Summary
Questo protocollo mostra un approccio semplice e flessibile per la valutazione di nuovi agenti di condizionamento o strategie per aumentare la fattibilità della donazione cardiaca dopo la morte circolatoria.
Abstract
La domanda di trapianto cardiaco è in aumento; tuttavia, la disponibilità di organi è limitata a causa della scarsità di donatori idonei. La donazione di organi dopo la morte circolatoria (DCD) è una soluzione per affrontare questa disponibilità limitata, ma a causa di un periodo di ischemia calda prolungata e il rischio di lesioni tissutali, il suo uso di routine nel trapianto cardiaco è raramente visto. In questo manoscritto forniamo un protocollo dettagliato che imita da vicino le attuali pratiche cliniche nel contesto della DCD con il monitoraggio continuo della funzione cardiaca, consentendo la valutazione di nuove strategie cardioprotettivhe e interventi per diminuire lesione da ischemia-reperfusione.
In questo modello, il protocollo DCD viene avviato in ratti Lewis anestesizzati fermando la ventilazione per indurre la morte circolatoria. Quando la pressione sanguigna sistolica scende al di sotto di 30 mmHg, viene iniziato il tempo ischemico caldo. Dopo un periodo ischemico caldo preimpostato, i cuori vengono lavati con una soluzione cardioplegica normotermica, procurati e montati su un sistema di perfusione cardiaca ex vivo di Langendorff. Dopo 10 min di riperfusione e stabilizzazione iniziale, il ricondizionamento cardiaco viene continuamente valutato per 60 min utilizzando il monitoraggio della pressione intraventricolare. Una lesione cardiaca viene valutata misurando la troponina cardiaca T e la dimensione dell'infarto è quantificata dalla colorazione istologica. Il tempo ischemico caldo può essere modulato e su misura per sviluppare la quantità desiderata di danni strutturali e funzionali. Questo semplice protocollo consente la valutazione di diverse strategie di condizionamento cardioprotettivo introdotte al momento della cardioplegia, della riperfusione iniziale e/o durante la perfusione ex vivo. I risultati ottenuti da questo protocollo possono essere riprodotti in grandi modelli, facilitando la traduzione clinica.
Introduction
Il trapianto di organi solidi in generale e il trapianto cardiaco, in particolare, sono in aumento in tutto il mondo1,2. Il metodo standard di approvvigionamento degli organi è la donazione dopo la morte cerebrale (DBD). Dati i rigorosi criteri di inclusione della DBD, meno del 40% dei cuori offerti sono accettati3, limitando così l'offerta a fronte della crescente domanda ed estendendo la lista d'attesa dell'organo. Per risolvere questo problema, l'uso di organi donati dopo la morte circolatoria (DCD) è considerato una potenziale soluzione4.
Nei donatori di DCD, tuttavia, una fase agonale dopo il ritiro delle cure e un periodo di ischemia calda non protetta prima della rianimazione sono inevitabili5. La potenziale lesione dell'organo dopo la morte circolatoria può portare alla disfunzione dell'organo, spiegando la riluttanza ad adottare regolarmente trapianti di cuore DCD. Si dice che solo 4 centri utilizzino clinicamente i cuori DCD, con criteri rigorosi che includono tempi di ischemia calda molto brevi e giovani donatori senza patologie croniche6,7. Per motivi etici e giuridici, nei donatori possono essere applicati interventi cardioprotettivi limitati o associali prima della morte circolatoria5,8,9. Pertanto, qualsiasi mitigazione per alleviare la lesione ischemia-reperfusione (IR) è limitata alle terapie cardioprotettive iniziate durante la reperfusione precoce con soluzioni cardiopleganti e non consente una corretta valutazione funzionale. Ex vivo cuore perfusione (EVHP) e il ricondizionamento del cuore DCD utilizzando piattaforme dedicate è stato proposto come soluzione alternativa e studiato da vari studiosi10,11,12,13 . EVHP offre un'opportunità unica per fornire agenti post-condizionamento ai cuori DCD per migliorare il recupero funzionale. Tuttavia, per una traduzione clinica efficiente, restano da affrontare molte questioni tecniche e pratiche, e ciò è ulteriormente aggravato dalla mancanza di consenso su una serie di criteri funzionali e per la perfusione per determinare la capacità dei trapianti6, 8.
Qui segnaliamo lo sviluppo di un protocollo DCD preclinico preclinico preclinico riproducibile combinato con un sistema di perfusione cardiaca ex vivo che può essere utilizzato per indagare organo post-condizionamento avviato al momento dell'approvvigionamento, durante la riperfusione iniziale, e /o in tutta EVHP.
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Protocol
Tutti i protocolli di cura degli animali e sperimentali sono conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro di ricerca Centre Hospitalier de l'Université de Montréal.
1. Preparativi preliminari
- Accendere il bagno d'acqua per riscaldare il sistema di consegna cardioplegia (Figura 1A) e il sistema di perfusione ex vivo Langendorff (Figura 1B). Impostare la temperatura dell'acqua a 38,5 gradi centigradi per una temperatura di soluzione di 37 gradi centigradi. Le fotografie di installazione possono essere visualizzate nella Figura supplementare 1A,B.
- Preparare 1 L di soluzione cardioplegica. Aggiungere 1 mL di 2% cloruro lidocaino e 10 mL di 2 mM KCl (concentrazione finale 20 mM) a 1 L di Plasma-Lyte A (140 mM Na, 5 mM K, 1,5 mM Mg, 98 mM Cl, acetato da 27 mM, 23 mM di gluconato). Correggere il pH a 7,4 utilizzando 6 N HCl.
ATTENZIONE: Questo modello è altamente sensibile al pH. Una correzione errata del pH (al di fuori della portata fisiologica 7.3-7.4) o soluzioni instabili per il pH possono compromettere l'esperimento o fornire dati inaffidabili. - Preparare la soluzione 4 L di Krebs (113 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1.6 mM NaH2PO4, 1.25 mM CaCl2, 1 mM MgCl2x 6H2O, 5.5 mM D-Glucose, 25 mM NaHCO3). Le masse di substrati per 1 L di soluzione dovrebbero essere le seguenti: 6,1 g di NaCl, 0,3355 g di KCl, 0,2035 g di MgCl2x 6H2O, 0,192 g di NaH2PO4, 0,1387 g di CaCl2, 0,99 g di D-Glucose, 2,1 g di NaHCO3 , volume finale di 1 L in acqua ultrapura deionizzata. Aggiungere il NaHCO 3 (COM del nome per evitare precipitazioni. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 m e conservarla durante la notte. Correggere il pH a 7,4 quando la soluzione è a 37 gradi centigradi e bolla con 5% CO2/95% O2.
- Riempire il circuito Langendorff con la soluzione Krebs e avviare la pompa di sistema. Assicurarsi che non vengano lasciate bolle all'interno del tubo. Regolare la velocità della pompa peristale a 80 giri/mm (equivalente a 1 L/min). Utilizzando il cazzo arresto a due vie, regolare il flusso per mantenere una goccia lenta attraverso la cannula aortica fino a quando il cuore è attaccato (Figura 1B). Tenere un campione di soluzione Krebs (15 mL) in un tubo conico da 50 ml sul ghiaccio per il trasporto del cuore.
- Riempire il sistema di erogazione di cardioplegia con la soluzione cardioplegica. Una volta rimosse le bolle, passare il circuito in salina utilizzando un cazzo di arresto a 3 vie (Figura 1A). Regolare la frequenza di gocciolamento. La salina deve gocciolare lentamente dalla punta del catetere per assicurare che nessuna soluzione cardiopelgica venga iniettata prima della morte dell'animale.
2. Preparazione degli animali
- Utilizzando una camera di inalazione, indurre l'anestesia con 3% isoflurane. Una volta che l'animale non risponde, eseguire un'iniezione intraperitoneale di ketamina (75 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) o anestetici altrettanto adatti, seguendo le normative locali, per mantenere l'anestesia per il resto della procedura. Garantire la profondità dell'anestesia senza alcuna reazione al pizzico e al riflesso palpebrale.
- Intubare l'animale utilizzando un catetere I.V da 14 G e 2 pollici. Iniziare la ventilazione a 50 respiri al min, con pressione delle vie aeree limitata a 20 cmH2O.
- Posizionare l'animale su un pad di riscaldamento impostato su "medio" e coprire con un pad assorbente per mantenere la temperatura corporea. Inserire una sonda di temperatura rettale e collegare un sensore ossimetro a impulsi transdermici a uno dei piedi. Mantenere la temperatura rettale a 37 gradi centigradi per tutta la durata della procedura.
-
Accesso vascolare
- Fare un'incisione cutanea media da 3 a 4 cm nel collo utilizzando le forbici. Utilizzando forbici curve contundenti, sezionato sezionato il tessuto sottocutaneo ed esporre il muscolo sternoioide destro. Utilizzando la forza non traumatica, spostare il muscolo lateralmente fino a quando l'arteria carotide destra (pulsazione), la vena giugulare (non pulsante) e il nervo vago (bianco) sono identificati visivamente (Figura supplementare 2A). Separare con cura il nervo vago dall'arteria carotide utilizzando forbici curve con punta smussata.
- Iniettare l'eparina (2.000 IU/kg) attraverso la vena giugulare destra. Applicare la pressione sul sito di iniezione dopo la retrazione dell'ago per evitare perdite di sangue.
- Utilizzando pinze curve, passare due suture di seta 5-0 intorno all'arteria carotide. Fissare saldamente una sutura distale per occludono l'arteria carotide all'aspetto superiore dell'arteria esposta. Mantenere la sutura prossimale slegata. La trazione della sutura prossimale verrà utilizzata per il controllo del sanguinamento nella fase successiva ( Figura supplementare2B). La distanza tra le suture deve essere di circa 2 cm.
- Utilizzando uno stereoscopio per una migliore visualizzazione, fare con attenzione un'incisione di 1 mm con forbici microchirurgiche sulla parete anteriore dell'arteria carotide. Inserire un catetere I.V. chiuso da 22 G e 1 pollice verso l'arco aortico. Il catetere è collegato a un cazzo di arresto a 2 vie, consentendo il collegamento a un trasduttore di pressione per un monitoraggio costante, con la possibilità di iniettare salina o cardioplegia tramite il sistema di consegna cardioplegia (Figura 1A).
3. Avvio della donazione cardiaca dopo il protocollo di morte circolatoria (DCD)
NOT: Una sequenza temporale del protocollo completo può essere visualizzata nella Figura 2.
- Ri-asses la profondità anestetica eseguendo un pizzico di toe e valutando il riflesso palpebrale. Se si osserva una reazione, eseguire un'iniezione intraperitoneale di Ketamina (37,5 mg/Kg) e xylazina (2,5 mg/kg). Rivalutare dopo 5 minuti. Se non viene osservata alcuna risposta, continuare la procedura. Il morsetto tracheale deve essere eseguito solo in animali adeguatamente anestesizzati.
- Spegnere il ventilatore ed estralare l'animale. Utilizzando pinze antizanzare, bloccare la trachea. Questo momento è considerato come l'inizio della fase agonia. Iniziare a contare il tempo ischemico caldo funzionale (WIT) quando la pressione sanguigna sistolica di picco scende al di sotto di 30 mmHg, o se appare fibrillazione asistole o ventricolare, qualunque cosa venga prima (Figura3).
NOT: L'entità del danno deve essere proporzionale alla WIT. Sono necessari esperimenti per ottimizzare il tempo WIT in base all'anestetico utilizzato, ceppo animale, sesso e peso scelti. Negli animali di controllo, subito dopo l'accesso vascolare carotideè è assicurato, la cardioplegia viene iniettata e il cuore viene procurato come descritto nella fase successiva (Figura 2). L'inizio della perfusione con cardioplegia è considerato come la fine del WIT. - Alla fine del WIT, eseguire una sternotomia mediale. Tenere aperto il torace utilizzando un retrattore Alm. Usando le forbici, aprire la vena cava inferiore e sia atri a tria per evitare la distensione miopidea o la ricircolazione cardioplegia (Figura supplementare 3). Stringete l'aorta sopra il diaframma. Attraverso l'arteria carotide precedentemente catetere, infondere la soluzione cardioplegica ad una pressione costante di 60 mmHg per 5 min utilizzando il sistema di consegna cardioplegia. La pressione di infusione può essere modificata alterando l'altezza della colonna d'acqua.
- Alla fine dell'infusione cardioplegica, sezionare l'aorta prossimale ascendente dall'arteria polmonare utilizzando la forza curva (Figura supplementare 4A). Tagliare il distale dell'aorta all'arteria subclavianaria sinistra. Assicurare una lunghezza aortica di almeno 0,5 cm per la connulura per l'apparato Langendorff.
- Tenendo il cuore dall'aorta, completare la cardiectomia separando il cuore dalle vene polmonari e da altre strutture toraciche (Figura supplementare 4B). Rapidamente, immergi il cuore nella soluzione Krebs ghiacciata per un trasporto rapido al sistema ex vivo. Mantenere i tempi di dissezione e trasporto il più breve possibile (5 min).
4. Ex Vivo Heart Perfusion System (EVHP) e Valutazione Funzionale Cardiaca
- Aprire il lume aortico usando le pinze. Deair l'aorta riempiendo il lume con la soluzione Krebs gocciolante per evitare di forzare le bolle nei vasi coronarici. Abbassare la cannula nell'aorta, facendo attenzione a non passare la radice aortica o danneggiare i volantini della valvola aortica. Fissare l'installazione con un piccolo morsetto.
- Utilizzando il stopcock a 2 vie, aumentare il flusso per cercare possibili perdite nell'aorta. Se non vengono rilevati, fissare saldamente l'aorta alla cannula utilizzando una sutura di seta 2-0. Aprire completamente il flusso verso la cannula. Mantenere la pressione aortica ad una pressione fisiologica di 60-70 mmHg (regolata cambiando l'altezza del sistema). In questo momento viene avviato il tempo iniziale di riperfusione e stabilizzazione. La pressione aortica può essere modificata secondo il piano sperimentale dello sperimentatore.
- Ruotare il cuore in modo che la base del cuore (atria) sia rivolta verso il sensore di pressione. Allargare l'apertura atriale ventricolare sinistra sezionando le vene polmonari. Inserire il palloncino in lattice collegato a un sensore di pressione. Assicurarsi che il palloncino sia completamente posizionato all'interno del ventricolo mediante ispezione visiva. Riempire lentamente il palloncino con la pressione diastolica finale (EDP) è impostato su 15 mmHg. Regolare in base alle esigenze per mantenere costante EDP (EDP fisiologico predeterminato). L'EDP può essere regolato in base agli obiettivi sperimentali di ciascun ricercatore.
- Inserire l'elettrodo di stimolazione nella faccia anteriore del cuore (tratto di deflusso ventricolare destro). Evitare di perforare i vasi coronarici. Una volta osservata la battitura spontanea, avviare il ritmo a 300 battiti al min. La tensione richiesta può variare tra esperimenti e ceppi di ratto.
- Dopo 10 min di stabilizzazione, avviare la registrazione continua di misurazione della pressione intraventricolara. Questo momento è considerato l'inizio della fase di ricondizionamento e valutazione (tempo 0) che durerà per 1 h (Figura 2). Il ricondizionamento può essere prolungato, ma si prevede una diminuzione della contrattilità dipendente dal tempo in tutti i cuori.
- All'inizio del ricondizionamento, raccogliere gli effluenti cardiaci che cadono dalle vene cardiache per 5 min per la valutazione del flusso coronario di base e le analisi biochimiche. Per troponina T ripetere ogni 15 min (per 0, 15, 30, 45 e 60 min). Per altre analisi è necessaria l'individualizzazione dei tempi di raccolta (Figura 2).
5. Fine dell'esperienza
- Togliere il cuore dall'apparato Langendorff.
- Utilizzando una lama di acciaio ad alto carbonio dritto (lama di microtoma o simili), rimuovere la base del cuore (compresa l'aorta e l'arteria polmonare).
- Con il ventricolo destro rivolto verso il basso, tagliare i vetrini ventricolari trasversali di 1-2 mm di spessore. In una sezione rappresentativa (normalmente la terza) accisa il ventricolo destro e snap congelare il ventricolo sinistro. Questo campione può essere utilizzato per analisi biochimiche.
- Sommergi le restanti sezioni per preparare il 5% 2,3,5 tripile-tetrazolium cloruro nel buffer salina commerciale di fosfato pH 7,4 per 10 minuti a 37 gradi centigradi. Tessuti vitali sono di colore mattone rosso.
- Lavare due volte con fosfato tampone salina pH 7.4 e fissare con 10% formalina a 4 gradi durante la notte. Lavare due volte con fosfato tamponato pH 7.4 e mantenere ogni fetta sommersa.
- Ritirare il liquido in eccesso e il peso di ogni diapositiva. Scatta immagini a colori digitali di entrambi i lati. Utilizzare le analisi planimetriche per calcolare la dimensione percentuale in farta e correggere la fetta e il peso ventricolare totale. Colorazione svanisce con il tempo. Le foto devono essere scattate il prima possibile.
6. Analisi dei dati
- Salvare tutti i dati di pressione in un nuovo file per animale.
- Per le analisi della pressione, selezionare almeno 200 cicli di pressione per punto temporale. Le analisi possono essere eseguite off-line (dopo il completamento dell'esperimento) utilizzando un software dedicato (ad esempio, LabChart). I parametri cardiovascolari più comuni disponibili includono: Pressione massima generata, pressione diastolica finale, dP/dt (pendenza più ripida durante l'upstroke della curva di pressione, indicatore di capacità contrattile ventricolare), -dP/dt (pendenza più ripida durante la verso il basso della curva di pressione, un indicatore di capacità di rilassamento ventricolare) tra gli altri.
NOTA: per le analisi della troponina, è previsto un aumento del rilascio della troponina durante la riperfusione. Dopo 1 h di reperfusione nel sistema EVHP, i livelli di troponina possono diminuire al basale, sottolineando la necessità di un'attenta tempistica nella raccolta e nella gestione di questi campioni.
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Representative Results
Dopo l'estubazione, la pressione sanguigna diminuisce rapidamente in un modello prevedibile (Figura 3). L'ora prevista per la morte è inferiore a 5 min.
La figura 4 mostra una curva media pressione/tempo all'inizio del ricondizionamento dopo 0, 10 e 15 min di WIT. Funzione contrattile migliorerà nel tempo. L'uso di brevi periodi di WIT consentirà la contrattilità per tornare alla normalità, e danni morfologici non saranno rilevabili (Figura 5 e Figura 6).
L'uso proof-of-concept di un agente condizionante aggiunto con la cardioplegia e in fase di stabilizzazione mostra che i danni generati da 15 min di WIT in questo modello sono suscettibili di modulazione da agenti cardioprotettivi (Figura 4, Figura 5 e Figura 6).
Figura 1: schemi di attrezzatura necessari. Requisiti minimi perun sistema di consegna cardioplegia ( A) e un sistema di perfusione cardiaca Langendorff ex vivo di(B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sequenza temporale del protocollo. Sequenza temporale dal momento dell'estubazione fino alla fine del protocollo. Negli animali di controllo, la cardioplegia viene iniziata senza DCD o tempo ischemico caldo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Grafico pressione sanguigna/tempo intracarotid. Evoluzione tipica della pressione sanguigna intracarotide dopo l'estubazione. Il tempo di ischemia calda è quando la pressione sanguigna sistolica di picco scende al di sotto di 30 mmHg, o se appare una fibrillazione asistole o ventricolare, qualunque cosa venga prima. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Curva del tempo di pressione ventricolare media beat-to-beat ex vivo. Immagine derivata da analisi di dati acquisiti dopo 10 min di stabilizzazione e perfusione (tempo 0 in figura 2) con o senza l'uso di un agente sperimentale di condizionamento cardioprotettivo farmacologico. Il tempo ischemico si riferisce ai tempi ischemici caldi (WIT). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Recupero ex vivo e analisi funzionali. (A) Curva continua del tempo di pressione ventricolare dopo 10 stabilizzazione e perfusione con o senza l'uso di un agente sperimentale di condizionamento cardioprotettivo farmacologico. Le frecce mostrano gli artefatti dovuti alla modifica manuale di EDP. (B) Tasso massimo (dP/dt) e minimo (-dP/dt) del tasso minimo di variazione della pressione nel grafico LV rispetto al tempo derivato da (A) che mostra un miglioramento dipendente dal tempo della contrattilità senza trattamento (linea verde). Cuori Brevi WIT (linea rossa) o trattati (giallo) mostrano un modello simile al gruppo di controllo (linea blu). I punti dati sono la media di almeno 200 battiti individuali. Le barre mostrano l'errore standard della media di ogni punto dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: colorazione del cloruro 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium alla fine degli esperimenti. Area infarto osservata a seguito di diversi tempi ischemici caldi (WIT) e l'uso di un agente di condizionamento cardioprotettivo farmacologico. Rosso mattone: tessuto vitale. Giallo chiaro: tessuto non vitale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Impostazione della fotografia. (A) Fotografia che mostra la configurazione del sistema di consegna cardioplegia. L'apparecchiatura numerata corrisponde a: contenitore cardioplegia (1), trappola per bolle (2), sensore di pressione e catetere (3), pompa peristale (4), poligrafo collegato al sensore di pressione (5) e piccolo ventilatore animale (6). (B) Fotografia che mostra l'impostazione del sistema di perfusione del cuore ex vivo di Langendorff. L'equipaggiamento numerato corrisponde a: contenitore Perfusate (1), contenitore agente di condizionamento (2) e camera cardiaca (3). Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare Figura 2: Dissezione del collo. (A) Fotografia che mostra la vena giugulare esposta (freccia) prima dell'iniezione di eparina. (B) mostra l'arteria carotide sezionata (freccia) con le suture poste per il controllo del sanguinamento. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 3: Apertura degli atri per impedire il ricircolo. (A) Fotografia che mostra l'apertura dell'appendice atriale sinistra (1). Sullo sfondo l'aorta (2) è bloccata sopra il diaframma (3). (B) Mostra l'apertura dell'appendice atriale destra (1). Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura 4 supplementare: Approvvigionamento cardiaco. (A) Fotografia che mostra l'uso di pinze curve per separare l'aorta (freccia) e l'arteria polmonare. (B) Fotografia che mostra la dissezione e l'approvvigionamento cardiaco. Il cuore è tenuto dall'aorta usando le pinze. Clicca qui per scaricare questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui presentato introduce un modello semplice, comodo e versatile di DCD cardiaco, che offre l'opportunità di valutare il recupero funzionale cardiaco, i danni ai tessuti e l'uso di agenti cardioprotettivi post-condizionamento per migliorare il recupero del donatore altrimenti scartati per il trapianto. I sistemi di perfusione del cuore ex vivo (EVHP) sono stati ottimizzati per fornire una piattaforma per la valutazione della funzione cardiaca e offrono un'opportunità unica di fornire e testare soluzioni modificate integrate con agenti farmacologici post-condizionamento per conservare e riparare i cuori dCD in piccoli15 e grandi animali16,17 modelli di DCD cardiaco. Tuttavia, i protocolli sono spesso sufficientemente dettagliati e non sempre clinicamente rilevanti, rendendo difficile la traduzione clinica.
Nel regno dei modelli DCD, i modelli DCD ex vivo, come quello descritto da Sanz18,mancano di una fase agonale. Inducendo l'arresto cardiaco arrestando la ventilazione meccanica, il sistema nervoso simpatico viene sovraattivato, portando ad una "tempesta di catecholamina"19. Questo aumento delle catecholamine modifica le caratteristiche degli organi del donatore ed è stato collegato a un ridotto stato funzionale degli organi DCD sperimentali19. Inoltre, il progressivo declino della funzione prima dell'asistolo porta alla distensione ventricolare destra e alla conseguente lesione. Nel nostro protocollo, abbiamo indotto la morte circolatoria utilizzando un modello di asfissia clinicamente rilevante, che mantiene queste risposte.
Nella letteratura sono descritti due principali modelli di DCD cardiaco in vivo: torace aperto15 e20 modelli di petto chiuso. La fisiologia cardiaca è alterata dall'approccio toracico aperto riducendo l'interazione polmonare/cuore meccanica e la precarico. Inoltre, nelle procedure aperte toraciche, la perdita di calore del corpo è accelerata, influenzando ulteriormente gli esiti funzionali21. Pertanto è preferibile mantenere un approccio toracico chiuso prevenendo la perdita di calore. Un altro perfezionamento è quello di ridurre al minimo la variabilità del tempo alla morte circolatoria. Kearns et al. ha riferito che il tempo a morte (tempo di pressione sanguigna non-pulsatile o media inferiore a 30 mmHg) era tra 3 a 11 min. Nel 10 e 20 min WIT, il 40% e il 60% dei cuori non ha recuperato la funzione, rispettivamente, su un apparato cardiaco di lavoro ex vivo, rendendo più difficile l'interpretazione dei dati15. Un'alternativa per ridurre il tempo di morte circolatoria consiste nell'utilizzare agenti paralittici20; tuttavia, alcune prove indicano effetti cardiaci diretti del vecuronio, a causa dei suoi effetti sull'innervazione simpatica e parasimpatica22. Per aumentare la riproducibilità, abbiamo scelto il bloccaggio tracheale, combinato con una precisa monitorazione della pressione arteriosa, consentendo un tempo agonale più omogeneo (<5 min). È noto che il danno agli organi inizia prima del momento della morte circolatoria; con alcuni autori che considerano una pressione sanguigna sistolica tagliata al di sotto di 50 mmHg come l'inizio del WIT6funzionale, spiegando la riluttanza agli organi di trapianto dopo un lungo periodo di ritiro delle misure di sostegno della vita fino alla riperfusione. In questo protocollo, la definizione WIT utilizzata segue l'attuale standard sperimentale15, tuttavia, sono necessari ulteriori studi per chiarire l'esatta serie di parametri emodinamici che segnano l'induzione del danno agli organi al fine di migliorare la WIT calcolo, offrendo così informazioni migliori per la pratica clinica.
L'infusione di soluzione cardiovincola a pressione e temperatura fisiologiche costanti offre un'opportunità unica per avviare il condizionamento cardiaco e la protezione dei tessuti con qualsiasi agente farmacologico o con altri mezzi. I perfezionamenti tecnici includono il bloccaggio dell'aorta toracica, la limitazione della perfusione al cuore e quindi la riduzione della quantità di soluzione necessaria per ogni saggio. Una volta che il cuore è sul sistema EVHP, è necessaria una valutazione funzionale standardizzata. È stato dimostrato che l'uso di un sistema EVHP ha il potenziale per migliorare la rianimazione dei cuori precedentemente considerati non trapiantabili23,24. È interessante notare che il sistema EVHP clinicamente disponibile valuta la vitalità cardiaca solo utilizzando misurazioni seriali del lattato8,23. Le misurazioni lattati non sono correlate alle prestazioni cardiache dei cuori DCD24,25, quindi sono necessarie misurazioni aggiuntive per valutare la capacità di trapianto. Questa configurazione sperimentale consente una valutazione funzionale completa, comprese le pressioni generate e le misurazioni della contrattinalità miocardiale, tra cui i valori di dP/dT e –dP/dT, consentendo una valutazione più approfondita della funzione cardiaca prima del trapianto finale decisione. Inoltre, le misurazioni della troponina cardiaca, un marcatore di danno miocardico direttamente correlato alla dimensione ischemica infarto26e il rilascio cinetico sono correlati alla portata dell'ischemia cardiaca in un sistema di ischemia/reperfusione di Langendorff. In particolare, con tempi ischemici lunghi (60 min), i livelli di troponina vengono mantenuti dopo 1 h di reperconi, mentre l'LDH e la creatinina lacinare diminuiscono significativamente e non sono correlati all'entità del danno cardiaco27,28, quindi l'uso di misure di troponina seriale garantisce una valutazione completa della vitalità degli organi prima del trapianto. Una delle principali variabili di confusione nella valutazione funzionale cardiaca è la frequenza cardiaca. La frequenza cardiaca spontanea è inversamente correlata alla lunghezza dell'ischemia29,e la frequenza cardiaca è direttamente correlata con il dP/dt nei cuori di ratto isolati30 e nei modelli animali31. È interessante notare che, nel lavoro recentemente pubblicato su modelli di roditori di cuori DCD e condizionamento EVHP, il ritmo non è stato utilizzato e tassi cardiaci sono stati variabili e registrati nei loro protocolli15,18,20. Per mantenere la frequenza cardiaca fisiologica, il ritmo è stato utilizzato una volta che il cuore aveva recuperato la contrazione ritmica. La frequenza prescelta 300 bpm è simile a quella dei ratti sani e non stressati32.
Limitazioni di questo protocollo includono l'uso di anestetico volatile per l'induzione. Questi agenti hanno dimostrato di conferire il precondizionamento ischemico33. Tuttavia, il breve tempo di uso anestetico inalato non ha avuto alcun effetto osservabile in questo protocollo e disfunzione miocardiale progressiva è stato ancora notato con l'aumento WIT. L'uso della cardioplegia normotermica può anche essere visto come una limitazione. L'uso della cardioplegia normotermica consente una traduzione ottimale dalle condizioni in vitro utilizzate per lo sviluppo di agenti di condizionamento farmacologico, poiché le cellule sono di solito mantenute a 37 gradi centigradi. Tuttavia, in questa configurazione la temperatura di cardioplegia può essere facilmente regolata in base alle esigenze dello sperimentatore. D'altra parte, l'uso di una preparazione Langendorff rispetto a una preparazione del cuore di lavoro per il ricondizionamento potrebbe anche essere visto come una limitazione. La preparazione del cuore di lavoro consente la registrazione continua di un loop pressione/volume12,15, con pre e post-carico controllati, consentendo una completa valutazione funzionale. Il vantaggio principale di una preparazione Langendorff è che mantiene una pressione aortica e perfusione costante, soprattutto durante la riperfusione iniziale, quando la pressione generata è minima. Inoltre, la configurazione della valutazione è più semplice per il cuore Langendorff rispetto a una preparazione del cuore di lavoro. Tuttavia, questa configurazione può essere convertita in una preparazione del cuore di lavoro, se lo riterranno necessario. In alternativa, il rianimazione cardiaco può essere eseguito in situ utilizzando perfusione regionale norma, con prestazioni cardiache misurate direttamente dall'uso di un catetere Millar34, consentendo un'emodinamica completa e miocardiale funzionale valutazione prima dell'approvvigionamento degli organi. Nell'uomo, sia in situ che in ex vivo strategie di ricondizionamento sono state descritte6, quindi lo sviluppo di entrambi i modelli consente confronti sperimentali che possono tradursi in ottimizzazione della pratica clinica. Infine, le piccole dimensioni e l'alta frequenza cardiaca di questo modello animale possono essere considerate come una limitazione a causa delle potenziali difficoltà tecniche osservate durante l'esecuzione di questi esperimenti e delle inevitabili differenze fisiologiche tra ratto e cuore umano. Se la valutazione EVHP è già standardizzata, un ricercatore può avere familiarità con questa tecnica eseguendo solo 3 esperimenti. D'altra parte, l'uso di questo piccolo modello animale consente un comodo screening a un costo ragionevole, riservando modelli animali più grandi e più costosi come il modello di suine, a terapie ad alto potenziale traslazionale umano.
In conclusione, il protocollo qui descritto tiene conto delle migliori pratiche derivanti da diversi gruppi alla ricerca dei cuori d'DCD. Questo protocollo consente il pieno controllo della WIT, consentendo una valutazione strutturale e funzionale completa delle strategie di trattamento del condizionamento cardioprotettivo nei ratti. Questo protocollo può essere aggiornato e trasferito a grandi modelli animali, consentendo di tradurre i risultati della ricerca in realtà clinica e, in ultima analisi, consentendo lo sviluppo di nuove terapie che aumentano la qualità e la disponibilità di organi salvavita molto necessari Pazienti.
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Disclosures
Gli autori non segnalano alcun interesse proprietario o commerciale in qualsiasi prodotto menzionato o concetto discusso in questo articolo.
Acknowledgments
Parti di questo lavoro sono state sostenute da un generoso contributo della Fondation Marcel et Rolande Gosselin e della Fondation Mr Stefane Foumy. Nicolas Noiseux è studioso del FRQ-S.
Gli autori desiderano ringraziare Josh Ehuo Le Huang, Gabrielle Gascon, Sophia Ghiassi e Catherine Scalabrini per il loro sostegno nella raccolta dei dati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride. 1 L bag | Baxter | Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system. | |
| 14 G 2" I.V catheter | Jelco | 4098 | To act as endotracheal tube. |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Milipore-Sigma | T8877 | Vital coloration |
| 22 G 1" I.V catheter | BD | 383532 | I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization |
| Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr | Skalar | 50-3147 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" | Skalar | 22-9027 | Tissue retractor used to maintain the chest open. |
| Bridge amp | ADinstruments | FE221 | Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement |
| Calcium chloride | Milipore-Sigma | C1016 | CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution |
| D-(+)-Glucose | Milipore-Sigma | G8270 | D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| DIN(8) to Disposable BP Transducer | ADinstruments | MLAC06 | Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer |
| Disposable BP Transducer (stopcock) | ADinstruments | MLT0670 | Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | Electrolyte solution without calcium or magnesium. |
| Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" | Skalar | 66-2740 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Milipore-Sigma | HT501128 | Fixative solution |
| Heating Pad | Sunbean | 756-CN | |
| Heparin sodium 1,000 UI/mL | Sandoz | For systemic anticoagulation | |
| Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% | Fisher scientific | A144-500 | Diluted 1:1 for pH correction |
| Ketamine | Bimeda | Anesthetic. 100 mg/mL | |
| LabChart | ADinstruments | Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled | |
| Left ventricle pressure balloon | Radnoti | 170404 | In latex. Size 4. |
| Lidocaine HCl 2% solution | AstraZeneca | Antiarrhythmic for the cardioplegic solution | |
| Magnesium Chloride ACS | ACP Chemicals | M-0460 | MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Micro pressure sensor | Radnoti | 159905 | Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon |
| Pacemaker | Biotronik | Reliaty | Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm. |
| pH bench top meter | Fisher scientific | AE150 | |
| Physiological monitor | Kent Scientific | Physiosuite | For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure |
| Plasma-Lyte A | Baxter | Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia | |
| Potassium Chloride | Milipore-Sigma | P4504 | KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Potassium Chloride 2 meq/ml | Hospira | Part of the cardioplegic solution | |
| PowerLab 8/30 Polygraph | ADinstruments | Electronic polygraph | |
| Silk 2-0 | Ethicon | A305H | Suture material for Langendorff apparatus |
| Silk 5-0 | Ethicon | A302H | Suture material for carotid |
| Small animal anesthesia workstation | Hallowell EMC | 000A2770 | Small animal ventilator |
| Sodium bicarbonate | Milipore-Sigma | S5761 | NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Chloride | Milipore-Sigma | S7653 | NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Hydroxide pellets | ACP chemicals | S3700 | Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction |
| Sodium phosphate monobasic | Milipore-Sigma | S0751 | NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" | Skalar | 22-1240 | Small scisors for atria and cava vein opening |
| Tissue slicer blades | Thomas scientific | 6727C18 | Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol |
| Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" | CardinalHealth | 8881511235 | For heparin injection |
| Veterinary General Surgery Set | Skalar | 98-1275 | Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps |
| Veterinary Micro Set | Skalar | 98-1311 | Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening |
| Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system | Radnoti | 120101BEZ | Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock |
| Xylazine | Bayer | Sedative. 20 mg/mL |
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