирована на 18 000 человеческих генов кодирования белка с 71 090 направляющих, оптимизированных для редактирования эффективности с использованием эмпирических данных10. Кроме того, TKOv3 доступен в качестве однокомпонентной библиотеки (LCV2:::TKOv3, Addgene ID #90294), выражающей Cas9 и sgRNA на одном векторе, облегчая необходимость создания стабильных клеток Cas9- Expressing, что позволяет нокаутировать геном по широкому кругу типы клеток млекопитающих. TKOv3 также доступен в векторе без Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID 125517) и может быть использован в ячейках, которые выражают Cas911.

Геном всей CRISPR-Cas9 редактируемых клеток населения может подвергаться различным условиям роста, с обилием sgRNAs с течением времени количественно следующего поколения секвенирования, обеспечивая считывание для оценки отсева или обогащения клеток с прослеживаемыми генетическими Возмущений. Библиотеки выбивания CRISPR могут быть использованы для определения генов, которые, после возмущения, вызывают дефекты клеточного фитнеса, умеренную чувствительность к лекарственным препаратам (например, чувствительные или устойчивые гены), регулировать экспрессию белка (например, репортер) или необходимы для определенного функции пути и клеточного состояния12,13,14. Например, дифференциальные фитнес-экраны в линии раковых клеток могут выявить как истощение, так и уменьшение онкогенов и обогащения или увеличение генов супрессоров опухолей3,14,15. Аналогичным образом, использование промежуточных доз терапевтических препаратов может выявить как лекарственной устойчивости и сенсибилизации генов16,17.

Приведенный здесь подробный протокол скрининга для генома масштаба CRISPR-Cas9 потери функции скрининга с использованием Торонто Knock-out библиотек (TKOv1 или v3) в клетках млекопитающих от библиотеки поколения, скрининг производительности для анализа данных. Хотя этот протокол был оптимизирован для скрининга с использованием библиотек Toronto Knock-out, он может быть применен и масштабируемым для всех объединенных библиотек CRISPR sgRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты, изложенные ниже, должны следовать руководящим принципам Управления по охране окружающей среды и безопасности Института.

1. Бассейн CRISPR sgRNA лентивирусной библиотеки плазмид усиления

  1. Разбавить готовый CRISPR sgRNA плазмид ной ДНК библиотеки до 50 нг / Л в TE (например, TKOv3).
  2. Электропорат библиотеки с помощью электрокомпетентных клеток. Настроили в общей сложности четыре реакции электропорации, как описано ниже.
    1. Добавьте 2 л из 50 нг/Л Библиотеки ТКО к 25 л оттаятых электрокомпетентных клеток к предварительно охлажденным кюветам (1,0 мм) на льду.
    2. Электропорат с использованием оптимальных настроек, предложенных протоколом производителя. В пределах 10 с импульса, добавить 975 л восстановления medium (или SOC среды) в cuvette.
    3. Перенесите электропорированные клетки в культурную трубку и добавьте 1 мл восстановительного среднего. Инкубировать трубки в трясущемся инкубаторе при 250 об/мин при 1 ч при 37 градусах Цельсия.
  3. Навязайте разбавленную пластину для титрировать библиотеку и оценить эффективность преобразования.
    1. Бассейн все 8 мл восстановленных клеток и хорошо перемешать. Передача 10 зл и цельсия объединенных клеток в 990 л восстановительного среднего для 800-кратного разбавления и хорошо перемешайте.
    2. Плита 20 л разбавления на предварительно разогретой 10 см Lb и карбенициллин (100 мкг/л) агарплита пластины. Это приводит к 40000-кратному разбавлению трансформаторов, которые будут использоваться для расчета эффективности преобразования.
    3. Плита 400 л восстановленных клеток на каждой пластине в общей сложности 20 предварительно разогретых 15 см LB и карбенициллин агар пластин. Инкубировать тарелки для 14-16 ч при 30 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рост при такой более низкой температуре сводит к минимуму рекомбинацию между длинными терминальными повторами (LTR)18.
    4. Чтобы рассчитать эффективность преобразования, подсчитайте количество колоний на 40 000-кратной раз разбавленной пластине (шаг 1.3.2). Умножьте количество колоний, подсчитанных на 40 000, чтобы получить общее количество колоний на всех плитах. Продолжить, если общее число колоний представляет собой охват библиотеки эквивалентно минимум 200x колоний на sgRNA (наиболее оптимальным является 500-1000x).
      1. Например, минимальный номер колонии для библиотеки TKOv3 (71 090 сГРН) составляет 1,4 х 107,что эквивалентно 200-x колониям на сгРН. Если представительство колонии недостаточно, увеличьте количество электропораций в шаге 1.2 в зависимости от количества колоний на разбавленной пластине для достижения минимального охвата библиотеки.
  4. Урожай колоний, как описано ниже
    1. К каждой 15 см пластины, добавить 7 мл LB и carbenicillin (100 мкг / л) среды, а затем соскребать колонии с помощью распределителя клеток. С помощью 10 мл пипетки перенесите выцарапанные клетки в стерильную 1 л конической колбы или бутылку.
    2. Еще раз промыть тарелку с 5 мл LB и карбенициллин среды и передать раствор в бутылку.
    3. Повторите для всех пластин, чтобы бассейн клетки из 20 пластин в стерильную бутылку.
  5. Смешайте собранные клетки с перемешивание бар для 1 ч при комнатной температуре (RT), чтобы разбить ячейки сгустки. Передача клеток в предварительно взвешенные центрифуги бутылки и центрифуги на 7000 х г гранулы бактерий, а затем отказаться от средств массовой информации.
  6. Взвесьте мокрые клетки гранулы и вычесть вес бутылки центрифуги, чтобы определить окончательный вес мокрой гранулы. Очистите плазмидную ДНК с помощью макси- или мега-шкалы плазмидной очистки комплекта в зависимости от количества бактериальных гранул каждый столбец может обрабатывать.

2. Крупномасштабная библиотека CRISPR sgRNA производства лентивирусного

ПРИМЕЧАНИЕ: Все действия в этом разделе протокола выполняются в BSL2 "объекта в классе II, Тип A2 биобезопасности кабинета.

  1. Рассчитайте количество 15 см пластин, необходимых для производства вируса на основе оценки, что 18 мл вируса, как правило, собирают из одной 15 см пластины.
  2. Подготовка клеток для трансфекции путем посева HEK-293T упаковочных клеток в низко-антибионовых средах роста (DMEM 10% FBS и опционально: 0.1x перо/strep) на 8 x 106 клеток на 15 см пластины в 20 мл носителей. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. Убедитесь, что покрывало клетки 70%-80% конфлюент и равномерно распределены в момент трансфекции.
  3. На следующий день приготовьте три трансфекционные плазмиды смеси, изложенные в таблице 1 для 15 см пластин. Рассчитайте количество плазмиды, необходимое для одного трансфекции и сделать смесь плазмиды для количества пластин, а также один для транс-инфекции.
  4. Подготовьте липидный трансфекционный реагент для каждого трансфекционного реагента, как описано в таблице 2. Aliquot уменьшил осечек сыворотки в отдельные 1,5 мл микроцентрифуговых труб для числа пластин, которые будут трансфицироваться. Добавить трансфекционный реагент, аккуратно перемешать и инкубировать в течение 5 мин на RT.
  5. После 5 мин инкубации, добавить количество ДНК, необходимое для одного трансфекции в трансфекционный реагент для 3:1 отношение трансфекционного реагента к мкг ДНК комплекса. Смешайте осторожно и инкубировать в течение 30 минут на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие трансфекции могут быть подготовлены в наборах из пяти или менее, с интервалом 5 минут, чтобы оптимизировать время и избежать чрезмерной инкубации.
  6. После 30 минут инкубации тщательно перенесите каждую смесь трансфекции на каждую тарелку упаковочных ячеек. Добавить всю смесь с помощью 1 мл пипетка отзыв dropwise в круговой, зигзагообразное движение, не нарушая монослой клетки. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию на 18 ч при 5% CO2.
  7. Подготовка вирусных носителей урожая: 500 мл Среднего DMEM 32 мл акций BSA (20 г/100 мл, растворенного в DMEM, фильтра стерилизованного с фильтром 0,22 мкм) 5 мл 100x пера/стрептококка.
  8. После 18 ч, удалить средства массовой информации (использовать надлежащее обращение с лентивирусными отходами, такими как инкубация в 1% гипохлорит натрия в течение 30 минут до удаления). Аккуратно замените 18 мл вирусных носителей урожая на каждую тарелку. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию на 18 ч при 5% CO2.
  9. После 24 ч, проверить упаковочные клетки для ненормальных и сросшиеся морфологии, как признак хорошего производства вируса. Затем собираем лентивирус, собирая все супернатанты и передаваясь в стерильную коническую центрифугу трубки.
  10. Спин сми, содержащие вирус на 300 х г в течение 5 мин и гранулы упаковочных клеток. Aliquot супернатант в стерильную трубку полипропилена, не нарушая гранулы.
  11. Храните вирус при 4 градусах По Цельсия в течение коротких периодов (менее 1 недели) или сразу при -80 градусов по Цельсию для длительного хранения. Крупномасштабный вирус Aliquot подготавживает к одноразовым объемам использования для длительного хранения, чтобы избежать замораживания/оттаивания.

3. Характеристика клеточной линии для скрининга

  1. Выберите нужную линию ячейки.
    1. Измерьте и запишите приблизительное время удвоения клеток.
    2. Определите оптимальную плотность клеточного покрытия для культивирования клеток каждые 3-4 клетки, удвоение в сосуде культуры тканей по выбору (например, 15 см пластин культуры тканей).
  2. Определите концентрацию пуромицина для использования в желаемой клеточной линии для выбора библиотек ТКО, содержащих маркер сопротивления пуромицину следующим образом:
    1. Семенные клетки в 12 хорошо пластины при плотности, необходимой для достижения слияния после 72 ч, а затем инкубировать на ночь (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).
    2. На следующий день переоденьте на носитель, содержащий диапазон разбавления концентраций пуромицина от 0 мкг/мл до 10 мкг/мл, с шагом 0,5 мкг/мл. Инкубировать клетки на 48 ч.
    3. После 48 ч измерьте жизнеспособность клеток путем подсчета клеток или окрашивания alamarBlue.
    4. Определите самую низкую концентрацию, которая убивает 100% клеток в 48 ч. Используйте эту концентрацию, чтобы выбрать для библиотеки CRISPR передаваемые популяции клеток в шагах 4.6 и 5.2.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеточных линий с более длительным удвоением времени можно переносить более длительные инкубации с пуромицином. В таких ситуациях определите кривую убийства для инкубационного времени, необходимого для удвоения ячейки в йт;3. Свести к минимуму время отбора, чтобы избежать отсева основных генов до начала скрининга.
  3. Проверьте клетки на чувствительность к бромистому гексадиметрину (до 8 мкг/мл) путем выполнения кривой реакции дозы в том же методе, который используется для измерения чувствительности пуромицина (шаг 3.2). Если токсичность наблюдается с йlt;8 мкг/мл бромистого гексадиметрина, не используйте.

4. Функциональная титрование объединенной лентивирусной библиотеки CRISPR для определения МВД

  1. Оттепель свежий аликвот объединенной библиотеки CRISPR sgRNA лентивирус (например, LCV2::TKOv3) и держать на льду.
  2. Разработай серию объемов вирусов для тестирования между диапазоном 0-2 мл (т.е. 0 мл, 0,25 мл, 0,5 мл, 1 мл и 2 мл).
  3. Урожай целевых клеток и семенных клеток в 15 см пластин при плотности, необходимой для достижения слияния в 72 ч.
  4. Для каждого объема вируса, который будет протестирован, подготовить дубликаты пластин. Добавьте клетки, вирус, бромистый гексадиметрин (8 мкг/мл) и носители до окончательного объема 20 мл. Тщательно перемешайте тарелки, посидите на уровне инкубатора и инкубировать 24 ч (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).
  5. После 24 ч удалите вирус, содержащий носители мультимедиа, и утилизируйте (используйте меры предосторожности биобезопасности для обработки лецивирусных отходов). Дополнительно, осторожно промыть тарелку с теплой PBS для удаления посторонних вирусов.
  6. Для каждого состояния вируса, заменить 20 мл средств, содержащих пуромицин с помощью концентрации определяется убить клетки в разделе 3, на одну пластину репликации. К другой пластине добавьте 20 мл свежих носителей без пуромицицина. Инкубировать 48 ч (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).
  7. После 48 ч, убедитесь, что все неинфицированные клетки (состояние вируса 0 мл), обработанные пуромицином мертвы. Урожай все пластины индивидуально и разогнать клетки путем повторного нежного пипеттинг.
  8. Подсчитайте клетки всех пластин и вычислите МВД для каждого объема вируса, сравнивая количество клеток с выбором пуромицина с количеством клеток без пуромицина (т.е. пуромицин).
  9. График результаты, чтобы определить объем вируса, что приводит к 30%-40% выживаемости клеток с puromycin выбор по сравнению без пуромицина. Используйте этот объем вируса для достижения МВД 0,3-0,4 во время экрана в тех же условиях культуры тканей.

5. Первичная инфекция экрана, выбор и пропуск клеток

  1. Выберите покрытие библиотеки CRISPR sgRNA, которая будет поддерживаться по всему экрану (рекомендуемое минимум в 200 раз).
    1. Основываясь на библиотечном охвате, определите количество клеток, необходимых для поддержания этого охвата на сгРНК, и количество клеток, необходимых для инфицирования в МВД 0,3 (Таблица 3).
    2. Определите количество пластин, необходимых для настройки инфекции(Таблица 4).
  2. Заражение клеток библиотекой CRISPR
    1. Урожай клетки и семена необходимого номера ячейки для каждой тарелки 15 см.
    2. Добавьте бромистый гексадимитрин (8 мкг/мл) во все пластины.
    3. Добавьте вирус в объеме, необходимом для МВД 0,3, к скринингу и контрольные 2 пластины. Для Control 1 не добавляйте вирус и заменяйте этот том носителями.
    4. Тщательно перемешайте тарелки, наклонив. Поместите тарелки в инкубатор, убедившись, что они являются ровными.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пакет инфекций может быть сделано путем объединения мастер сочетание вируса, средств массовой информации и гексадетрина бромистого бромида в клетки в подвеске перед покрытием.
    5. Удалить средства массовой информации и заменить свежими средствами, содержащими пуромицин в концентрации определяется в шаге 3.2.4 для скрининга и контролировать 1 пластины 24 ч после вирусной инфекции. Добавить свежие носители без пуромицина в контроль 2 пластины. Инкубировать клетки для 48 ч (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).
    6. 48 ч после puromycin кроме того, убедитесь, что все неинфицированные клетки мертвы (контроль 1) для подтверждения активности пуромицина, а затем урожай инфицированных клеток.
  3. Сбор инфицированных клеток населения и клеточной просажещения
    1. Урожай пуромицин-выбранных клеток из всех скрининговых пластин в один стерильный контейнер. Соберите ячейки с каждой контрольной пластины отдельно. Разгоняйте клетки нежным повторным пипеттингом.
    2. Подсчитайте клетки из объединенных скрининговых ячеек, контролируйте 1 и контролируйте 2 отдельно и вычисляйте количество ячеек на 1 мл.
    3. Рассчитайте МВД и сложите охват, достигнутый следующим образом:
      Equation 1
      Equation 2
    4. Соберите три реплики клеточных гранул из объединенных клеток в выбранной библиотеке покрытия для экстракции геномной ДНК. Центрифуги клетки на 500 х г в течение 5 мин. Вымойте с PBS. Пометьте трубки и заморозить сухой клеточных гранул на -80 градусов по Цельсию (это T0 эталонных образцов).
    5. Разделите пул инфицированных клеток на три группы репликации (например, реплицировать A, реплицировать B, реплицировать C), сохраняя при этом охват библиотеки в каждой репликации. Семенные клетки при той же плотности посева, как обычно, используются при их расширении. Используйте одинаковое количество клеток для каждой репликационной пластины и такое же общее количество клеток между репликациями.
    6. Продолжайте проход клеток и собрать три реплики клеточных гранул из каждой репликации объединенных инфицированных клеток, как указано выше, каждые 3-8 дней в зависимости от клеточной линии, до 15-20 клеточных удвоений. При каждом проходе собирают клетки из всех пластин в каждой группе репликации друг с другом (т.е. все клетки из репликационных пластин смешиваются вместе, все клетки из повторяют пластин Ы смешиваются вместе и т.д.).
    7. Этикетка каждого гранулы с временем (T) и репликации обозначения. Это соответствует количеству дней после T0, которые собираютгра (например, T3'A, T3'B, T3'C и т.д.).
  4. Для отрицательного отбора наркотиков экраны, позволяют клеткам восстановить, по крайней мере один проход после T0 до лечения. На T3 или T6, разделить клетки от каждой группы репликации (A, B, C) в медикаментозное лечение и контроль населения, используя ту же плотность посева используется в шаге 5.3.5.
    1. Отдельно объединить количество клеток, необходимых для библиотечного покрытия для каждого репликации в группе лечения наркомании. Добавить препарат в промежуточных концентрациях (IC20-IC50). Семя клетки и инкубировать (37 градусов по Цельсию, 5% CO2) до следующего прохода.
    2. Отдельно объедините количество ячеек, необходимых для покрытия библиотеки для каждого репликации в группе управления транспортным средством. Добавьте управление транспортным средством, используя тот же объем, что и препарат (0,5% v/v). Семя клетки и инкубировать (37 градусов по Цельсию, 5% CO2) до следующего прохода.
    3. Продолжайте проход клеток и собирать клетки гранулы для геномной ДНК каждые 3 дня, как описано в шаге 5.3.5, в то время как освежающий препарат или транспортное средство на каждом проходе.
  5. Для положительных экранов отбора или лекарственной устойчивости разделите каждую группу репликации в зависимости от количества ячеек, необходимых для покрытия библиотеки. Добавьте концентрацию ic90 наркотиков к каждой репликации. В IC90, большинство клеток будут убиты. Разрешить устойчивых популяций расти и собирать клеточные гранулы (1-2 х 107 клеток) для экстракции геномной ДНК.

6. Подготовка и секвенирование образца CRISPR

  1. Геномная очистка ДНК
    1. Инкубировать замороженные клеточные гранулы в течение 5-10 минут на RT для оттаивания.
    2. Добавьте 1,4 мл PBS в 50 мл центрифуги трубки, содержащей клеточные гранулы. Вихрь на 20 с, чтобы повторно приостановить клетки и отдохнуть в течение 1 мин. При необходимости, пипетка 15x с P1000, чтобы разбить оставшиеся ячейки скопления. При переносе клеток из трубки 15 мл или 1,5 мл, resuspend клетки с 1 мл PBS, а затем передать клетки в 50 мл трубки и промыть оригинальную трубку с 400 Л Л PBS.
    3. Добавьте 5 мл раствора ядра лизиса в новьостановимые клетки. Используя пипетку 10 мл, смешайте образец, повысив вверх и вниз в 5 раз.
    4. Добавьте 32 кЛ RNase A (20 мг/мл; для получения конечной концентрации 100 мкг/мл) к ядерному лизату и смешайте образец, инвертируя трубку 5x. Инкубировать смесь при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут и дать пробе остыть в течение 10 минут на RT.
    5. Добавьте 1,67 мл раствора протеинового осадка в лизат и вихрь энергично в течение 20 с. Небольшие белковые комки могут быть видны после смешивания.
    6. Центрифуга при 4500 х г в течение 10 мин на RT.
    7. Используя пипетку 10 мл, перенесите супернатант в 50-мл центрифугную трубку, содержащую 5 мл изопропанола. Аккуратно перемешайте раствор 10x путем инверсии до тех пор, пока ДНК не будет замечена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК можно наблюдать как белые, нити, как нити, которые образуют видимую массу.
    8. Центрифуга при 4500 х г в течение 5 мин на RT, чтобы гранулы ДНК.
    9. Используя 10 мл пипетки, тщательно удалить супернатант и избежать вытеснения ДНК гранулы. Добавьте 5 мл 70% этанола на RT в ДНК. Аккуратно поверните трубку, чтобы промыть гранулы ДНК и стороны центрифуги трубки.
    10. Центрифуга при 4500 х г в течение 5 мин на RT.
    11. Используя 10 мл пипетки, тщательно удалить 70% этанола и избежать выбивания ДНК гранулы. Воздушно-сухая геномная ДНК в течение 10 мин на RT.
    12. Добавьте 400 зЛ раствора TE в трубку и дайте ДНК раствориться, инкубируя при 65 градусах По Цельсию в течение 1 ч. Смешайте ДНК, аккуратно щелкая трубкой каждые 15 минут. Если ДНК не растворяется полностью, инкубировать трубку при 65 градусах По Цельсию в течение дополнительного 1 ч, нежно щелкая трубку каждые 15 минут, и оставьте ее на 4 градуса Цельсия на ночь.
    13. Центрифуга при 4500 х г в течение 1 мин на РТ и передача геномной ДНК в 1,5 мл низкосвязной трубки.
    14. Количественно и измерить чистоту геномной ДНК как на спектрофотометре (для общего содержания нуклеиновой кислоты) и на фторометре (для двухцепочечного содержания ДНК).
  2. Дополнительно, осадок геномной ДНК, если Есть проблемы с вниз по течению PcR усиления sgRNA следующим образом.
    1. Передача 400 мл геномной ДНК в микроцентрифугную трубку 1,5 мл.
    2. Добавьте 18 л из 5 M NaCl (окончательная концентрация 0,2 М) и 900 л 95% этанола.
    3. Перевернуть трубку 10x до тщательного смешивания, затем центрифугу при 16000 х г в течение 10 минут на RT.
    4. Тщательно удалите супернатант и избежать вытеснения гранул ДНК. Вымойте гранулы ДНК с 500 зл 70% этанола. Аккуратно поверните трубку, чтобы вымыть гранулы ДНК.
    5. Центрифуга при 16 000 х г в течение 5 мин на RT.
    6. Тщательно удалите супернатант и избежать выбивания гранул ДНК. Воздушно-сухая геномная ДНК в течение 10 мин на RT.
    7. Добавьте 300 зЛ TE, чтобы растворить ДНК, как описано в шагах 6.1.12.
    8. Количественно и измерить чистоту геномной ДНК, как описано в шаге 6.1.14.
  3. Подготовка библиотеки покечня CRISPR
    1. Назначь ПЦР 1, как указано в таблице 5, используя в общей сложности 100 мкг геномной ДНК. Добавьте 3,5 мкг геномной ДНК на реакцию 50 л и установите идентичные реакции 50 л для достижения желаемого покрытия. В таблице 6 приведены примеры грунтовых последовательностей для усиления библиотек секвеи LCV2::TKOv3. В таблице 7 приведены примеры грунтовых последовательностей для усиления библиотек секвенирования pLCKO2::TKOv3.
    2. Усилируйте реакцию ПЦР 1 в термоцикле, используя программу, изложенную в таблице 8.
    3. Проверьте усиление ПЦР 1, запустив 2 ЗЛ продукта ПЦР на 1% агарозного геля. ПЦР 1 дает продукт 600 bp.
    4. Объедините все отдельные реакции 50 л для каждого образца геномной ДНК и смешайте путем вихря.
    5. Назначь одну реакцию ПЦР 2 (50 кВ) для каждого образца, изложенного в таблице 9, используя в качестве шаблона 5 КЛ объединенного продукта ПЦР 1. Используйте уникальные комбинации индексных праймеров для каждого отдельного образца, чтобы объединить образцы библиотеки последовательности.
    6. Усилируйте реакцию ПЦР 2 в термоцикле, используя программу, изложенную в таблице 10.
    7. Очистите оборудование геля агарозы для очистки усиленных продуктов с 0,1 N HCl в течение 10 минут до литья геля. Подготовьте 2% агарозный гель, содержащий днк-пятно для очистки пЦР 2 усиленных продуктов.
    8. Запустите продукт PCR 2 на 2% агарозный гель при низком напряжении (1,0-1,5 ч перспективе). ПЦР 2 дает продукт 200 bp.
    9. Визуализируйте продукты ПЦР на синем световом трансиллиносторе. Выакцион 200 bp полосы и очистить ДНК от ломтика геля агарозы с помощью комплекта извлечения геля. Количественно и измерить чистоту библиотеки секвенирования как на спектрофотометре, так и на флюорометре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная концентрация библиотеки секвенирования геля колеблется от 5-10 нг/Л и общей урожайностью 150-300 нг.
  4. Секвенирование высокой пропускной способности
    1. Последовательность библиотек CRISPR по секвенсорам следующего поколения.
    2. Последовательность ссылки T0 образцов на более высокой глубине чтения 400-500-кратного покрытия библиотеки. Последовательность экспериментальных образцов временных точек для отсева экранов с минимальной глубиной чтения в 200 раз. Для сильных положительных экранов отбора для идентификации обогащенных сгРН достаточно минимальной глубины чтения в 50 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно секвенировать образец T0, чтобы определить представление библиотеки для конкретного экрана и служить в качестве эталона для определения изменений сгиба sgRNA с течением времени.

7. Анализ данных

  1. Выровнять последовательность с помощью таких программ, как Bowtie, чтобы сопоставить последовательность считывается в справочную библиотеку, используя следующие параметры: -v2 (позволяет два несоответствия) и -m1 (отбрасывание любого чтения, которое отображено до более чем одной последовательности в библиотеке).
  2. Нормализовать количество уникально отображеных считывателей для каждого sgRNA для данного образца до 10 миллионов считывает на образец следующим образом:
    Equation 3107
  3. Рассчитайте изменение складок журнала каждого sgRNA для каждого репликации в каждую точку времени (Tn) по сравнению с образцом T0 (Tn/T0). Добавьте псевдо-счет в 0,5 считывает все считываемые счета, чтобы предотвратить разрывы от нулей. Исключите sgRNA с йlt;30 сырые читает в образце T0 от расчета складных изменений и вниз по течению анализа.
  4. Анализ изменения раза с Байесовского анализа генов Essentiality (BAGEL) алгоритм ат-л;https://github.com/hart-lab/bagel Дополнительная таблица S1) или Наркотики »lt;https://github.com/hart-lab/drug»gt; для экранов наркотиков20.
  5. Рассчитайте точность и напомните для оценки производительности экрана с помощью баллов BF. Используйте важный набор из шага 7.4 в качестве истинного положительного списка для функции точного отзыва и кривой библиотеки Scikit-learn для Python, наряду с приведенным выше подмножеством баллов BF. Кроме того, выполните то же самое с помощью пакета PRROC в R.
  6. Рассчитайте среднее изменение складок всех направляющих для каждого гена. Создание плотных участков для основных и несущественных генов (см. шаг 7.4) в R или эквивалентном программном обеспечении. В R, если x.ess является вектором, содержащим значения изменения складок журнала основных генов и x.nonEss содержат несущественные гены, график с использованием следующей команды:
    плотность (плотность ( x.ess ), xlab'"средний logFC", col"red", lwd-2 )
    линии (плотность (x.nonEss), коле "синий", lwd-2 )
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для Python версии детали и пакеты используются, см scikit-узнать v0.19.1: (опубликовано Pedregosa и др.21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Обзор рабочего процесса скрининга по масштабу генома CRISPR

Рисунок 1 иллюстрирует обзор объединенного потока скрининга CRISPR, начиная с заражения целевых клеток с помощью лентивирусной библиотеки CRISPR при низком МВД для обеспечения проведения отдельных интеграционных мероприятий и адекватного представления библиотеки (обычно от 200 до 1000 -фолд). После инфекции, клетки лечатся антибиотиком пуромицин, чтобы выбрать для транс-индуцированных клеток. После отбора собирается базовый клеточные гранулы T0 для оценки распределения библиотек в начале скрининга. Остальные клетки, состоящие из разнородной популяции генетических возмущений, проходят при желаемом представлении библиотеки каждые 3-4 дня в течение 15-20 удвоений, чтобы позволить редактированию генов и вытекающим из этого эффектам проявляться. Экраны с медикаментозным лечением, как правило, добавляются на T3 или T6 после того, как клетки оправились от вирусной инфекции и выбора пуромицина. Клетки собирают в нужном представлении библиотеки в каждом отрывке для геномной ДНК, чтобы определить изобилие руководства путем секвенирования следующего поколения в желаемые временные точки.

Рекомендуется собирать несколько образцов в случае каких-либо сбоев, которые могут возникнуть в шагах подготовки библиотеки ниже по течению. Объединенные экраны, как правило, на основе жизнеспособности анализы, которые предназначены для положительного или отрицательного выбора основных sgRNAs. Положительные экраны идентифицируют гены, которые показывают устойчивость или повышают выживаемость при специфическом давлении отбора (например, препараты или линии мутантных клеток). В этом случае, большинство клеток умрет от выбора, и клетки, которые остаются будут обогащены для sgRNAs ориентации генов, которые устойчивы к препарату или состояние тестируется. Отрицательные экраны отбора или "выпадающие" экраны идентифицируют генные нокауты с повышенной чувствительностью или потерей выживания под давлением выбора экрана. Для выявления возмущений, которые имеют фенотипический эффект, такие как дефект роста, руководство изобилие в каждой точке времени количественно следующего поколения секвенирования и по сравнению с T0 для оценки отсева или обогащения направляющих в течение экрана. С помощью аналитических платформ для руководства измеряются изменения в журнале, а алгоритмы, такие как BAGEL, могут применяться для обеспечения ранжирования попаданий генов.

Усиление библиотеки и поддержание представительства библиотеки на объединенных экранах CRISPR

На рисунке 2 показано ожидаемое распределение направляющих выступов после усиления плазмидной библиотеки. Библиотека TKOv3 состоит из 71 090 sgRNA с четырьмя sgRNA на ген, ориентированных на гены кодирования белка18000евро. Идеальная библиотека должна иметь каждую sgRNA, представленную в аналогичных количествах. Поэтому рекомендуется подтвердить распределение руководств в усиленной библиотеке путем секвенирования следующего поколения. Здесь показана усиленная библиотека с очень плотным распределением sgRNAs, подтверждая, что 95% всех sgRNA находятся в 4-кратном диапазоне распределения(рисунок 2). Более широкое распространение sgRNA будет означать, что обилие библиотечных руководств не в равной степени представлены и может способствовать шуму в объединенных экранах.

Оценка производительности экрана

Рисунок 3 иллюстрирует, что качество работы экрана можно оценить путем оценки распределения изменений в раз всей sgRNA по отношению к золотому стандарту справочного списка необходимых (684 гена) и несущественных генов (926 генов) и визуализировать как кривые точного отзыва10. Используя наборы ссылок на золотой стандарт, баллы Bayes Factor (BF) рассчитываются для конечных точек экрана, а кривые точного отзыва начисляются. Баллы BF рассчитываются путем анализа изменения в журнале для всех руководств, нацеленных на ген с помощью байесовской структуры (алгоритм BAGEL, описанный ранее19)для сравнения распределения известных важных и несущественных наборов руководств. Ложные показатели обнаружения (FDR) получают эмпирически с использованием тех же комплектов ссылки золотого стандарта. Высокопроизводительный экран должен восстановить большое количество необходимых генов на пороге BF nogt;6 и FDR lt;5%, о чем свидетельствует резкий "локоть" в большинстве кривых и прямая линия к конечной точке, как показано на синей линии на рисунке 3A. Отсева руководств ориентации основных и несущественных генов также должны быть рассмотрены(Рисунок 3B). Руководства, ориентированные на эталонные несущественные гены, должны показать в значительной степени симметричное распределение изменений, с центрированных с нулевым, как показано на пунктирной линии на рисунке 3B. Распределение изменений в разнах руководств, нацеленных на основные гены, показывает сильный негативный сдвиг по отношению к распределению руководств, нацеленных на несущественные гены, о чем свидетельствует твердая линия на рисунке 3B.

Основные гены

Одним из основных применений объединенных экранов отсева генома является выявление основных генов. Основные гены, подкатегории фитнес генов, являются гены, возмущение которых вызывает летальность клеток, также рассматривается свободно, как гены распространения. В контексте биологии рака, можно определить контекст-специфических предметов первой необходимости для того, чтобы определить зависимости для конкретной линии опухолевых клеток. Рисунок 4, показывает генный ранг основных генов с использованием баллов Bayes Factor, полученных из алгоритма BAGEL. Bayes Factor (BF) представляет собой меру уверенности в том, что ген нокаут приводит к дефекту фитнеса. Более положительные оценки указывают на более высокую уверенность в том, что возмущение вызывает снижение физической подготовки.

Положительный экран выбора

Геном-широкий нокаут бассейны могут быть культивированы в присутствии избыточного агента наркотиков искать супрессор / устойчивость генов. Здесь показан пример клеток HCT116, скрининговых в присутствии тимидина для поиска супрессоров G1/S arrest3. Подробную информацию об этом экране можно найти в предыдущей публикации3. Короче говоря, через 6 дней после выбора CRISPR библиотеки инфицированных клеток, клетки были разделены на реплики поддержания охвата библиотеки и лечение тимидином. Клетки были проложены в присутствии препарата до тех пор, пока достаточно устойчивых клеток были восстановлены для геномной ДНК образца. Положительный выбор может быть секвенирован (прочитайте глубину) при более низком охвате, чем отрицательные экраны, так как из-за сильного селективного давления останется лишь небольшая часть руководств. В этом примере, секвенирование было получено с несколькими миллионами считывает, и 11 из 12 sgRNAs ориентации тимидин киназы (TK1) были восстановлены и обогащены, как ожидалось (Рисунок 5).

Суммы определялись на основе соотношения моляров 1:1:1
Компонент Сумма на 15-сантиметровую тарелку a
LCV2::TKOv3 pLCKO2::TKOv3
psPAX2 4,8 мкг 7,0 мкг
pMD2.G 3,8 мкг 4,0 мкг
TKOv3b 8,0 мкг 5,0 мкг
a Суммы, определяемые на основе наиболее продуктивной плазмидной комбинации для библиотеки ТКО в соотношении моляров 1:1:1
b Сумма TKO плазмида на основе векторного позвоночника библиотеки CRISPR. LCV2 все-в-одном вектор 13 кб, не-Cas9 pLCKO2 вектор 7,6 кб

Таблица 1: Рекомендуемое количество плазмида для трансфекции TKOv3.

Компонент Сумма на 15-сантиметровую тарелку
Опти-МЕМ 800 л
Трансфекционный реагент 48 зл.

Таблица 2: Установка трансфективного реагента на основе липидов.

Складной покрытие Количество клеток на сгРНКb  Количество клеток, необходимых для инфекцииb
(размер библиотеки sgRNA, охват складок) (размер библиотеки sgRNA и разпокрытие 0,3 МВД)
200 1,5 x 107 5 x 107
500 3,6 x 107 1.2 x 108
1000 7.1 x 107 2.4 x 108
a На основе размера библиотеки TKOv3 - 71 090 сГРН
b Номера округлены

Таблица 3: Определение номеров клеток, необходимых для инфекции библиотеки TKOv3 CRISPR и клеточного покрытия при различных складных покрытиях.

Лечения Количество пластин, необходимых для заражения
Скрининговые пластины Вирус, пуромицин (размер библиотеки sgRNA - 200 раз) 0,3 МВД - плотность посева клеток при инфекции , количество пластинтребуется
Управление 1 Нет вируса, пуромицин (0% контроль за выживанием) 1
Управление 2 Вирус, без пуромицицина (100% контроль за выживанием) 1
включить дополнительные пластины для размещения для колебаний МВД и темпов роста

Таблица 4: Расчет инфекции настройки.

Реагентов Сумма за реакцию 1x
2x Мастер Микс 25 зл.
10 мМ PCR 1 LCV2 передняя грунтовка 2,5 л л
10 мМ PCR 1 LCV2 реверсная грунтовка 2,5 л л
Геномная ДНК 3,5 мкг
Воды до 50 л л
Общая 50 зл

Таблица 5: Настройка ПЦР 1.

Таблица 6: ПЦР праймеры для усиления библиотек LCV2::TKOv3 посекречивания библиотек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Таблица 7: ПЦР праймеры для усиления pLCKO2::TKOv3 секвенирования библиотек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Шаг Температура Время
1 98 градусов по Цельсию 30 сек
2 98 градусов по Цельсию 10 сек 25 циклов (шаг 2 - 4)
3 66 градусов по Цельсию 30 сек
4 72 градусов по Цельсию 15 сек
5 72 градусов по Цельсию 2 мин.
6 10 градусов по Цельсию Держать

Таблица 8: Параметры цикла ПЦР 1.

Реагентов Сумма за реакцию 1x
2x Мастер Микс 25 зл.
10 mM i5 передняя грунтовка 2,5 л л
10 мМ i7 реверс-праймер 2,5 л л
Продукт ПЦР 1 5 зл
Воды 15 зл
Общая 50 зл

Таблица 9: Настройка ПЦР 2.

Шаг Температура Время
1 98 градусов по Цельсию 30 сек
2 98 градусов по Цельсию 10 сек 10 циклов (шаг 2 - 4)
3 55 градусов по Цельсию 30 сек
4 65 градусов по Цельсию 15 сек
5 65 градусов по Цельсию 5 мин.
6 10 градусов по Цельсию Держать

Таблица 10: Параметры цикла ПЦР 2.

Дополнительная таблица S1. Наборы генов тКО Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Figure 1
Рисунок 1: Схематический обзор объединенного скринингового рабочего процесса. (A) Популяция целевых клеток заражена лентивирусом библиотеки CRISPR при низком МВД, чтобы гарантировать, что большинство клеток получают одну вирусную интеграцию и что представительство библиотекподдерживается. Различные цвета представляют различные sgRNAs в каждой вирусной частицы. Выбраны генетически модифицированные пулы клеток. Как только выбор завершен, ячейки проходят отбор для ссылки T0 и последовательно проходят. (B) При первом проходе после T0, клетки оправились от инфекции и медикаментозное лечение может быть добавлено, если это необходимо. После лечения популяции клеток последовательно проходят в течение нескольких недель. Во время каждого прохода клетки собираются для геномной ДНК и повторно засеяны при необходимом разовом охвате библиотеки sgRNA. (C) Два типа экранов могут быть выполнены: 1) положительные экраны отбора, которые определяют мутантные клетки, которые показывают устойчивость или повышенную выживаемость под определенным давлением отбора (например, препараты или мутантной клеточной линии), так как они будут обогащены во время экран; или 2) отрицательные экраны выбора, которые идентифицируют клетки мутантов с повышенной чувствительностью к или потерей выживания под давлением выбора экрана, так как они будут потеряны во время экрана. (D) Геномная ДНК собирается и ПЦР-усиливается, чтобы обогатить для направляющих регионов. (E) Избыток руководства количественно следующего поколения секвенирования и обогащенных, или истощенные руководства определяются для "хит" идентификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Качество усиленной библиотеки CRISPR sgRNA. Усиленные библиотечные плазмиды анализируются с помощью секвенирования следующего поколения (рекомендуемое читает: 30 миллионов считывает, что соответствует 400-кратному представлению библиотеки). Здесь представлена библиотека с плотным распределением sgRNA, с 95% всех sgRNA в 4-кратном диапазоне распределения.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Оценка качества экрана отсева с использованием основных наборов генов, стандартных по золоту. (A) Точный анализ отзыва результатов скрининга в восстановлении основных генов на пороге BF Высокопроизводительный экран представлен синей линией, а низкопроизводительные экраны – красной. (B) Сложите распределение изменений sgRNA пристрелвая необходимые гены (твердая линия) и nonessential гены (пунктирные линии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Определение генной существенности. Bayes Factor ранжирование гена по существу в определенном экране. Bayes Factor (BF) представляет собой меру уверенности в том, что ген нокаут приводит к дефекту фитнеса. Higher Bayes Факторы указывают на повышенную уверенность в том, что ген нокаут приводит к дефекту фитнеса, (красные точки). Нижние Bayes Factor оценки предложить нокаут обеспечивает преимущество роста (синие точки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Положительный экран отбора для супрессора блока тимидина в клетках HCT116. Нормализованное чтение рассчитывает на все sgRNAs на T0 построен против среднего нормализованного чтения рассчитывает на тимидин обработанных образцов. Для положительных экранов отбора (т.е. с использованием IC90 концентрации препарата), количество возмущений, которые будут придают устойчивость к препарату, как ожидается, будет небольшим. По этой причине глубина чтения может быть ниже, чем то, что необходимо для отрицательных экранов, в whch большая часть библиотеки, как ожидается, будет представлена. TK1 sgRNAs обведены красным цветом. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Благодаря простоте использования и высокой гибкости, технология CRISPR была широко принята в качестве инструмента выбора для точного редактирования генома. Объединенный скрининг CRISPR предоставляет метод для допроса тысяч генетических возмущений в одном эксперименте. В объединенных экранах библиотеки sgRNA служат молекулярными штрих-кодами, так как каждая последовательность уникальна и отображается в целевом гене. Путем изолировать геномную дна от населенности клетки, гены причиняя фенотип интереса можно обусловить путем количественной оценки изобилия sgRNA путем sequencing следующего поколения. Для количественной оценки sgRNA в образцах используются методы значительного параллельного секвенирования, а это означает, что несколько независимых популяций клеток могут быть объединены в одну и ту же полосу секвенирования, чтобы свести к минимуму затраты.

Прежде чем приступить к масштабному скрининговому проекту, важно иметь хорошо охарактеризованную и технически оптимизированную модель. Генетический фон, темпы роста и эффективность трансдукции являются важными факторами при выборе клеточных линий для скрининга. Например, темпы роста и эффективность редактирования будут определять масштабируемость и техническую пригодность модели. Для того, чтобы адекватно представлять большие библиотеки sgRNA, требуются десятки миллионов клеток, поэтому число клеток может быть ограничивающим фактором в скрининговой осуществимости для клеточных линий с более медленными удвоениями или теми, которые не обладают хорошей пролиферативной способностью (например, первичных клеток). На основе темпов роста, условия культуры клеток, такие как плотность посева клеток и размер пластины для скрининга должны быть выбраны соответствующим образом. Рекомендуется культуры клеток в крупнейших сосудах, что является практичным и технически осуществимым для экрана.

Эффективность трансдукции лентивирусной инфекции варьируется в зависимости от типов клеток, так как клетки различаются по присущей инфекционности. В результате объем вируса, необходимого для достижения достаточной инфекции в одном типе клеток, не обязательно будет одинаковым в другом. Таким образом, очень важно функционально титр каждой партии лентивирусной библиотеки, производимой в клеточной линии, которая будет проверена для обеспечения достаточного охвата библиотеки и в основном одиночных событий трансдукции на ячейку путем преобразовывания при более низких MOIs около 0,3 (раздел 4). Эффективность трансдукции также может зависеть от условий клеточной культуры; таким образом, функциональные титры должны быть определены с использованием тех же условий ячейки, которые будут использоваться на экране. То есть, важно использовать те же сосуды культуры тканей, компоненты мультимедиа и объем, плотность клеточного покрытия и подготовку к вирусу без предварительной оттепели. Измерения, сделанные в различных форматах или условиях, не будут надежно масштабироваться в формате скрининга.

Несмотря на преимущество использования универсальных библиотек гидов CRISPR-Cas9, таких как LCV2::TKOv3, кодирование гена Cas9 довольно велико, что затрудняет эффективное упаковование в вирусные частицы (105-106 ТУ/мл). Доставка более низких лентивирных титеров может быть ограничением для клеточных линий, которые трудно преобразить, так как они будут иметь еще большие трудности с библиотеками все-один-CRISPR. Чтобы смягчить это, Cas9 должен быть выражен в клеточной линии заранее, а затем доставка CRISPR библиотек только содержащие sgRNAs (например, pLCKO2::TKOv3), которые могут быть сделаны на гораздо более высоких титрах (107-108 ТУ /мл). Плоидия клеточной линии также имеет важное значение, так как она определяет количество целевых локусов, которые должны быть изменены. Способность генерировать полный нокаут в гаплоидных клетках является более эффективным, чем в клетках с несколькими копиями данного гена. Таким образом, экраны в гаплоидных клетках могут быть более чувствительными и давать более высокое качество данных, чем экраны, выполняемые в диплоидных или анеуплоидных клеточных линиях6. Тестирование известных генов, связанных с фенотипом, поможет определить экранную способность модели клеточной линии. Например, для экранов существенности, руководства, ориентированные на подразделение 26S proteasome, PSMD1 (Addgene: плазмида #74180), основной основной ген, могут быть использованы для проверки эффективности редактирования и инфекционности клеточных линий, как возмущение PSMD1 приведет к гибели клеток.

Надежность объединенных экранов сильно зависит от представления sgRNA. Это важный показатель, который определяет производительность библиотеки во время экрана и способность идентифицировать хиты. Разнообразие библиотек предвзято в представлении каждого sgRNA; таким образом, популяция клеток, которые должны быть проверены и проанализированы, должна быть достаточно большой для обеспечения захвата недопредставленных sgRNAs6. 200- до 1000-кратное представление каждого sgRNA является типичным покрытием, которое было использовано в опубликованных экранах (т.е., 200-1000 клеток на sgRNA)10,15. Это представление должно быть сохранено при усилении библиотеки плазмида (раздел 1) и на протяжении всего экрана путем заражения и прохождения необходимого номера ячейки (раздел 5), чтобы представлять желаемое покрытие библиотеки и во время секвенирования библиотеки подготовки (протокол 6), как описано во всем протоколе. Например, для достижения 200-кратного охвата библиотеки TKOv3 требуется отбор и пропуск 15 миллионов инфицированных клеток. Во время секвенирования, предполагая, что диплоидный геном человека содержит 7,2 пг ДНК и 1 сгРННа на геном, в общей сложности 100 мкг геномной ДНК требуется для создания библиотеки секвенирования для 15 миллионов считываемых последовательности. Решение о охвате будет зависеть от размера библиотеки, поскольку охват более крупными библиотеками потребует культивирования большего числа ячеек, которые могут быть трудно поддерживать и технически не целесообразно. Как минимум 200-кратный охват рекомендуется с библиотеками TKOv3, так как 200-кратное обеспечивает оптимальный баланс между логистикой скрининга большого количества клеток и поддержанием достаточного динамического диапазона для обнаружения истинного биологического отсева sgRNA с ограниченным шум от случайных истощений22,23. Более высокие представления библиотеки сложить приведут к повышению воспроизводимости и обеспечат достаточное окно для обнаружения изменений в изобилии sgRNA, особенно для отрицательных выделений. Ограничивающей особенностью отрицательных экранов является то, что возмущение только истощается до такой степени, что оно присутствовало в стартовой библиотеке24. Для сравнения, динамический диапазон положительных экранов отбора гораздо больше, так как они полагаются на обогащение клеток, и могли бы обогатить до 100% конечной популяции23. Таким образом, для положительных экранов отбора (например, экраны лекарственной устойчивости) охват библиотеки и глубина чтения могут быть сокращены до 50-100-кратного представления, поскольку ожидается, что выживет лишь небольшая популяция клеток.

Описанный здесь протокол библиотеки секвенирования представляет собой двухступенчатый PCR, оптимизированный для библиотек TKOv3 CRISPR как в векторных магистралях, так и в последовательности на платформе последовательности Illumina. Эти библиотеки секвенирования также могут быть созданы с помощью одного протокола ПЦР, аналогичного описанному в Харте и др.3. Для других готовых библиотек следует проконсультироваться с протоколами праймеров и последовательности, предусмотренными для этих библиотек. При подготовке образцов геномной ДНК и ПЦР необходимо учитывать меры предосторожности загрязнения. Например, настоятельно рекомендуется выделенная область для очистки геномной ДНК. Она также должна физически отлично отличиться от бактериальных плазмидных препов, которые являются общими загрязняющими веществами, обнаруженными в образцах геномной ДНК. Реакции ПЦР должны быть настроены в специальном капоте ПЦР, так как это позволит свести к минимуму загрязнение плазмидов и других библиотек секвенирования. Для хорошей практики, не шаблон отрицательный контроль может быть включен, чтобы помочь контролировать для загрязнения ПЦР.

Анализ данных для перевода секвенирования считывающих сэкранов является нетривиальной задачей, учитывая размер и разнообразие этих наборов данных. После того, как последовательность читает были выровнены и нормализованы, несколько биоинформатики инструменты доступны для оказания помощи в оценке производительности экрана(Рисунок 3) и хит идентификации (Рисунок 4). BAGEL описан в этом протоколе как ключевой инструмент для анализа данных. BAGEL использует байесовскую структуру для сравнения распределения известных основных и несущественных наборов генов с изменением журнальных раз всех руководств, нацеленных на ген. Этот метод подробно описан в Hart et al3. В дополнение к BAGEL, другие алгоритмы, предназначенные для идентификации как обогащенных, так и истощенных sgRNAs, таких как MAGeCK25 также могут быть использованы. Для лекарственных экранов рекомендуется использовать алгоритм препарата для выявления как синергетических, так и супрессорных химических генетических взаимодействий. Препарат был разработан для сравнения относительного изобилия сгРНК в обработанной популяции с относительным обилием сгРНК в необработанной популяции в то же времяточка20.

Ограничение CRISPR экранов является то, что Cas9 не всегда приводит к нокаут, как всегда есть вероятность того, что indels созданы в кадре мутаций, в результате чего функции гена нетронутыми13. Это приводит к смешанной популяции, что делает экран "шумным" и интерпретацией данных сложной задачей. Использование нескольких независимых sgRNA ориентации гена может построить в избыточности, уменьшая эффект sgRNAs с низкой активностью. Дополнительным предостережением к исследованиям CRISPR является эффект двойных разрывов нитей, созданных Nuclease Cas9, что может привести к клеточной летальности независимо от гена, мишенью. Этот анти-пролиферативный эффект увеличивается с целевым номером копии сайта, что приводит к ложноположительной идентификации генов в сильно усиленных регионах26. Вычислительные методы, такие как CERES были разработаны, чтобы исправить для эффектов числакопий 27. Эти рабочие процессы учитывают эффект числа копий для оценки уровней зависимости генов на экранах существенности, основанных на нокауте. Тщательное изучение геномных мест попадания генов в усиленных регионах может помочь определить ложные срабатывания, которые обусловлены множественностью режущих эффектов13. Первичные экраны могут только идентифицировать потенциальные попадания. Важно, чтобы последующей деятельности с вторичным экраном или протоколом для проверки хитов и отличить на цель от вне цели эффекты, отсеивание ложных срабатываний и обеспечения генов, которые забил слабо из-за неэффективных возмущений не остались позади, как ложные негативы23.

Этот протокол фокусируется на подходах скрининга на основе жизнеспособности, при которых состояние исследования должно привести к дефекту распространения или смерти клеток. Для процессов, которые не приводят к изменению жизнеспособности клеток, метод скрининга, основанного на жизнеспособности, может быть ограничительным. Альтернативой является выполнение экранов с использованием репортера или маркера на основе анализов и обогащения флуоресценции активированной ячейки сортировки (FACS) подходов. В маркер на основе экрана отбора, фенотип основан на мутации, которые регулируют экспрессию генов маркера, а не здоровье клеток13,23. Arrayed CRISPR форматы также доступны для одного гена на хорошо скрининга. Arrayed форматы более поддаются сложным или микроскопии основе чтения выходов. Однако, массивные форматы требуют автоматизированного оборудования и большого количества реагентов28.

Протокол скрининга, обсуждаемый здесь, использует nuclease S. pyogenes Cas9 для создания null аллелей, которые наиболее широко используются для генетических экранов и для которых доступны многие библиотеки (Addgene: Pooled Libraries). Также доступны альтернативные варианты выбивания библиотек, которые используют каталитически мертвый dCas9, привязанный к белкам-модификаторам хроматина, чтобы ингибировать (CRISPRi) или активировать (CRISPRa) транскрипцию генов. Как и RNAi, CRISPRi предлагает возможность изучать фенотипические эффекты в различных дозах генов и основных генов, которые не могут терпеть полного нокаута, в то время как CRISPRa может быть использован для выполнения прироста функций экранов. Каждая из этих технологий имеет свои преимущества, но в целом, подход CRISPR нокаут является наиболее развитым. Было доказано, что он хорошо работает с низким уровнем шума, минимальными эффектами вне цели и экспериментальной консистенцией, особенно в исходных экранах на основе основных генов, по сравнению с нокдаун подходами, использующими либо CRISPRi и shRNAs5. Несмотря на свою обширную применимость на сегодняшний день, технология скрининга CRISPR остается на ранних стадиях. Из основных компонентов CRISPR продолжают строиться новые инструменты. К ним относятся комбинированные стратегии редактирования генов, которые могут быть нацелены на несколько геномных локусов, оптимизацию ортогоналовых ферментов Cas и модификации функциональных областей хроматина для диверсификации деятельности Cas9. Поскольку технология CRISPR продолжает расти, ее связь с подходами генетического скрининга будет служить мощной платформой для функциональных открытий в генетике.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Геномканады, Исследовательским фондом Онтарио и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (MOP-142375, PJT-148802).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaCl Promega V4221
50X TAE buffer BioShop TAE222.4
6 N Hydrochloric acid solution BioShop HCL666.500
95% Ethanol
Alamar blue ThermoFisher Scientific DAL1025
Blue-light transilluminator ThermoFisher Scientific G6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade Bioshop ALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles Medium Life Technologies 11995-065 Cel culture media
Electroporation cuvettes BTX 45-0134
Electroporator BTX 45-0651
Endura electrocompetent cells Lucigen 90293
Fetal Bovine Serum GIBCO 12483-020
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216 recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) Sigma H9268 Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladder New England Biolabs N3233S
Nanodrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544L
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media
Plasmid maxi purification kit Qiagen 12963
pMD2.G (envelope plasmid) Addgene Plasmid #12259 lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid) Addgene Plasmid #12260 lentiviral system
Puromycin Wisent 400-160-UG
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
Qubit dsDNA BR assay ThermoFisher Scientific Q32853
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33226
RNAse A Invitrogen 12091021
S.O.C recovery medium Invitrogen 15544034
SYRB Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included Addgene Addgene ID #90203 Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 Addgene Addgene ID #125517 Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agarose ThermoFisher Scientific 16500500
Wizard genomic DNA purification kit Promega A1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 06 365 809 001 Lipid based transfection reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
  2. Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
  3. Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  4. Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
  5. Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  6. Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
  7. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  8. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  9. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
  12. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
  15. Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
  16. Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
  17. Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
  18. Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
  19. Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
  20. Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
  21. Pedregosa, F. V., G,, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
  22. Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
  23. Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
  24. Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
  25. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
  26. Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
  27. Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
  28. Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).

Tags

Генетика Выпуск 151 CRISPR-Cas9 библиотеки sgRNA Торонто-Knock-out скрининг CRISPR по всему геному объединенные экраны отсева функциональная геномика необходимые гены клеточная пригодность пролиферация
Объединенные ГЕНЕТИЧЕСКИе экраны на основе CRISPR в клетках млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K.… More

Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (151), e59780, doi:10.3791/59780 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter