Summary
Décrit ici est une méthode simple pour la purification d'un produit génique dans Streptococcus mutans. Cette technique peut être avantageuse dans la purification des protéines, en particulier les protéines membranaires et les protéines de masse moléculaire élevée, et peut être utilisée avec diverses autres espèces bactériennes.
Abstract
L'élucidation de la fonction d'un gène implique généralement la comparaison des traits phénotypiques des souches et souches de type sauvage dans lesquelles le gène d'intérêt a été perturbé. La perte de fonction à la suite d'une perturbation génétique est ensuite rétablie par l'ajout exogène du produit du gène perturbé. Cela aide à déterminer la fonction du gène. Une méthode précédemment décrite consiste à générer une souche de Streptococcus mutans perturbée par le gène gtfC. Ici, une méthode peu exigeante est décrite pour purifier le produit de gène de gtfC de la souche nouvellement produite de S. mutans suivant la perturbation de gène. Il s'agit de l'ajout d'une séquence de codage de polyhistidine à l'extrémité 3 du gène d'intérêt, ce qui permet une simple purification du produit génique à l'aide d'une chromatographie d'affinité métallique immobilisée. Aucune réaction enzymatique autre que PCR n'est requise pour la modification génétique de cette méthode. La restauration du produit génique par ajout exogène après la rupture des gènes est une méthode efficace pour déterminer la fonction génique, qui peut également être adaptée à différentes espèces.
Introduction
L'analyse de la fonction d'un gène implique généralement la comparaison des traits phénotypiques des souches de type sauvage aux souches dans lesquelles le gène d'intérêt a été perturbé. Une fois que la souche perturbée par le gène est produite, l'ajout exogène du produit génique permet une restauration fonctionnelle.
La méthode la plus courante pour obtenir les produits géniques purifiés requis pour les essais de restauration ultérieures est en effectuant l'expression hétérologue dans Escherichia coli1. Cependant, l'expression des protéines membranaires ou des protéines de masse moléculaire élevée est souvent difficile à l'aide de ce système1. Dans ces cas, la protéine cible est habituellement isolée des cellules qui synthétisent la protéine par une série complexe d'étapes, qui peuvent mener à la perte du produit génique. Pour surmonter ces problèmes, une procédure simple a été développée pour la purification des produits géniques à la suite d'une méthode de perturbation génétique2, pcR à base de méthode d'épissage de l'ADN3 (désigné en deux étapes de fusion PCR), et l'électroporation pour la génétique transformation dans Streptococcus mutans. L'ajout d'une étiquette de polyhistidine (His-tag) au c-terminus du produit génique facilite sa purification par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC).
Pour isoler la souche His-tag-expressing, l'ADN génomique entier du gène d'intérêt (dans cette souche son-étiquette-exprimant gène-perturbé) est remplacé par un gène de marqueur antibiorésistant. La procédure pour générer la souche His-tag-exprimant est presque identique à celle pour générer une souche gène-perturbée comme décrit précédemment4,5. Par conséquent, les méthodes de perturbation génétique et d'isolement des produits géniques devraient être effectuées en série d'expériences pour l'analyse fonctionnelle.
Dans le présent travail, une séquence de codage de polyhistidine est attachée à l'extrémité 3 du gène gtfC (GenBank locus tag SMU 1005), codant la glucosyltransferase-SI (GTF-SI) en S. mutans6. Ensuite, des études d'expression chez une espèce streptococcique ont été réalisées. Il est difficile d'atteindre l'expression hétérologue de la gtfC par E. coli, probablement en raison de la masse moléculaire élevée de GTF-SI. Cette souche est nommée S. mutans His-gtfC. Une illustration schématique représentant l'organisation de la cassette de gène de résistance à la gtfC et à la spectinomycine (spcr)7 loci dans le type sauvage S. mutans (S. mutans WT) et ses dérivés est montrée dans Figure 1. Le GTF-SI est une protéine sécrétrice qui contribue au développement du biofilm dentaire cariogénique6. Sous la présence du saccharose, un biofilm adhérent est observé sur une surface de verre lisse dans la souche WT S. mutans, mais pas dans la souche S. mutans gtfC-perturbée (S. mutans 'gtfC)2,5 . La formation de biofilms est restaurée dans S. mutans -gtfC après l'ajout exogène du GTF-SI recombinant. La souche, S. mutans His-gtfC, est ensuite utilisé pour produire le GTF-SI recombinant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE: Génération de S. mutans gtfC, dans lequel toute la région de codage du gène gtfC est remplacée par spcr, doit être complétée avant d'effectuer ces protocoles. Consultez l'article publié pour plus de détails sur la génération5.
1. Conception d'apprêt
-
Préparer les amorces pour la construction de S. mutans His-gtfC.
REMARQUE: Les séquences d'amorce utilisées dans ce protocole sont indiquées dans le tableau 1. La méthode PCR de fusion en deux étapes pour la génération de S. mutans His-gtfC est schématiquement illustrée dans la figure 2.- Amorces de conception(gtfC-reverse et spcr-forward)pour l'attachement de sa séquence de codage de tag, intervenant entre le gène gtfC et spcr (Figure 2A).
- Inclure le lien GS et la séquence de codage His-tag dans les deux amorces gtfC-reverse et spcr-avant,dans lesquelles 24 bases aux régions de 5' sont complémentaires les unes aux autres.
REMARQUE : La séquence d'acides aminés du lien GS et de son étiquette (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-His) est attachée au terminus C de GTF-SI par la traduction de gènes. - Concevoir une amorce gtfC-avantpour cibler le gène gtfC dans le génome de S. mutans WT en aval du gène et l'amorce spcr-reversepour cibler la région de flanc en aval de spcr dans le S. mutans -gtfC. Définir la température de fonte8 (Tm) du gtfC-avant et spcr-inverse amorces pour correspondre avec les températures de fonte de la gtfC-inverse et spcr- amorces avant, respectivement.
- Inclure le lien GS et la séquence de codage His-tag dans les deux amorces gtfC-reverse et spcr-avant,dans lesquelles 24 bases aux régions de 5' sont complémentaires les unes aux autres.
- Concevoir des amorces non-parisées (nichées vers l'avant et inversées) pour le deuxième PCR (Figure 2B).
- Amorces de conception(gtfC-avant et colonie-revers) spécifiques pour l'ADN génomique du transformateur (figure 2C; les amorces sont utilisées pour la colonie PCR).
REMARQUE: Les amplicons chevauchent la frontière entre gtfC et spcr. L'amorce avant gtfCpeut être appliquée comme amorce avant. - Amorces de conception (vers l'avant et vers le bas) pour la confirmation finale de la génération de S. mutans His-gtfC (Figure 2C; le produit PCR amplifié par les amorces est utilisé pour le séquençage de l'ADN).
- Amorces de conception(gtfC-reverse et spcr-forward)pour l'attachement de sa séquence de codage de tag, intervenant entre le gène gtfC et spcr (Figure 2A).
2. Extraction d'ADN génomique de S. mutans
REMARQUE: Chaque souche de S. mutans doit être cultivée dans le milieu d'infusion cardiaque du cerveau (BHI) à 37 oC dans des conditions anaérobies. Les souches mutantes de S. mutans et S. mutans His-gtfC sont cultivées en BHI complétées par une spectinomycine de 100 g/mL.
- Streak S. mutans WT et S. mutans -gtfC séparément sur chacune des plaques d'agar BHI. Incuber pendant la nuit à 37 oC.
- Choisissez des colonies simples de S. mutans WT ou S. mutans -gtfC à l'aide d'un cure-dent stérilisé et inoculez-vous dans 1,5 ml de bouillon BHI. Incuber pendant la nuit à 37 oC.
REMARQUE: Les colonies peuvent être utilisées comme source d'ADN modèle pour le premier PCR (étape 3.1). - Transférer 1 ml de chaque culture bactérienne dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Centrifugelant la culture pendant 1 min à 15 000 x g.
- Retirez le supernatant et ajoutez 1 ml du tampon Tris-EDTA (pH 8,0) pour suspendre à nouveau le granule cellulaire.
- Centrifugeuse suspension pendant 1 min à 15 000 x g. Retirez le supernatant. Resuspendre la pastille cellulaire dans 50 oL de tampon Tris-EDTA (pH 8,0).
- Chauffer la suspension à l'aide d'un incubateur de blocs pendant 5 min à 95 oC. Centrifugeuse suspension pendant 5 min à 15 000 x g.
- Transférer le supernatant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml (le supernatant servira d'ADN modèle pour le premier PCR).
3. Amplification DE PCR
REMARQUE: Le tableau 1, le tableau 2et le tableau 3 résument respectivement les amorces, les réactifs et les cycles d'amplification du PCR.
- Effectuez le premier PCR en utilisant le génome S. mutans WT et S. mutans gtfC comme modèles PCR. Amplifiez les régions abritant la partie aval du gène gtfC et celles qui hébergent spcr à l'aide des amorces décrites à l'étape 1.1.1.2 (Figure 2A).
- Électrophorese chaque produit PCR sur 1% gel agarose. Accises les fragments d'ADN souhaités d'environ 1 000 pb et 2 000 pb. Purifiez les fragments des gels à l'aide de la méthode d'extraction de gel à base de membrane de silice.
REMARQUE: Les procédures de base pour PCR9, l'électrophorèse de gel d'ADN10,et la purificationd'ADN 11 sont détaillées ailleurs. - Effectuez un deuxième PCR à l'aide des produits du premier PCR (environ équimolar) comme modèles PCR avec les amorces non remue-avant et nichées -inversées (figure 2B).
- Électrophorese un dixième du mélange PCR sur le gel d'agarose. Confirmer la génération de l'amplicon approprié d'environ 3 000 pb.
-
Précipitez le produit PCR restant.
REMARQUE : La purification du produit PCR n'est pas nécessaire, car les amplicons non spécifiques générés par le deuxième PCR n'interfèrent pas avec la recombinaison homologue.- Ajouter de l'eau sans nauséabonde au mélange DE PCR et porter le volume total à 100 l, suivi de 0,1 volume (10 l) d'acétate de sodium de 3 M (pH 5,2) et de 2,5 volumes (250 l) d'éthanol absolu. Mélanger et conserver le mélange pendant 10 min à température ambiante (RT).
- Centrifuger l'échantillon pendant 20 min à 15 000 x g à 4 oC. Jetez le supernatant. Ajouter 1 ml d'éthanol à 70 % pour laver le granule d'ADN.
- Centrifuger l'échantillon pendant 5 min à 15 000 x g à 4 oC. Jetez le supernatant. Séchez et dissez la pastille d'ADN avec 10 l l d'eau exempte de nucléane.
4. Transformation cellulaire
- Préparer compétent S. mutans WT pour introduire le deuxième produit PCR en suivant les étapes décrites dans la publication précédente5. Conserver les cellules à -80 oC.
REMARQUE: Pour cette expérience, les cellules WT compétentes de S. mutanont déjà été conservées en -80 oC pour générer S. mutans etgtfC. - Mélanger 5 'L du deuxième produit PCR concentré à l'aliquot de 50 L de cellules compétentes glacées congelées précédemment. Ajouter le mélange dans des cuvettes d'électroporation. Donner une seule impulsion électrique (1,8 kV, 2,5 ms, 600 , 10 F) aux cellules à l'aide de l'appareil d'électroporation.
- Resuspendre les cellules dans 500 'L de bouillon BHI. Immédiatement, étalez 10 à 100 l de la suspension sur des plaques d'agar BHI contenant de la spectinomycine. Incuber les assiettes pendant 2 à 6 jours à 37 oC jusqu'à ce que les colonies aient suffisamment grandi pour être ramassées.
5. Vérification de larecombinaison et du stockage de Genome
- Effectuer la PCR de la colonie, à l'aide d'amorces gtfC-avant et de colonie-inversées pour dépister la recombinaison. Électrophorese chaque produit PCR de colonie sur un gel d'agarose. Confirmer le fragment d'ADN d'environ 1 500 pb.
- Choisissez l'une des colonies positives à l'aide d'un cure-dent stérilisé et la sous-culture des cellules pendant la nuit dans 2 ml de bouillon BHI contenant de la spectinomycine.
- Mélanger 0,8 ml de culture bactérienne avec 0,8 ml de glycérol stérile à 50 % et stocker à -80 oC ou -20 oC.
- Transférer les 1 ml restants de suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Répétez les étapes 2.3-2.7 pour extraire l'ADN génomique des cellules.
- Effectuez PCR en utilisant les amorces vers l'avant et vers le bas et l'ADN génomique comme modèle. Répétez l'étape 3.2 pour purifier le produit d'ADN amplifié des gels.
- Déterminer la séquence d'ADN de l'amplicon purifié par séquençage de l'ADN.
REMARQUE: Assurez-vous de confirmer la génération de S. mutans Son-gtfC par séquençage de l'ADN.
6. Purification du GTF-SI étiqueté polyhistidine
- Streak S. mute sa gtfC sur une plaque d'agar BHI contenant de la spectinomycine. Incuber pendant la nuit à 37 oC.
- Ramassez une seule colonie à l'aide d'un cure-dent stérilisé et de cellules de sous-culture dans 3 ml de bouillon de BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.
- Préparer deux flacons coniques avec 1 L de bouillon BHI sans spectinomycine. Inoculer 1 ml de la suspension de culture de nuit dans 1 L du bouillon BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.
- Concentrer les protéines du supernatant de culture par la précipitation de sulfate d'ammonium.
REMARQUE : Extraire des corps cellulaires si une protéine cible est intracellulaire. Les procédures de base pour les précipitations de sulfate d'ammonium sont détaillées ailleurs12.- Centrifugelant la suspension de culture bactérienne pendant 20 min à 10 000 x g à 4 oC. Récupérer le supernatant de culture dans un bécher en verre de 3 L.
- Ajouter 1 122 g de sulfate d'ammonium à 2 L du supernatant (80% de saturation) avec un remuant vigoureux à l'aide d'un agitateur magnétique. Laisser le précipité se former pendant 4 h ou plus à 4 oC en remuant.
REMARQUE : La formation précipitée peut se poursuivre pendant la nuit. - Centrifugeuse solution précipitée par le sulfate d'ammonium à 15 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Decant le supernatant.
- Recueillir le précipité à l'une spatule et le transférer dans un bécher en verre de 200 ml. Resuspendre les granulés en 35 ml de tampon de liaison (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8,0).
- Dialyser la suspension contre 2 500 ml du tampon de liaison à l'aide d'un tube de dialyse de cellulose régénéré, à 4 oC, en remuant. Remplacer la solution de dialyse après 2 h et poursuivre la dialyse toute la nuit.
- Remplacez à nouveau la solution de dialyse. Continuer à dialyser pendant 2 h supplémentaires.
- Centrifuger la suspension dialysée à 20 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Filtrer le supernatant à l'aide d'un filtre à membrane à l'aide d'un équipement de filtration par aspiration. Transférer le filtrate dans un flacon de 75 cm2.
- Fractionner le GTF-SI étiqueté polyhistidine de la suspension filtérée par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC).
- Transférer 2 ml de boue de résine IMAC chargée par Ni (environ 1 ml de résine) dans une colonne chromatographique dont la sortie est montée sur un tube de silicone. Retirez la solution de stockage par le flux de gravité.
MISE EN GARDE: Ne laissez pas la résine sécher dans l'ensemble de l'IMAC. - Ajouter 3 ml d'eau distillée dans la colonne pour laver la résine. Ajouter 5 ml du tampon de liaison pour réquiliber la résine.
- Arrêtez le flux avec une bite Hoffmann pincement. Ajouter 5 ml de la suspension filtrée de l'étape 6.5 pour faire la boue.
- Ajouter toute la boue à la suspension filtrée restante. Faire tourbillonner doucement le mélange pendant 30 min à 4 oC.
- Chargez le mélange sur la colonne. Retirez la suspension par le flux de gravité. Laver la résine IMAC avec 20 ml de tampon de liaison.
REMARQUE: Ajustez le débit à environ 2 ml/min avec un coq Hoffmann pincement tout au long de l'IMAC suivant. - Elute le GTF-SI recombinant avec 20 mL de tampon d'élution (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8,0).
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. L'éluate doit être stockée à 4 oC. La résine IMAC peut être réutilisée. Consultez les instructions pour la résine IMAC.
- Transférer 2 ml de boue de résine IMAC chargée par Ni (environ 1 ml de résine) dans une colonne chromatographique dont la sortie est montée sur un tube de silicone. Retirez la solution de stockage par le flux de gravité.
- Remplacez le tampon d'élution par le tampon de stockage (tampon de phosphate de 50 mM, pH 6,5) et concentrez la solution RecombinantGTF-SI à environ 1 ml à l'aide d'une unité d'ultrafiltration centrifuge. Entreposez la solution GTF-SI recombinante à 4 oC.
REMARQUE: Confirmer la purification GTF-SI étiquetée polyhistidine à l'aide de SDS-PAGE13 et de l'ouest de l'ouest en utilisant un anticorps monoclonal anti-polyhistidine conjugué au raifort. Ajout de CHAPS (concentration finale, 0,1 %) à l'éluence peut être nécessaire pour éviter l'adsorption non spécifique à l'unité, selon la protéine cible.
7. Restauration fonctionnelle par Recombinant GTF-SI
- Stries chaque souche S. mutansur une plaque d'agar BHI individuellement. Incuber les assiettes toute la nuit à 37 oC.
- À l'aide d'un cure-dent stérilisé, prendre une seule colonie pour inoculer 2 ml de bouillon de BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.
- Utilisez 20 l de la culture de la nuit de S. mutans etgtfC pour inoculer 2 ml de bouillon DE BHI contenant 1 % de saccharose sans antibiotiques dans un tube à essai en verre. Ajoutez le GTF-SI ou un volume équivalent du véhicule à la culture S. mutans etgtfC, et cultureles les cellules avec le tube placé en position inclinée pendant la nuit.
REMARQUE: Stérilisez la solution GTF-SI à l'aide d'un filtre à seringues stériles et déterminez la concentration en protéines à l'aide d'un test de protéines d'acide bicinchoninique15 avant utilisation. - Agiter les suspensions de culture avec un mélangeur de vortex pour 10 s. Décant les suspensions. Laver les tubes à essai avec une quantité suffisante d'eau distillée.
- Tainer les biofilms sur la paroi du tube avec 1 ml de 0,25% Coomassie bleu brillant (CBB).
- Décant la solution de coloration après 1 min. Laver les tubes à essai avec une quantité suffisante d'eau distillée. Séchez à l'air les tubes à essai.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 3 montre la taille de chaque amplicon du premier PCR (Figure 3A) et du deuxième PCR (Figure 3B). La taille de chaque amplicon correspondait à la taille prévue, tel que décrit dans le tableau 1. La figure 4A montre des colonies de S. mutans transformées avec le deuxième produit PCR et plaquées sur les plaques d'agar BHI contenant de la spectinomycine. Les produits Colony PCR étaient ensuite exécutés sur le gel d'agarose (Figure 4B). Chaque amplicon était de la taille prévue, tel que décrit dans le tableau 1. La figure 5 montre des images de SDS-PAGE et western blot. Les protéines purifiées avec IMAC ont été observées en bande unique par SDS-PAGE (Figure 5A). Western blot a été réalisée à l'aide de l'anticorps anti-polyhistidine pour confirmer que la bande observée était la protéine étiquetée polyhistidine attendue (figure 5B) de 160 kDa. La figure 6 montre la capacité de formation de biofilms dérivéedu par le saccharose de chaque souche de S. mutans. Seuls S. mutans WT et S. mutans His-gtfC pourrait former un biofilm adhérent sur la paroi du tube en présence de 1% de saccharose. Cela n'a pas été observé dans S. mutans -gtfC (Figure 6A). Cependant, l'ajout du GTF-SI recombinant a restauré la capacité de formation de biofilms adhérents chez S. mutans (gtfC (Figure 6B).
Figure 1 : Organisation du gtfC et du spcr loci dans le génome de S. mutans UA159 et ses dérivés. Une illustration schématique de la His-tag entre gtfC et spcr. La longueur des gènes et des lacunes ne sont pas à l'échelle. Pentagone ombragé : SMU-1004 ; pentagone solide: SMU 1006. Ce chiffre a été modifié par rapport à une publication précédente2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Stratégie de fusion en deux étapes PCR. Une illustration schématique de S. mutans (mutans) Sa constructiongtfC. La longueur des gènes et des lacunes ne sont pas à l'échelle. Les sites de liaison d'amorce dans le modèle sont indiqués par des modèles. (A) Les régions abritant une partie du gène gtfC dans le génome de S. mutans WT et hébergeant spcr dans le génome de S. mutans -gtfC ont été amplifiées à l'aide du premier PCR. (B) Le deuxième PCR a été exécuté avec des amorces nichées utilisant les deux fragments qui ont été amplifiés par le premier PCR comme modèles, et une construction d'ADN pour la recombinaison homologue a été obtenue. (C) La souche mutante a été générée lors d'une recombinaison homologue chez les bactéries. Ce chiffre a été modifié par rapport à une publication précédente2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Électrophorèse de gel d'agarose des premiers et deuxièmes produits de PCR. (A) Les produits du premier PCR d'une partie de gtfC (gtfC; image gauche) et de la région abritant spcr (spcr; image droite) sont affichés. L'image électrophorétique unique est divisée pour étiqueter les bandes de marqueurs. (B) Les deuxièmes produits PCR amplifiés avec les amorces nichées sont présentés. Chaque pointe de flèche indique la taille prévue de chaque produit PCR. M - marqueur moléculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Colony PCR à la génération d'écran de S. mutans His-gtfC. (A) S. mutans colonies transformées par le deuxième produit PCR sont montrés. L'ID de la colonie est indiqué par des nombres encerclés. (B) Agarose gel électrophoresis of the colony PCR products is shown. Le numéro de voie encerclée correspond à l'ID de la colonie à la figure 4A. M - marqueur moléculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Confirmation de la purification gTF-SI étiquetée polyhistidine. (A) L'image sDS-PAGE représentative est affichée. (B) L'image de tache occidentale représentative est montrée. Une membrane de nitrocellulose sur laquelle GTF-SI a été transféré a été sondée avec un anticorps monoclonal anti-polyhistidine de peroxidase de raifort- conjugué. Des bandes immunoréactives ont été visualisées utilisant une réaction de chemiluminescence. Les pointes de flèche indiquent la taille prévue du GTF-SI recombinant. M: marqueur moléculaire; 1 échantillon avant l'IMAC; Échantillon obtenu par l'IMAC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Restauration fonctionnelle par ajout du GTF-SI recombiné. (A) La capacité de la formation de biofilm adhérent dérivé du saccharose est démontrée pour chaque souche de S. mutans. (B) La capacité de former des biofilms adhérents a été restaurée dans S. mutans gtfC par l'ajout de GTF-SI recombinant (25 g). WT et S. mutans WT; 'gtfC 'S. mutans 'gtfC; Son-gtfC -S. mutans His-gtfC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Paires d'amorce | Séquence (5 à 3)) | Taille prévue de la bande (bp) | ||
| 1er PCR | ||||
|
gtfC-avant gtfC-revers A,B |
TAAAGGTTATGTTATTATTCAACGAGTGGTAACC ATGATGATGATGATGatGACTACCACCTCC AAATCTAAgaAATTGTCAA AAATCTAAAGAAATTGTCAA AAATCTAAAGAAATTGTCAA AAAT |
1,090 | ||
|
spcr-avant A,C spcr-revers |
GGTGGTAGTCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT CHAT (CHAT) TAAATCGATTTTCGTTCGTGAAT TTAAGAGCAAGTTTATAGTAGACATGTTACTCAC |
2,232 | ||
| 2ème PCR | ||||
| Niché vers l'avant Inversé niché |
TGGTATTATTTCGATAATACGGTTATGGTCAC GCCATACTTAGAGAAATTTTTTTTTTGCTAATTCTTTTG |
3,179 | ||
| Vérification de la recombinaison | ||||
| Colonie PCR | ||||
|
gtfC-avant Colonie-inverse |
TAAAGGTTATGTTATTATTCAACGAGTGGTAACC CCACTCTCAACTCCTGATCCAACATGTAAGTACC |
1,482 | ||
| Vérification finale | ||||
| Vers l'avant Revers |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
6,173 | ||
Tableau 1 : Amorces utilisées dans le protocole. A A (En) Les séquences soulignées de 'gtfC-reverse et spcr-forward'sont complémentaires, et les séquences de caractère stylisé code pour le His-tag(gtfC-revers; ATGATGATGATGATGATG, spcr-avant; CATCATCATCATCATCATCAT) et GS linker(gtfC-reverse; ACTACCACCACCTCC, spcr-avant; GGTGGTAGT). B (en) Le codon d'arrêt d'ADN de gtfC a été enlevé. C (en) Un codon d'arrêt d'ADN (TAA) a été ajouté immédiatement après les séquences de polyhistidine-codage.
| réactif | Concentration de la solution de stock | volume | Concentration finale |
| Prémélange de polymérase d'ADN | 2x 2x | 25 l | 1x 1x |
| Apprêt vers l'avant | 5 M | 2 l | 0,2 M |
| Apprêt inversé | 5 M | 2 l | 0,2 M |
| Adn de modèle | variable | variable | variable |
| Désionisée | - | Jusqu'à 50 l | - |
Tableau 2 : Réagents PCR: Pour le premier PCR, 2 L du modèle d'ADN ont été ajoutés. Pour le deuxième PCR, 0,5-2 L de premier amplicon PCR a été ajouté au mélange de réaction. Pour la colonie PCR, des cellules bactériennes ont été directement ajoutées au mélange de réaction.
| pas | température | temps | Nombre de cycles |
| Dénaturation initiale | 98 oC | 2 min | 1 |
| Dénaturation Recuit prolongation |
98 oC 50 oC 72 oC |
10 s 5 s Amplicon-dépendant (1 min/1 kbp) |
35 |
| Prolongation finale | 72 oC | Amplicon-dépendant (1 min/1 kbp) |
1 |
Tableau 3 : cycles d'amplification PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La conception des amorces est l'étape la plus critique du protocole. Les séquences des amorces gtfC-reverse et spcr-avantont été automatiquement déterminées en fonction des séquences de la région d'extrémité de 3 degrés de gtfC et de la région de fin de 5 degrés de spcr. Chaque amorce comprend 24 bases complémentaires qui codent un lien GS et une séquence de codage His-tag dans leurs régions de 5'. La perturbation des séquences réglementaires indigènes situées dans les régions de flanc en amont peut être évitée par l'ajout de séquences de codage his-tag à l'extrémité 3'. Le codon d'arrêt d'ADN doit être enlevé de l'amorce inverse de gtfCet ajouté à l'amorce spcr-avant. En outre, le gtfC-avant et spcr-reversedevrait être conçu pour amplifier les régions de flanc d'environ 1 kb en amont et en aval de la région cible de la recombinaison homologue dans le génome S. mutans WT, respectivement. L'ajout de longues séquences de flanc améliore l'efficacité de la recombinaison homologue. Les amorces inoliées ont été conçues pour être utilisées à la place de la paire d'amorce la plus externe(gtfC-avant et spcr-reverse)dans ce protocole. L'inclusion des amorces nichées est nécessaire pour le deuxième PCR, comme détaillé ailleurs5.
La transformation par électroporation est efficace1 et les procédures de préparation cellulaire compétente avant l'électroporation sont également beaucoup plus simples par rapport aux méthodes alternatives16,17,18, bien qu'un appareil d'électroporation soit nécessaire. Il est fortement recommandé de préparer à nouveau le WT compétent de S. mutanen cas de colonies manquantes sur la plaque après l'électroporation. Bien que l'incubation pendant quelques heures après l'électroporation puisse améliorer l'efficacité de la transformation, l'incubation supplémentaire n'affecte pas le succès de la transformation. Les cellules dans la phase de croissance du journal doivent être utilisées pour la préparation des cellules compétentes, comme décrit précédemment5.
Puisque la quantité de protéine recombinante dépend de l'expression indigène du gène, la culture d'échelle-vers le haut peut être exigée dans les cas des protéines avec l'expression inférieure. La méthode présentée ici est limitée par l'application de l'analyse de restauration fonctionnelle. L'ajout de gène d'intérêt ne peut pas être appliqué aux protéines intracellulaires exogènement. Cependant, la méthode développée présente des avantages considérables en termes d'installation, d'efficacité et de coût (par exemple, pas de réactions enzymatiques autres que le PCR) lorsqu'on travaille avec la protéine cible extracellulaire. En outre, la purification de la protéine recombinante et la confirmation de l'expression génétique réelle peuvent être effectuées simplement en utilisant des applications communes His-tag, comme indiqué dans la figure 5.
La méthode actuelle, y compris la perturbation génétique et l'isolement des produits géniques, peut être adaptée pour une utilisation future chez d'autres espèces comme expériences en série pour l'analyse fonctionnelle d'un gène d'intérêt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) (numéros de subvention 16K15860 et 19K10471 à T. M., 17K12032 à M. I., et 18K09926 à N. H.) et la SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (numéro de subvention 2018.09.10 No 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Wingfield, P. T.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Smith, P. K., et al.
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
