Summary
Beskrevet her er en enkel metode for rensing av et gen produkt i Streptococcus mutans. Denne teknikken kan være fordelaktig i rensing av proteiner, spesielt membran proteiner og høy molekyl masse proteiner, og kan brukes med ulike andre bakterielle arter.
Abstract
Elucidation av et gen funksjon innebærer vanligvis sammenligning av fenotypiske trekk av vill-type stammer og belastninger der genet av interesse har blitt forstyrret. Tap av funksjon etter genet avbrudd er senere restaurert av eksogene tillegg av produktet av forstyrret genet. Dette bidrar til å bestemme funksjonen av genet. En metode tidligere beskrevet innebærer å generere en gtfC Gene-forstyrret Streptococcus mutans belastning. Her er en lite krevende metode som er beskrevet for rensing av gtfC Gene produktet fra den nylig genererte S. mutans stamme etter gen forstyrrelsen. Det innebærer tillegg av en polyhistidinhale-koding sekvens på 3 ' slutten av genet av interesse, som tillater enkel rensing av genet produktet ved hjelp immobilisert metall affinitet kromatografi. Ingen enzymatisk reaksjoner enn PCR er nødvendig for genetisk modifisering i denne metoden. Restaurering av genet produktet ved eksogene tillegg etter gen avbrudd er en effektiv metode for å bestemme gen funksjon, som også kan tilpasses ulike arter.
Introduction
Analyse av et gen funksjon innebærer vanligvis sammenligning av fenotypiske trekk av vill-type stammer til belastninger der genet av interesse har blitt forstyrret. Når gen-forstyrret belastning er produsert, eksogene tillegg av genet produktet tillater funksjonell restaurering.
Den vanligste metoden for å skaffe renset gen produkter som kreves for påfølgende restaurering analysene er ved å utføre heterologous uttrykk i Escherichia coli1. Imidlertid er uttrykket av membran proteiner eller høy molekyl masse proteiner ofte vanskelig å bruke dette systemet1. I disse tilfellene er mål proteinet vanligvis isolert fra cellene som opprinnelig syntetiserer proteinet gjennom en komplisert serie med trinn, noe som kan føre til tap av gen produktet. For å løse disse problemene, en enkel prosedyre er utviklet for gen produkt rensing etter et gen avbrudd metode2, PCR-basert DNA skjøting metode3 (utpekt to-trinns fusjon PCR), og electroporation for genetisk transformasjon i Streptococcus mutans. Tilsetting av en polyhistidinhale tag (hans-tag) til C-Terminus av genet produktet Letter sin rensing av immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC).
For å isolere hans-tag-uttrykke belastning, hele genomisk DNA av genet av interesse (i denne His-tag-uttrykke genet-forstyrret belastning) er erstattet med en antibiotika-resistente markør genet. Prosedyren for å generere hans-tag-uttrykker strainis nesten identisk med det for å generere et gen-forstyrret belastning som beskrevet tidligere4,5. Derfor bør metodene for gen avbrudd og gen produkt isolasjon utføres som serielle eksperimenter for den funksjonelle analysen.
I dagens arbeid, en polyhistidinhale-koding sekvensen er festet til 3 ' slutten av gtfC (GenBank GEOMETRISKE tag SMU_1005) genet, koding GLUCOSYLTRANSFERASE-si (GTF-si) i S. mutans6. Deretter ble det utført uttrykks studier i en streptokokk art. Oppnå heterologous gtfC uttrykk ved E. coli er vanskelig, sannsynligvis på grunn av den høye molekylære MASSEN av GTF-si. Denne belastningen heter S. mutans hans-gtfC. En skjematisk illustrasjon som skildrer organiseringen av gtfC og spectinomycin motstands gen kassett (SPCr)7 Loci i vill-type S. mutans (s. mutans WT) og dets derivater er vist i Figur 1. GTF-SI er et sekretoriske protein som bidrar til utviklingen av cariogenic Dental biofilm6. Under tilstedeværelsen av sukrose, en tilhenger biofilm er observert på en glatt glass overflate i WT S. mutans belastning, men ikke i S. mutans gtfC-forstyrret belastning (S. mutans ΔgtfC)2,5 . Biofilm formasjon er gjenopprettet i S. mutans ΔgtfC upon EKSOGENE tillegg av rekombinant GTF-si. Belastningen, S. mutans hans-gtfC, brukes deretter til å produsere rekombinant GTF-si.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Generasjon S. mutans ∆gtfC, der hele kodings området av det gtfC genet er erstattet med SPCr, må være fullført før du utfører disse protokollene. Se den publiserte artikkelen for detaljer om generasjon5.
1. primer design
-
Forbered grunning for bygging av S. mutans hans-gtfC.
Merk: Primer sekvensene som brukes i denne protokollen, er vist i tabell 1. Totrinns Fusion PCR-metode for generering av S. mutans hans-gtfC er skjematisk illustrert i figur 2.- Design primere (gtfC-revers og SPCr-Forward) for festing av hans-tag-koding sekvens, mellom gtfC genet og SPCr (figur 2a).
- Inkluder GS linker og hans-tag-koding sekvens i både gtfC-revers og SPCr-Forward primere, der 24 baser på 5 ' regioner er komplementære til hverandre.
Merk: amino acid sekvensen av GS linker og hans-tag (Gly-Gly-Gly-Gly-ser-hans-hans-hans-hans-hans-hans) er festet til C-Terminus av GTF-SI gjennom gen oversettelse. - Design en gtfC-Forward primer for å målrette GtfC Gene i S. mutans WT Genova > 1 kb nedstrøms av genet og SPCr-Reverse primer for å målrette den nedstrøms flankerer regionen SPCr i S. mutans ∆gtfC. Still inn Smeltetemperaturen8 (Tm) for gtfCog SPCr-Reverse primere for å matche med smelte temperaturene til gtfC-revers og SPC- fremover primere, henholdsvis.
- Inkluder GS linker og hans-tag-koding sekvens i både gtfC-revers og SPCr-Forward primere, der 24 baser på 5 ' regioner er komplementære til hverandre.
- Utform nestede primere (nestet fremover og nestet-revers) for den andre PCR (figur 2b).
- Design primere (gtfC-Forward og koloni-revers) spesifikke for genomisk DNA av Transformant (figur 2C; PRIMERE brukes for kolonien PCR).
Merk: Amplicons strekker grensen mellom gtfC og SPCr. Den gtfC-Forward primer kan brukes som fremover primer. - Design primere (opp-frem og ned-revers) for endelig bekreftelse på generering av S. mutans hans-GtfC (figur 2C; PCR-produktet forsterket av primere brukes for DNA-sekvensering).
- Design primere (gtfC-revers og SPCr-Forward) for festing av hans-tag-koding sekvens, mellom gtfC genet og SPCr (figur 2a).
2. genomisk DNA-ekstraksjon fra S. mutans
Merk: Hver S. mutans stamme bør være kultivert i hjernen hjertet infusjon (BHI) medium ved 37 ° c under anaerobe forhold. Den muterte stammer av S. mutans ∆gtfC og S. mutans hans-gtfC er kultivert i BHI supplert med 100 μg/ml spectinomycin.
- Stripe S. Mutans WT og S. mutans ∆gtfC separat på hver av de BHI agar platene. Ruge dem over natten ved 37 ° c.
- Plukk enkelt kolonier av s. Mutans WT eller S. mutans ∆gtfC ved hjelp av en sterilisert TANNPIRKER og vaksinere i 1,5 ml BHI buljong. Ruge dem over natten ved 37 ° c.
Merk: Koloniene kan brukes som en kilde til mal DNA for den første PCR (trinn 3,1). - Overfør 1 mL av hver bakteriekultur til en 1,5 mL mikrosentrifugen slange. Sentrifuger kulturen i 1 min ved 15 000 x g.
- Fjern supernatanten og tilsett 1 mL av Tris-EDTA-bufferen (pH 8,0) for å resuspend celle pellet.
- Sentrifuger suspensjonen i 1 min ved 15 000 x g. Fjern supernatanten. Resuspend celle pellet i 50, μL av Tris-EDTA-buffer (pH 8,0).
- Varm opp fjæringen ved hjelp av en blokk inkubator i 5 minutter ved 95 ° c. Sentrifuger suspensjonen i 5 min ved 15 000 x g.
- Overfør supernatanten til en ny 1,5 mL mikrosentrifugen Tube (supernatanten vil tjene som mal-DNA for den første PCR).
3. PCR forsterkning
Merk: Tabell 1, tabell 2og tabell 3 oppsummerer henholdsvis PCR-primere, reagenser og forsterknings sykluser.
- Utfør den første PCR ved hjelp av s. Mutans WT og S. mutans ∆gtfC Genova som PCR-malene. Forsterke regionene harboring nedstrøms delen av det gtfC genet og de harboring SPCr ved hjelp av grunning beskrevet i trinn 1.1.1.2 (figur 2a).
- Electrophorese hvert PCR-produkt på 1% agarose gel. Avgiftsdirektoratet ønsket DNA fragmenter av ca 1 000 BP og 2 000 BP. rens fragmenter fra gels ved hjelp av silica membran-baserte gel utvinning metoden.
Merk: De grunnleggende prosedyrene for PCR9, DNA gel elektroforese10, og DNA rensing11 er detaljert andre steder. - Utfør en ny PCR ved hjelp av produktene fra den første PCR (ca. ekvimolare) som PCR-maler med nestede-Forward-og nestede-Reverse primere (figur 2b).
- Electrophorese en tiendedel av PCR-blandingen på agarose gel. Bekreft generering av den aktuelle amplicon på ca 3 000 BP.
-
Utløse det gjenværende PCR-produktet.
Merk: rensing av PCR-produktet er ikke nødvendig, fordi ikke-spesifikke amplicons generert av den andre PCR ikke forstyrrer homologe rekombinasjon.- Tilsett nuklease vann til PCR-blandingen og Bring det totale volumet til 100 μL, etterfulgt av 0,1 volum (10 μL) på 3 M natrium acetate (pH 5,2) og 2,5 volumer (250 μL) av absolutt etanol. Bland og oppbevar blandingen i 10 min ved romtemperatur (RT).
- Sentrifuger prøven i 20 min ved 15 000 x g ved 4 ° c. Kast supernatanten. Tilsett 1 mL 70% etanol for å vaske DNA-pellet.
- Sentrifuger prøven i 5 minutter ved 15 000 x g ved 4 ° c. Kast supernatanten. Lufttørke og løs opp DNA-pellet-en med 10 μL nuklease vann.
4. celle transformasjon
- Forbered kompetent s. Mutans WT for å innføre det andre PCR-produktet ved å følge trinnene som er beskrevet i forrige publikasjon5. Oppbevar cellene ved-80 ° c.
Merk: For dette eksperimentet har de kompetente s. Mutans WT-cellene allerede blitt bevart i-80 ° c for å generere S. mutans ∆gtfC. - Bland 5 μL av det konsentrerte andre PCR-produktet til 50 μL alikvot av iskalde kompetente celler frosset tidligere. Tilsett blandingen i electroporation kyvetter. Gi en enkelt elektrisk puls (1,8 kV, 2,5 MS, 600 Ω, 10 μF) til cellene ved hjelp av electroporation apparater.
- Resuspend cellene i 500-μL av BHI buljong. Umiddelbart, spre 10 – 100 μL av suspensjonen på BHI agar plater som inneholder spectinomycin. Ruge platene i 2 – 6 dager ved 37 ° c til koloniene har vokst tilstrekkelig til å bli plukket opp.
5. verifisering av GEnome rekombinasjon og lagring
- Utføre koloni PCR, ved hjelp av gtfC-Forward og koloni-revers primere til skjermen for rekombinasjon. Electrophorese hver koloni PCR-produkt på en agarose gel. Bekreft DNA-fragmentet på ca 1 500 BP.
- Velg en av de positive koloniene ved hjelp av en sterilisert tannpirker og under kultur cellene over natten i 2 mL BHI buljong inneholder spectinomycin.
- Bland 0,8 mL bakteriekultur med 0,8 mL steril 50% glyserol og lager ved-80 ° c eller-20 ° c.
- Overfør de resterende 1 mL av celle fjæringen til en 1,5 mL mikrosentrifugen slange. Gjenta trinn 2.3 – 2.7 for å trekke ut genomisk DNA fra cellene.
- Utføre PCR ved hjelp av opp-fremover og ned-revers primere og genomisk DNA som en mal. Gjenta trinn 3,2 for å rense det forsterkede DNA-produktet fra gels.
- Bestem DNA sekvensen av renset amplicon av DNA-sekvensering.
Merk: Sørg for å bekrefte generering av S. mutans hans-gtfC av DNA sekvensering.
6. rensing av Polyhistidinhale-Tagged GTF-SI
- Stripe S. mutans hans-gtfC på en spectinomycin-inneholdende BHI agar plate. Ruge dem over natten ved 37 ° c.
- Plukk opp en enkelt koloni ved hjelp av en sterilisert tannpirker og under kultur celler i 3 mL BHI buljong. Ruge over natten ved 37 ° c.
- Forbered to koniske flasker med 1 liter BHI buljong uten spectinomycin. Vaksinere 1 mL av overnight kulturen suspensjon i 1 L av BHI buljong. Ruge over natten ved 37 ° c.
- Konsentrer proteiner fra kulturen supernatanten av ammonium sulfat nedbør.
Merk: utdrag fra celle organer hvis et mål protein er intracellulære. De grunnleggende prosedyrene for ammonium sulfat nedbør er beskrevet andre steder12.- Sentrifuger bakteriell kultur suspensjonen i 20 min ved 10 000 x g ved 4 ° c. Gjenopprette kulturen supernatanten i et 3 L glass beger.
- Tilsett 1 122 g ammonium sulfat til 2 L av supernatanten (80% metning) med kraftig omrøring ved hjelp av en magnetisk rører. La utfelling danne for 4 t eller mer ved 4 ° c med omrøring.
Merk: dannelse av utfelling kan fortsettes over natten. - Sentrifuger den ammonium sulfat-igangsatte løsningen ved 15 000 x g i 20 min ved 4 ° c. Dekanter supernatanten.
- Samle utfelling med en slikkepott og Overfør til en 200 mL glass beger. Resuspend pellets i 35 mL bindings buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8,0).
- Dialyze suspensjonen mot 2 500 mL av bindings bufferen ved hjelp av en generert cellulose dialyse slange, ved 4 ° c, med omrøring. Bytt ut dialyse løsningen etter 2 timer og Fortsett dialyse over natten.
- Skift ut dialyse løsningen igjen. Fortsett å dialyze for ytterligere 2 h.
- Sentrifuger dialyzed suspensjonen ved 20 000 x g i 10 min ved 4 ° c. Filtrer supernatanten gjennom et membran filter ved hjelp av suge Filtreringsutstyr. Overfør Filtrer til en 75 cm2 kolbe.
- Fractionate den polyhistidinhale GTF-SI fra den filtrert suspensjonen ved immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC).
- Overføring 2 mL av ni-ladet IMAC harpiks slurry (ca 1 mL harpiks) til en kromatografiske kolonne som utløp er montert på en silikon tube. Fjern lagringsløsningen ved tyngdekraften flyt.
Forsiktig: Ikke la harpiks tørke ut gjennom hele IMAC-en. - Tilsett 3 mL destillert vann i kolonnen for å vaske harpiks. Tilsett 5 mL av bindings bufferen for å likevekt harpiks.
- Steng av strømmen med en Hoffmann klype kuk. Tilsett 5 mL av filtrert suspensjon fra trinn 6,5 for å gjøre slurry.
- Legg alle slurry til de resterende filtrert suspensjon. Snurr blandingen forsiktig i 30 min ved 4 ° c.
- Legg blandingen tilbake på søylen. Fjern suspensjonen av tyngdekraften flyt. Vask IMAC-harpiks med 20 mL bindings buffer.
Merk: Juster strømningshastighet til ca 2 mL/min med en Hoffmann klype kuk gjennom den påfølgende IMAC. - Eluere rekombinant GTF-SI med 20 mL eluering buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mm imidazole, pH 8,0).
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. Eluatet skal oppbevares ved 4 ° c. IMAC harpiks kan gjenbrukes. Se instruksjonene for IMAC-harpiks.
- Overføring 2 mL av ni-ladet IMAC harpiks slurry (ca 1 mL harpiks) til en kromatografiske kolonne som utløp er montert på en silikon tube. Fjern lagringsløsningen ved tyngdekraften flyt.
- Erstatt eluering buffer med lagrings buffer (50 mM fosfat buffer, pH 6,5) og konsentrere rekombinant GTF-SI løsningen til ca 1 mL ved hjelp av en sentrifugal ultrafiltrering enhet. Oppbevar rekombinant GTF-SI-løsningen ved 4 ° c.
Merk: Bekreft polyhistidinhale-merket GTF-SI-rensing ved hjelp av SDS-PAGE13 og Western blotting14 ved å bruke et pepperrot peroksidase polyhistidinhale antistoff. Tilsetting av gutter (endelig konsentrasjon, 0,1%) til eluent kan være nødvendig for å unngå ikke-spesifikk absorpsjon til enheten, avhengig av mål proteinet.
7. funksjonell restaurering av rekombinant GTF-SI
- Stripe hver s. Mutans belastning på en BHI agar plate individuelt. Ruge platene over natten ved 37 ° c.
- Ved hjelp av en sterilisert tannpirker, plukke opp en enkelt koloni til vaksinere i 2 mL BHI buljong. Ruge over natten ved 37 ° c.
- Bruk 20 μL av natt kulturen S. mutans ∆gtfC til vaksinere 2 ml BHI buljong inneholdende 1% sukrose uten antibiotika i et glass reagensrør. Legg til GTF-SI eller et tilsvarende volum av kjøretøyet til S. mutans ∆gtfC kultur, og kultur cellene med røret plassert i en skråstilt posisjon over natten.
Merk: Sterilisere GTF-SI-løsningen med et sterilt sprøyte filter og Bestem proteinkonsentrasjon ved hjelp av en bicinchoninic yre proteinanalyse15 før bruk. - Agitere kulturen suspensjoner med en Vortex mikser for 10 s. Dekanter suspensjoner. Vask reagens rørene med en tilstrekkelig mengde destillert vann.
- Stain biofilm på røret veggen med 1 mL 0,25% Coomassie brilliant blå (CBB).
- Dekanter farge oppløsningen etter 1 min. vask reagens rørene med en tilstrekkelig mengde destillert vann. Luft-tørk reagens rørene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser størrelsen på hver amplicon fra den første PCR (figur 3a) og andre PCR (figur 3b). Størrelsen på hver amplicon tilsvarte den anslåtte størrelsen, som beskrevet i tabell 1. Figur 4a viser S. mutans kolonier TRANSFORMERT med det andre PCR-produktet og belagt på BHI agar plater som inneholder spectinomycin. Koloni PCR-produkter ble deretter kjørt på agarose gel (figur 4b). Hver amplicon var av anslått størrelse, som beskrevet i tabell 1. Figur 5 viser bilder av SDS-Page og Western Blot. Protein renset med IMAC ble observert som et enkelt band ved SDS-PAGE (figur 5a). Western Blot ble utført ved hjelp av anti-polyhistidinhale antistoff for å bekrefte at det observerte båndet var det forventede polyhistidinhale proteinet (figur 5B) av 160 KDA. Figur 6 viser sukrose-avledet biofilm-forming evne av hver S. mutans belastning. Bare S. mutans WT og S. mutans hans-gtfC kunne danne en tilhenger biofilm på røret veggen i nærvær av 1% sukrose. Dette ble ikke observert i S. mutans ΔGtfC (figur 6a). Men, tillegg av rekombinant GTF-SI restaurert tilhenger biofilm dannelse evne i S. mutans ΔGtfC (figur 6b).
Figur 1: organisering av gtfC og SPCr Loci i S. mutans UA159 Genova og dets derivater. En skjematisk illustrasjon av hans-tag mellom gtfC og SPCr. Lengden av genene og hullene er ikke å skalere. Skyggelagt Pentagon: SMU_1004; solid Pentagon: SMU_1006. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: strategi for to-trinns Fusion PCR. En skjematisk illustrasjon av S. mutans Hans-gtfC konstruksjon. Lengden av genene og hullene er ikke å skalere. De primer-bindende nettstedene i malen er angitt med mønstre. (A) regionene harboring del av gtfC -genet i s. mutans WT Genova og harboring SPCr i s. MUTANS Δ gtfC Genova ble forsterket ved hjelp av den første PCR. (B) den andre PCR ble utført med nestede primere ved hjelp av to fragmenter som ble forsterket av den første PCR som maler, og en DNA-konstruksjon for homologe rekombinasjon ble innhentet. (C) den muterte belastningen ble generert ved homologe rekombinasjon i bakteriene. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Agarose gel elektroforese av første og andre PCR produkter. (A) produkter av den første PCR av en del av gtfC (gtfC; venstre bilde) og regionen harboring SPCR (SPCR; høyre bilde) vises. Det enkle Elektroforetiske bildet er delt for å merke markør båndene. (B) andre PCR-produkter forsterket med nestede primere vises. Hver pil spiss indikerer den anslåtte størrelsen på hvert PCR-produkt. M = molekyl markør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Colony PCR til skjermen generasjon S. mutans hans-gtfC. (A) S. mutans KOLONIER transformert av det andre PCR-produktet vises. Koloni-ID indikeres av tall med sirkel nummer. (B) Agarose gel elektroforese av kolonien PCR produkter vises. Kjørefelt nummer i sirkel tilsvarer koloni-ID-en i figur 4a. M = molekyl markør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bekreftelse av polyhistidinhale-merket GTF-si rensing. (A) representative SDS-side bilde vises. (B) representative Western Blot bildet vises. En nitrocellulose membran der GTF-SI ble overført ble analysert med pepperrot peroksidase polyhistidinhale antistoff. Immunoreactive band ble visualisere ved hjelp av en kjemiluminescens reaksjon. Pilspisser indikerer anslått størrelse på rekombinant GTF-SI. M: molekylær markør; 1 = prøve før IMAC; 2 = sample innhentet av IMAC. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: funksjonell restaurering ved tilsetning av REKOMBINANT GTF-si. (A) evne til sukrose-avledet tilhenger biofilm formasjon er vist for hver S. mutans belastning. (B) evne til forming tilhenger biofilm ble restaurert i S. mutans ΔGTFC ved tilsetning av rekombinant GTF-si (25 μg). WT = S. mutans WT; ΔgtfC = S. mutans ΔgtfC; Hans-gtfC = S. mutans hans-gtfC. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primer parene | Sekvens (5 ' til 3 ') | Forventet bånd størrelse (BP) | ||
| første PCR | ||||
|
gtfC-forover gtfC-revers A, B |
TAAAGGTTATGTTTATTATTCAACGAGTGGTAACC ATGATGATGATGATGACTACCACCACCTCC AAATCTAAAGAAATTGTCAA |
1 090 | ||
|
SPCr-frem A, C SPCr-revers |
GGTGGTAGTCATCATCATCATCAT Katt TAAATCGATTTTCGTTCGTGAAT TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
2 232 | ||
| 2dre PCR | ||||
| Nestet-fremover Nestet-omvendt |
TGGTATTATTTCGATAATAACGGTTATATGGTCAC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3 179 | ||
| Verifisering av rekombinasjon | ||||
| Koloni PCR | ||||
|
gtfC-forover Koloni-revers |
TAAAGGTTATGTTTATTATTCAACGAGTGGTAACC CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
1 482 | ||
| Endelig verifisering | ||||
| Opp-frem Ned-revers |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
6 173 | ||
Tabell 1: primere som brukes i protokollen. En egen Den understrekede sekvenser av ' gtfC-Reverse og SPCr-Forward ' er komplementære, og fet-skrevet sequencescode for His-tag (gtfC-revers; ATGATGATGATGATG, SPCr-fremover; CATCATCATCATCATCAT) og GS linker (gtfC-revers; ACTACCACCACCTCC, SPCr-fremover; GGTGGTAGT). B DNA stopp Codon av gtfC er fjernet. C En DNA stopp Codon (TAA) har blitt lagt til umiddelbart etter polyhistidinhale-koding sekvenser.
| Reagens | Konsentrasjon av lagerløsning | Volum | Endelig konsentrasjon |
| DNA polymerase Premix | 2x | 25 μL | 1x |
| Forover primer | 5 μM | 2 μL | 0,2 μM |
| Omvendt primer | 5 μM | 2 μL | 0,2 μM |
| Mal DNA | Variabel | Variabel | Variabel |
| Deionisert vann | - | Opptil 50 μL | - |
Tabell 2: PCR-reagenser: For den første PCR ble 2 μL av DNA-malen lagt til. For den andre PCR ble 0,5-2 μL av første PCR-amplicon tilsatt til reaksjonsblandingen. For koloni PCR ble bakterieceller direkte lagt til reaksjonsblandingen.
| Trinn | Temperatur | Tid | Antall sykluser |
| Innledende denaturering | 98 ° c | 2 min | 1 |
| Denaturering Annealing Forlengelsen |
98 ° c 50 ° c 72 ° c |
10 s 5-s Amplicon-avhengig (1 min/1 KBP) |
35 |
| Siste utvidelse | 72 ° c | Amplicon-avhengig (1 min/1 KBP) |
1 |
Tabell 3: PCR forsterkning sykluser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utformingen av grunning er det mest kritiske trinnet i protokollen. Sekvensene av gtfC-revers og SPCr-Forward primere ble automatisk bestemt basert på sekvenser av både 3 ' end regionen gtfC og 5 ' end regionen i SPCr. Hver primer inneholder 24 komplementære baser som koder en GS linker og en hans-tag-koding sekvens på sine 5 ' regioner. Forstyrrelse av de innfødte regulatoriske sekvenser ligger i oppstrøms flankerer regionene kan unngås ved tilsetning av hans-tag-koding sekvenser til 3 ' end. DNA-Codon må fjernes fra gtfC-revers primer og legges til SPCr-Forward primer. Videre bør gtfC-Forward og SPCr-revers utformes for å forsterke flankerer regioner på ca 1 kb oppstrøms og nedstrøms i målregionen for homologe rekombinasjon i S. mutans WT Genova, Henholdsvis. Tilsetting av lange flankerer sekvenser forbedrer effektiviteten av homologe rekombinasjon. De nestede primere ble utformet for å brukes i stedet for det ytterste primer paret (gtfC-Forward og SPCr-revers) i denne protokollen. Inkludering av nestede primere er nødvendig for den andre PCR, som beskrevet andre steder5.
Transformasjon av electroporation er effektiv1 og prosedyrer for kompetent celle forberedelse foregående electroporation er også mye enklere i forhold til de alternative metodene16,17,18, Selv om det er nødvendig med et electroporation apparat. Det anbefales på det sterkeste å forberede kompetent s. Mutans WT på nytt i tilfelle av manglende kolonier på tallerkenen etter electroporation. Selv om inkubasjons for et par timer etter electroporation kan forbedre transformerings effektiviteten, påvirker ikke den ekstra inkubasjons suksessen til transformasjonen. Celler i loggen vekstfasen skal brukes for kompetent celle forberedelse, som beskrevet tidligere5.
Siden mengden av rekombinant protein avhenger av det opprinnelige uttrykket av genet, kan oppskalering kultur være nødvendig i tilfeller av proteiner med lavere uttrykk. Metoden som presenteres her er begrenset av anvendelsen av den funksjonelle restaurering analysen. Tillegg av gen av interesse kan ikke anvendes på intracellulære proteiner exogenously. Den utviklede metoden presenterer imidlertid betydelige fordeler når det gjelder anlegg, effektivitet og kostnader (f.eks. ingen enzymatisk reaksjoner enn PCR) når du arbeider med ekstracellulære mål protein. I tillegg kan rensing av rekombinant protein og bekreftelse av faktiske genuttrykk utføres bare ved hjelp av felles hans-tag programmer, som vist i figur 5.
Den nåværende metoden, inkludert gen forstyrrelse og gen produkt isolering, kan tilpasses for fremtidig bruk i andre arter som serielle eksperimenter for funksjonell analyse av et gen av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for Promotion of Science (JSP) (Grant tall 16K15860 og 19K10471 til T. M., 17K12032 til M. I., og 18K09926 til N. H.) og SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (Grant nummer 2018.09.10 nr. 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Wingfield, P. T.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Smith, P. K., et al.
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
