Summary

Fabricage van de Microscoop fase voor verticale observatie met temperatuur regelfunctie

Published: July 31, 2019
doi:

Summary

Hier gepresenteerd is een protocol met behulp van een temperatuur gecontroleerde Microscoop fase die het mogelijk maakt een monster container te monteren op een verticale Microscoop.

Abstract

Monsters worden meestal op een horizontale Microscoop-fase geplaatst voor microscopische observatie. Echter, om de invloed van de zwaartekracht op een monster of studie drijven gedrag te observeren, is het noodzakelijk om de Microscoop fase verticaal te maken. Om dit te bereiken, is een zijwaartse omgekeerde Microscoop gekanteld met 90 ° bedacht. Om monsters met deze Microscoop te observeren, moeten Monsterhouders zoals Petri schalen of glaasjes verticaal op het podium worden vastgezet. Er is een apparaat ontwikkeld dat de Monsterhouders op een verticale Microscoop-fase kan beveiligen en hier wordt beschreven. Bevestiging van dit apparaat aan het werkgebied maakt observatie van de monster dynamiek in het verticale vlak mogelijk. De mogelijkheid om de temperatuur te reguleren met een silicone rubberen kachel maakt ook observatie van temperatuurafhankelijke monster gedragingen mogelijk. Bovendien worden de temperatuur gegevens overgebracht naar een Internet server. Temperatuurinstellingen en logboek bewaking kunnen op afstand vanaf een PC of smartphone worden bediend.

Introduction

Optische microscopie is een techniek gebruikt om observeerbare details te verhogen via vergroting van een monster met lenzen en zichtbaar licht. In optische microscopie wordt licht op een monster gericht, vervolgens overgebracht, gereflecteerd, of fluorescerende licht wordt opgevangen door vergrootglazen voor observatie. Er zijn verschillende soorten Microscoop beschikbaar die verschillen in ontwerp om tegemoet te komen aan verschillende toepassingen en observatie methoden. De verschillende ontwerpen omvatten een rechtopstaande Microscoop, die is gestructureerd om een monster van onder te verlichten voor observatie van bovenaf, en een omgekeerde Microscoop, die het monster van bovenaf verlicht voor observatie van onderen. Staande microscopen zijn het meest voorkomende en meest gebruikte ontwerp. Omgekeerde microscopen worden vaak gebruikt om monsters te observeren die een lens niet in de verte van bovenaf kunnen sluiten, zoals gekweekte cellen die zich aan de onderkant van een container hechten. Veel onderzoeksgroepen hebben waarnemingen gerapporteerd in een breed scala van velden met behulp van omgekeerde microscopen1,2,3,4,5,6,7. Veel extra apparaten zijn ook ontwikkeld die profiteren van de functies van omgekeerde microscopen8,9,10,11,12,13 .

Momenteel is de Microscoop fase in alle conventionele Microscoop ontwerpen horizontaal en ongeschikt voor het observeren van monsters die beweging in het verticale vlak produceren (door zwaartekracht, drijfvermogen, beweging, enz.). Om deze waarnemingen mogelijk te maken, moeten de Microscoop fase en het lichtpad worden gedraaid naar verticaal. De verticale trap is vereist voor het verticaal monteren van glaasjes of Monsterhouders zoals een Petri schaaltje op het podium. Om dit aan te pakken, is er al een zijwaartse omgekeerde Microscoop gekanteld met 90 ° bedacht. Het bevestigen van samples met tape of andere lijmen geeft echter niet de noodzakelijke langdurige immobiliteit. Hier beschreven is een apparaat dat de nodige stabiliteit kan bereiken. Dit apparaat maakt observatie mogelijk na verloop van tijd van de monster beweging in het verticale vlak. Het monteren van een siliconen rubberen kachel heeft het ook mogelijk gemaakt om de invloed van temperatuur variatie op het monster gedrag te observeren. Temperatuur gegevens worden via Wi-Fi overgebracht naar een Internet server en de temperatuurinstellingen en logboek bewaking kunnen op afstand vanaf een PC of smartphone worden bestuurd. Naar onze kennis is het podium bevestigd aan een zijwaartse gekantelde Microscoop, gekanteld met 90 °, nog niet gemeld in voorgaande studies.

De Microscoop fase bestaat uit drie aluminium platen. De middelste aluminium plaat is gemonteerd op de onderste aluminium plaat die aan het podium wordt bevestigd. Het Silicone rubber met de temperatuursensor is bevestigd tussen de middelste en bovenste aluminium platen. Elastiekjes worden gebruikt om het monster aan te brengen. De klauwen zijn links en rechts vier punten van de bovenste aluminium plaat bevestigd om de elastiekjes te beveiligen. Het controle circuit van de temperatuurregelaar ontvangt een signaal van de temperatuursensor ingebed in Silicone rubber en moduleert elektrische stroom door de Pulsbreedtemodulatie (PWM) methode. De temperatuur kan geleidelijk worden verhoogd tot 50 °C in stappen van 1 °C. Dit apparaat is handig voor toepassingen waarin verticale monster bewegingen afhankelijk van de temperatuur kunnen zijn.

Dit verslag geeft voorbeelden van temperatuureffecten op het drijvende fenomeen van diatomen. Als voorbeelden van diatoom observatiestudies werden metingen van sedimentatie snelheid van celclusters, bewegingsanalyses, ultrafijne structuur studies, etc. gerapporteerd14,15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. de soortelijke zwaarte van diatomen die in water met fotosynthetische organismen zweven, is iets hoger dan dat van water, zodat ze de neiging hebben om te zinken; ze zullen echter stijgen als er zelfs lichte convectie optreedt. Om dit fenomeen te bestuderen, wordt een glazen glijbaan verticaal op een Microscoop-fase aangebracht en worden de effecten van stijgende temperatuur op diatoom verticale beweging waargenomen.

Protocol

1. ontwerp Fabricage van aluminium platen Snijd een gat van 101 mm in het midden van een aluminium plaat met afmetingen 150 mm x 200 mm x 2 mm om te worden gebruikt als de voorste plaat met een laser verwerkingsmachine. Machine klauwen op acht punten om twee elastiekjes over de lengte aan te brengen, of twee over de breedte van deze plaat (Zie aanvullende figuur 1a en aanvullende Figuur 2a). Snijd een gat van 130 mm in het midden van een andere 150 mm x 200 m…

Representative Results

Figuur 2 toont de temperatuurverdeling van de rubberen kachel. De oppervlaktetemperatuur van de rubberen kachel was bij elke temperatuur uniform. Figuur 3 toont de responsiviteit van de gemeten temperatuur om temperatuurveranderingen in te stellen. De oranje lijn toont de ingestelde temperatuur en de blauwe lijn toont de verandering van de monstertemperatuur. De overschrijding van de gemeten waarde naar de instelling verandering …

Discussion

Traject analyse van bewegende diatoom cellen is een nuttige benadering voor het evalueren van de beweeglijkheid van de diatoom. Echter, terwijl een normale omgekeerde Microscoop monsters horizontaal observeert, is het niet geschikt voor observaties van de invloed van de zwaartekracht of zwevende beweging in de verticale richting. Hier ontwikkeld en beschreven is een verticale Microscoop fase met temperatuurregeling en bevestigd aan een omgekeerde Microscoop, die is geroteerd door 90 °. Deze Microscoop fase met temperatu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs hebben geen erkenningen.

Materials

AC adapter 12V2A Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. AD-D120P200 Tokyo, Japan
ADS1015 Substrate Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. adafruit PRODUCT ID: 1083 Tokyo, Japan
Alminium Plate (Back Side Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 1.5mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Forefront Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 2mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Lower Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 4mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Upper Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 5mm Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Lower Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Upper Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution Sigma-Aldrich Co. LLC B5282-500ML St. Louis, USA
Controller Case Marutsu Elec Co., Ltd. pff-13-3-9 Tokyo, Japan
CPU Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. ESP-WROOM-02D Tokyo, Japan
Inverted microscope Olympus Corporation CKX 53 Tokyo, Japan
Low temperature hardening epoxy resin adhesive ThreeBond Co., Ltd. TB2086M Tokyo, Japan
Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. 3296W-1-501LF Tokyo, Japan
OLED module Akihabara Inc. M096P4W Tokyo, Japan
Pressed Cork (For supporting electrode ) Tera Co., Ltd. W 42mm×L 30㎜ Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Lower Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 0.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Upper Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Rotary encoder with switch with 2 color LED Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. P-05772 Tokyo, Japan
Silicone rubber heater Three High Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Kanagawa, Japan
Substrate Seeed Technology Co., Ltd. mh5.0 Shenzhen, China
Temperature sensor Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. NXFT15XH103FA2B050 Tokyo, Japan
Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V Marutsu Elec Co., Ltd. BR301 Tokyo, Japan
Universal Flexible Arm Banggood Technology Co., Ltd. YP-003-2 Hong Kong, China
USB cable USB-A – MicroUSB Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. USB CABLE A-MICROB Tokyo, Japan
Video Canera Sony Corporation HDR-CX590 Tokyo, Japan

References

  1. Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
  2. McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
  3. Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
  4. Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
  5. Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
  6. Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
  7. Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM – selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
  8. Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
  9. Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
  10. Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
  11. Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
  12. Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
  13. Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
  14. Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
  15. Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
  16. Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
  17. Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields – A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
  18. Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
  19. Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
  20. Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
  21. Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates – potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
  22. Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
  23. Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion – An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).

Play Video

Cite This Article
Matsukawa, Y., Ide, Y., Umemura, K. Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function. J. Vis. Exp. (149), e59799, doi:10.3791/59799 (2019).

View Video