Summary
Этот протокол показывает простой и гибкий подход к оценке новых кондиционирующих агентов или стратегий для повышения осуществимости сердечного донорства после смерти кровообращения.
Abstract
Спрос на пересадку сердца растет; тем не менее доступность органов ограничена из-за нехватки подходящих доноров. Донорство органов после смерти кровообращения (DCD) является решением для решения этой ограниченной доступности, но из-за периода длительной теплой ишемии и риск повреждения тканей, его регулярное использование в трансплантации сердца редко видели. В этой рукописи мы предоставляем подробный протокол, тесно имитирующий современные клинические практики в контексте DCD с непрерывным мониторингом функции сердца, что позволяет оценить новые кардиопротекторные стратегии и вмешательства, чтобы уменьшить ишемия-реперфузионная травма.
В этой модели, протокол DCD инициируется в анестезируется Льюис крыс, остановив вентиляцию, чтобы вызвать кровообращение смерти. Когда систолическое кровяное давление опускается ниже 30 мм рт. 00, инициируется теплое ишемическое время. После предустановленного теплого ишемического периода сердца промывают сяртом кардиоплегический раствор, закупаются и устанавливаются на систему перфузии сердца Langendorff ex vivo. После 10 минут первоначального реперфузии и стабилизации, восстановление сердца постоянно оценивается в течение 60 минут с помощью внутривенного мониторинга давления. Травма сердца оценивается путем измерения сердечного тропонина T и размер инфаркта количественно гистологического окрашивания. Теплое ишемическое время можно модулировать и адаптировать для разработки желаемого количества структурных и функциональных повреждений. Этот простой протокол позволяет оценить различные кардиопротекторные стратегии кондиционирования, введенные в момент кардиоплегии, начального реперфузии и/или во время перфузии ex vivo. Выводы, полученные из этого протокола, могут быть воспроизведены в больших моделях, облегчающих клинический перевод.
Introduction
Твердая трансплантация органов в целом и пересадка сердца,в частности, находятся на подъеме во всем мире 1,2. Стандартным методом закупки органов является донорство после смерти мозга (DBD). Учитывая строгие критерии включения DBD, менее 40%предлагаемых сердец принимаются 3, тем самым ограничивая предложение в условиях растущего спроса и расширения списка ожидания органа. Для решения этой проблемы, использование органов, пожертвованных после смерти кровообращения (DCD) считается потенциальным решением4.
В DCD доноров, однако, агональный этап после отмены ухода и период незащищенной теплой ишемии до реанимации неизбежны5. Потенциальная травма органа после смерти кровообращения может привести к дисфункции органов, объясняя нежелание регулярно принимать DCD трансплантации сердца. Сообщается, что только 4 центра используют DCD сердца клинически, с строгими критериями, которые включают в себя очень короткие теплые времена ишемии и молодых доноров без хронических патологий6,7. По этическим и юридическим причинам, ограниченные или не кардиопротекторные вмешательства могут быть применены к донорам до смерти кровообращения5,8,9. Таким образом, любое смягчение, чтобы облегчить ишемию реперфузии (ИК) травмы ограничивается кардиопротекторных терапии, начатой во время раннего реперфузии с кардиоплегическими решениями, и не позволяют для надлежащей функциональной оценки. Ex vivo перфузии сердца (EVHP) и восстановление сердца DCD с использованием специальных платформ была предложена в качестве альтернативного решения и изучены различными учеными10,11,12,13 . EVHP предлагает уникальную возможность доставить пост-кондиционирования агентов DCD сердца для улучшения функционального восстановления. Однако для эффективного клинического перевода многие технические и практические вопросы еще предстоит решить, и это еще больше усугубляется отсутствием консенсуса по целому ряду перфузии и функциональных критериев для определения трансплантируемости6, 8.
В этом мы сообщаем о разработке воспроизводимого доклинического протокола DCD с первичным малым животным в сочетании с системой перфузии сердца ex vivo, которая может быть использована для исследования органов после кондиционирования, начатого во время закупок, во время первоначального реперфузии, и /или по всему EVHP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы по уходу за животными и экспериментальные протоколы соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Центра Hospitalier de l'Universit' de Montr'al Research Center.
1. Предварительная подготовка
- Включите водяную ванну, чтобы нагреть систему доставки кардиоплегии(рисунок 1A)и систему перфузии Ex vivo Langendorff (рисунок1B). Установите температуру воды до 38,5 градусов по Цельсию при температуре раствора 37 градусов по Цельсию. Настройка фотографии можно увидеть в дополнительной рисунок 1A, B.
- Приготовьте 1 л кардиоплегического раствора. Добавьте 1 мл 2% гидрохлорида лидокаина и 10 мл 2 мм ККл (окончательная концентрация 20 мМ) к 1 л плазменно-лита А (140 мМ Н, 5 мМ К, 1,5 мм Мм Мг, 98 мм Хл, 27 мм ацетата, 23 мм глюконата). Правильный рН до 7,4 с помощью 6 N HCl.
ПРЕДЕКТО: Эта модель очень чувствительна к рН. Неправильная коррекция рН (вне физиологического диапазона 7,3-7,4) или нестабильные растворы pH могут поставить под угрозу эксперимент или предоставить ненадежные данные. - Подготовьте 4 l решения Krebs (113 мм NaCl, 4,5 мм KCl, 1,6 мМ2PO4, 1,25 мм CaCl2, 1 мМ ММ МГКл26H2O, 5,5 мМ D-Глюкоза, 25 мм NaHCO3). Массы субстрата на 1 л раствора должны быть следующими: 6,1 г NaCl, 0,3355 г KCl, 0,2035 г MgCl2No6H2O, 0,192 г2PO4, 0,1387 г CaCl2, 0,99 г D-Глюкозы, 2,1 г NaHCO3 , окончательный объем 1 л в ультрачистой деионизированной воде. Добавить NaHCO 3 последнее, чтобы избежать осадков. Отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм и храните его на ночь. Исправить рН до 7,4, когда решение находится на 37 градусов по Цельсию и пузырь с 5% CO2/95% O2.
- Заполните схему Langendorff раствором Krebs и запустите системный насос. Убедитесь, что пузырьки не остаются внутри трубки. Отрегулируйте скорость перистальтической насоса до 80 об/мин (эквивалент 1 л/мин). Используя двухсторонний стоп петух, настроить поток для поддержания медленного капельного через аорты канюли, пока сердце не прилагается(Рисунок 1B). Держите образец раствора Кребса (15 мл) в конической трубке 50 мл на льду для транспортировки сердца.
- Заполните систему доставки кардиоплегии кардиоплегическим раствором. После того, как пузыри удаляются, переключите схему на солин с помощью 3-способа остановить петух(рисунок 1A). Отрегулируйте скорость капельного произвока. Солин должен медленно капать с кончика катетера, чтобы гарантировать, что ни один кардиоплегический раствор не вводится до смерти животного.
2. Подготовка животных
- Используя ингаляционную камеру, индуцировать анестезию с 3% изолюран. После того, как животное не реагирует, выполнить интраперитонеальной инъекции кетамина (75 мг/кг) и ксилазин (5 мг/кг) или аналогично подходящий анестезии, в соответствии с местными правилами, для поддержания анестезии для остальной части процедуры. Обеспечьте глубину анестезии без реакции на щепотку и пальпебральный рефлекс.
- Интубировать животное с помощью 14 G, 2-дюймовый катетер I.V. Начало вентиляции при 50 вдохах на мин, при этом давление в дыхательных спуске ограничено 20 см2О.
- Поместите животное на грелку, установленную на "среднюю" и накройте абсорбирующим колодкой для поддержания температуры тела. Вставьте ректальный зонд температуры и прикрепите датчик предермального импульса оксиметра к одной из ног. Поддерживайте ректальную температуру при температуре 37 градусов по Цельсию на протяжении всей процедуры.
-
Сосудистый доступ
- Сделайте разрез кожи средней линии от 3 до 4 см в шее ножницами. Используя тупые кончики изогнутых ножницами, тупо вскрыть подкожную ткань и разоблачить правую стерноиоидную мышцу. Использование не травматических щипцов, двигаться мышцы боковой до правой сонной артерии (пульсирующая), яремной вены (не пульсирующий) и блуждающий нерв (белый) визуально определены(Дополнительная рисунок 2A). Тщательно отделите блуждающий нерв от сонной артерии с помощью тупых кончиков изогнутых ножниц.
- Вводят гепарин (2000 МЕ/кг) через правую яремную вену. Применить давление на место инъекции после иглы опрокидки, чтобы избежать утечки крови.
- Используя изогнутые щипцы, пройдите два 5-0 шелковых швов вокруг сонной артерии. Твердо прикрепите дистальный шов, чтобы зафиксировать сонную артерию при верхнем аспекте открытой артерии. Держите проксимальный шов развязанным. Тяговая проксимального шва будет использоваться для контроля кровотечения на следующем этапе(Дополнительная рисунок 2B). Расстояние между швами должно составить около 2 см.
- Используя стереомикроскоп для лучшей визуализации, тщательно сделайте разрез 1 мм ножницами на передней стенке сонной артерии. Вставьте 22 G, 1-дюймовый закрытый катетер I.V. к аорте арки. Катетер подключен к 2 способ остановки петух, что позволяет подключение к преобразователю давления для постоянного мониторинга, с возможностью введения сосудили или кардиоплегии через систему доставки кардиоплегии (Рисунок 1A).
3. Инициирование сердечного донорства после сердечной смерти (DCD) Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Полную хронологию протокола можно увидеть на рисунке 2.
- Re-asses анестезии глубины, выполняя щепотку ног и оценки palpebral рефлекс. Если реакция наблюдается, выполнить интраперитонеальный инъекции кетамина (37,5 мг/кг) и ксилазина (2,5 мг/кг). Переоценить через 5 минут. Если ответа не наблюдается, продолжайте процедуру. Трахеальный зажим должен выполняться только у адекватно обезболиваенных животных.
- Выключите вентилятор и extubate животное. Использование комаров щиптем, зажим трахеи. Этот момент рассматривается как начало агональной фазы. Начните считать функциональное теплое ишемическое время (WIT), когда пик систолического кровяного давления падает ниже 30 мм рт. ст., или если появляется асистолия или фибрилляция желудочков, все, что приходит первым (Рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер ущерба должен быть пропорционален WIT. Эксперименты необходимы для оптимизации времени WIT в соответствии с анестезией используется, животное штамм, пол и вес выбран. В контроль животных, сразу же после сонных сосудистых доступ обеспечивается, кардиоплегия вводится и сердце закупается, как описано в следующем шаге (Рисунок 2). Начало перфузии с кардиоплегией считается концом WIT. - В конце WIT, выполнить медиаль стернотомии. Держите грудную клетку открытой с помощью втягивающего втягивающего элемента Alm. Используя ножницы, откройте нижнюю полиа вены и оба предплеции, чтобы избежать разгрузки миокарда или рециркуляции кардиоплегии (дополнительная цифра 3). Зажим аорты над диафрагмой. Через ранее катетеризированную сонотидную артерию, настоять кардиоплегический раствор при постоянном давлении 60 мм рт. ст. с помощью системы доставки кардиоплегии. Давление инфузии можно изменить, изменив высоту водного столба.
- В конце кардиоплегического инфузии, вскрыть восходящую проксимальную аорту из легочной артерии с помощью изогнутых щипц(Дополнительная диаграмма 4A). Отрежьте аорту дисталь в левую подклавианальную артерию. Обеспечьте длину аорты не менее 0,5 см для каннулирования для аппарата Langendorff.
- Удерживая сердце от аорты, завершить кардиэктомии, отделяя сердце от легочных вен и других грудных структур(Дополнительная рисунок 4B). Быстро погрузите сердце в ледяной раствор Кребса для быстрой транспортировки в систему ex vivo. Держите вскрытие и время транспортировки как можно меньше (5 мин).
4. Ex Vivo сердце перфузии системы (EVHP) и сердечной функциональной оценки
- Откройте просвет аорты с помощью щипцы. Побили аорту, заполнив просвет капающим раствором Кребса, чтобы избежать заставить пузырьки в коронарные сосуды. Опустите канюль в аорту, заботясь, чтобы не пройти корень аорты или повреждения аортальных клапан листовок. Исправить установку с небольшим зажимом.
- Используя 2-способ стопкок, увеличить поток для поиска возможных утечек в аорте. Если ни один не обнаружен, плотно исправить аорты к канюле с помощью 2-0 шелковый шов. Полностью откройте поток к канюле. Поддержание аортального давления при физиологическом давлении 60-70 мм рт. см (с поправкой на изменение высоты системы). В этот момент инициируется начальное время реперфузии и стабилизации. Давление аорты может быть изменено в соответствии с экспериментальным планом следователя.
- Поверните сердце, чтобы основа сердца (атрии) стояла перед датчиком давления. Расширьте левожелудочковое отверстие предсердий, рассекая легочные вены. Вставьте латексный шар, подключенный к датчику давления. Убедитесь, что воздушный шар полностью расположен внутри желудочка путем визуального осмотра. Медленно заполните шарик солевой раствор до конца диастолического давления (EDP) установлен до 15 мм рт. ст. Отрегулируйте по мере необходимости, чтобы сохранить постоянный EDP (предопределенный физиологический EDP). EDP может быть скорректирован в соответствии с экспериментальными целями каждого исследователя.
- Вставьте темпэлектрода в переднее лицо сердца (правый желудочковый отток тракта). Избегайте прокалывающих коронарных сосудов. Как только спонтанное избиение наблюдается, инициировать ходить на 300 ударов в минуту. Требуемое напряжение может варьироваться между экспериментами и крысиных штаммов.
- После 10 минут стабилизации инициируйте непрерывную внутривенную запись измерения давления. Этот момент считается началом этапа восстановления и оценки (время 0), который будет длиться 1 ч(рисунок 2). Восстановление может быть длительным, но во всех сердцах ожидается временное снижение контрактности.
- В начале восстановления, собирать сердечные стоки снижается из сердечных вен в течение 5 минут для базовой оценки коронарного потока и биохимических анализов. Для тропонина T повторить каждые 15 минут (время 0, 15, 30, 45 и 60 мин). Для других анализов необходима индивидуализация времени сбора (Рисунок 2).
5. Конец опыта
- Удалить сердце из аппарата Langendorff.
- Используя прямое высокоуглеродное стальное лезвие (микротомное лезвие или подобное), удалите основание сердца (включая аорту и легочную артерию).
- С правой желудочка лицом вниз, сократить поперечные желудочковые горки 1-2 мм толщиной. В одном репрезентативном разделе (обычно третий) выкрепите правый желудочек и заморозьте левый желудочек. Этот образец может быть использован для биохимического анализа.
- Погрузите оставшиеся секции в свежеприготовленный 5%, 2,3,5-трифенил-тетразолий хлорид в коммерческих фосфатных буферных солен овый рН 7,4 в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия. Жизнеспособные ткани окрашены в красный кирпич.
- Вымойте дважды фосфат буфера соливой рН 7,4 и исправить с 10% формалин на 4 кв к в одночасье. Вымойте дважды с фосфатами буферных солен рН 7,4 и держать каждый ломтик погружен.
- Снимите лишнюю жидкость и вескаждого слайда. Возьмите цифровые цветные изображения с обеих сторон. Используйте планиметрические анализы для расчета процента размера инфаркта и правильного для среза и общего веса желудочков. Окраска исчезает со временем. Фотографии должны быть сделаны как можно скорее.
6. Анализ данных
- Сохраните все данные о давлении в новом файле на одно животное.
- Для анализа давления выберите не менее 200 циклов давления на временные точки. Анализ может быть выполнен в автономном режиме (после завершения эксперимента) с использованием специального программного обеспечения (т.е. LabChart). Общие сердечно-сосудистые параметры доступны включают в себя: Максимальное генерируемое давление, конец диастолического давления, здП/дт (самый крутой склон во время подъема кривой давления, индикатор желудочковой контрактильной способности), -dP/dt (самый крутой склон во время вниз кривой давления, индикатор релакса релакса) среди других.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа тропонина ожидается увеличение высвобождения тропонина при реперфузии. После 1 ч реперфузии в системе EVHP уровень тропонина может снизиться до базового уровня, подчеркивая необходимость тщательного времени в сборе и обработке этих образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После экстубации, кровяное давление быстро падает в предсказуемой картины(Рисунок 3). Ожидаемое время до смерти составляет менее 5 мин.
На рисунке 4 показана средняя кривая давления/времени в начале восстановления после 0, 10 и 15 минут WIT. Со временем функция контрактила улучшится. Использование коротких периодов WIT позволит контрактности вернуться к нормальной жизни, и морфологические повреждения не будут обнаружены(Рисунок 5 и рисунок 6).
Доказательство концепции использования кондиционирования агента, добавленного с кардиоплегией и на этапе стабилизации показывают, что ущерб, генерируемый 15 мин WIT в этой модели поддаются модуляции кардиопротекторных агентов (Рисунок 4, Рисунок 5 и Рисунок 6).
Рисунок 1: Необходимые схемы оборудования. Минимальные требованияк системе доставки кардиоплегии ( A) и a (B) Langendorff ex vivo системы перфузии сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Хронология протокола. Хронология с момента экстубации до конца протокола. У контрольных животных кардиоплегия инициируется без ДЦД или теплого ишемического времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Интракаротидное кровяное давление/участок времени. Типичная эволюция внутрикаротидного кровяного давления после экстубации. Теплый ишемия время звезды, когда пик систолического кровяного давления падает ниже 30 мм рт. ст., или если асистолы или фибрилляции желудочков появляется, что приходит в первую очередь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Ex vivo средний бить-бить желудочковой кривой времени давления. Изображение, полученное из анализа данных, полученных после 10 мин стабилизации и перфузии (время 0 в рисунке 2) с или без использования экспериментального фармакологического кардиопротекторного кондиционирования агента. Ишемическое время относится к теплым ишемическим временам (ВИТ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Восстановление Ex vivo и функциональный анализ. (A) Непрерывная кривая давления желудочка после 10 мин стабилизации и перфузии с или без использования экспериментального фармакологического кардиопротекторного кондиционирующего агента. Стрелки показывают артефакты из-за ручной модификации EDP. (B) Максимальная (здП/дт) и минимальная (-dP/dt) скорость изменения давления в LV против графика времени, полученного из (A), показывая временно-зависимое улучшение контрактности без лечения (зеленая линия). Короткие WIT (красная линия) или обработанные (желтые) сердца показывают рисунок, похожий на контрольную группу (синяя линия). Точки данных являются средним и средним, по крайней мере, 200 индивидуальных ударов. Бары показывают стандартную ошибку среднего значения каждой точки данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: 2,3,5-Трифенил-тетразолий хлорид окраски в конце экспериментов. Инфарктная область наблюдается после различных теплых ишемических времен (ВИТ) и использования фармакологического кардиопротекторного кондиционирующего средства. Кирпич красный: жизнеспособная ткань. Светло-желтый: нежизнеспособная ткань. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная диаграмма 1: Настройка фотографии. (A) Фотография, показывающая установку для системы доставки кардиоплегии. Номерное оборудование соответствует: кардиоплегия контейнер (1), пузырь ловушка (2), датчик давления и катетер (3), перистальтический насос (4), полиграф подключен к датчику давления (5) и небольшой вентилятор животных (6). (B) Фотография, показывающая установку для системы перфузии сердца Langendorff ex vivo. Номерное оборудование соответствует: Контейнер Perfusate (1), контейнер кондиционирования агента (2) и сердечная камера (3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная рисунок 2: вскрытие шеи. (A) Фотография, показывающая открытые яремной вены (стрелка) до инъекции гепарина. (B) показывает расчлененную сонную артерию (стрелку) с швами, помещенными для контроля кровотечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная рисунок 3: Открытие предприимчивого отверстия для предотвращения рециркуляции. (A) Фотография, показывающая открытие левого предсердного придатка (1). На заднем плане аорта (2) зажата над диафрагмой (3). (B) Показывает открытие правого предсердного придатка (1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 4: Закупка сердца. (A) Фотография, показывающая использование изогнутых щипц для разделения аорты (стрелка) и легочной артерии. (B) Фотография, показывающая сердечное вскрытие и закупки. Сердце держита аорта с помощью щипц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь протокол вводит простую, удобную и универсальную модель сердечного DCD, предлагающую возможность оценить сердечное функциональное восстановление, повреждение тканей и использование посткондиционирующих кардиопротекторных средств для улучшения восстановления донора сердца в противном случае отбрасываются для трансплантации. Системы перфузии сердца Ex vivo (EVHP) были оптимизированы, чтобы обеспечить платформу для оценки сердечной функции и предложить уникальную возможность доставить и протестировать модифицированные решения, дополненные апфармакологическими агентами после кондиционирования сохранить и отремонтировать DCD сердца в малых15 и крупных животных16,17 моделей сердечного DCD. Тем не менее протоколы часто недостаточно детализированы и не всегда клинически актуальны, что затрудняет клинический перевод.
В области моделей DCD, модели ex vivo DCD, как описано Sanz18, не имеют агональной фазы. Путем индуцировать остановку сердца путем останавливать механическую вентиляцию, симпатическая нервная система overactivated, водя к «шторму catecholamine»19. Это увеличение катехоламинов изменяет характеристики донорских органов, и было связано со снижением функционального статуса экспериментальных органов DCD19. Кроме того, постепенное снижение функции до асистолии приводит к правой желудочковой растяжения и последующей травмы. В нашем протоколе мы индуцировали смерть в кровеносном веществе с помощью клинически релевантной модели удушья, которая поддерживает эти реакции.
В литературе описаны две основные модели in vivo cardiac DCD: открытая грудь15 и закрытая грудь20 моделей. Сердечная физиология изменяется открытым подходом грудной клетки за счет уменьшения механического взаимодействия легких/сердца и предварительной нагрузки. Кроме того, в открытых процедурах грудной клетки, потеря тепла тела ускоряется, что еще больше влияет на функциональные исходы21. Поэтому предпочтительнее поддерживать закрытый подход грудной клетки, предотвращающий потерю тепла. Еще одно уточнение заключается в том, чтобы свести к минимуму изменчивость времени для смерти кровообращения. Kearns et al. сообщили, что время до смерти (время непульсиального или среднего кровяного давления менее 30 мм рт. ст.) составляло от 3 до 11 мин. В 10 и 20 мин WIT, 40% и 60% сердец не восстановить функцию, соответственно, на ex vivo рабочего аппарата сердца, что делает интерпретацию данных более трудным15. Альтернативой сокращению времени смерти от кровообращения является использование паралитических средств20; тем не менее, некоторые данные указывают на прямое сердечное воздействие векурония, из-за его воздействия на симпатической и парасимпатической иннервации22. Чтобы повысить воспроизводимость, мы выбрали для трахеи зажима, в сочетании с точной артериальной мониторинга давления, что позволяет более однородной агональной времени (злт;5 мин). Известно, что повреждение органов начинается до момента смерти кровообращения; с некоторыми авторами рассматривает отсечение систолического кровяного давления ниже 50 мм рт. ст. в начале функционального WIT6, объясняя нежелание трансплантации органов после длительного периода формы снять жизни поддерживающих мер до реперфузии. В этом протоколе, определение WIT используется следует текущей экспериментальной стандарт15, тем не менее, дальнейшие исследования необходимы для уточнения точного набора гемодинамических параметров, которые отмечают индукции повреждения органов в целях улучшения WIT расчета, таким образом, предлагая более подробную информацию для клинической практики.
Вливание кардиоплегического раствора при постоянном физиологическом давлении и температуре дает уникальную возможность инициировать кондиционирование сердца и защиту тканей любым фармакологическим агентом или другими средствами. Технические усовершенствования включают зажим грудной аорты, ограничение перфузии в сердце и тем самым уменьшение количества раствора, необходимого для каждого эссе. Как только сердце находится в системе EVHP, необходима стандартизированная функциональная оценка. Было показано, что использование системы EVHP имеет потенциал для улучшения реанимации сердца ранее считается не трансплантируемых23,24. Интересно, что клинически доступная система EVHP оценивает жизнеспособность сердца толькос помощью серийных измерений лактата 8,23. Лактатные измерения не связаны с сердечной работоспособностью DCD сердца24,25, таким образом, необходимы дополнительные измерения для оценки трансплантируемости. Эта экспериментальная установка позволяет провести полную функциональную оценку, включая генерируемое давление и измерения контрактности миокарда, включая измерения сотруднительной работы, включая «dP/dT» и «dP/dT», что позволяет проводить более тщательную оценку сердечной функции до окончательной трансплантации решение принято. Кроме того, измерения сердечного тропонина, маркер повреждения миокарда непосредственно коррелирует с ишемической инфарктразмер 26, и выпустить кинетики связаны с степенью сердечной ишемии в системе ишемии Langendorff / реперфузии. В частности, с длительным ишемическим временем (60 мин), уровни тропонина поддерживаются после 1 ч реперфузии, в то время как LdH и креатинина киназы значительно уменьшаются, и не связанных с степенью повреждения сердца27,28, таким образом, использование серийных мер тропонина обеспечивает полную оценку жизнеспособности органов перед пересадкой. Основным смешанным переменным в сердечной функциональной оценки является частота сердечных приступов. Спонтанный пульс обратно связан с длиной ишемии29, и частота сердечных приступов непосредственно коррелирует с ЗДП/ДТ в изолированных крысиных сердцах30 и в животных моделях31. Интересно, что в недавно опубликованных работах по моделям грызунов DCD сердца и EVHP кондиционирования, темп не был использован и сердечной ставки были переменными и зарегистрированы в своих протоколах15,18,20. Для поддержания физиологической частоты сердечных сокращений, темп был использован после того, как сердце восстановило ритмическое сокращение. Выбранная частота 300 bpm аналогична частоте здоровых, не напряженных крыс32.
Ограничения этого протокола включают использование летучих анестезии для индукции. Эти агенты были показаны, чтобы придать ишемической предки33. Тем не менее, короткое время вдыхания анестезии не было наблюдаемого эффекта в этом протоколе и прогрессивная дисфункция миокарда по-прежнему отмечается с увеличением WIT. Использование нормотермической кардиоплегии также можно рассматривать как ограничение. Использование нормоматерной кардиоплегии позволяет оптимально переделать из условий in vitro, используемых для развития фармакологических кондиционирования агентов, так как клетки, как правило, поддерживаются при 37 градусах Цельсия. Тем не менее, в этой установке кардиоплегия температура может быть легко регулируется в соответствии с требованиями следователя. С другой стороны, использование подготовки Langendorff по сравнению с рабочим сердцем подготовки к восстановлению также может рассматриваться как ограничение. Подготовка рабочего сердца позволяет непрерывно записывать цикл давления/объема12,15,с контролируемой преди- и послезагрузкой, что позволяет провести полную функциональную оценку. Основным преимуществом препарата Лангендорф является то, что он поддерживает постоянное давление аорты и перфузии, особенно во время первоначального реперфузии, когда генерируемое давление минимально. Кроме того, установка оценки проще для сердца Langendorff по сравнению с рабочим сердцем подготовки. Тем не менее, эта установка может быть преобразована в рабочую подготовку сердца, если сочтет это необходимым. Кроме того, сердечной реанимации может быть выполнена на месте с использованием нормомерного регионального перфузии, с сердечной производительности измеряется непосредственно с помощью катетера Millar34, что позволяет всеобъемлющего гемодинамического и миокарда функциональных оценка перед закупкой органов. У людей, как на месте, так и ex vivo стратегии восстановления были описаны6, таким образом, развитие обеих моделей позволяет экспериментальные сравнения, которые могут перевести в оптимизацию клинической практики. Наконец, небольшой размер и высокий частота сердечных сокращений этой модели животных может рассматриваться как ограничение из-за потенциальных технических трудностей, наблюдаемых при выполнении этих экспериментов, и неизбежные физиологические различия между крысами и человеческими сердцами. Если оценка EVHP уже стандартизирована, исследователь может быть ознакомен с этим методом, выполнив всего лишь 3 эксперимента. С другой стороны, использование этой модели малых животных позволяет удобный скрининг по разумной цене, резервирование больших и более дорогостоящих моделей животных, таких как свиная модель, для терапии с высоким человеческим переводным потенциалом.
В заключение, описанный здесь протокол учитывает лучшие практики, исходят от нескольких групп, исследующих сердца DCD. Этот протокол предоставляет полный контроль над WIT, что позволяет всеобъемлющую структурную и функциональную оценку кардиопротекторных стратегий лечения кондиционирования у крыс. Этот протокол может быть высококлассным и передан на крупные модели животных, что позволяет переводить результаты исследований в клиническую реальность и в конечном итоге позволяет разработать новые методы лечения, повышающие качество и доступность жизненно важных органов, столь необходимых Пациентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не сообщают о непривычной или коммерческой заинтересованности в каком-либо упомянутом продукте или концепции, обсуждаемой в этой статье.
Acknowledgments
Часть этой работы была поддержана щедрым вкладом Фонда Марселя и Роланда Госселина и Фонда г-на Стефана Фуми. Николя Noiseux является ученым ФРЗ-S.
Авторы хотели бы поблагодарить Джоша Чжуо Ле Хуанга, Габриэль Гаскон, Софию Гиасси и Катрин Скалабрини за поддержку в сборе данных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride. 1 L bag | Baxter | Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system. | |
| 14 G 2" I.V catheter | Jelco | 4098 | To act as endotracheal tube. |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Milipore-Sigma | T8877 | Vital coloration |
| 22 G 1" I.V catheter | BD | 383532 | I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization |
| Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr | Skalar | 50-3147 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" | Skalar | 22-9027 | Tissue retractor used to maintain the chest open. |
| Bridge amp | ADinstruments | FE221 | Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement |
| Calcium chloride | Milipore-Sigma | C1016 | CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution |
| D-(+)-Glucose | Milipore-Sigma | G8270 | D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| DIN(8) to Disposable BP Transducer | ADinstruments | MLAC06 | Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer |
| Disposable BP Transducer (stopcock) | ADinstruments | MLT0670 | Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | Electrolyte solution without calcium or magnesium. |
| Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" | Skalar | 66-2740 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Milipore-Sigma | HT501128 | Fixative solution |
| Heating Pad | Sunbean | 756-CN | |
| Heparin sodium 1,000 UI/mL | Sandoz | For systemic anticoagulation | |
| Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% | Fisher scientific | A144-500 | Diluted 1:1 for pH correction |
| Ketamine | Bimeda | Anesthetic. 100 mg/mL | |
| LabChart | ADinstruments | Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled | |
| Left ventricle pressure balloon | Radnoti | 170404 | In latex. Size 4. |
| Lidocaine HCl 2% solution | AstraZeneca | Antiarrhythmic for the cardioplegic solution | |
| Magnesium Chloride ACS | ACP Chemicals | M-0460 | MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Micro pressure sensor | Radnoti | 159905 | Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon |
| Pacemaker | Biotronik | Reliaty | Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm. |
| pH bench top meter | Fisher scientific | AE150 | |
| Physiological monitor | Kent Scientific | Physiosuite | For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure |
| Plasma-Lyte A | Baxter | Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia | |
| Potassium Chloride | Milipore-Sigma | P4504 | KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Potassium Chloride 2 meq/ml | Hospira | Part of the cardioplegic solution | |
| PowerLab 8/30 Polygraph | ADinstruments | Electronic polygraph | |
| Silk 2-0 | Ethicon | A305H | Suture material for Langendorff apparatus |
| Silk 5-0 | Ethicon | A302H | Suture material for carotid |
| Small animal anesthesia workstation | Hallowell EMC | 000A2770 | Small animal ventilator |
| Sodium bicarbonate | Milipore-Sigma | S5761 | NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Chloride | Milipore-Sigma | S7653 | NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Hydroxide pellets | ACP chemicals | S3700 | Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction |
| Sodium phosphate monobasic | Milipore-Sigma | S0751 | NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" | Skalar | 22-1240 | Small scisors for atria and cava vein opening |
| Tissue slicer blades | Thomas scientific | 6727C18 | Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol |
| Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" | CardinalHealth | 8881511235 | For heparin injection |
| Veterinary General Surgery Set | Skalar | 98-1275 | Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps |
| Veterinary Micro Set | Skalar | 98-1311 | Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening |
| Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system | Radnoti | 120101BEZ | Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock |
| Xylazine | Bayer | Sedative. 20 mg/mL |
References
- Gass, A. L., et al.
- von Dossow, V., Costa, J., D'Ovidio, F., Marczin, N. Worldwide trends in heart and lung transplantation: Guarding the most precious gift ever. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 31 (2), 141-152 (2017).
- Hornby, K., Ross, H., Keshavjee, S., Rao, V., Shemie, S. D. Non-utilization of hearts and lungs after consent for donation: a Canadian multicentre study. Canadian Journal Of Anaesthesia. 53 (8), 831-837 (2006).
- Manyalich, M., Nelson, H., Delmonico, F. L. The need and opportunity for donation after circulatory death worldwide. Current Opinion In Organ Transplantation. 23 (1), 136-141 (2018).
- Shemie, S. D., et al. National recommendations for donation after cardiocirculatory death in Canada: Donation after cardiocirculatory death in Canada. CMAJ : Canadian Medical Association Journal. 175 (8), S1 (2006).
- Page, A., Messer, S., Large, S. R. Heart transplantation from donation after circulatory determined death. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 75-81 (2018).
- Monteagudo Vela, M., Garcia Saez, D., Simon, A. R. Current approaches in retrieval and heart preservation. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 67-74 (2018).
- Dhital, K. K., Chew, H. C., Macdonald, P. S. Donation after circulatory death heart transplantation. Current Opinion In Organ Transplantation. 22 (3), 189-197 (2017).
- McNally, S. J., Harrison, E. M., Wigmore, S. J. Ethical considerations in the application of preconditioning to solid organ transplantation. Journal of Medical Ethics. 31 (11), 631-634 (2005).
- Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 16 (6), 667-673 (1997).
- Ramzy, D., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (10), 1665-1672 (2005).
- Xin, L., et al. A New Multi-Mode Perfusion System for Ex vivo Heart Perfusion Study. Journal of Medical Systems. 42 (2), 25 (2017).
- Messer, S., Ardehali, A., Tsui, S. Normothermic donor heart perfusion: current clinical experience and the future. Transplant International. 28 (6), 634-642 (2015).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). , Academic Press. 77-108 (2016).
- Kearns, M. J., et al. A Rodent Model of Cardiac Donation After Circulatory Death and Novel Biomarkers of Cardiac Viability During Ex vivo Heart Perfusion. Transplantation. 101 (8), e231-e239 (2017).
- Sandha, J. K., et al. Steroids Limit Myocardial Edema During Ex vivo Perfusion of Hearts Donated After Circulatory Death. The Annals of Thoracic Surgery. 105 (6), 1763-1770 (2018).
- Iyer, A., et al. Increasing the tolerance of DCD hearts to warm ischemia by pharmacological postconditioning. American Journal of Transplantation. 14 (8), 1744-1752 (2014).
- Sanz, M. N., et al. Cardioprotective reperfusion strategies differentially affect mitochondria:studies in an isolated rat heart model of donation after circulatory death (DCD). American Journal of Transplantation. , (2018).
- Van de Wauwer, C., et al. The mode of death in the non-heart-beating donor has an impact on lung graft quality. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 36 (5), 919-926 (2009).
- Quader, M., et al. Determination of Optimal Coronary Flow for the Preservation of "Donation after Circulatory Death" in Murine Heart Model. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs : 1992). 64 (2), 225-231 (2018).
- Priebe, H. J.
- Narita, M., et al. Cardiac effects of vecuronium and its interaction with autonomic nervous system in isolated perfused canine hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 19 (6), 1000-1008 (1992).
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet (London, England). 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Messer, S. J., et al. Functional assessment and transplantation of the donor heart after circulatory death. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (12), 1443-1452 (2016).
- White, C. W., et al. Assessment of donor heart viability during ex vivo heart perfusion. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93 (10), 893-901 (2015).
- Mayr, A., et al. Cardiac troponin T and creatine kinase predict mid-term infarct size and left ventricular function after acute myocardial infarction: a cardiac MR study. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33 (4), 847-854 (2011).
- Remppis, A., et al. Intracellular compartmentation of troponin T: release kinetics after global ischemia and calcium paradox in the isolated perfused rat heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (2), 793-803 (1995).
- Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff Perfused Isolated Mouse Heart Model of Global Ischemia-Reperfusion Injury: Impact of Ischemia and Reperfusion Length on Infarct Size and LDH Release. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).
- Dornbierer, M., et al. Early reperfusion hemodynamics predict recovery in rat hearts: a potential approach towards evaluating cardiac grafts from non-heart-beating donors. PloS One. 7 (8), e43642 (2012).
- Henry, P. D. Positive staircase effect in the rat heart. The American Journal of Physiology. 228 (2), 360-364 (1975).
- Markert, M., et al. Evaluation of a method to correct the contractility index LVdP/dt(max) for changes in heart rate. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 98-105 (2012).
- Azar, T., Sharp, J., Lawson, D. Heart rates of male and female Sprague-Dawley and spontaneously hypertensive rats housed singly or in groups. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (2), 175-184 (2011).
- Bonney, S., Hughes, K., Eckle, T.
- Ali, A. A., et al. Rat model of veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation. Journal of Translational Medicine. 12, 37 (2014).
