Технология CRISPR-Cas9 обеспечивает эффективный метод точного редактирования генома млекопитающих в любом типе клеток и представляет собой новое средство для выполнения генетических экранов генома. Здесь представлен подробный протокол, в котором обсуждаются шаги, необходимые для успешного выполнения объединенных экранов CRISPR-Cas9, в масштабах всего генома.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Объединенные ГЕНЕТИЧЕСКИе экраны на основе CRISPR в клетках млекопитающих
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Редактирование генома с помощью системы CRISPR-Cas значительно повысило способность точно редактировать геномы различных организмов. В контексте клеток млекопитающих, эта технология представляет собой новое средство для выполнения генома всей генетические экраны для функциональных исследований геномики. Библиотеки направляющих РНК (sgRNA), ориентированные на все открытые кадры чтения, позволяют легкому поколению тысяч генетических возмущений в одном пуле клеток, которые могут быть проверены на конкретные фенотипы для вовлечения функции гена и клеточных процессов в беспристрастной и систематической образом. Экраны CRISPR-Cas предоставляют исследователям простой, эффективный и недорогой метод раскрытия генетических чертежей клеточных фенотипов. Кроме того, дифференциальный анализ экранов, выполняемых в различных клеточных линиях и из различных типов рака, может определить гены, которые имеют контекстуально важное значение в опухолевых клетках, выявляя потенциальные цели для конкретных противоопухолевых методов лечения. Выполнение геномных экранов в клетках человека может быть сложной задачей, так как это предполагает обработку десятков миллионов клеток и требует анализа больших наборов данных. Детали этих экранов, такие как характеристика клеточной линии, соображения библиотеки CRISPR и понимание ограничений и возможностей технологии CRISPR в ходе анализа, часто упускаются из виду. Приведен ный подробный протокол для успешного выполнения объединенных экранов на основе CRISPR-Cas9 в масштабах всего генома.
Введение
CRISPR-Cas, сокращение от кластерных регулярно межпространственных коротких палиндромных повторов и связанных с CRISPR нуклеаза, состоит из одного белка nuclease (например, Cas9) в комплексе с синтетической направляющей РНК (sgRNA). Этот комплекс рибонуклеопротеинов нацелен на фермент Cas9, чтобы вызвать двухцепочечные разрывы ДНК при специфическом геномном локусе1. Двухцепочечные перерывы могут быть отремонтированы с помощью гомологии направленного ремонта (HDR) или, чаще всего, через негомологическую конечную присоединение (NHEJ), механизм ремонта, подверженный ошибкам, который приводит к вставке и/или удалению (INDELS), которые часто нарушаю....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты, изложенные ниже, должны следовать руководящим принципам Управления по охране окружающей среды и безопасности Института.
1. Бассейн CRISPR sgRNA лентивирусной библиотеки плазмид усиления
- Разбавить готовый CRISPR sgRNA плазмид ной ДНК библиотеки до 50 нг / Л в TE (например, TKOv3).
- Электропорат библиотеки с помощью электрокомпетентных клеток. Настроили в общей сложности четыре реакции электропорации, как описано ниже.
- Добавьте 2 л из 50 нг/Л Библиотеки ТКО к 25 л оттаятых электрокомпетентных клеток к предварительно охлажденным кюветам (1,0 мм) на льду.
- Электропорат с использованием оптималь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Обзор рабочего процесса скрининга по масштабу генома CRISPR
Рисунок 1 иллюстрирует обзор объединенного потока скрининга CRISPR, начиная с заражения целевых клеток с помощью лентивирусной библиотеки CRISPR при низком МВД для обеспечения проведения отдельных интеграционных мероприятий и адекватного представления библиотеки (обычно от 200 до 1000 -фолд). После инфекции, клетки лечатся .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Благодаря простоте использования и высокой гибкости, технология CRISPR была широко принята в качестве инструмента выбора для точного редактирования генома. Объединенный скрининг CRISPR предоставляет метод для допроса тысяч генетических возмущений в одном эксперименте. В объединенных экранах библиотеки sgRNA служат молекулярными штрих-кодами, так как каждая последовательность уникальна и отображается в целевом гене. Путем изолировать геномную дна от населенности клетки, гены причиняя фенотип интереса можно обусловить путе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.
Благодарности
Эта работа была поддержана Геномканады, Исследовательским фондом Онтарио и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (MOP-142375, PJT-148802).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,22 мкм | |||
| 30&�Д; С-пластинчатый | |||
| 37° C встряхивающий инкубатор | |||
| 37° C, 5% CO2 инкубатор | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Раствор соляной кислоты | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% этанол | |||
| Аламар синий | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Трансиллюминатор синего света | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Бычья сыворотка Альбумин, Тепловая Шоковая Изоляция, Фракция V. Мин. 98%, Биотехнологический класс | Bioshop | ALB001.250 | |
| Модификация Дульбекко Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel Питательные среды |
| Электропорационные кюветы | BTX | 45-0134 | |
| Электропоратор | BTX | 45-0651 | |
| Endura электрокомпетентные клетки | Lucigen | 90293 | |
| Фетальная бычья сыворотка | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T упаковочные клетки | ATCC | CRL-3216 | рекомендуют номер прохода < 15 |
| Гексадиметрина бромид (полибрен) | Sigma | H9268 | Катионный полимер для повышения эффективности трансдукции |
| Гексадиметрина бромид (полибрен) | |||
| LB агаровые пластины с карбенициллином | |||
| LB среда с карбенициллином | |||
| Низкомолекулярная ДНК-лестница | England Biolabs | N3233S | |
| Нанокапельный спектрофотометр | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Уменьшенная сывороточная среда |
| Набор для очистки плазмиды | макси Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (плазмида в конверте) | Плазмида Addgene | #12259 | Лентивирусная система |
| psPAX2 (упаковка плазмида) | Адген | Плазмида #12260 | Лентивирусная система |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick гель экстракционный набор | Qiagen | 28704 | |
| Кубит dsDNA BR анализ | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Кубит флуориметр | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| РНКаза | А Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C восстанавливающая среда | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 включен | Addgene | Addgene ID #90203 | Полногеномная библиотека CRISPR , включает Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 | Addgene Addgene | ID #125517 | Полногеномная библиотека CRISPR, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard набор для очистки геномной ДНК | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 реагент для трансфекции ДНК | Roche | 06 365 809 001 | Липидный реагент для трансфекции |
Ссылки
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
