Summary
Ici, nous montrons le potentiel thérapeutique des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic après leur transfert dans les souris tumeur-portantes. Ce protocole peut être utilisé pour manipuler l'activité neutrophile ex vivo et pour ensuite évaluer leur fonctionnalité in vivo dans le développement de tumeurs. Il s'agit d'un modèle approprié pour l'étude des immunothérapies potentielles à base de neutrophiles.
Abstract
La contribution des neutrophiles à la régulation de la tumorigénèse reçoit une attention accrue. Ces cellules sont hétérogènes, et selon le milieu tumoral peut posséder une capacité pro- ou anti-tumorale. Une des cytokines importantes régulant des fonctions de neutrophile dans un contexte de tumeur sont des interférons de type I. En présence d'interférons, les neutrophiles gagnent des propriétés antitumorales, y compris la cytotoxicité ou la stimulation du système immunitaire. Inversement, l'absence d'un signal d'interféron a comme conséquence l'activité pro-tumorale pro en avant, caractérisée avec la stimulation forte de l'angiogenèse de tumeur. Récemment, nous pourrions démontrer que les propriétés pro-angiogéniques des neutrophiles dépendent de l'activation de la voie de signalisation de phosphoribosyltransferase de nicotinamide (NAMPT) dans ces cellules. L'inhibition de cette voie dans les neutrophiles tumeur-associés mène à leur phénotype anti-angiogenic puissant. Ici, nous démontrons notre modèle nouvellement établi permettant l'évaluation in vivo du potentiel tumorigenic des neutrophiles tumoraux-associés manipulés (TANs). Peu de temps après, les neutrophiles tumeur-associés pro-angiogenic peuvent être isolés des souris interféron-déficientes de tumeur-portantes et repolarized dans le phénotype anti-angiogenic en bloquant la signalisation de NAMPT. L'activité angiogénique de ces cellules peut être ensuite évaluée à l'aide d'un analyse de l'anneau aortique. Les TAN anti-angiogéniques peuvent être transférés dans les destinataires sauvages de type tumeur-portant s'ils portent et la croissance de tumeur devrait être surveillée pendant 14 jours. Au jour 14 souris sont sacrifiées, tumeurs enlevées et coupées avec leur vascularisation évaluée. Dans l'ensemble, notre protocole fournit un nouvel outil pour évaluer in vivo la capacité angiogénique des cellules primaires, telles que les neutrophiles tumeur-associés, sans avoir besoin d'employer des modèles artificiels de ligne de cellules de neutrophile. Vc
Introduction
Les interférons de type I (IFN) jouent un rôle important dans la stimulation des réponses de l'hôte aux néoplasias, car l'absence de signalisation IFN de type I entraîne une croissance tumorale significativement élevée1. Un des mécanismes impliqués dans ce processus est la régulation de l'activité tumorigène des neutrophiles tumeur-associés, qui estcontrôlé par le récepteur de facteur 3 de colonie-stimulant (CSF3R) en aval signalant 2. Le facteur de stimulation de la colonie 3 (CSF3), ou facteur stimulant la colonie de granulocytes, a été montré pour activer la signalisation impliquant le phosphoribosyltransferase de nicotinamide (NAMPT)3,4. NAMPT est une enzyme limitant le taux pour la synthèse de dinuccléotide d'adénine de nicotinamide, qui améliore la glycolyse et régule la réparation d'ADN, l'expression de gène, et la réponse de stress favorisant la survie et la proliférationdecellules cancéreuses 5. Le NAMPT est surexprimé dans plusieurs types de cancer, y compris colorectal, ovaire, sein, gastrique, cancer de la prostate et gliomes6. NAMPT est essentiel non seulement pour les cellules tumorales, mais aussi pour une grande variété d'autres types de cellules qui sont présents dans les tumeurs, telles que les cellules myéloïdes - il conduit leur différenciation4, inhibe l'apoptose et stimuler l'expression de cytokines multiples ou enzymes dégradantes dans les macrophages7.
Les neutrophiles tumeur-associés représentent les modulateurs importants de la croissance de tumeur. Les fonctions TAN dépendent fortement de la disponibilité de type I IFN, car ces cytokines première activité antitumorale des neutrophiles. Au contraire, l'absence d'IFN soutient l'activation tumorigène de ces cellules, en particulier leurs propriétés pro-angiogéniques. En accord avec cela, les souris déficientes en IFN développent des tumeurs significativement plus grandes et mieux vascularisées, qui sont fortement infiltrées avec des neutrophiles pro-tumoral/pro-angiogéniques1,2,8, 9,10. Fait important, ces TAN pro-angiogéniques montrent une activité élevée de NAMPT, suggérant son rôle essentiel dans la polarisation pro-tumorale des neutrophiles.
L'épuisement des neutrophiles utilisant l'anticorps ly6G ou l'inhibition de leur migration (anticorps CXCR2) a comme conséquence l'angiogenèse diminuée de tumeur, la croissance, et la métastasie1,8. Néanmoins, les anticorps monoclonaux générés sont immunogènes, et leur administration est associée à une gamme d'effets secondaires représentant un danger pour la vie11. Le traitement avec de petites molécules, telles que l'inhibiteur de NAMPT FK866, qui modulent la tumoriogenicity de neutrophile, pourrait aider à éviter de telles complications. Malheureusement, l'inhibition systémique pharmacologique de NAMPT, à côté de son effet thérapeutique sur la croissance de tumeur, mène aux effets secondaires graves comprenant la toxicité gastro-intestinale et la thrombocytopenia. Par conséquent, l'application systémique des inhibiteurs nAMPT n'est pas faisable12,13,14.
Pour cette raison, nous suggérons ici un protocole où l'activité NAMPT est bloquée directement dans les NAN isolés. De tels neutrophiles antitumorales sont alors adoptifs transférés dans un hôte tumeur-portant. Ce protocole permettra d'éviter les effets secondaires toxiques systémiques des composés, tandis que son effet sur les cellules cibles sera maintenu.
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Protocol
Toutes les procédures, y compris les sujets animaux, ont été approuvées par les autorités de régulation : LANUV (Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) et Regierungspr'sidium T'bingen, Allemagne. Toutes les manipulations doivent être effectuées dans des conditions stériles (sous le capot à débit laminaire) à l'aide de réactifs et d'instruments stériles (seringues, ciseaux, forceps, scalpels jetables, vaisselle Petri).
REMARQUE : Le schéma global du protocole est indiqué dans la figure 1.
1. Préparation de la lignée cellulaire du mélanome B16F10
- Préparer les cellules mycoplasme-négatives cultivées à une monocouche confluente de 90 % (environ 10 x 106 cellules/T75 flacon) dans le moyen modifié de Dulbecco d'Iscove (IMDMc : IMDM - sérum bovin fœtal (FBS) de 1 % de pénicilline-streptomycine).
- Retirez le milieu et rincez les cellules avec du phosphate salin (PBS). Appliquer 6 ml d'une solution de détachement cellulaire contenant des enzymes protéolytiques et collagènes (voir le Tableau des matériaux)et incuber à 37 oC pendant 2 min.
- Frappez doucement le flacon pour mobiliser les cellules adhérentes restantes du fond. Recueillir la suspension cellulaire dans des tubes de 15 ml et la centrifugeuse à 300 x g pendant 7 min et 20 oC.
- Retirez le supernatant et suspendez le puits de granule en 1 ml de PBS. Ajouter 14 ml de PBS et centrifugeuse (300 x g et 20 oC pendant 7 min).
- Retirez le supernatant et suspendez la pastille dans 1 ml de PBS.
- Comptez les cellules, et les resuspendre à la concentration de 3 x 106/mL PBS (pour l'étape 2) ou 6 x 106/mL PBS (pour l'étape 6) pour l'injection. Maintenir les cellules sur la glace pendant un maximum de 30 min.
2. Modèle allogénique de tumeur chez les souris
- Utilisez 10 femelles Ifnar1-/- souris de 8 à 12 semaines qui sont conservées dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes (FPS).
NOTE : Les souris femelles sont préférables dans un modèle sous-cutané de la croissance de tumeur, puisque les mâles sont plus agressifs et donc enclins aux infractions du site de tumeur, qui influence la croissance de tumeur. - Raser la peau de la souris sur le flanc avec un rasage électrique, et désinfecter la peau avec des tissus mouillés avec 70% d'éthanol.
- Recueillir les cellules du mélanome B16F10 préparées à une concentration de 3 x 106/mL PBS (voir l'étape 1) dans une seringue de 1 ml et 0,4 x 19 mm aiguille. Injecter 100 ml de la suspension sous-cutané.
- Mélanger les cellules bien avant chaque injection. Utilisez des aiguilles d'au moins 0,4 mm de diamètre pour ne pas déranger les cellules tumorales.
- Placez jusqu'à 5 souris dans une cage, et contrôlez la taille de la tumeur (longueur, largeur et profondeur) avec un étrier pendant 14 jours.
REMARQUE: Selon les règlements animaux, la taille de la tumeur ne doit pas dépasser 15 mm de diamètre, les souris avec des tumeurs plus grandes ou nécrotiques / ouvertes doivent être sacrifiés à l'avance. - Au jour 14, sacrifiez les souris dans la chambre CO2.
- Désinfecter la peau avec 70% d'éthanol et enlever les tumeurs avec des ciseaux et des forceps dans un plat stérile Petri. Gardez les tumeurs dans un tube de 50 ml dans le milieu aigle modifié complet de Dulbecco (DMEMc : DMEM - 10 % FBS - 1 % pénicilline-streptomycine) sur la glace.
3. Isolement TAN
- Placez les tumeurs dans des plaques stériles de 6 puits, 5 tumeurs par puits. Couper les tumeurs en morceaux de 2-3 mm avec des ciseaux stériles.
- Digest avec 1 mL de dispase/collagenase D/DNase I solution (0.2 mg/0.2 mg/100 mg dans 1 ml de DMEMc) par tumeur. Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 dans un incubateur humide et mélanger avec une seringue de 10 ml sans aiguille toutes les 15 min 3 fois.
- Pour enlever les fibres non digérées, maillez les cellules à travers des filtres de 100 m en tubes de 15 ml (un puits par filtre par tube). Ajouter le PBS à 15 ml, les tubes centrifugeants à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant.
- Lyse érythrocytes avec un tampon de lyse (NH4Cl 150 mM, KHCO3 10 mm, EDTA 0,1 mm, pH 7,3, 20 oC) en ajoutant 1 ml dans chaque tube. Bien mélanger et combiner la solution de tous les tubes en un seul. Arrêtez la réaction après 2 minutes avec 11 ml de dMEMc glacé (4 oC).
- Centrifugeuse à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant. Resuspendre la pastille avec 15 ml de PBS froid. Centrifugeuse à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant.
- Resuspendre la pastille dans 1 ml de PBS. Ajouter 3 ml d'anticorps à bloc Fc (CD16/CD32, stock 0,5 mg/mL), et couver sur la glace pendant 15 min.
- Ajouter les anticorps : 10 ml de Ly6G-PE (stock 0,2 mg/ml) et 10 ml de CD11b-APC (stock 0,2 mg/ml). Ajouter 20 ml de colorant de viabilité 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI, stock 5 mg/mL) et incuber sur la glace dans l'obscurité pendant 30 min.
REMARQUE : Une autre combinaison de colorants de viabilité et de conjugues fluorescentes d'anticorps peut être utilisée. - Ajouter le PBS jusqu'à 15 ml, la centrifugeuse à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant.
- Resuspendre la pastille dans DMEMc à la concentration d'environ 10 x 106/mL, et garder sur la glace.
- Trier les neutrophiles CD11bet Ly6Ghi alive (DAPI-négatif) avec un trieur de cellules activé par la fluorescence (stratégie de gating voir Figure 2).
REMARQUE : Gardez le tube avec la suspension cellulaire et le tube avec DMEMc pour les cellules triées à 4 oC. Utilisez les réglages de tri optimaux suivants : une buse de 70 mm, un taux de seuil de 22 000 événements/seconde maximum et un débit de 1 à 3. - Vérifiez la pureté des neutrophiles triés à l'aide d'un cytomètre pour une pureté recommandée de 'gt;95%.
- Centrifugeles triés neutrophiles à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant. Resuspendre les cellules triées dans DMEMc à la concentration de 1 x 106/mL.
REMARQUE : Le nombre prévu de neutrophiles dans une tumeur de 14 jours de B16F10 (10 millimètres diamètre) est approximativement 3 x 104 cellules.
4. Inhibition de NAMPT dans les TAN in vitro
- Préparer le bouillon FK866 (inhibiteur nAMPT) dans le diméthylsulfoxide (DMSO) à une concentration finale de 100 mM.
- Neutrophiles triés (étape 3.11) en 2 puits d'une plaque de 96 puits en U-bas (1,5 x 105 neutrophiles/puits). Ajouter FK866 dans le puits d'intervention (concentration finale de 100 nM), et une quantité égale de DMEMc avec DMSO dans le puits de contrôle. Incuber pendant 2 h à 37 oC, 5 % de CO2 dans un incubateur humide.
- Centrifugeuse à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant. Resuspendre dans 200 ml de PBS dans chaque puits. Répéter 2 fois.
- Centrifugeuse à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant. Resuspendre dans le milieu commercial de croissance endothéliale de cellules (complété avec le supplément de croissance endothelial de cellules de 4 l/mL, 0.1 ng/mL recombinant le facteur épidermique humain, 1 ng/mL facteur de croissance de base de fibroblast humain, 90 'g/mL heparin et 1 'g/mL hydrocortisone) à une concentration finale de 0,2 x 106 cellules/mL (en 0,75 ml) (pour l'étape 5) ou en PBS à la concentration finale de 0,6 x 106 cellules/mL (en 0,25 ml) (pour l'étape 6).
5. Estimation des propriétés angiogéniques des TAN à l'aide de l'ananneau aortique
- Disséquer l'aorte thoracique d'une souris mâle C57BL/6J (WT). Nettoyer et couper en anneaux de largeur de 0,5 mm. Placer tous les anneaux dans un puits d'une plaque de 24 puits avec 1 ml de milieu de croissance endothéliale complété. Incuber toute la nuit à 37 oC, 5 % de CO2 dans un incubateur humide.
REMARQUE: L'utilisation de jeunes souris mâles (moins de 8 semaines) pour la dissection de l'aorte est préférable, car ils donnent une réponse angiogénique plus robuste15. - Remplissez les puits de la plaque à fond plat de 96 puits avec 50 l de matrice de membrane de sous-sol solubilisée, laissez le gel reposer pendant 30 min dans un incubateur humide de 37 oC et 5 % de CO2 pour permettre à la matrice de polymériser. Préparer au moins 3 puits par condition.
- Intégrez les anneaux dans la matrice de membrane solubilisée de sous-sol en plaçant un anneau aortique sur le dessus de la couche de matrice pleine, 1 anneau dans le centre de chaque puits. Ajouter 50 ll de matrice membranaire de sous-sol solubilisée pour couvrir chaque anneau.
- Placez la plaque dans un incubateur humide de 37 oC et 5 % de CO2 pendant 30 min pour permettre la polymérisation de la deuxième couche de matrice.
- Ajouter 150 mL/puits de milieu de croissance endothéliale complété et 2x104Ifnar1-/- TANs (contrôle et FK866-traité) (étape 4.4).
- Incuber la plaque pendant 14 jours à 37 oC, 5 % de CO2 dans un incubateur humide.
- Image à l'aide d'un microscope standard de contraste de phase et estimer la ramification endothéliale. L'évaluation quantitative des paramètres morphométriques et spatiaux des navires, y compris l'indice de ramification, peut être effectuée automatiquement à l'aide du programme de traitement d'image conçu pour les images scientifiques.
REMARQUE : Les résultats des représentants sont représentés dans la figure 3.
6. Transfert adoptif des neutrophiles traités dans le modèle allogénique de tumeur
- Préparer les cellules du mélanome B16F10 (étape 1.6) en PBS à une concentration de 6 x 106 cellules/mL.
- Préparer 2 types de neutrophiles : les neutrophiles traités par FK866 et contrôler les neutrophiles non traités (étape 4.4) en PBS à une concentration de 6 x 105 cellules/mL. Mélanger les neutrophiles avec les cellules du mélanome B16F10 (le rapport final neutrophile/cellules tumorales 1:10) pour avoir 2 types de mélanges cellulaires.
- Prenez 10 souris Femelles WT 8-12 semaines, 5 dans chaque groupe. Raser la peau sur le flanc à l'etoile avec un rasage électrique et désinfecter avec 70 % d'éthanol.
- Injecter 100 l de la suspension cellulaire (étape 6.2) sous-cutanée avec une seringue à insuline et une aiguille de 0,4 mm de diamètre, aux deux groupes de souris. Placer 1-5 souris du même groupe dans une cage.
- Au jour 2, préparez 2 types de neutrophiles : les neutrophiles traités par FK866 et contrôlez les neutrophiles non traités (étape 4.4) en PBS à une concentration de 6 x 105 cellules/mL. Injecter 100 ll de suspension cellulaire (étape 6.4) i.v. dans la veine de la queue avec une seringue à insuline et une aiguille de 0,4 mm de diamètre, aux deux groupes de souris. Remettre les souris dans la cage.
7. Mesure de croissance de tumeur, examen histologique
- Surveillez la croissance tumorale tous les deux jours. Évaluer la taille de la tumeur avec des étriers et calculer le volume tumoral avec la formule V-4/3 '(hw2)/8 (h-hauteur, w -largeur, profondeur).
- Sacrifier les souris au jour 14 dans la chambre CO 2. Enlever les tumeurs et mesurer les poids tumoraux.
- Congeler les tumeurs dans un composé optimal de température de coupe dans l'azote liquide, et les stocker à -80 oC.
- Décongeler les échantillons à -20 oC et préparer des sections de 5 mm à l'aide d'un cryotome. Laisser sécher les cryocuts pendant 30 min à 20 oC. Fixer les sections en acétone froide de -20 oC pendant 2 min et les laisser sécher pendant 30 min à 20 oC.
- Bloc avec des anticorps De-bloc Fc (CD16/CD32, stock 0.5 mg/mL 1:500) en PBS pendant 1 h à 20 oC.
- Tache avec le lapin anti souris Laminin gamma anticorps (1:1500 en PBS, 200 'L) pour 1 h à 20 oC. Laver avec PBS trois fois.
- Tache avec anticorps anti-lapin de chèvre secondaire (stock 0.5 mg/mL, 1:400 en PBS,), anti-souris SMA (1:500 en PBS) et 2 L de DAPI (stock 5 mg/mL, 1:100 en PBS) dans un volume final de 200 'L de solution d'anticorps. Incuber pendant 1 h à 20 oC dans l'obscurité. Laver avec PBS trois fois.
- Sécher les toboggans pendant 20 minutes à 20 oC dans l'obscurité. Monter avec un support de montage anhydre pour la microscopie et couvrir d'un bordereau. Laisser sécher 1 h à 37 oC.
- Effectuer un examen microscopique. Quantifier la vascularisation en comptant le nombre total (en option) des navires Laminin et le nombre (zone) des navires développés s'ensontifiant.
REMARQUE : Pour effectuer une analyse d'image, prenez toutes les images dans les mêmes conditions (lumière, contraste, grossissement). Dans ce cas, les paramètres de traitement sont fixes, et le traitement d'image devient complètement automatique. Les résultats représentatifs sont représentés dans la figure 4 et la figure 5.
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Representative Results
Utilisant la procédure décrite ici, Ifnar1-/- les neutrophiles ont été isolés des tumeurs et traités avec l'inhibiteur de NAMPT FK866 pendant 2 h. Ifnar1 non traité -/- les neutrophiles ont été employés comme contrôle. L'effectivité du traitement a été évaluée à l'aide de l'antoire aortique, qui reflète les étapes clés impliquées dans l'angiogenèse (dégradation de la matrice, migration, prolifération, réorganisation). Nous pourrions démontrer que les neutrophiles traités par FK866 ont une capacité significativement réduite pour stimuler la formation de branches aortiques, par rapport aux cellules non traitées (Figure 3A, 3B). Des neutrophiles anti-angiogéniques traités par FK866 ont été injectés sous-cutanés sur des souris porteuses de tumeurs (au jour 0 flanc et au jour 2 i.v.). Nous pourrions observer la croissance significativement altérée de tumeur, par rapport aux souris injectées avec Ifnar1 non traité-/- neutrophiles (figure 4A, 4B). L'examen histologique des tumeurs extraites a prouvé la suppression significative de l'angiogenèse dans les tumeurs isolées des souris traitées avec des TAN FK866-traités, par rapport à ceux injectés avec Ifnar1-/- neutrophiles non traités ( Figure 5A ,B).
Figure 1. Le schéma du protocole. Étape 1. Préparation de la lignée cellulaire du mélanome B16F10; 2. Modèle allogénique de tumeur chez les souris ; 3. Isolement des TAN des tumeurs ; 4. Inhibition du NAMPT dans les TAN in vitro; 5. Estimation des propriétés angiogéniques des TAN dans l'indice aortique; 6. Transfert adoptif des neutrophiles traités dans le modèle allogénique de tumeur ; 7. Surveillance de croissance de tumeur, examen histologique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Stratégiede gating pour le tri des TAN . CD11b- Ly6Gsalut neutrophiles vivants sont triés à partir de tumeurs avec la pureté de 95%. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Suppression des propriétés angiogéniques des TAN après le traitement FK866. Les propriétés angiogéniques des Ifnar1 triés-/-Les TAN traités avec FK866 ou avec le milieu ont été estimés utilisant l'analyse d'anneau d'aorte. La formation des succursales a été surveillée pendant 14 jours, les résultats représentatifs au jour 14 sont présentés (A). Le traitement par FK866 a considérablement diminué le nombre de branches endothéliales (B). Les données sont présentées sous la forme d'une portée médiane, interquartile et min-max, de 0,05 . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Retardation de la croissance de tumeur après transfert adoptif des neutrophiles FK866-traités. L'influence des TANs sur la croissance de tumeur a été évaluée. Les TAN ont été isolés, traités avec FK866 et injectés dans des souris tumorales comme décrit ci-dessus. Au jour 14 souris ont été sacrifiées, tumeurs enlevées et analysées. Ifnar1-/- Les TAN traités avec FK866 contre les contrôles ont été comparés. (A) La croissance de tumeur a été mesurée, (B) masse de tumeur et (C) taille ont été estimées. Les données sont présentées sous la forme d'une portée médiane, interquartile et min-max, de 0,05 . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. Vascularisation de tumeur supprimée après transfert adoptif des neutrophiles FK866-traités. Les tumeurs ont été isolées comme décrit ci-dessus (Fig 4). La maturation des vaisseaux a été évaluée à l'aide d'anticorps anti-SMA (vaisseaux matures) et de la lamininine antigamma (cellules endothéliales). (A) La coloration représentative des tumeurs sont montrées : SMA (vert), laminin (rouge). Barres d'échelle : 50 m. (B) Quantification de la vascularisation tumorale après transfert adoptif de TANs cultivés avec FK866 (vert) ou moyen (rouge) Les données sont présentées sous forme de médiane, de portée interquartile et de min-max, de 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Malgré les progrès dans le traitement chirurgical et pharmacologique du cancer, la thérapie réussie demeure un défi. Puisque les cellules immunitaires sont connues pour jouer un rôle important dans la régulation de la croissance de tumeur, de nouvelles méthodes inhibant la tumorigenicité de telles cellules devraient être établies. Ici nous démontrons une approche nouvelle pour supprimer la croissance de tumeur par l'intermédiaire du transfert adoptif des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic tumeur-associés. Le ciblage sélectif de la signalisation nAMPT pro-angiogénique dans les TAN, utilisant l'inhibiteur de FK866, empêche des effets secondaires, qui sont observés sur le traitement systémique de FK866.
La partie la plus critique du protocole est la nécessité d'utiliser des neutrophiles primaires fraîchement isolés. Les neutrophiles sont des cellules à courte durée de vie, subissant une apoptose ou activées pendant la procédure d'isolement. Les neutrophiles murines doivent être conservés dans des supports de 4 oC pendant toutes les étapes d'isolement, y compris le tri cellulaire. L'isolement des neutrophiles doit être effectué dès que possible et l'expérience ne doit pas être interrompue. L'utilisation de Fc-block permet de réduire la coloration non spécifique des cellules à forte expression des récepteurs Fc, comme les cellules NK. Nous recommandons également de réduire au minimum le nombre d'anticorps fluorescents conjugués pour simplifier la stratégie de gating et pour éviter l'activation des neutrophiles en raison de la liaison d'anticorps.
L'étape limitante du protocole est l'isolement des neutrophiles vivants des tumeurs dues à une quantité relativement faible de ces cellules dans les tumeurs (pas plus de 1% des cellules vivantes simples dans le mélanome). Cela ne pourrait être possible qu'à l'aide d'un tri basé sur la cytométrie du débit. Dans le même temps, l'utilisation de neutrophiles de sang pour ce protocole devrait être évitée en raison de la régulation mineure seulement de l'expression NAMPT et de leur faible fonctionnalité, qui est modifiée à l'arrivée des tissus tumoraux16. Peut-être, afin d'employer des neutrophiles de sang, ils devraient être précédemment activés utilisant des facteurs tumoraux-dérivés de croissance.
Pour éviter l'apoptose neutrophile, un traitement court avec FK866 (2-4 h) est suggéré, car il n'a aucune influence sur la viabilité des TANs, tandis que le traitement prolongé induit l'apoptose neutrophile16. En somme, le protocole démontre le potentiel des neutrophiles anti-angiogéniques manipulés ex vitro pour supprimer fonctionnellement la croissance de tumeur dans le modèle de tumeur de mélanome de souris.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Notre travail a été soutenu par des subventions de Deutsche Krebshilfe, Numéro de subvention: 111647, et German Research Council (DFG), Grant Number: JA 2461/2-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T.
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
