Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Pre-klinisk modell av CARDIAC donasjon etter sirkulasjonssystemet Death

Published: August 2, 2019 doi: 10.3791/59789
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 3, 1,4, 1,4
1Centre de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), 2Deparment of pharmacology and physiology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 3Division of Cardiovascular Surgery, Toronto General Hospital, University Health Network, 4Department of surgery, Faculty of Medicine, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen viser en enkel og fleksibel tilnærming for evaluering av nye condition agenter eller strategier for å øke muligheten for CARDIAC donasjon etter sirkulasjons død.

Abstract

CARDIAC transplantasjon etterspørselen er på vei oppover; Likevel er organ tilgjengelighet begrenset på grunn av en mangelen av egnede donorer. Organ donasjon etter sirkulasjons død (DCD) er en løsning for å løse dette begrenset tilgjengelighet, men på grunn av en periode med langvarig varme iskemi og risikoen for vevsskader, er dens rutine bruk i hjerte transplantasjon sjelden sett. I dette manuskriptet gir vi en detaljert protokoll som nøye etterligner dagens kliniske praksis i sammenheng med DCD med kontinuerlig overvåkning av hjertefunksjon, noe som åpner for evaluering av romanen Kardioprotektive strategier og intervensjoner for å redusere ischemia-reperfusion skade.

I denne modellen initieres DCD-protokollen i anesthetized Lewis-rotter ved å stoppe ventilasjonen for å indusere død i sirkulasjonssystemet. Når systolisk blodtrykk synker under 30 mmHg, den varme iskemiske tiden er igangsatt. Etter en pre-set varm iskemiske periode, hjerter spyles med en normothermic cardioplegic løsning, anskaffet, og montert på et Langendorff ex vivo hjerte-system. Etter 10 minutter med innledende reperfusion og stabilisering blir hjerte justering kontinuerlig evaluert i 60 min. ved bruk av intraventricular trykk overvåking. Et hjerte skade vurderes ved å måle CARDIAC Troponin T og infarkt størrelse er kvantifisert av histologiske farging. Den varme iskemiske tiden kan være modulert og skreddersydd for å utvikle ønsket mengde av strukturelle og funksjonelle skader. Denne enkle protokollen tillater evaluering av ulike Kardioprotektive condition strategier innført i øyeblikket av cardioplegia, innledende reperfusion og/eller under ex vivo. Funn innhentet fra denne protokollen kan reproduseres i store modeller, tilrettelegging klinisk oversettelse.

Introduction

Solid organ transplantasjon generelt og hjerte-transplantasjon, i særdeleshet, er på vei oppover over hele verden1,2. Standardmetoden for orgel anskaffelser er donasjon etter hjerne død (DBD). Gitt den strenge inkludering kriteriene for DBD, er mindre enn 40% av de tilbudte hjerter akseptert3, og dermed begrense tilbudet i møte med økende etterspørsel og utvide orgelet venteliste. For å løse dette problemet, bruk av organer donert etter sirkulasjons død (DCD) regnes som en potensiell løsning4.

I DCD-givere er imidlertid en agonal fase etter tilbaketrekking av omsorg og en periode med ubeskyttet varme iskemi før gjenoppliving uunngåelig5. Den potensielle organ skaden etter sirkulasjons død kan føre til organ dysfunksjon, forklarer motvilje mot å rutinemessig vedta DCD hjerte Sygehus. Det rapporteres at bare 4 sentre bruker DCD hjerter klinisk, med strenge kriterier som inkluderer svært korte varme iskemi ganger og unge donorer uten kroniske patologi6,7. For etiske og juridiske årsaker kan begrensede eller ingen Kardioprotektive intervensjoner anvendes i donorer før sirkulasjons død5,8,9. Således, alle begrensning å lindre det iskemi-reperfusion (IR) skaden er begrenset å Kardioprotektive terapeut innviet i løpet av tidlig reperfusion med cardioplegic løsninger, og tillater ikke for lated funksjonell vurderingen. Ex vivo hjerte-(EVHP) og overhaling av DCD-hjertet ved hjelp av dedikerte plattformer har blitt foreslått som en alternativ løsning og studert av ulike forskere10,11,12,13 . EVHP tilbyr en unik mulighet til å levere post-condition agenter til DCD hjerter for å forbedre funksjonell utvinning. For effektiv klinisk oversettelse gjenstår imidlertid mange tekniske og praktiske spørsmål, og dette blir ytterligere forsterket av manglende enighet om en rekke bruks-og funksjons kriterier for å fastslå transplantability6, 8i den.

Heri rapporterer vi utviklingen av en reproduserbar pre-klinisk liten type DCD-protokoll kombinert med et ex vivo hjerte-system som kan brukes til å undersøke organ post-condition initiert på tidspunktet for innkjøp, under innledende reperfusion, og /eller gjennom hele EVHP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr omsorg og eksperimentelle protokoller likedannet til guide for Stell og bruk av laboratorium dyr og ble godkjent av den institusjonelle dyr omsorg og bruk komité av Centre Hospitalier de l'Université de Montréal Research Center.

1. foreløpige forberedelser

  1. Slå på vannbadet for å varme opp cardioplegia leveringssystem (figur 1a) og Langendorff ex vivo-systemet (figur 1B). Sett vanntemperaturen til 38,5 ° c for en løsnings temperatur på 37 ° c. Oppsett fotografier kan ses i supplerende figur 1a, B.
  2. Forbered 1 L av cardioplegic løsning. Tilsett 1 mL 2% lidokain hydrochloride og 10 mL 2 mM KCl (siste konsentrasjon 20 mM) til 1 L av plasma-lyte A (140 mM na, 5 mM K, 1,5 mM mg, 98 mM CL, 27 mM acetate, 23 mM gluconate). Korriger pH til 7,4 med 6 N HCl.
    Forsiktig: Denne modellen er svært følsom for pH. En feil pH korreksjon (utenfor 7.3-7.4 fysiologiske område) eller pH ustabile løsninger kan kompromittere eksperimentet eller gi upålitelige data.
  3. Forbered 4 L av Krebs oppløsning (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH2PO4, 1,25 mm CaCl2, 1 mm MgCl2∙ 6H2O, 5,5 mm D-glukose, 25 mm NaHCO3). Substrat massene per 1 L av løsningen skal være som følger: 6,1 g NaCl, 0,3355 g av KCl, 0,2035 g av MgCl2∙ 6h2O, 0,192 g NaH2PO4, 0,1387 g av CaCl2, 0,99 g av D-glukose, 2,1 g av NaHCO3 , siste bind av 1 L i ultrarent deionisert vann. Legg til NaHCO 3 andre priser siste for å unngå nedbør. Filtrer løsningen med et 0,22 μm-filter og lagre over natten. Korriger pH til 7,4 når løsningen er ved 37 ° c og boble med 5% CO2/95% O2.
  4. Fyll Langendorff krets med Krebs løsning og starte systemet pumpen. Pass på at det ikke er bobler igjen inne i slangen. Juster peristaltisk pumpehastighet til 80 RPM (tilsvarer 1 L/min). Ved hjelp av toveis stopp kuk, justere flyten for å opprettholde en langsom drypp gjennom aorta kanyle til hjertet er festet (figur 1B). Oppbevar en prøve av Krebs oppløsning (15 mL) i et 50 mL kjeglesnitt rør på isen for hjerte transport.
  5. Fyll cardioplegia leveringssystem med den cardioplegic løsningen. Når boblene er fjernet, slå kretsen til saltvann ved hjelp av en 3-veis stopp kuk (figur 1a). Juster drypp raten. Saline må langsomt drypper fra spissen av kateteret for å sikre at ingen cardioplegic løsning injiseres før dyrets død.

2. Animal forberedelse

  1. Ved hjelp av et innånding kammer, indusere anestesi med 3% isoflurane. Når Dyret ikke svarer, utføre en intraperitoneal injeksjon av ketamin (75 mg/kg) og xylazine (5 mg/kg) eller tilsvarende egnet bedøvelse, etter lokale forskrifter, for å opprettholde anestesi for resten av prosedyren. Sikre dybden av anestesi uten reaksjon på tå knipe og palpebral refleks.
  2. Intubere dyret ved hjelp av et 14 G, 2-tommers IV-kateter. Start ventilasjon ved 50 pust per min, med luftveistrykk begrenset til 20 cmH2O.
  3. Plasser dyret på en varmepute satt til "medium" og dekk med en absorberende pute for å opprettholde kroppstemperatur. Sett inn en temperatur sonde for endetarmen og fest en Depot puls oximeter sensor til en av føttene. Oppretthold rektal temperatur ved 37 ° c gjennom hele prosedyren.
  4. Vaskulær tilgang
    1. Lag en 3 til 4 cm midtlinjen huden snitt i nakken ved hjelp av saks. Ved hjelp av Butt tip buet saks, stump analysere under Huds vevet og utsett høyre sternohyoidus muskelen. Ved hjelp av ikke traumatisk tang, flytte muskelen sideveis til høyre hals puls arterien (pulserende), hals vene (ikke-pulserende) og vagus nerve (hvit) er visuelt identifisert (supplerende figur 2a). Forsiktig skille vagus nerve fra hals puls arterien ved hjelp av Butt spissen buet saks.
    2. Injiser heparin (2 000 IE/kg) via høyre hals vene. Påfør Trykk på injeksjonsstedet etter nålen tilbaketrekking for å unngå blod lekkasje.
    3. Ved hjelp av buet tang, passerer to 5-0 silke sting rundt hals puls arterien. Fest en tett Sutur for å tette hals puls arterien i det overlegne aspektet av den eksponerte arterien. Hold proksimale Sutur ubundne. Trekking av proksimale Sutur vil bli brukt for blødning kontroll i neste trinn (supplerende figur 2b). Avstanden mellom sting skal være ca 2 cm.
    4. Ved hjelp av en stereomikroskopet for bedre visualisering, nøye lage en 1 mm snitt med mikrokirurgi saks over fremre vegg av hals puls arterien. Sett inn en 22 G, 1-tommers lukket IV kateter mot aorta buen. Kateteret er koblet til en toveis stopp kuk, noe som åpner for tilkobling til en trykk svinger for konstant overvåking, med mulighet for å injisere saltvann eller cardioplegia via cardioplegia leveringssystem (figur 1a).

3. initiering av CARDIAC donasjon etter sirkulasjonssystemet Death (DCD) protokoll

Merk: En komplett protokoll tidslinje kan sees i figur 2.

  1. Re-asses bedøvelse dybde ved å utføre en tå knipe og evaluere palpebral refleks. Hvis reaksjonen er observert, Utfør en intraperitoneal injeksjon av ketamin (37,5 mg/kg) og xylazine (2,5 mg/kg). Re-evaluere etter 5 minutter. Hvis det ikke er observert et svar, fortsetter du prosedyren. Tracheal klemme skal bare utføres i tilstrekkelig anesthetized dyr.
  2. Slå av ventilatoren og ekstubere dyret. Ved hjelp av mygg tang, klemme luftrøret. Dette øyeblikket regnes som starten av agonal fasen. Begynn å telle funksjonell varm iskemiske tid (WIT) når peak systolisk blodtrykk synker under 30 mmHg, eller hvis asystole eller ventrikkel atrieflimmer vises, hva kommer først (Figur 3).
    Merk: Skadegrad bør være proporsjonal med WIT. Eksperimenter er nødvendig for å optimalisere WIT tid i henhold til bedøvelse brukt, dyr belastning, kjønn og vekt valgt. I kontroll dyr, umiddelbart etter hals puls vaskulær tilgang er sikret, cardioplegia injiseres og hjertet er anskaffet som beskrevet i neste trinn (figur 2). Starten av cardioplegia er regnet som slutten av WIT.
  3. På slutten av WIT, utføre en midtre sternotomy. Hold thorax åpen ved hjelp av en Alm retractor. Bruk saks, åpne den underlegne vena cava og begge Atria for å unngå hjerteinfarkt distensjon eller cardioplegia resirkulering (supplerende figur 3). Klemme aorta over membranen. Gjennom den tidligere kateteriseres hals puls arterien, tilfører du cardioplegic løsningen ved et konstant trykk på 60 mmHg i 5 min ved hjelp av cardioplegia leveringssystem. Infusjons trykk kan endres ved å endre høyden på vannsøylen.
  4. På slutten av cardioplegic infusjon, analysere stigende proksimale aorta fra lungearterien ved hjelp av buet tang (supplerende figur 4a). Skjær aorta til venstre arteria arterien. Sikre en aorta lengde på minst 0,5 cm for kanyleringen for Langendorff apparatet.
  5. Holde hjertet fra aorta, fullføre cardiectomy ved å skille hjertet fra lunge årer og andre bryst strukturer (supplerende figur 4b). Raskt, Senk hjertet i til iskald Krebs løsning for rask transport til ex vivo systemet. Hold disseksjon og transporttidene så korte som mulig (5 min).

4. ex vivo hjerte-system (EVHP) og hjerte funksjons vurdering

  1. Åpne aorta lumen ved hjelp av tang. Deair aorta ved å fylle lumen med dryppende Krebs løsning for å unngå å tvinge bobler i koronar fartøy. Senk kanyle inn i aorta, ta vare ikke å passere aorta roten eller skade aorta ventilen brosjyrer. Fest oppsettet med en liten klemme.
  2. Bruk 2-veis stopcock til å øke flyten for å søke etter mulige lekkasjer i aorta. Hvis ingen er oppdaget, tett fikse aorta til kanyle ved hjelp av en 2-0 silke Sutur. Åpne flyten helt til kanyle. Opprettholde aorta trykket ved et fysiologisk Trykk på 60-70 mmHg (justert ved å endre høyden på systemet). I dette øyeblikket startes den innledende reperfusion og stabiliserings tiden. Aorta press kan endres i henhold til etterforsker eksperimentelle plan.
  3. Roter hjertet slik at bunnen av hjertet (Atria) er vendt mot trykksensoren. Utvid venstre ventrikkel atrieflimmer ved å dissekere lunge venene. Sett inn latex-ballongen som er koblet til en trykksensor. Sørg for at ballongen er fullt posisjonert i ventrikkel ved visuell inspeksjon. Langsomt fylle ballongen med saltvann til slutten diastolisk trykk (EDP) er satt til 15 mmHg. Juster etter behov for å holde EDP-konstanten (forhåndsbestemt FYSIOLOGISK EDP). EDP kan justeres i henhold til de eksperimentelle målene for hver undersøker.
  4. Sett inn pacing elektroden i fremre ansiktet av hjertet (høyre ventrikkel utløp skrift). Unngå punktering av koronar fartøy. Når spontan juling er observert, initiere pacing på 300 slag per min. nødvendig spenning kan variere mellom eksperimenter og rotte stammer.
  5. Etter 10 min av stabilisering, initiere kontinuerlig intraventricular trykkmåling opptak. Dette øyeblikket regnes som begynnelsen av den renoverings-og vurderingsfasen (tid 0) som vil vare i 1 time (figur 2). Overhaling kan være forlenget, men en tidsavhengig nedgang i contractility er forventet i alle hjerter.
  6. Ved starten av ombygging, samle CARDIAC avløpsvann slippe fra CARDIAC årer for 5 min for Baseline koronar flyt vurdering og biokjemiske analyser. For Troponin gjenta hver 15 min (ganger 0, 15, 30, 45 og 60 min). For andre analyser individualisering av innsamlings tider er nødvendig (Figur 2).

5. slutt på erfaring

  1. Fjern hjertet fra Langendorff apparatet.
  2. Ved hjelp av en rett høy karbonstål blad (mikrotomen blad eller lignende), fjerne bunnen av hjertet (inkludert aorta og lungearterien).
  3. Med høyre ventrikkel vendt ned, kuttet tverrgående ventrikkel lysbilder av 1-2 mm tykkelse. I en representativ seksjon (normalt den tredje) avgiftsdirektoratet høyre ventrikkel og snap fryse venstre ventrikkel. Denne prøven kan brukes til biokjemiske analyser.
  4. Senk de resterende delene inn til ferskt forberedt 5% 2, 3, 5-trifenylfosfat-tetrazolium klorid i kommersiell fosfat buffer saltoppløsning pH 7,4 i 10 min ved 37 ° c. Levedyktig vev er farget rød murstein.
  5. Vask to ganger med fosfat buffer saltvann med pH 7,4 og Fix med 10% formalin ved 4 ° c over natten. Vask to ganger med fosfat bufret saltvann pH 7,4 og hold hvert stykke under vann.
  6. Ta ut overflødig væske og vekt hvert lysbilde. Ta digitale fargebilder av begge sider. Bruk posisjonell analyser for å beregne prosent infarkt størrelse og riktig for skive og total ventrikkel vekt. Farging Fades med tiden. Bilder må tas så snart som mulig.

6. data analyser

  1. Lagre alle trykkdata i en ny fil per dyr.
  2. For Trykk analyser velger du minst 200 trykk sykluser per gang poeng. Analyser kan utføres av-linje (etter at eksperimentet er fullført) ved hjelp av dedikert programvare (dvs. LabChart). Vanlige kardiovaskulære parametre tilgjengelig inkluderer: maksimal generert trykk, ende diastolisk trykk, + dP/dt (bratteste skråning under oppstrekningen av trykk kurven, en indikator på ventrikkel kontraktile evne),-dP/dt (bratteste skråning under nedslaget av trykk kurven, en indikator på ventrikkel avslapping kapasitet) blant andre.
    Merk: for Troponin analyser forventes en økning i Troponin frigivelse ved reperfusion. Etter 1 h av reperfusion i EVHP-systemet, kan Troponin nivåer reduseres til Baseline, understreker behovet for forsiktig timing i innsamling og håndtering av disse prøvene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter ekstubering synker blodtrykket raskt i et forutsigbart mønster (Figur 3). Forventet tid til døden er mindre enn 5 min.

Figur 4 viser en gjennomsnittlig trykk/tid kurve ved starten av overhaling følgende 0, 10 og 15 min av Wit. Kontraktile funksjonen vil bli bedre over tid. Bruk av korte perioder med WIT vil tillate contractility å gå tilbake til normal, og morfologiske skader vil ikke være synlig (figur 5 og figur 6).

Proof-of-konsept bruk av en condition agent lagt med cardioplegia og på stabilisering fase viser at skaden generert av 15 min av WIT i denne modellen er mottagelig for modulering av Kardioprotektive agenter (Figur 4, figur 5 og Figur 6).

Figure 1
Figur 1: obligatoriske utstyrs skjemaer. Minimale krav til et (a) cardioplegia leveringssystem og et (B) Langendorff ex vivo hjerte system. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: tidslinje for protokoll. Tidslinje fra det øyeblikk av ekstubering til slutten av protokollen. I kontroll dyr, er cardioplegia igangsatt uten DCD eller varm iskemiske tid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Intracarotid blodtrykk/tids plott. Typisk utvikling av intracarotid blodtrykk etter ekstubering. Warm ischemia tid stjerner når peak systolisk blodtrykk synker under 30 mmHg, eller hvis asystole eller ventrikkel atrieflimmer vises, hva kommer først. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: ex vivo gjennomsnittlig Beat-to-beat ventrikkel trykk tid kurve. Bilde avledet fra analyser av data tatt etter 10 min stabilisering og mengde (tid 0 i figur 2) med eller uten bruk av en eksperimentell farmakologiske Kardioprotektive condition agent. Iskemiske tid refererer til varm iskemiske ganger (WIT). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: ex vivo-gjenoppretting og funksjonelle analyser. (A) kontinuerlig ventrikkel trykk tid kurve etter 10 min stabilisering og blod med eller uten bruk av en eksperimentell farmakologiske Kardioprotektive condition agent. Pilene viser artefakter som følge av manuell endring av EDP. (B) maksimal (+ DP/dt) og minimum (-DP/dt) trykkendring i LV vs. tids plott avledet fra (A) viser en tidsavhengig forbedring i contractility uten behandling (grønn linje). Kort WIT (rød linje) eller behandlet (gult) hjerter viser et mønster som ligner på kontrollgruppen (blå linje). Data punkter er gjennomsnittet av minst 200 individuelle beats. Stolper viser standardfeilen for gjennomsnittet for hvert datapunkt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6:2, 3, 5-trifenylfosfat-tetrazolium klorid farge på slutten av eksperimenter. Infarkt området observert etter diverse varme iskemiske tider (WIT) og bruk av en farmakologisk Kardioprotektive condition agent. Brick rød: levedyktig vev. Lys gul: ikke-levedyktig vev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: oppsett fotografiet. (A) fotografi som viser oppsettet for cardioplegia leveringssystem. Nummerert utstyr tilsvarer: cardioplegia beholder (1), boble felle (2), trykksensor og kateter (3), peristaltisk pumpe (4), polygraph koblet til trykksensoren (5) og liten dyre Ventilator (6). (B) fotografiet som viser oppsettet for Langendorff ex vivo hjerte system. Nummerert utstyr tilsvarer: Perfusate container (1), condition agent container (2) og hjertekammer (3). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 2: nakke disseksjon. (A) fotografering viser eksponert hals vene (arrow) før heparin injeksjon. (B) viser den dissekert hals puls arterien (pil) med sting plassert for blødning kontroll. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 3: åpning av Atria for å hindre resirkulering. (A) fotografering som viser åpningen av venstre atrieflimmer vedheng (1). På bakgrunn av aorta (2) er klemt over membranen (3). (B) viser åpningen av høyre atrieflimmer vedheng (1). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 4: hjerte anskaffelser. (A) fotografi som viser bruk av buet tang for å skille aorta (pil) og lungearterien. (B) fotografering som viser CARDIAC disseksjon og anskaffelser. Hjertet er Hold ved aorta ved hjelp av tang. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som presenteres her introduserer en enkel, praktisk og allsidig modell av hjerte-DCD, som gir mulighet til å vurdere CARDIAC funksjonell utvinning, vevsskade og bruk av post-condition Kardioprotektive agenter for å forbedre utvinningen av donor hjerter ellers kastes for transplantasjon. Ex vivo hjerte-systemer (EVHP) har blitt optimalisert for å gi en plattform for å evaluere hjertefunksjon og tilbyr en unik mulighet til å levere og teste modifiserte løsninger supplert med post-condition farmakologiske agenter til bevare og reparer DCD hjerter i små15 og store dyr16,17 modeller av hjerte DCD. Likevel protokollene er ofte utilstrekkelig detaljert og ikke alltid klinisk relevant, noe som gjør klinisk oversettelse vanskelig.

I riket av DCD modeller, ex vivo DCD-modeller, som beskrevet av Sanz18, mangler en agonal fase. Ved å indusere hjertestans ved å stoppe mekanisk ventilasjon, det sympatiske nervesystemet er overactivated, fører til en "katekolaminer storm"19. Denne økningen i katekolaminer endrer egenskapene til donor organene, og har vært knyttet til en redusert funksjonell status for eksperimentell DCD organer19. I tillegg fører progressiv nedgang i funksjon før asystole til høyre ventrikkel distensjon og påfølgende skade. I vår protokoll, har vi indusert sirkulasjons død ved hjelp av en klinisk relevant kvelning modell, som opprettholder disse svarene.

To Main in vivo hjerte DCD modeller er beskrevet i litteraturen: åpne brystet15 og lukkede brystet20 modeller. Hjerte fysiologi er endret av den åpne brystet tilnærming ved å redusere den mekaniske lunge/hjerte interaksjon og Forhåndslasting. Videre, i åpne brystet prosedyrer, er kroppsvarme tap akselerert, ytterligere påvirker funksjonelle resultater21. Derfor er det best å opprettholde en lukket bryst tilnærming forebygge varmetap. En annen avgrensning er å minimere variasjon av tid til sirkulasjons død. Kearns et al. rapporterte at tid til døden (tid til ikke-pulsatile eller bety blodtrykk mindre enn 30 mmHg) var mellom 3 til 11 min. I de 10 og 20 min WIT, 40% og 60% av hjerter ikke gjenopprette funksjon, henholdsvis på en ex vivo arbeids hjerte apparat, noe som gjør data tolkning vanskeligere15. Et alternativ for å redusere tiden til sirkulasjonssystemet død er å bruke paralytisk agenter20; Likevel, noen bevis peker mot direkte CARDIAC effekter av vecuronium, på grunn av dens virkninger på sympatisk og parasympatiske innervasjon22. For å øke reproduserbarhet, valgte vi for tracheal klemme, kombinert med et presist arterietrykk monitorization, noe som åpner for en mer homogen agonal tid (< 5 min). Det er kjent at organskade starter før det øyeblikket av sirkulasjons død; med noen forfattere vurderer en cut-off systolisk blodtrykk under 50 mmHg som begynnelsen av funksjonell WIT6, forklarer motvilje mot transplantasjon organer etter en lang periode form tilbaketrekking av liv opprettholde tiltak inntil reperfusion. I denne protokollen, WIT definisjonen som brukes følger dagens eksperimentelle standard15, likevel, er videre studier nødvendig for å avklare nøyaktig sett av hemodynamisk parametre som markerer induksjon av organskade for å forbedre Wit beregning, og gir dermed bedre informasjon for klinisk praksis.

Infusjon av cardioplegic løsning ved konstant fysiologisk trykk og temperatur gir en unik mulighet til å initiere hjerte condition og vev beskyttelse med noen farmakologiske agent eller på annen måte. Tekniske avgrensninger inkluderer klemme på bryst aorta, begrense mengde til hjertet og dermed redusere mengden av løsningen som trengs for hvert essay. Når hjertet er på EVHP-systemet, er standardisert funksjonell evaluering nødvendig. Det har blitt vist at bruken av et EVHP-system har potensiale til å bedre gjenoppliving av hjerter som tidligere ikke er transplantable23,24. Interessant nok evaluerer det klinisk tilgjengelige EVHP systemet hjerte levedyktighet bare ved bruk av serie melkesyre målinger8,23. Melkesyre målinger er ikke relatert til CARDIAC ytelse av DCD hjerter24,25, og dermed ytterligere målinger for å evaluere transplantability er nødvendig. Dette eksperimentelle oppsettet gir en komplett funksjonell evaluering, inkludert genererte trykk og hjerteinfarkt contractility målinger inkludert + dP/dT og-dP/dT, noe som åpner for en grundigere evaluering av hjertefunksjon før den endelige transplantasjon avgjørelsen er gjort. I tillegg målinger av CARDIAC Troponin, en markør av hjerteinfarkt skade direkte korrelert til iskemiske infarkt størrelse26, og slipp Kinetics er knyttet til omfanget av CARDIAC iskemi i en Langendorff iskemi/reperfusion system. Spesielt med lange iskemiske tider (60 min), Troponin nivåer opprettholdes etter 1 h reperfusion, mens LDH og kreatinin kinase betydelig reduksjon, og er ikke relatert til omfanget av CARDIAC skade27,28, og dermed Bruk av serielle Troponin tiltak sikre en fullstendig evaluering av organ levedyktighet før transplantasjon. En stor forvirrende variabel i hjerte funksjonell evaluering er hjertefrekvensen. Spontan hjertefrekvens er omvendt relatert til lengden på iskemi29, og hjertefrekvensen direkte samsvarer med + DP/dt i isolerte rotte hjerter30 og i dyremodeller31. Interessant, i nylig publisert arbeid på gnager modeller av DCD hjerter og EVHP condition, pacing ble ikke brukt og CARDIAC ratene var variable og spilt inn i sine protokoller15,18,20. For å opprettholde fysiologisk hjertefrekvens, ble pacing brukt når hjertet hadde gjenvunnet rytmisk sammentrekning. Det valgt 300 BPM hyppigheten er analog med dem av rask, ingen-trykk rotter32.

Begrensninger av denne protokollen inkluderer bruk av flyktig bedøvelse for induksjon. Disse agentene har vist å konferere iskemiske preconditioning33. Likevel, den korte tiden av inhalert anestesi bruk hadde ingen Observer effekt i denne protokollen og progressive hjerteinfarkt dysfunksjon var fortsatt bemerket med økende WIT. Bruk av normothermic cardioplegia kan også betraktes som en begrensning. Ved hjelp av normothermic cardioplegia gir optimal oversettelse fra in vitro forhold som brukes for utvikling av farmakologiske condition agenter, siden cellene er vanligvis opprettholdes ved 37 ° c. Likevel, i dette oppsettet cardioplegia temperatur kan lett reguleres i henhold til kravene til etterforsker. På den annen side kan bruken av en Langendorff forberedelse kontra en arbeids hjerte forberedelse til overhaling også bli sett på som en begrensning. Arbeids hjertet forberedelse gjør det mulig for kontinuerlig opptak av en trykk/volum loop12,15, med kontrollerte pre-og afterload, slik at for komplett funksjonell evaluering. Den største fordelen med en Langendorff forberedelse er at den opprettholder en konstant aorta-og trykk, spesielt under første reperfusion, når generert trykk er minimal. I tillegg er evalueringen oppsett enklere for Langendorff hjertet i forhold til en arbeidsgruppe hjerte forberedelse. Likevel, dette oppsettet kan omdannes til en arbeidsgruppe hjerte forberedelse hvis anser nødvendig. Alternativt kan CARDIAC Reanimation utføres in situ ved hjelp av normothermic regionale, med CARDIAC ytelse måles direkte ved bruk av et Millar kateter34, slik at omfattende hemodynamisk og hjerte-funksjonell vurdering før orgel anskaffelser. Hos mennesker, har både in situ og ex vivo renoverings strategier blitt beskrevet6, og dermed utviklingen av begge modellene gir eksperimentelle sammenligninger som kan oversette til optimalisering av klinisk praksis. Til slutt, den lille størrelsen og høy hjertefrekvens av denne dyre modellen kan betraktes som en begrensning på grunn av de potensielle tekniske problemer observert under utføring av disse eksperimentene, og den uunngåelige fysiologiske forskjellene mellom rotte og menneske hjerter. Hvis EVHP-evalueringen allerede er standardisert, kan en forsker bli kjent med denne teknikken ved å utføre så lite som 3 eksperimenter. På den andre side, bruken av denne liten dyr modell innrømmer for bekvem skjermen med ett fornuftig bekostning, reservere større og flere kostbar dyr modeller som det svin modell, å terapeut med høy Human translational muligheter.

Som konklusjon, protokollen beskrevet her tar hensyn til beste praksis som kommer fra flere grupper forsker DCD hjerter. Denne protokollen gir full kontroll over WIT, noe som åpner for en omfattende strukturell og funksjonell evaluering av Kardioprotektive condition behandling strategier i rotter. Denne protokollen kan oppskalert og overføres til store dyremodeller, slik at å oversette forskningsresultater til klinisk virkelighet og til slutt slik at utviklingen av romanen terapier øke kvaliteten og tilgjengeligheten av livreddende organer sårt tiltrengt av Pasienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen proprietær eller kommersiell interesse for noe produkt nevnt eller konsept diskutert i denne artikkelen.

Acknowledgments

Deler av dette arbeidet ble støttet av et generøst bidrag fra Fondation Marcel et Rolande Gosselin og Fondation Mr Stefane Foumy. Nicolas Noiseux er forsker i FRQ-S.

Forfatterne ønsker å takket Josh Zhuo Le Huang, Gabrielle Gascon, Sophia Ghiassi, og Catherine Scalabrini for deres støtte i datainnsamling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag Baxter Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter Jelco 4098 To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Milipore-Sigma T8877 Vital coloration
22 G 1" I.V catheter BD 383532 I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr Skalar 50-3147 Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" Skalar 22-9027 Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp ADinstruments FE221 Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride Milipore-Sigma C1016 CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose Milipore-Sigma G8270 D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer ADinstruments MLAC06 Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock) ADinstruments MLT0670 Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS Gibco 14190-144 Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" Skalar 66-2740 Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10% Milipore-Sigma HT501128 Fixative solution
Heating Pad Sunbean 756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL Sandoz For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% Fisher scientific A144-500 Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine Bimeda Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart ADinstruments Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon Radnoti 170404 In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution AstraZeneca Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS ACP Chemicals M-0460 MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor Radnoti 159905 Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker Biotronik Reliaty Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter Fisher scientific AE150
Physiological monitor Kent Scientific Physiosuite For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A Baxter Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride Milipore-Sigma P4504 KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml Hospira Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph ADinstruments Electronic polygraph
Silk 2-0 Ethicon A305H Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0 Ethicon A302H Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation Hallowell EMC 000A2770 Small animal ventilator
Sodium bicarbonate Milipore-Sigma S5761 NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride Milipore-Sigma S7653 NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets ACP chemicals S3700 Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic Milipore-Sigma S0751 NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" Skalar 22-1240 Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades Thomas scientific 6727C18 Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" CardinalHealth 8881511235 For heparin injection
Veterinary General Surgery Set Skalar 98-1275 Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set Skalar 98-1311 Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system Radnoti 120101BEZ Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine Bayer Sedative. 20 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gass, A. L., et al. Cardiac Transplantation in the New Era. Cardiology in Review. 23 (4), 182-188 (2015).
  2. von Dossow, V., Costa, J., D'Ovidio, F., Marczin, N. Worldwide trends in heart and lung transplantation: Guarding the most precious gift ever. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 31 (2), 141-152 (2017).
  3. Hornby, K., Ross, H., Keshavjee, S., Rao, V., Shemie, S. D. Non-utilization of hearts and lungs after consent for donation: a Canadian multicentre study. Canadian Journal Of Anaesthesia. 53 (8), 831-837 (2006).
  4. Manyalich, M., Nelson, H., Delmonico, F. L. The need and opportunity for donation after circulatory death worldwide. Current Opinion In Organ Transplantation. 23 (1), 136-141 (2018).
  5. Shemie, S. D., et al. National recommendations for donation after cardiocirculatory death in Canada: Donation after cardiocirculatory death in Canada. CMAJ : Canadian Medical Association Journal. 175 (8), S1 (2006).
  6. Page, A., Messer, S., Large, S. R. Heart transplantation from donation after circulatory determined death. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 75-81 (2018).
  7. Monteagudo Vela, M., Garcia Saez, D., Simon, A. R. Current approaches in retrieval and heart preservation. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 67-74 (2018).
  8. Dhital, K. K., Chew, H. C., Macdonald, P. S. Donation after circulatory death heart transplantation. Current Opinion In Organ Transplantation. 22 (3), 189-197 (2017).
  9. McNally, S. J., Harrison, E. M., Wigmore, S. J. Ethical considerations in the application of preconditioning to solid organ transplantation. Journal of Medical Ethics. 31 (11), 631-634 (2005).
  10. Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 16 (6), 667-673 (1997).
  11. Ramzy, D., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (10), 1665-1672 (2005).
  12. Xin, L., et al. A New Multi-Mode Perfusion System for Ex vivo Heart Perfusion Study. Journal of Medical Systems. 42 (2), 25 (2017).
  13. Messer, S., Ardehali, A., Tsui, S. Normothermic donor heart perfusion: current clinical experience and the future. Transplant International. 28 (6), 634-642 (2015).
  14. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). , Academic Press. 77-108 (2016).
  15. Kearns, M. J., et al. A Rodent Model of Cardiac Donation After Circulatory Death and Novel Biomarkers of Cardiac Viability During Ex vivo Heart Perfusion. Transplantation. 101 (8), e231-e239 (2017).
  16. Sandha, J. K., et al. Steroids Limit Myocardial Edema During Ex vivo Perfusion of Hearts Donated After Circulatory Death. The Annals of Thoracic Surgery. 105 (6), 1763-1770 (2018).
  17. Iyer, A., et al. Increasing the tolerance of DCD hearts to warm ischemia by pharmacological postconditioning. American Journal of Transplantation. 14 (8), 1744-1752 (2014).
  18. Sanz, M. N., et al. Cardioprotective reperfusion strategies differentially affect mitochondria:studies in an isolated rat heart model of donation after circulatory death (DCD). American Journal of Transplantation. , (2018).
  19. Van de Wauwer, C., et al. The mode of death in the non-heart-beating donor has an impact on lung graft quality. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 36 (5), 919-926 (2009).
  20. Quader, M., et al. Determination of Optimal Coronary Flow for the Preservation of "Donation after Circulatory Death" in Murine Heart Model. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs : 1992). 64 (2), 225-231 (2018).
  21. Priebe, H. J. The acute open-chest model. British Journal Of Anaesthesia. 60 (8 Suppl 1), 38-41 (1988).
  22. Narita, M., et al. Cardiac effects of vecuronium and its interaction with autonomic nervous system in isolated perfused canine hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 19 (6), 1000-1008 (1992).
  23. Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet (London, England). 385 (9987), 2585-2591 (2015).
  24. Messer, S. J., et al. Functional assessment and transplantation of the donor heart after circulatory death. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (12), 1443-1452 (2016).
  25. White, C. W., et al. Assessment of donor heart viability during ex vivo heart perfusion. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93 (10), 893-901 (2015).
  26. Mayr, A., et al. Cardiac troponin T and creatine kinase predict mid-term infarct size and left ventricular function after acute myocardial infarction: a cardiac MR study. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33 (4), 847-854 (2011).
  27. Remppis, A., et al. Intracellular compartmentation of troponin T: release kinetics after global ischemia and calcium paradox in the isolated perfused rat heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (2), 793-803 (1995).
  28. Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff Perfused Isolated Mouse Heart Model of Global Ischemia-Reperfusion Injury: Impact of Ischemia and Reperfusion Length on Infarct Size and LDH Release. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).
  29. Dornbierer, M., et al. Early reperfusion hemodynamics predict recovery in rat hearts: a potential approach towards evaluating cardiac grafts from non-heart-beating donors. PloS One. 7 (8), e43642 (2012).
  30. Henry, P. D. Positive staircase effect in the rat heart. The American Journal of Physiology. 228 (2), 360-364 (1975).
  31. Markert, M., et al. Evaluation of a method to correct the contractility index LVdP/dt(max) for changes in heart rate. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 98-105 (2012).
  32. Azar, T., Sharp, J., Lawson, D. Heart rates of male and female Sprague-Dawley and spontaneously hypertensive rats housed singly or in groups. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (2), 175-184 (2011).
  33. Bonney, S., Hughes, K., Eckle, T. Anesthetic cardioprotection: the role of adenosine. Current Pharmaceutical Design. 20 (36), 5690-5695 (2014).
  34. Ali, A. A., et al. Rat model of veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation. Journal of Translational Medicine. 12, 37 (2014).

Tags

Medisin hjerte transplantasjon donasjon etter sirkulasjons død iskemiske condition iskemi-reperfusion skade ex Vivo Langendorff funksjonell evaluering.
Pre-klinisk modell av CARDIAC donasjon etter sirkulasjonssystemet Death
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aceros, H., Joulali, L., Borie, M.,… More

Aceros, H., Joulali, L., Borie, M., Ribeiro, R. V. P., Badiwala, M. V., Der Sarkissian, S., Noiseux, N. Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death. J. Vis. Exp. (150), e59789, doi:10.3791/59789 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter