Summary
Hier tonen we therapeutisch potentieel van Anti-angiogene tumor-geassocieerde neutrofielen na hun overdracht in tumor-dragende muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om de neutrofiele activiteit ex vivo te manipuleren en vervolgens hun functionaliteit in vivo te evalueren bij het ontwikkelen van tumoren. Het is een geschikt model voor het bestuderen van potentiële op neutrofielen gebaseerde immunotherapieën.
Abstract
De bijdrage van neutrofielen aan de regulering van de tumorigenese wordt steeds meer aandacht. Deze cellen zijn heterogeen, en afhankelijk van de tumor milieu kan bezitten Pro-of anti-tumor capaciteit. Een van de belangrijke cytokines die neutrofiele functies reguleren in een tumor context zijn type I interferonen. In aanwezigheid van interferonen krijgen neutrofielen anti-tumor eigenschappen, waaronder cytotoxiciteit of stimulatie van het immuunsysteem. Omgekeerd, de afwezigheid van een interferon-signalering resulteert in prominente Pro-tumor activiteit, gekenmerkt door sterke stimulatie van tumor angiogenese. Onlangs konden we aantonen dat Pro-angiogene eigenschappen van neutrofielen afhangen van de activering van de signalering van Nicotinamide foshoribosyltransferase (NAMPT) in deze cellen. Remming van dit traject in tumor-geassocieerde neutrofielen leidt tot hun krachtige Anti-angiogene fenotype. Hier, we demonstreren onze nieuw opgerichte model waardoor in vivo evaluatie van tumorigene potentieel van gemanipuleerde tumor-geassocieerde neutrofielen (Tans). Kort, Pro-angiogene tumor-geassocieerde neutrofielen kunnen worden geïsoleerd van tumor-dragende interferon-deficiënte muizen en geherpolariseerd in anti-angiogenic fenotype door het blokkeren van NAMPT signalering. De angiogene activiteit van deze cellen kan vervolgens worden geëvalueerd met behulp van een aorta ringtest. Anti-angiogene TANs kunnen worden overgebracht in tumor-dragende wilde type ontvangers en tumorgroei moet worden gecontroleerd voor 14 dagen. Op dag 14 worden muizen opgeofferd, tumoren verwijderd en gesneden met hun vascularisatie beoordeeld. Over het algemeen biedt ons protocol een nieuw hulpmiddel om in vivo de angiogene capaciteit van primaire cellen te evalueren, zoals tumor-geassocieerde neutrofielen, zonder dat er gebruik moet worden maken van kunstmatige neutrofiele cellenlijn modellen. Vc
Introduction
Type I interferonen (IFNs) spelen een belangrijke rol bij het stimuleren van gastheer reacties op neoplasias, als het ontbreken van type I IFN signalering resulteert in significant verhoogde tumorgroei1. Een van de mechanismen die betrokken zijn bij dit proces is de regulering van de tumorigene activiteit van tumor-geassocieerde neutrofielen, die wordt gecontroleerd door kolonie-stimulerende factor 3 receptor (CSF3R) downstream signalering2. Kolonie-stimulerende factor 3 (CSF3), of granulocyt kolonie-stimulerende factor, werd aangetoond dat het activeren van signalering met betrekking tot Nicotinamide foshoribosyltransferase (nampt)3,4. NAMPT is een snelheidsbegrenzer enzym voor de synthese van Nicotinamide adenine dinucleotide, dat de glycolyse verbetert en de DNA-herstelling, genexpressie en stressrespons bevordert die kankercellen overleven en proliferatie5. Nampt wordt overuitgedrukt in meerdere soorten kanker, waaronder colorectale, ovariële, borst, maag, prostaatkanker en gliomen6. NAMPT is niet alleen essentieel voor tumorcellen, maar ook voor een breed scala aan andere celtypen die aanwezig zijn in tumoren, zoals myeloïde cellen-het drijft hun differentiatie4, remt apoptosis en stimuleren van expressie van meerdere cytokines of matrix-vernederende enzymen in macrofagen7.
Tumor-geassocieerde neutrofielen vertegenwoordigen belangrijke modulatoren van tumorgroei. TAN-functies zijn sterk afhankelijk van de beschikbaarheid van type I IFN, zoals deze cytokines Prime anti-tumor activiteit van neutrofielen. Integendeel, de afwezigheid van IFNs ondersteunt tumorigene activering van deze cellen, met name hun Pro-angiogenic eigenschappen. In overeenstemming met deze, muizen tekort aan IFNs ontwikkelen aanzienlijk grotere en betere gevasculariseerde tumoren, die sterk zijn geïnfiltreerd met Pro-tumoral/Pro-angiogene neutrofielen1,2,8, 9,10. Belangrijk is dat dergelijke Pro-angiogene TANs een verhoogde activiteit van NAMPT vertonen, wat haar essentiële rol in de Pro-tumor-polarisatie van neutrofielen suggereert.
Depletie van neutrofielen met behulp van Ly6G antilichaam of remming van hun migratie (CXCR2 antilichaam) resulteert in verminderde tumor angiogenese, groei, en metastase1,8. Niettemin, gegenereerde monoklonale antilichamen zijn immunogeen, en hun administratie wordt geassocieerd met een scala aan levensbedreigende bijwerkingen11. Behandeling met kleine moleculen, zoals NAMPT-remmer FK866, die de neutrofiele tumoriogeniciteit moduleren, kan dergelijke complicaties helpen voorkomen. Helaas, farmacologische systemische remming van NAMPT, naast het therapeutische effect op tumorgroei, leidt tot ernstige bijwerkingen met inbegrip van gastro-intestinale toxiciteit en trombocytopenie. Daarom is de systemische toepassing van nampt-remmers niet haalbaar12,13,14.
Daarom stellen we hier een protocol voor waarbij NAMPT-activiteit direct in geïsoleerde TANs wordt geblokkeerd. Dergelijke anti-tumor neutrofielen worden vervolgens adoptively overgebracht naar een tumor-dragende gastheer. Dit protocol zal helpen voorkomen dat systemische toxische neveneffecten van de verbindingen, terwijl het effect ervan op de doelcellen zal worden gehandhaafd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures, met inbegrip van dierproef personen, zijn goedgekeurd door de regulerende instanties: LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) en Regierungspräsidium Tübingen, Duitsland. Alle manipulaties moeten worden uitgevoerd in steriele omstandigheden (onder laminaire stroom afzuigkap) met behulp van steriele reagentia en instrumenten (spuiten, schaar, Tang, wegwerp scalpels, Petri schalen).
Opmerking: het algemene schema van het protocol wordt weergegeven in Figuur 1.
1. bereiding van B16F10 melanoom cellijn
- Bereid Mycoplasma-negatieve cellen die zijn gekweekt in een 90% confluente monolaag (ongeveer 10 x 106 cellen/T75 kolf) in volledige Iscove gemodificeerde dulbecco's medium (imdmc: imdm + 10% foetaal runderserum (FBS) + 1% penicillaire-streptomycine).
- Verwijder het medium en spoel de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Breng 6 mL van een cel loslating oplossing met Proteolytische en collagenolytische enzymen aan (Zie de tabel met materialen) en inbroed gedurende 2 minuten bij 37 °c.
- Klop de kolf zachtjes om de overgebleven heupcellen van de bodem te mobiliseren. Verzamel de celsuspensie in buisjes van 15 mL en centrifugeer bij 300 x g gedurende 7 min en 20 °c.
- Verwijder de supernatant en rebreng de pellet goed in 1 mL PBS. Voeg 14 mL PBS en centrifuge (300 x g en 20 °c gedurende 7 min) toe.
- Verwijder de supernatant en rebreng de pellet in 1 mL PBS.
- Tel de cellen en hervat ze tot de concentratie van 3 x 106/ml PBS (voor de stap 2) of 6 x 106/ml PBS (voor de stap 6) voor injectie. Houd cellen maximaal 30 minuten op ijs.
2. allogene tumor model in muizen
- Gebruik 10 vrouwelijke Ifnar1-/- muizen 8-12 weken oud die onder specifieke-pathogeen-vrije (SPF) condities worden gehouden.
Opmerking: vrouwelijke muizen hebben de voorkeur in een subcutaan model van tumorgroei, aangezien mannetjes agressiever zijn en dus vatbaar zijn voor overtredingen van de tumor-site, die de tumorgroei beïnvloedt. - Scheer de huid van de muis op de flank met een elektrisch scheerapparaat en Desinfecteer de huid met NAT weefsel met 70% ethanol.
- Verzamel de bereide B16F10 melanoom cellen in een concentratie van 3 x 106/ml PBS (zie stap 1) in een 1 ml spuit en 0,4 x 19 mm naald. Injecteer 100 mL van de suspensie subcutaan.
- Meng de cellen goed voor elke injectie. Gebruik naalden niet minder dan 0,4 mm in diameter als niet storen tumorcellen.
- Plaats maximaal 5 muizen in één kooi en bedien de grootte van de tumor (lengte, breedte en diepte) met een remklauw gedurende 14 dagen.
Opmerking: volgens de dierlijke voorschriften, de grootte van de tumor mag niet groter zijn dan 15 mm in diameter, muizen met grotere of necrotische/open tumoren moeten vooraf worden geofferd. - Op dag 14, offeren de muizen in de CO2 kamer.
- Desinfecteer de huid met 70% ethanol en verwijder tumoren met een schaar en een tang in een steriele Petri schaal. Houd tumoren in een buis van 50 mL in volledige Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% penicillaire-streptomycine) op ijs.
3. TAN-isolatie
- Plaats tumoren in steriele 6-well platen, 5 tumoren per put. Snijd tumoren in 2-3 mm stukken met steriele schaar.
- Verteren met 1 mL dispase/Collagenase D/DNase I-oplossing (0,2 mg/0,2 mg/100 mg in 1 mL DMEMc) per tumor. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2 in een vochtige incubator en meng met een spuit van 10 ml zonder naald om de 15 min 3 keer.
- Om onverteerde vezels te verwijderen, worden mesh cellen tot 100 μm gefilterd in buizen van 15 mL (één goed per filter per buis). Voeg PBS toe aan 15 mL, centrifugebuizen bij 460 x g, 4 °c gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Lyse erytrocyten met een lysisbuffer (NH4cl 150 mm, khco3 10 mM, EDTA 0,1 mm, pH 7,3, 20 °C) door 1 ml in elke buis toe te voegen. Meng goed en combineer de oplossing van alle buizen in één. Stop de reactie na 2 minuten met 11 mL ijskoud (4 °C) DMEMc.
- Centrifugeer bij 460 x g, 4 °c gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Respendeer de pellet met 15 mL koude PBS. Centrifugeer bij 460 x g, 4 °c gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Respendeer de pellet in 1 mL PBS. Voeg 3 mL antilichamen van FC-Block (CD16/CD32, voorraad 0,5 mg/mL) toe en incuberen op ijs gedurende 15 minuten.
- Voeg antilichamen toe: 10 mL Ly6G-PE (Stock 0,2 mg/mL) en 10 mL CD11b-APC (Stock 0,2 mg/mL). Voeg toe 20 mL 6-Diamidin-2-fenylindol levensvatbaarheid kleurstof (DAPI, voorraad 5 mg/mL) en inincuberen op ijs in de duisternis gedurende 30 minuten.
Opmerking: er kan een andere combinatie van levensvatbaarheid kleurstoffen en fluorescerende conjugaten van antilichamen worden gebruikt. - Voeg PBS tot 15 mL toe, centrifugeer bij 460 x g, 4 °c gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Rebreng de pellet in DMEMc naar de concentratie ongeveer 10 x 106/ml, en blijf op ijs.
- Sorteer CD11b+ Ly6GHi Alive (DAPI-negatief) neutrofielen met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (gating-strategie Zie Figuur 2).
Opmerking: Houd de buis met celsuspensie en de buis met DMEMc voor gesorteerde cellen bij 4 °C. Gebruik de volgende optimale sorteerinstellingen: een 70 mm nozzle, een drempel snelheid van maximaal 22.000 gebeurtenissen/seconde en een debiet van 1-3. - Controleer de zuiverheid van de gesorteerde neutrofielen met behulp van een cytometer voor een aanbevolen zuiverheid van > 95%.
- Centrifugeer de gesorteerde neutrofielen bij 460 x g, 4 °c gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Respendeer de gesorteerde cellen in DMEMc naar de concentratie van 1 x 106/ml.
Opmerking: het verwachte aantal neutrofielen in 1 14-dag B16F10 tumor (10 mm diameter) is ongeveer 3 x 104 cellen.
4. NAMPT remming in TANs in vitro
- Bereid FK866 (NAMPT inhibitor) voorraad in dimethylsulfoxide (DMSO) bij een eindconcentratie van 100 mM.
- Zaad gesorteerde neutrofielen (stap 3,11) in 2 putten van een 96-goed U-bodemplaat (1,5 x 105 neutrofielen/goed). Voeg FK866 in de interventie goed (uiteindelijke concentratie van 100 nM), en een gelijke hoeveelheid DMEMc met DMSO in de controle goed. Incuberen voor 2 uur bij 37 °C, 5% CO2 in een vochtige incubator.
- Centrifugeer bij 460 x g, 4 °c gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Respendeer in elke put in 200 mL PBS. Herhaal dit 2 keer.
- Centrifugeer bij 460 x g, 4 °c gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Respenderen in commercieel endotheel celgroei medium (aangevuld met 4 μL/mL endotheliale celgroei supplement, 0,1 ng/mL recombinant humane epidermale groeifactor, 1 ng/mL recombinant humane basis fibroblast groeifactor, 90 μg/mL heparine en 1 μg/mL Hydrocortison) tot een eindconcentratie van 0,2 x 106 cellen/ml (in 0,75 ml) (voor stap 5) of in PBS tot de eindconcentratie van 0,6 x 106 cellen/mL (in 0,25 ml) (voor stap 6).
5. schatting van de angiogene eigenschappen van TANs met behulp van de aorta ringtest
- Dissect de thoracale aorta van een mannelijke C57BL/6j (WT) muis. Reinig en snijd in 0,5 mm breedte ringen. Plaats alle ringen in een put van een 24-put plaat met 1 mL aangevuld endotheliale celgroei medium. Incubate 's nachts bij 37 °C, 5% CO2 in een vochtige incubator.
Opmerking: het gebruik van jonge (jonger dan 8 weken) mannelijke muizen voor aorta dissectie heeft de voorkeur, omdat ze een robuustere angiogene respons geven15. - Vul de putjes van de 96-goed vlakke bodemplaat met 50 μL opgeloste kelder membraan matrix, laat de gel 30 minuten in een 37 °C, 5% CO2 vochtige incubator instellen om de matrix toe te laten polymeriseren. Bereid ten minste 3 putjes per conditie.
- Embed de ringen in opgeloste kelder membraan matrix door het plaatsen van een aorta ring op de bovenkant van de massieve matrix laag, 1 ring in het midden van elk goed. Voeg nog eens 50 μL opgeloste kelder membraan matrix toe om elke ring te bedekken.
- Plaats de plaat in een 37 °C, 5% CO2 vochtige incubator voor nog eens 30 min om de polymerisatie van de tweede matrix laag mogelijk te maken.
- Voeg 150 ml/goed aangevuld endotheliale celgroei medium en 2x104Ifnar1-/- Tans (controle en FK866-behandeld) (stap 4,4).
- Incuberen de plaat gedurende 14 dagen bij 37 °C, 5% CO2 in een vochtige incubator.
- Beeld met behulp van een standaard fase-contrast Microscoop en schat de endotheliale vertakkingen. Kwantitatieve beoordeling van het vat morphometrische en ruimtelijke parameters met inbegrip van vertakkings index kan automatisch worden uitgevoerd met behulp van het beeldverwerkings programma ontworpen voor wetenschappelijke beelden.
Opmerking: representatieve resultaten worden afgebeeld in Figuur 3.
6. adoptieve overdracht van behandelde neutrofielen in het allogene tumor model
- Bereid B16F10 melanoom cellen (stap 1,6) in PBS met een concentratie van 6 x 106 cellen/ml.
- Bereid 2 soorten neutrofielen voor: FK866-behandelde neutrofielen en controle van onbehandelde neutrofielen (stap 4,4) in PBS met een concentratie van 6 x 105 cellen/ml. Meng neutrofielen met B16F10 melanoom cellen (de uiteindelijke neutrofiele naar tumorcellen ratio 1:10) om 2 soorten celmengsels te hebben.
- Neem 10 vrouwelijke WT muizen 8-12 weken oud, 5 in elke groep. Scheer de huid op de flank met een elektrisch scheerapparaat en desinfecteer met 70% ethanol.
- Injecteer 100 μL van de celsuspensie (stap 6,2) subcutaan met een insulinespuit en een naald van 0,4 mm diameter, aan beide groepen muizen. Plaats 1-5 muizen uit dezelfde groep in één kooi.
- Op dag 2, bereid 2 soorten neutrofielen: FK866-behandelde neutrofielen en controle onbehandeld neutrofielen (stap 4,4) in PBS in een concentratie 6 x 105 cellen/ml. Injecteer 100 μL celsuspensie (stap 6,4) i.v. in de staart ader met een insulinespuit en een naald van 0,4 mm diameter, aan beide groepen muizen. Plaats de muizen terug in de kooi.
7. tumor groei meting, histologisch onderzoek
- Monitor tumorgroei om de andere dag. Evalueer de grootte van de tumor met remklauwen en bereken het tumor volume met de formule V = 4/3 * π * (h * w2)/8 (h = hoogte, w = breedte, diepte = breedte).
- Offer muizen op de dag 14 in de CO2 kamer. Tumoren verwijderen en meten van de tumor gewichten.
- Bevriezen van tumoren in optimale snijtemperatuur compound in vloeibare stikstof, en bewaren bij-80 °C.
- Dooi de monsters tot-20 °C en maak 5 mm profielen met behulp van een cryotome. Laat de cryosnijden 30 minuten drogen bij 20 °C. Bevestig de secties in-20 °C koude aceton gedurende 2 minuten en laat ze 30 minuten drogen bij 20 °C.
- Blok met FC-Block antilichamen (CD16/CD32, voorraad 0,5 mg/mL 1:500) in PBS voor 1 uur bij 20 °C.
- Vlek met konijn-anti-muis laminin gamma-antilichamen (1:1500 in PBS, 200 μL) voor 1 uur bij 20 °C. Wassen met PBS drie keer.
- Beits met secundair geit anti-konijnen antilichaam (voorraad 0,5 mg/mL, 1:400 in PBS), anti-muis αSMA (1:500 in PBS) en 2 μL DAPI (voorraad 5 mg/mL, 1:100 in PBS) in een eindvolume van 200 μL antilichaam oplossing. Inincuberen gedurende 1 uur bij 20 °C in duisternis. Wassen met PBS drie keer.
- Droge glijbanen gedurende 20 minuten bij 20 °C in duisternis. Monteer met watervrij montage medium voor microscopie en afdekking met een dekslip. Laat het 1 uur drogen in 37 °C.
- Voer microscopisch onderzoek uit. Kwantificeer de vascularisatie door het totale aantal (optioneel gebied) van laminin+ vaten en het aantal (gebied) van SMA+ ontwikkelde vaten te tellen.
Opmerking: om beeldanalyse uit te voeren, neemt u alle beelden onder dezelfde omstandigheden (licht, contrast, vergroting). In dit geval zijn de verwerkingsparameters vast en wordt de beeldverwerking volledig automatisch. Representatieve resultaten worden afgebeeld in Figuur 4 en Figuur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de hier beschreven procedure, Ifnar1-/- neutrofielen werden geïsoleerd van tumoren en behandeld met nampt inhibitor FK866 voor 2 h. onbehandeld Ifnar1-/- neutrofielen werden gebruikt als een controle. De effectiviteit van de behandeling werd geëvalueerd met behulp van de aorta ringtest, die de belangrijkste stappen weerspiegelt die betrokken zijn bij angiogenese (matrix degradatie, migratie, proliferatie, reorganisatie). We kunnen aantonen dat FK866 behandelde neutrofielen een significant verminderde capaciteit hebben om de vorming van aorta takken te stimuleren, in vergelijking met onbehandelde cellen (Figuur 3a, 3B). FK866-behandelde Anti-angiogene neutrofielen werden subcutaan geïnjecteerd in tumor-dragende muizen (op dag 0 flank en dag 2 i.v.). We konden observeren significant verminderde tumorgroei, in vergelijking met muizen geïnjecteerd met onbehandelde Ifnar1-/- neutrofielen (figuur 4a, 4b). Histologisch onderzoek van de geëxtraheerde tumoren bleek de significante onderdrukking van angiogenese in tumoren geïsoleerd van muizen behandeld met FK866-behandelde tans, in vergelijking met die geïnjecteerd met onbehandelde Ifnar1-/- neutrofielen ( Figuur 5a , B).
Figuur 1. Het schema van het protocol. Stap 1. Bereiding van B16F10 melanoom cellijn; 2. allogene tumor model in muizen; 3. isolatie van TANs van de tumoren; 4. remming van NAMPT in TANs in vitro; 5. schatting van de angiogene eigenschappen van TANs in de aorta ringtest; 6. adoptie overdracht van behandelde neutrofielen in het allogene tumor model; 7. tumor groei monitoring, histologisch onderzoek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Gating strategie voor TANs sorteren. CD11b+ Ly6GHi levend neutrofielen worden gesorteerd van tumoren met de zuiverheid ≥ 95%. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Onderdrukking van angiogene eigenschappen van TANs na FK866 behandeling. Angiogene eigenschappen van gesorteerde Ifnar1-/-Tans behandeld met FK866 of met medium werden geschat met behulp van aorta ring assay. De vestigings formatie werd gedurende 14 dagen gemonitord, representatieve resultaten op dag 14 worden weergegeven (a). Behandeling met FK866 daalde significant het aantal endotheel takken (B). Gegevens worden weergegeven als mediaan, interkwartielafstand en min-max, * p < 0.05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Retardatie van tumorgroei na adoptie overdracht van FK866-behandelde neutrofielen. De invloed van TANs op de tumorgroei werd beoordeeld. TANs werden geïsoleerd, behandeld met FK866 en geïnjecteerd in tumor-dragende muizen zoals hierboven beschreven. Op dag 14 werden muizen geofferd, tumoren verwijderd en geanalyseerd. Ifnar1-/- TANs behandeld met FK866 versus Controls werden vergeleken. (A) tumorgroei werd gemeten, (B) tumor massa en (C) grootte werden geschat. Gegevens worden weergegeven als mediaan, interkwartielafstand en min-max, * p < 0.05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5. Onderdrukt tumor vascularisatie na adoptie overdracht van FK866-behandelde neutrofielen. Tumoren werden geïsoleerd zoals hierboven beschreven (Fig 4). De rijping van het vat werd beoordeeld met anti-SMA antilichamen (volwassen vaten) en anti-gamma laminine (endotheel cellen). A) representatieve kleuring van tumoren wordt getoond: SMA (groen), laminine (rood). Schaal stangen: 50 μm. B) kwantificering van tumor vascularisatie na adoptie van Tans met FK866 (groen) of medium (rood) gegevens worden weergegeven als mediaan, interkwartielafstand en min-max, * p < 0.05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks de vooruitgang in chirurgische en farmacologische kankerbehandeling blijft succesvolle therapie een uitdaging. Aangezien immuun cellen zijn bekend dat een belangrijke rol spelen in de regulering van de tumorgroei, nieuwe methoden remming van de tumorigeniciteit van dergelijke cellen moeten worden vastgesteld. Hier demonstreren we een nieuwe aanpak om tumorgroei te onderdrukken via adoptie overdracht van Anti-angiogene tumor-geassocieerde neutrofielen. Selectieve targeting van Pro-angiogene NAMPT signalering in TANs, met behulp van FK866 inhibitor, voorkomt bijwerkingen, die worden waargenomen bij systemische FK866 behandeling.
Het meest kritieke onderdeel van het protocol is de noodzaak om vers geïsoleerde primaire neutrofielen te gebruiken. Neutrofielen zijn korte-levende cellen, ondergaan apoptosis of geactiveerd tijdens de procedure van isolatie. Muriene neutrofielen moeten worden bewaard in 4 °C Media tijdens alle stappen van isolatie, inclusief het sorteren van cellen. Het isoleren van neutrofielen moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd en het experiment mag niet worden onderbroken. Gebruik van FC-Block maakt het verminderen van de onspecifieke kleuring van de cellen met hoge FC-receptor expressie, zoals NK-cellen. We raden ook aan om het aantal fluorescerende-geconjugeerde antilichamen te minimaliseren om de gating-strategie te vereenvoudigen en om de activering van neutrofielen te voorkomen als gevolg van antilichaam binding.
De beperkende stap van het protocol is de isolatie van levende neutrofielen van tumoren als gevolg van een relatief lage hoeveelheid van deze cellen in tumoren (niet meer dan 1% van de enkelvoudige levende cellen in melanoom). Dit kan alleen mogelijk met behulp van flow Cytometry-gebaseerde sortering. Op hetzelfde moment, het gebruik van bloed neutrofielen voor dit protocol moet worden vermeden als gevolg van slechts geringe regulering van NAMPT expressie en hun lage functionaliteit, die wordt gewijzigd op tumorweefsel aankomst16. Eventueel, om te gebruiken bloed neutrofielen, ze moeten eerder worden geactiveerd met behulp van tumor-afgeleide groeifactoren.
Om neutrofiele apoptosis te voorkomen, wordt een korte behandeling met FK866 (2-4 h) gesuggereerd, omdat het geen invloed heeft op de levensvatbaarheid van TANs, terwijl langdurige behandeling neutrofiele apoptosis16induceert. Kortom, het protocol demonstreert het potentieel van ex-vitro gemanipuleerde Anti-angiogene neutrofielen om functioneel onderdrukken tumorgroei in muis melanoom tumor model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ons werk werd gesteund door subsidies van Deutsche Krebshilfe, subsidie nummer: 111647, en Duitse Onderzoeksraad (DFG), subsidie nummer: JA 2461/2-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
