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Immunology and Infection

स्ट्रेप्टोकॉकस म्यूटान में एक उच्च आण्विक द्रव्यमान प्रोटीन की शुद्धि

Published: September 14, 2019 doi: 10.3791/59804
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 2, 1
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Laboratory for Oral Health Science

Summary

यहाँ वर्णित स्ट्रेप्टोकॉकस म्यूटानमें जीन उत्पाद की शुद्धि के लिए एक सरल विधि है . इस तकनीक प्रोटीन की शुद्धि में फायदेमंद हो सकता है, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन और उच्च आणविक बड़े पैमाने पर प्रोटीन, और विभिन्न अन्य जीवाणु प्रजातियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

एक जीन के समारोह के स्पष्टीकरण आम तौर पर जंगली प्रकार उपभेदों और उपभेदों जिसमें ब्याज के जीन बाधित किया गया है के phenotypic लक्षण की तुलना शामिल है. जीन व्यवधान के बाद कार्य की हानि बाद में बाधित जीन के उत्पाद के बहिर्जात योग द्वारा बहाल की जाती है। यह जीन के कार्य को निर्धारित करने में मदद करता है। एक विधि पहले वर्णित एक gtfC जीन-विघटित Streptococus mutans तनाव पैदा करना शामिल है. यहाँ, एक unmanding विधि जीन व्यवधान के बाद नव उत्पन्न एस mutans तनाव से gtfC जीन उत्पाद को शुद्ध करने के लिए वर्णित है. यह ब्याज की जीन के 3 "अंत में एक polyhistidine-कोडिंग अनुक्रम के अलावा शामिल है, जो स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग जीन उत्पाद के सरल शुद्धि की अनुमति देता है. पीसीआर के अलावा कोई एंजाइमी प्रतिक्रियाओं इस विधि में आनुवंशिक संशोधन के लिए आवश्यक हैं। जीन विघटन के बाद exogenous इसके अलावा द्वारा जीन उत्पाद की बहाली जीन समारोह है, जो भी विभिन्न प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए एक कुशल तरीका है.

Introduction

एक जीन के समारोह के विश्लेषण आमतौर पर जिसमें ब्याज के जीन बाधित किया गया है उपभेदों के लिए जंगली प्रकार उपभेदों के phenotypic लक्षण की तुलना शामिल है. एक बार जीन-विक्षिंघरित तनाव का उत्पादन किया जाता है, जीन उत्पाद के exogenous इसके अलावा कार्यात्मक बहाली की अनुमति देता है.

बाद में बहाली परख के लिए आवश्यक शुद्ध जीन उत्पादों को प्राप्त करने के लिए सबसे आम तरीका एस्चेरीचिया कोली1में हेटेरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रदर्शन करना है . हालांकि, झिल्ली प्रोटीन या उच्च आणविक द्रव्यमान प्रोटीन की अभिव्यक्ति अक्सर इस प्रणाली1का उपयोग कर मुश्किल है. इन मामलों में, लक्ष्य प्रोटीन आमतौर पर कोशिकाओं है कि natively कदम है, जो जीन उत्पाद के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की एक जटिल श्रृंखला के माध्यम से प्रोटीन संश्लेषित से अलग है. इन मुद्दों को दूर करने के लिए, एक सरल प्रक्रिया जीन व्यवधान विधि के बाद जीन उत्पाद शुद्धिकरण के लिए विकसित किया गया है2, पीसीआर आधारित डीएनए splicing विधि3 (नामित दो कदम संलयन पीसीआर), और आनुवंशिक के लिए electroporation स्ट्रेप्टोकॉकस म्यूटमेंसमें रूपांतरण | जीन उत्पाद के सी-टर्मिनस में पॉलीहिसिडीन टैग (उसका टैग) के अलावा धातु संबंध क्रोमैटोग्राफी (आईएमए) द्वारा अपनी शुद्धि की सुविधा प्रदान करता है।

उनके टैग-expressing तनाव को अलग करने के लिए, ब्याज की जीन के पूरे जीनोमिक डीएनए (इस अपने टैग में-विघ्वित जीन-विघनी तनाव) एक एंटीबायोटिक प्रतिरोधी मार्कर जीन के साथ बदल दिया है. उनके टैग-अपशसन तनाव उत्पन्न करने की प्रक्रिया लगभग एक जीन-विघनी विकृति उत्पन्न करने के समान है जैसा कि पहले वर्णित4,5. इसलिए, जीन व्यवधान और जीन उत्पाद अलगाव के लिए तरीकों कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सीरियल प्रयोगों के रूप में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

वर्तमान कार्य में, एक polyhistidine-कोडिंग अनुक्रम gtfC के 3 "अंत से जुड़ा हुआ है (GenBank टिड्डी टैग SMU $1005) जीन, एन्कोडिंग glucosyltransferase-SI (GTF-SI) S. mutans6में . फिर, एक स्ट्रेप्टोकोकल प्रजातियों में अभिव्यक्ति अध्ययन प्रदर्शन किया गया. ई. कोलाई द्वारा विषमजीवी gtfC अभिव्यक्ति प्राप्त करना मुश्किल है, GTF-SI के उच्च आणविक द्रव्यमान के कारण होने की संभावना है। इस विकृति का नाम एस मटान उनका-gtfC है। एक योजनाबद्ध चित्रण gtfC और spectinomycin प्रतिरोध जीन कैसेट के संगठन का चित्रण (एसपीसीआर)7 वाइल्ड-टाइप एस mutans में loci (एस mutans WT) और उसके डेरिवेटिव में दिखाया गया है चित्र 1| GTF-SI एक स्रावी प्रोटीन है कि कैरिओजेनिक दंत बायोफिल्म6के विकास के लिए योगदान देता है। सुक्रोज की उपस्थिति में डब्ल्यूटी एस म्यूटन्स स्ट्रेन में कांच की चिकनी सतह पर एक अनुशीलन बायोफिल्म देखी जाती है, लेकिन एस म्यूटन्स जीटीएफसीमें नहीं - बाधित तनाव (एस. म्यूटन्स ]gtfC)2,5 . बायोफिल्म गठन एस mutans में बहाल किया जाता है -जी.टी.एफ.सी. पुनः संयोजक GTF-SI के exogenous इसके अलावा पर. तनाव, एस mutans उसकीgtfC,तो पुनः संयोजक GTF-SI का उत्पादन करने के लिए प्रयोग किया जाताहै.

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Protocol

नोट: S. mutans का उत्पादन -gtfC, जिसमें gtfC जीन के पूरे कोडन क्षेत्र spcr के साथ बदल दिया है, इन प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने से पहले पूरा किया जाना चाहिए. पीढ़ी5पर विवरण के लिए प्रकाशित लेख को देखें .

1. प्राइमर डिजाइन

  1. एस mutans उनकेgtfCके निर्माण के लिए प्राइमर तैयार करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त प्राइमर अनुक्रमों को सारणी 1 में दर्शायागया है। एस म्यूटों की पीढ़ी के लिए द्वि-चरणीय संलयन पीसीआर विधि उनकी-gtfC को योजनाबद्ध रूप से चित्र 2में चित्रित किया गया है।
    1. डिजाइन प्राइमर (gtfC-रिवर्स और spcआर-आगे) उसके टैग-कोडिंग अनुक्रम के अनुलग्नक के लिए, gtfC जीन और spcr के बीच हस्तक्षेप (चित्र 2A).
      1. दोनों gtfCमें जीएस linker और उनके टैग-कोडिंग अनुक्रम शामिल करें -रिवर्स और spcआर-आगेप्राइमर, जिसमें 5' क्षेत्रों में 24 कुर्सियां एक दूसरे के पूरक हैं।
        नोट: जी एस लिंकर और उनके टैग के एमिनो एसिड अनुक्रम (Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His) जीन अनुवाद के माध्यम से GTF-SI के सी-टर्मिनस से जुड़ा हुआ है।
      2. एस mutans WT जीनोम में gtfC जीन को लक्षित करने के लिए एक gtfC-आगेप्राइमर डिजाइन और spc आर के बहाव के नीचे spcr-रिवर्सप्राइमर को लक्षित करने के लिए में एस mutans [gtfC| जी.टी.एफ.सी.-फॉरवर्ड और एसपीसीआर-रिवर्सप्राइमर के पिघलने का तापमान8 (टीमी) सेट करें जो जीटीएफसी-रिवर्स और एसपीसीआरके पिघलने के तापमान से मेल खाते हैं - आगे प्राइमर, क्रमशः.
    2. दूसरी पीसीआर(चित्र 2B)के लिए नेस्टेड प्राइमर (नेस्टेड-फॉरवर्ड और नेस्टेड-रिवर्स) डिज़ाइन करें।
    3. परिवर्तक के जीनोमिक डीएनए के लिए विशिष्ट डिजाइन प्राइमर(gtfC-forwardऔर colony-reverse) (चित्र 2C; प्राइमर्स कॉलोनी पीसीआर के लिए उपयोग किया जाता है)।
      नोट: amplicons gtfC और spcआरके बीच सीमा straddle . gtfC-आगे प्राइमर आगे प्राइमर के रूप में लागू किया जा सकता है.
    4. डिजाइन प्राइमर (अप-फॉरवर्ड और डाउन-रिवर्स) एस mutans की पीढ़ी की अंतिम पुष्टि के लिए उनकी-gtfC (चित्र 2C; प्राइमर द्वारा प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद डीएनए अनुक्रमण के लिए प्रयोग किया जाता है)।

2. एस mutans से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण

नोट: प्रत्येक एस mutans तनाव अवायवीय परिस्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क दिल जलसेक (BHI) माध्यम में सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। S. mutans के उत्परिवर्ती उपभेदों -gtfC और एस mutans उसकी-gtfC BHI में सुसंस्कृत कर रहे हैं 100 g/

  1. स्ट्रीक एस म्यूटनएस डब्ल्यूटी और एस mutans ]gtfC अलग से BHI agar प्लेटों में से प्रत्येक पर. उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. S. mutans WT या S. mutans की एकल कालोनियों उठाओ -gtfC एक बाँझ टूथपिक का उपयोग कर और BHI शोरबा के 1.5 एमएल में टीका. उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: कालोनियों पहले पीसीआर (चरण 3.1) के लिए टेम्पलेट डीएनए के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. प्रत्येक जीवाणु संस्कृति के 1 एमएल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 15000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें .
  4. supernatant निकालें और सेल गोली को पुन: निलंबित करने के लिए Tris-EDTA बफर (पीएच 8.0) के 1 एमएल जोड़ें।
  5. 15000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें. सुपरनेंट निकालें. त्रिस-EDTA बफर (पीएच 8.0) के 50 डिग्री एल में सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
  6. 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक ब्लॉक इनक्यूबेटर का उपयोग कर निलंबन गर्मी। 15000 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें.
  7. एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण (सुपरनेंट पहले पीसीआर के लिए टेम्पलेट डीएनए के रूप में काम करेंगे).

3. पीसीआर प्रवर्धन

नोट: तालिका 1, सारणी 2,और तालिका 3 क्रमशः PCR प्राइमर, अभिकर्मकों, और प्रवर्धन चक्रों का सारांश प्रस्तुत करती है।

  1. S. mutans WT और S. mutans का उपयोग कर पहले PCR प्रदर्शन -gtfC जीनोम पीसीआर टेम्पलेट्स के रूप में. जी.टी.एफ.सी जीन के डाउनस्ट्रीम भाग को आश्रय देने वाले क्षेत्रों को बढ़ाना और उन ्हें आश्रय देना जो spcr को चरण 1-1-1-2 में वर्णित प्राइमर का उपयोग करते हैं (चित्र 2क)।
  2. इलेक्ट्रोफोरीज़ प्रत्येक पीसीआर उत्पाद पर 1% agarose जेल. लगभग 1,000 बीपी और 2,000 बीपी के वांछित डीएनए टुकड़े उत्पादित करें। सिलिका झिल्ली आधारित जेल निष्कर्षण विधि का उपयोग करके जैल से टुकड़ों को शुद्ध करें।
    नोट: पीसीआर9, डीएनए जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस10, और डीएनए शुद्धि11 के लिए बुनियादी प्रक्रियाओं कहीं और विस्तृत कर रहे हैं।
  3. नेस्टेड-आगे और नेस्टेड-रिवर्स प्राइमर(चित्र 2B)के साथ पीसीआर टेम्पलेट्स के रूप में पहले PCR (लगभग समसूत्री) के उत्पादों का उपयोग करके कोई दूसरा PCR निष्पादित करें।
  4. इलेक्ट्रोफोरीज़ एक-दसवें पीसीआर मिश्रण के agarose जेल पर. लगभग 3,000 बीपी के उपयुक्त amplicon की पीढ़ी की पुष्टि करें.
  5. शेष PCR उत्पाद की तैयारी करें।
    नोट:     पीसीआर उत्पाद का शुद्धि आवश्यक नहीं है, क्योंकि दूसरे पीसीआर द्वारा उत्पन्न गैर-विशिष्ट amplicons समजात पुनर्संयोजन के साथ हस्तक्षेप नहीं करते।
    1. पीसीआर मिश्रण में न्यूक्लेस-मुक्त जल जोड़ें और कुल मात्रा को 100 डिग्री सेल्सियस तक लाएं, इसके बाद 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) और निरपेक्ष इथेनॉल की 2.5 मात्रा (250 डिग्री सेल्सियस)। मिश्रण और कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए मिश्रण की दुकान.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 x g पर 20 मिनट के लिए नमूना सेंट्रीफ्यूज। महादलित को त्याग दें। डीएनए गोली धोने के लिए 70% इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 x g पर 5 मिनट के लिए नमूना सेंट्रीफ्यूज। महादलित को त्याग दें। वायु शुष्क और न्यूक्लीज-मुक्त जल के 10 डिग्री सेल्सियस के साथ डीएनए गोली को भंग कर दें।

4. सेल परिवर्तन

  1. पिछले प्रकाशन5में वर्णित चरणों का पालन करके दूसरे PCR उत्पाद को पेश करने के लिए सक्षम एस म्यूतनएस WT तैयार करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को स्टोर करें।
    नोट: इस प्रयोग के लिए सक्षम एस म्यूनएस डब्ल्यूटी कोशिकाओं को पहले से ही -80 डिग्री सेल्सियस में संरक्षित किया गया है ताकि एस म्यूटन ]जी.टी.एफ.सी.
  2. पहले जमे हुए बर्फ-ठंडा सक्षम कोशिकाओं के 50 डिग्री एल एलिकोट के लिए केंद्रित दूसरे पीसीआर उत्पाद के 5 डिग्री एल मिलाएं। इलेक्ट्रोपोरेशन cuvettes में मिश्रण जोड़ें. विद्युत तंत्र का उपयोग करके कोशिकाओं को एकल विद्युत स्पंद (1ण्8 केवी, 2ण्5 म.प्र., 600 र्, 10 े) दे दी गई है।
  3. BHI शोरबा के 500 डिग्री एल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। तुरंत, भि आगर प्लेटों पर निलंबन के 10-100 डिग्री सेल्सियस फैला spectinomycin युक्त. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-6 दिनों के लिए तब तक इन्क्यूबेट करें जब तक कि कालोनियों को उठाया न जाए।

5. जीenome पुनर्संयोजन और भंडारण का सत्यापन

  1. कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन, gtfC आगे और कॉलोनी रिवर्स प्राइमर का उपयोग कर पुनर्संयोजन के लिए स्क्रीन करने के लिए। इलेक्ट्रोफोरीज़ प्रत्येक कॉलोनी पीसीआर उत्पाद एक agarose जेल पर। लगभग 1,500 बीपी के डीएनए टुकड़ा की पुष्टि करें.
  2. एक बाँझ टूथपिक का उपयोग कर सकारात्मक कालोनियों में से एक उठाओ और subculture कोशिकाओं रात भर BHI शोरबा के 2 एमएल में spectinomycin युक्त.
  3. बाँझ 50% ग्लिसरोल के 0.8 एमएल और स्टॉक के साथ जीवाणु संस्कृति के 0.8 एमएल मिलाएं -80 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. सेल निलंबन के शेष 1 एमएल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए चरण 2-3-2.7 दोहराएँ।
  5. एक टेम्पलेट के रूप में अप-फॉरवर्ड और डाउन-रिवर्स प्राइमर और जीनोमिक डीएनए का उपयोग करपीसी करें। जैल से प्रवर्धित डीएनए उत्पाद को शुद्ध करने के लिए चरण 3.2 दोहराएँ।
  6. डीएनए अनुक्रमण द्वारा शुद्ध प्रवर्धक के डीएनए अनुक्रम का निर्धारण.
    नोट: डीएनए अनुक्रमण द्वारा एस mutans उनकीgtfC की पीढ़ी की पुष्टि करने के लिए सुनिश्चित करें।

6. पॉलीहिस्टिडीन-टैग किए गए जीटीएफ-एसआई का शुद्धिकरण

  1. स्ट्रीक एस म्हणतात की, एक स्पेक्टिनोमाइसिन युक्त भि गर प्लेट पर उसकीgtfC. उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. BHI शोरबा के 3 एमएल में एक बाँझ टूथपिक और subculture कोशिकाओं का उपयोग कर एक एकल कॉलोनी उठाओ। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  3. स्पेक्टिनोमाइसिन के बिना भि शोरबा के 1 एल के साथ दो शंकु फ्लास्क तैयार करें। BHI शोरबा के 1 एल में रात भर संस्कृति निलंबन के 1 एमएल टीका. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  4. अमोनियम सल्फेट वर्षा द्वारा संस्कृति supernatant से प्रोटीन ध्यान केंद्रित.
    नोट:     कोशिका निकायों से निकालें यदि एक लक्ष्य प्रोटीन इंट्रासेल्यूलर है। अमोनियम सल्फेट वर्षण के लिए बुनियादी प्रक्रियाओं कहीं और12विस्तृत कर रहे हैं .
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x ग्राम पर 20 मिनट के लिए जीवाणु संस्कृति निलंबन सेंट्रीफ्यूज। एक 3 एल ग्लास बीकर में संस्कृति supernatant पुनर्प्राप्त करें।
    2. एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर जोरदार सरगर्मी के साथ सुपरनेंट (80% संतृप्ति) के 2 एल करने के लिए 1,122 ग्राम अमोनियम सल्फेट जोड़ें। वेग को हिलाने के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 ज या उससे अधिक के लिए बनाने की अनुमति दें।
      नोट: वेग गठन रात भर जारी रखा जा सकता है.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर अमोनियम सल्फेट-प्रक्षिप्त समाधान सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट को कम करें।
    4. एक spatula के साथ वेग ले लीजिए और एक 200 एमएल ग्लास बीकर में स्थानांतरण। बंधन बफर के 35 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित (50 एमएम NaH2पीओ4, 300 एमएम NaCl, 5 एमएम imidazole, पीएच 8.0).
    5. एक पुनर्जीवित सेलूलोज़ डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग कर बाध्यकारी बफर के 2,500 एमएल के खिलाफ निलंबन Dialyze, 4 डिग्री सेल्सियस पर, सरगर्मी के साथ. 2 ज के बाद डायलिसिस समाधान बदलें और रात भर डायलिसिस जारी रखें।
    6. डायलिसिस समाधान को फिर से बदलें। एक अतिरिक्त 2 ज के लिए डायलीज़ जारी रखें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर डायलेज निलंबन सेंट्रीफ्यूज। चूषण निस्पंदन उपकरण का उपयोग कर एक झिल्ली फिल्टर के माध्यम से supernatant फ़िल्टर। छान को 75 सेमी2 फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
  6. पॉलीहिस्टडीन-टैग किए गए GTF-SI को स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) द्वारा छाने गए निलंबन से भिन्न करें।
    1. एक क्रोमेटोग्राफिक कॉलम जिसका आउटलेट एक सिलिकॉन ट्यूब के लिए फिट है करने के लिए Ni-चार्जIMAC राल घोल (लगभग 1 एमएल राल) के स्थानांतरण 2 एमएल। गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा भंडारण समाधान निकालें।
      चेतावनी: राल IMAC भर में बाहर सुखाने के लिए अनुमति नहीं है.
    2. राल धोने के लिए कॉलम में 3 एमएल आसुत पानी डालें। राल को बराबर करने के लिए बाइंडिंग बफर का 5 एमएल जोड़ें।
    3. एक हॉफमैन चुटकी मुर्गा के साथ प्रवाह बंद करो. घोल बनाने के लिए चरण 6.5 से फ़िल्टर किए गए निलंबन के 5 एमएल जोड़ें।
    4. शेष फ़िल्टर किए गए निलंबन के लिए सभी घोल जोड़ें। मिश्रण को धीरे से 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
    5. मिश्रण को स्तंभ पर वापस लोड करें. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से निलंबन निकालें. बाइंडिंग बफर के 20 एमएल के साथ IMAC राल धो लें।
      नोट: बाद IMAC भर में एक हॉफमैन चुटकी मुर्गा के साथ लगभग 2 एमएल/मिनट के लिए प्रवाह दर समायोजित करें।
    6. Elution बफर के 20 एमएल के साथ रिकॉमबिनेंट GTF-SI Elute (50 m NaH2PO4, 300 m NaCl, 500 m imidazole, पीएच 8.0).
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। एल्यूएट को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए। IMAC राल पुन: उपयोग किया जा सकता है. IMAC राल के लिए निर्देशों को देखें.
  7. elution बफर भंडारण बफर (50 एमएम फॉस्फेट बफर, पीएच 6.5) के साथ बदलें और रिकॉमबिनेंट GTF-SI समाधान लगभग 1 एमएल एक केन्द्रापसारक अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाई का उपयोग करने के लिए ध्यान केंद्रित। रिकॉमबिनेंट GTF-SI समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
    नोट: SDS-PAGE13 और पश्चिमी blotting14 का उपयोग कर polyhistidine-tagged GTF-SI शुद्धि की पुष्टि एक घोड़े की दुकान peroxidase-कंजेटेड विरोधी polyhistidine मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर. CHAPS के अलावा (अंतिम एकाग्रता, 0.1%) के लिए eluent इकाई के लिए nonspecific अधिशोषण से बचने के लिए आवश्यक हो सकता है, लक्ष्य प्रोटीन के आधार पर.

7. रिकॉमबिनेंट GTF-एसआई द्वारा कार्यात्मक बहाली

  1. एक भी गर प्लेट पर व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक एस म्यूटनतनाव खींचो. प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. एक बाँझ टूथपिक का उपयोग करके, BHI शोरबा के 2 एमएल में टीका लगाने के लिए एक ही कॉलोनी उठाओ। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  3. एस mutans की रात भर की संस्कृति के 20 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें -GTFC एक गिलास परीक्षण ट्यूब में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 1% sucrose युक्त BHI शोरबा के 2 एमएल टीका करने के लिए। जी.टी.एफ.-एसआई या वाहन के समतुल्य मात्रा को S. mutans -gtfC संस्कृति में जोड़ें, और ट्यूब के साथ कोशिकाओं को रात भर एक इच्छुक स्थिति में रखा संस्कृति.
    नोट: एक बाँझ सिरिंज फिल्टर के साथ GTF-SI समाधान बाँझ और उपयोग करने से पहले एक bicinoninic एसिड प्रोटीन परख का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण15.
  4. 10 s. के लिए एक भंवर मिक्सर के साथ संस्कृति निलंबन उत्तेजित निलंबन Decant. आसुत पानी की पर्याप्त मात्रा के साथ टेस्ट ट्यूब धो लें।
  5. ट्यूब दीवार पर biofilms 0.25% Coomasie शानदार नीले (CBB) के 1 एमएल के साथ दाग.
  6. 1 मिनट के बाद दागदार घोल को छान लें, परखनली को पर्याप्त मात्रा में आसुत जल से धो लें। परखी नलियों को हवा में सुखाएं।

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Representative Results

चित्र 3 प्रथम PCR (चित्र 3क) तथा द्वितीय PCR ( चित्र 3ख ) से प्रत्येक प्रतक्षेप का आकारदर्शाता है। प्रत्येक प्रप्लिकन का आकार अनुमानित आकार के अनुरूप होता है, जैसा कि सारणी 1में वर्णित है। चित्र 4क में एस मटन कालोनियों को दूसरे पीसीआर उत्पाद के साथ परिवर्तित किया गया है और भि गार प्लेटों पर चढ़ाया गया है जिसमें स्पेक्टिनोमाइसिन है। कालोनी पीसीआर उत्पादों तो agarose जेल पर चलाया गया (चित्र 4B) . प्रत्येक प्रप्लिकॉन अनुमानित आकार का था, जैसा कि सारणी 1में वर्णित है। चित्र 5 में एसडीएस-पेज और पश्चिमी दाग की छवियां दिखाई देती हैं। IMAC के साथ शुद्ध प्रोटीन एसडीएस-पेज द्वारा एक एकल बैंड के रूप में मनाया गया (चित्र 5A) . पश्चिमी दाग विरोधी polyhistidine एंटीबॉडी का उपयोग कर के लिए पुष्टि की है कि मनाया बैंड की उम्मीद polyhistidine-टैग प्रोटीन था (चित्र 5B) 160 kDa की. चित्र 6 प्रत्येक एस mutans तनाव के sucrose व्युत्पन्न biofilm बनाने की क्षमता से पता चलता है. केवल एस mutans WT और एस mutans उनकेgtfC 1% sucrose की उपस्थिति में ट्यूब दीवार पर एक अनुयायी biofilm फार्म सकता है. यह S. mutans में नहीं देखा गया था -gtFC (चित्र 6A) . तथापि, पुनः संयोजक जी टी एफ-एसआई के योग ने एस म्यूटंस में अनुशीलित बायोफिल्म निर्माण क्षमता को पुनः स्थापित किया।

Figure 1
चित्र 1: एस mutans UA159 जीनोम और उसके डेरिवेटिव में gtfC और spcआर loci के संगठन. gtfC और spcrके बीच उनके टैग का एक योजनाबद्ध उदाहरण. जीन और अंतराल की लंबाई पैमाने पर नहीं कर रहे हैं. छायांकन पंचभुज: SMU$1004; ठोस पेंटागॉन: SMU$1006. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन2से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: दो कदम संलयन पीसीआर के लिए रणनीति। एसका एक योजनाबद्ध उदाहरण . म्यूटन उसका-gtfC निर्माण. जीन और अंतराल की लंबाई पैमाने पर नहीं कर रहे हैं. टेम्पलेट में प्राइमर-बाइंडिंग साइट्स प्रतिमानों द्वारा इंगित की जाती हैं. (ए) एस म्यूटन्स डब्ल्यूटी जीनोम में जी टी एफ सी जीन का हिस्सा होने वाले क्षेत्र और एस म्यूटमेंट्स में एस पी सी आर को आश्रय देने वाले क्षेत्र पहले पीसीआर का उपयोग करके प्रवर्धित किए गए थे। (बी) दूसरा पीसीआर नेस्टेड प्राइमर के साथ किया गया था जो पहले पीसीआर द्वारा टेम्पलेट के रूप में प्रवर्धित किए गए थे, और समजात पुनर्संयोजन के लिए डीएनए निर्माण प्राप्त किया गया था। (ग) उत्परिवर्ती विकृति बैक्टीरिया में समजात पुनर्संयोजन पर उत्पन्न हुई थी. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन2से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पहले और दूसरे पीसीआर उत्पादों के Agarose जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस। (ए) जीटीएफसी (जीटीएफसी; बाईं छवि) के एक भाग के पहले पीसीआर के उत्पाद और एसपीसी (एसपीसी; दाएँ प्रतिबिंब) को आश्रय देने वाले क्षेत्र दिखाए जाते हैं। एकल वैद्युतधर प्रतिबिंब को मार्कर बैंडों को लेबल करने के लिए विभाजित किया जाता है। (ख)नेस्टेड प्राइमर के साथ प्रवर्धित दूसरे पीसीआर उत्पाद दिखाए जाते हैं। प्रत्येक arrowhead प्रत्येक PCR उत्पाद का अनुमानित आकार इंगित करता है। एम जेड आणविक मार्कर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: कालोनी पीसीआर एस mutans उनकी-gtfCकी पीढ़ी स्क्रीन करने के लिए | (ए) दूसरे पीसीआर उत्पाद द्वारा रूपांतरित एस म्यूटेंट कालोनियों को दिखाया गया है। कालोनी आईडी वृत्तित संख्या द्वारा इंगित की जाती है। (ख)कॉलोनी पीसीआर उत्पादों के आगरोस जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस दिखाया गया है। वृत्तलेन संख्या चित्र 4कमें उपनिवेश आईडी से मेल खाती है। एम जेड आणविक मार्कर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: polyhistidine-tagged GTF-SI शुद्धि की पुष्टि. (ए) प्रतिनिधि एसडीएस-पेज छवि दिखाया गया है। (ख)प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा छवि दिखाया गया है. एक नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली जिस पर जीटीएफ-एसआई का तबादला किया गया था, की जांच एक हॉर्सराडिश परोक्सिडेस-कंजुटेड एंटी-पॉलीहिस्टिडीन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ की गई थी। एक केमियुमिनेसेंस ेशन प्रतिक्रिया का उपयोग करके इम्यूनोरेएक्टिव बैंड की कल्पना की गई थी। arrowheads पुनः संयोजक GTF-SI की भविष्यवाणी आकार से संकेत मिलता है. एम: आणविक मार्कर; IMAC से पहले 1 ] नमूना; 2 IMAC द्वारा प्राप्त नमूना. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: पुनः संयोजक GTF-SI के अलावा कार्यात्मक बहाली. (क)प्रत्येक एस म्यूटन स्ट्रेन के लिए सुक्रोज व्युत्पन्न अनुशीलन बायोफिल्म निर्माण की क्षमता दर्शायी गई है। (ख ) पुनः संयोजक GTF-SI (25 g) के अलावा एस म्यूटंस में अनुलग्न बायोफिल्मों के गठन की क्षमता को पुनः स्थापित किया गया था। WT ] एस mutans WT; [gtfC ]एस mutans ]gtfC; उसका-gtfC ]एस mutans उसके-gtfC| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.  

प्राइमर जोड़े अनुक्रम (5 [से 3]) अपेक्षित बैंड आकार (बीपी)
1 पीसीआर
जी.टी.एफ.सी.-फॉरवर्ड
जी.टी.एफ.सी.-रिवर्स ए,बी 		तागागटगटताटाकाकागगटगटताक
ATGATGATGATACTACC ACCTCC AAATCAAAAAATGTCAA		 1,090
एसपीसीआर-फॉरवर्ड ए,सी

एस.सी.सी.आर-रिवर्स		 GGTGGTAGTCATCATCATCAT कैट TAAATCGATTTTCGTGTGAAT
तातागागाकागट्टागाटागाकागटैक्टाक		 2,232
2 पीसीआर
नेस्टेड-आगे
नेस्टेड-रिवर्स		 टीजीगटाट्टाटाटाटगटीसी
जीसीकैटागाआट्टTTCTGCTAAATTCG		 3,179
पुनर्संयोजन का सत्यापन
कॉलोनी पीसीआर
जी.टी.एफ.सी.-फॉरवर्ड
कालोनी-रिवर्स		 तागागटगटताटाकाकागगटगटताक
सीसीसीटीसीसीच्या कागद-यागटा		 1,482
अंतिम सत्यापन
ऊपर आगे
डाउन-रिवर्स		 टीएसीजीसीसीजीटीएजीटीटीएजीटीसीटीजीजीजी
TTGTCCACTGAGTCAACGTCTGCAAGGCATG		 6,173

तालिका 1: प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया प्राइमर. एक 'gtfC-रिवर्स और spcr-forward'के रेखांकित दृश्यों पूरक हैं, और उनके टैग के लिए बोल्ड-टाइप दृश्यों कोड (gtfC-रिवर्स; ATGATGATGATG, spcr-forward; CATCATCATCATCAT) और जी एस लिंकर (gtfC-रिवर्स; ACTACCACCTCC, spcr-forward; GGTGGTAGT). बी gtfC के डीएनए रोक codon हटा दिया गया है. सी एक डीएनए रोक codon (TAA) polyhistidine-कोडिंग दृश्यों के तुरंत बाद जोड़ा गया है.

अभिकर्मक स्टॉक समाधान की एकाग्रता आयतन अंतिम एकाग्रता
डीएनए पॉलिमरेज प्रीमिक्स 2x 25 जेडएल 1x
फॉरवर्ड प्राइमर 5 $M 2 $L 0.2 $M
रिवर्स प्राइमर 5 $M 2 $L 0.2 $M
टेम्पलेट डीएनए चर चर चर
Deionized पानी - 50 डिग्री सेल्सियस तक -

तालिका 2: पीसीआर अभिकर्मकों: पहले पीसीआर के लिए, डीएनए टेम्पलेट के 2 $L जोड़ा गया था। दूसरी पीसीआर के लिए, पहली पीसीआर amplicon के 0.5-2 $L प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया था। कॉलोनी पीसीआर के लिए, जीवाणु कोशिकाओं को सीधे प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा गया.

चरण तापमान समय चक्रों की संख्या
प्रारंभिक विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट 1
विकृतीकरण
अनीलन
एक्सटेंशन		 98 डिग्री सेल्सियस
50 डिग्री सेल्सियस
72 डिग्री सेल्सियस		 10 एस
5 एस
एम्प्लिकॉन-निर्भर
(1 मिनट/		 35
अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस एम्प्लिकॉन-निर्भर
(1 मिनट/		 1

तालिका 3: पीसीआर प्रवर्धन चक्र.

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Discussion

प्राइमर के डिजाइन प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है. gtfC-रिवर्स और एसपीसीआर-फॉरवर्डप्राइमर के अनुक्रम ों का निर्धारण gtfC के 3 के अंत क्षेत्र और एसपीसीआरके 5 के अंत क्षेत्र दोनों के अनुक्रमों के आधार पर स्वचालित रूप से निर्धारित किया गया था। प्रत्येक प्राइमर में 24 पूरक आधार शामिल हैं जो जीएस लिंकर को एन्कोड करते हैं और उनके 5 'क्षेत्रओं में उनका टैग-कोडिंग अनुक्रम होता है। अपस्ट्रीम पार्श्वक्षेत्रों में स्थित देशी विनियामक अनुक्रमों के विघटन को 3 डिग्री अंत में उनके टैग-कोडिंग अनुक्रमों के अतिरिक्त द्वारा टाला जा सकता है। डीएनए रोक codon gtfCसे हटाया जाना चाहिए -रिवर्स प्राइमर और spcआर-आगेप्राइमर करने के लिए जोड़ा. इसके अलावा, gtfC-forward और spcr-रिवर्स एस mutans WT जीनोम में समजात पुनर्संयोजन के लक्ष्य क्षेत्र के लगभग 1 केबी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम के flanking क्षेत्रों बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए, क्रमशः. लंबे flanking दृश्यों के अलावा समजात पुनर्संयोजन की दक्षता में सुधार. नेस्टेड प्राइमर इस प्रोटोकॉल में बाहरी प्राइमर जोड़ी(gtfC-forward और spcr-reverse)के बजाय उपयोग किए जाने के लिए डिज़ाइन किए गए थे। दूसरे पीसीआर के लिए नेस्टेड प्राइमर को शामिल करना आवश्यक है, जैसा कि कहीं और5विस्तृत है।

इलेक्ट्रोपोट्रेशन द्वारा परिवर्तन कुशल1 है और सक्षम सेल तैयारी के लिए प्रक्रियाएं इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले की प्रक्रियाएं भी वैकल्पिक विधियों की तुलना में बहुत सरल हैं16,17,18, यद्यपि एक विद्युत उपकरण की आवश्यकता होती है। विद्युत व्यवस्था के बाद प्लेट पर लापता कालोनियों के मामले में सक्षम एस म्यूटनएस डब्ल्यूटी नए सिरे से तैयार करने की पुरजोर सिफारिश की जाती है। हालांकि विद्युत अपाहिजहोने के बाद कुछ घंटों के लिए ऊष्मायन परिवर्तन दक्षता में सुधार कर सकता है, अतिरिक्त ऊष्मायन परिवर्तन की सफलता को प्रभावित नहीं करता है। लॉग वृद्धि चरण में कोशिकाओं सक्षम सेल तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जैसा कि पहले वर्णित5.

चूंकि पुनः संयोजक प्रोटीन की मात्रा जीन की मूल अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, पैमाने पर संस्कृति कम अभिव्यक्ति के साथ प्रोटीन के मामलों में आवश्यक हो सकता है. यहाँ प्रस्तुत विधि कार्यात्मक बहाली परख के आवेदन द्वारा सीमित है. ब्याज के जीन के अलावा intracellular प्रोटीन exogenously करने के लिए लागू नहीं किया जा सकता है. हालांकि, विकसित विधि सुविधा के मामले में काफी लाभ प्रस्तुत करता है, दक्षता, और लागत (जैसे, पीसीआर के अलावा कोई एंजाइमी प्रतिक्रियाओं) जब extracellular लक्ष्य प्रोटीन के साथ काम कर रहे. इसके अतिरिक्त, पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि और वास्तविक जीन अभिव्यक्ति की पुष्टि केवल सामान्य उसके टैग अनुप्रयोगों का उपयोग करके किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 5में दिखाया गया है।

जीन व्यवधान और जीन उत्पाद अलगाव सहित वर्तमान विधि, ब्याज की एक जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सीरियल प्रयोगों के रूप में अन्य प्रजातियों में भविष्य में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS) (संख्या 16K15860 और 19K10471 टी एम, 17K12032 से एम.आई., और 18K09926 एन एच) और SECOM विज्ञान और प्रौद्योगिकी फाउंडेशन (SECOM) (अनुदान 2018.00) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Nippon Genetics NE-AG02 For agarose gel electrophoresis
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody MBL D291-7 HRP-conjugated
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227 Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture medium
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit Sartorius VS2032 Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge Kubota 7780II
Chromatographic column Bio-Rad 7321010 For IMAC
Dialysis membrane clamp Fisher brand 21-153-100
Dialysis tubing As One 2-316-06
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing Eurofins Genomics
ECL substrate Bio-Rad 170-5060 For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0) Wako 311-90075 Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette Bio-Rad 1652086 0.2 cm gap
Electroporator Bio-Rad 1652100
EtBr solution Nippon Gene 315-90051 For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Imager GE Healthcare 29083461 For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole Wako 095-00015 Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments EZ-022 Temperature setting: 4 °C
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments LH-100-RDS Temperature setting: 37 °C
Membrane filter Merck Millipore JGWP04700 0.2 µm diameter
Microcentrifuge Kubota 3740
NaCl Wako 191-01665 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O Wako 192-02815 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH Wako 198-13765 Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4 Wako 015-06737 Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin Bio-Rad 1560133 For IMAC
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered
Protein standard Bio-Rad 161-0381 For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus As One FH-1G
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter Merckmillipore SLGV004SL 0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC Stock strain in the lab. gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159 Stock strain in the lab. S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
TAE (50 × ) Nippon Gene 313-90035 For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler Bio-Rad PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) Wako 314-90065 Tris-EDTA buffer preparation

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 151 एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर जीन डीएनए निर्माण इलेक्ट्रोपोरेशन जीन व्यवधान जीन अभिव्यक्ति जीन समारोह समजात पुनर्संयोजन स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी पॉलीहिस्टाइन टैग पॉलिमरेज शृंखला अभिक्रिया प्राइमर डिजाइन स्ट्रेप्टोकॉकस म्यूटान
<em>स्ट्रेप्टोकॉकस म्यूटान</em> में एक उच्च आण्विक द्रव्यमान प्रोटीन की शुद्धि
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Murata, T., Yamashita, M., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (151), e59804, doi:10.3791/59804 (2019).

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