Summary
Qui, mostriamo il potenziale terapeutico dei neutrofili anti-angiogenici associati al tumore dopo il loro trasferimento in topi portatori di tumore. Questo protocollo può essere utilizzato per manipolare l'attività dei neutrofili ex vivo e successivamente valutare la loro funzionalità in vivo nello sviluppo di tumori. È un modello appropriato per studiare potenziali immunoterapie a base di neutrofili.
Abstract
Il contributo dei neutrofili alla regolazione della tumorigenesi sta ricevendo una maggiore attenzione. Queste cellule sono eterogenee, e a seconda dell'ambiente tumorale può possedere capacità pro o anti-tumorale. Una delle citochine importanti che regolano le funzioni neutrofili in un contesto tumorale sono gli interferoni di tipo I. In presenza di interferoni, i neutrofili ottengono proprietà antitumorali, tra cui citotossicità o stimolazione del sistema immunitario. Al contrario, l'assenza di un segnale di interferone si traduce in un'attività pro-tumorale prominente, caratterizzata da una forte stimolazione dell'angiogenesi tumorale. Recentemente, potremmo dimostrare che le proprietà pro-angiogeniche dei neutrofili dipendono dall'attivazione del percorso di segnalazione del fosfororiboyltransferae nicotina (NAMPT) in queste cellule. L'inibizione di questa via nei neutrofili associati al tumore porta al loro potente fenotipo anti-angiogenico. Qui, dimostriamo il nostro modello appena stabilito che consente la valutazione in vivo del potenziale tumorale dei neutrofili associati al tumore manipolati (TAN). A breve, i neutrofili pro-angiogenici associati al tumore possono essere isolati da topi carenti di interferonzi otumorali e ripolarti in fenotipi anti-angiogenici bloccando la segnalazione NAMPT. L'attività angiogenica di queste cellule può essere successivamente valutata utilizzando un saggio ad anello aortico. I TAN anti-angiogenici possono essere trasferiti in destinatari di tipo selvaggio portatori di tumore e la crescita del tumore deve essere monitorata per 14 giorni. Al giorno 14 topi vengono sacrificati, tumori rimossi e tagliati con la loro vascolarizzazione valutata. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un nuovo strumento per valutare la capacità angiogenica delle cellule primarie, come i neutrofili associati al tumore, senza la necessità di utilizzare modelli di linee cellulari artificiali di neutrofili. Vc
Introduction
Gli interferoni di tipo I (IFN) svolgono un ruolo importante nella stimolazione delle risposte dell'ospite alle neoplasie, poiché la mancanza di segnalazione IFN di tipo I si traduce in una crescita tumorale significativamente elevata1. Uno dei meccanismi coinvolti in questo processo è la regolazione dell'attività tumorale dei neutrofili associati al tumore, che è controllata dalla segnalazione a valle del fattore di stimolazione della colonia 3 (CSF3R). Il fattore stimolante della colonia 3 (CSF3), o fattore di stimolazione della colonia di granulociti, ha dimostrato di attivare la segnalazione che coinvolge la tosfororibosyltransferae alla nicotinamina (NAMPT)3,4. NAMPT è un enzima che limita il tasso per la sintesi di dinucleotide dell'adenina nicotinamide, che migliora la glicolisi e regola la riparazione del DNA, l'espressione genica e la risposta allo stress promuovendo la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule tumorali5 . NAMPT è sovraespresso in più tipi di cancro, tra cui colorettale, ovarico, seno, gastrico, cancro alla prostata e glioma6 . NAMPT è essenziale non solo per le cellule tumorali, ma anche per una grande varietà di altri tipi di cellule presenti nei tumori, come le cellule mieloidi - guida la loro differenziazione4, inibisce l'apoptosi e stimola l'espressione di citochine multiple o enzimi degradanti in macrofagi7.
I neutrofili associati al tumore rappresentano importanti modulatori della crescita tumorale. Le funzioni TAN dipendono fortemente dalla disponibilità IFN di tipo I, in quanto queste citochine primo attività anti-tumorale dei neutrofili. Al contrario, l'assenza di IFN supporta l'attivazione cancerogena di queste cellule, in particolare le loro proprietà pro-angiogeniche. In accordo con questo, i topi carenti in IFN sviluppano tumori vascolarizzati significativamente più grandi e migliori, che sono fortemente infiltrati con neutrofili pro-tumorale / pro-angiogenico1,2,8, 9,10. È importante sottolineare che tali TAN pro-angiogenici mostrano un'elevata attività di NAMPT, suggerendo il suo ruolo essenziale nella polarizzazione pro-tumorale dei neutrofili.
L'esaurimento dei neutrofili usando anticorpo Ly6G o inibizione della loro migrazione (anticorpo CXCR2) provoca una diminuzione dell'angiogenesi tumorale, crescita, e metastasi1,8. Tuttavia, gli anticorpi monoclonali generati sono immunogenici e la loro somministrazione è associata a una serie di effetti collaterali pericolosi per la vita11. Il trattamento con piccole molecole, come l'inibitore NAMPT FK866, che modula la tumoriogenicità dei neutrofi, potrebbe aiutare a evitare tali complicazioni. Sfortunatamente, l'inibizione sistemica farmacologica di NAMPT, accanto al suo effetto terapeutico sulla crescita del tumore, porta a gravi effetti collaterali tra cui tossicità gastrointestinale e trombocitopenia. Pertanto, l'applicazione sistemica degli inibitori NAMPT non è fattibile12,13,14.
Per questo motivo, è possibile suggerire un protocollo in cui l'attività NAMPT viene bloccata direttamente in TAN isolati. Tali neutrofili anti-tumorale vengono poi trasferiti adottivamente in un ospite portatore di tumori. Questo protocollo aiuterà a evitare gli effetti collaterali tossici sistemici dei composti, mentre il suo effetto sulle cellule bersaglio sarà sostenuto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure, compresi i soggetti animali, sono state approvate dalle autorità di regolamentazione: LANUV (Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) e Regierungspr-sidium Tubingen, Germania. Tutte le manipolazioni devono essere eseguite in condizioni sterili (sotto cofano di flusso laminare) utilizzando reagenti e strumenti sterili (siringhe, forbici, pinze, bisturi usa e getta, piatti Petri).
NOTA: lo schema generale del protocollo è illustrato nella figura 1.
1. Preparazione della linea cellulare del melanoma B16F10
- Preparare le cellule micoplasma-negative cresciute fino a raggiungere il 90% di un monostrato confluente del 90% (circa 10 x 106 cellule/t75) in un flask completo di Iscove's Modified Dulbecco (IMDMc: IMDM - 10% Fetal Bovine Serum (FBS) - 1% di penicillina-streptomicina).
- Rimuovere il mezzo e sciacquare le cellule con salina tampina buffer di fosfato (PBS). Applicare 6 mL di una soluzione di distacco cellulare contenente enzimi proteolitici e collagenolitici (vedi tabella dei materiali) e incubare a 37 gradi centigradi per 2 min.
- Knock la fiaschetta delicatamente per mobilitare le cellule rimanenti aderenti dal fondo. Raccogliere la sospensione cellulare in tubi da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 7 min e 20 gradi centigradi.
- Rimuovere il supernatante e risospendere bene il pellet in 1 mL di PBS. Aggiungere 14 mL di PBS e centrifuga (300 x g e 20 gradi centigradi per 7 min).
- Rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet in 1 mL di PBS.
- Contare le cellule e sospenderle nuovamente alla concentrazione di 3 x 106/mL PBS (per il passaggio 2) o 6 x 106/mL PBS (per il passaggio 6) per l'iniezione. Tenere le cellule sul ghiaccio per un massimo di 30 min.
2. Modello tumorale allogenico nei topi
- Utilizzare 10 femmine Ifnar1-/- topi di 8-12 settimane che sono tenuti in condizioni specifiche-senza patogeni (SPF).
NOTA: I topi femminili sono preferibili in un modello sottocutaneo di crescita tumorale, poiché i maschi sono più aggressivi e quindi inclini a infrazioni del sito tumorale, che influenza la crescita del tumore. - Rasare la pelle del topo sul fianco con un rasoio elettrico e disinfettare la pelle con tessuto bagnato con 70% di etanolo.
- Raccogliere le cellule melanoma B16F10 preparate ad una concentrazione di 3 x 106/mL PBS (vedere il passaggio 1) in una siringa da 1 mL e un ago da 0,4 x 19 mm. Iniettare 100 mL della sospensione sottocutaneamente.
- Mescolare le cellule ben prima di ogni iniezione. Utilizzare aghi di diametro non inferiore a 0,4 mm per non disturbare le cellule tumorali.
- Mettere fino a 5 topi in una gabbia e controllare la dimensione del tumore (lunghezza, larghezza e profondità) con una pinza per 14 giorni.
NOTA: Secondo le normative sugli animali, la dimensione del tumore non deve superare i 15 mm di diametro, i topi con tumori più grandi o necrotici/aperti devono essere sacrificati in anticipo. - Al giorno 14, sacrificare i topi nella camera CO 2.
- Disinfettare la pelle con il 70% di etanolo e rimuovere i tumori con le forbici e le pinze in una parabola Petri sterile. Tenere i tumori in un tubo da 50 mL in completo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEMc: DMEM - 10% FBS - 1% penicillina-streptomycin) sul ghiaccio.
3. Isolamento TAN
- Mettere i tumori in piastre sterili a 6 pozzi, 5 tumori per pozzo. Tagliare i tumori in pezzi da 2-3 mm con forbici sterili.
- Digest con 1 mL di dispase/collagenase D/DNase I soluzione (0,2 mg/0,2 mg/100 mg in 1 mL di DMEMc) per tumore. Incubare a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 in un'incubatrice umida, e mescolare con una siringa da 10 mL senza ago ogni 15 min 3 volte.
- Per rimuovere le fibre non digerite, le celle mesh attraverso filtri da 100 m in tubi da 15 mL (un pozzo per tubo). Aggiungere PBS a 15 mL, centrifugare i tubi a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatante.
- Eritrociti di lisse con un buffer di lisi (NH4Cl 150 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3, 20 gradi centigradi) aggiungendo 1 mL in ogni tubo. Mescolare bene, e combinare la soluzione da tutti i tubi in uno. Interrompere la reazione dopo 2 minuti con 11 mL di DMEMc ghiacciato.
- Centrifuga a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatante. Risospendere il pellet con 15 mL di PBS freddo. Centrifuga a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatante.
- Risospendere il pellet in 1 mL di PBS. Aggiungere 3 mL di anticorpi Fc-block (CD16/CD32, stock 0,5 mg/mL) e incubare sul ghiaccio per 15 min.
- Aggiungere anticorpi: 10 mL di Ly6G-PE (stock 0,2 mg/mL) e 10 mL di CD11b-APC (stock 0,2 mg/mL). Aggiungere 20 mL di 6-Diamidin-2-fenilindol viability dye (DAPI, stock 5 mg/mL) e incubare sul ghiaccio nel buio per 30 min.
NOTA: È possibile utilizzare un'altra combinazione di coloranti di vitalità e coniugati fluorescenti di anticorpi. - Aggiungere PBS fino a 15 mL, centrifugare a 460 x g, 4 gradi C per 5 min, e rimuovere il supernatante.
- Risospendere il pellet in DMEMc alla concentrazione di circa 10 x 106/mL, e mantenere il ghiaccio.
- Ordinare i neutrofili CD11b- Ly6Ghi alive (DAPI-negative) con una selezionatrice cellulare attivata dalla fluorescenza (strategia di gating vedere Figura 2).
NOTA: Tenere il tubo con la sospensione cellulare e il tubo con DMEMc per le celle ordinate a 4 gradi centigradi. Utilizzare le seguenti impostazioni di ordinamento ottimali: un ugello di 70 mm, una soglia di massimo 22.000 eventi al secondo e una portata di 1-3. - Controllare la purezza dei neutrofili ordinati utilizzando un citometro per una purezza raccomandata di >95%.
- Centrifuga neutrofili ordinati a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatore. Sospendere le celle ordinate in DMEMc alla concentrazione di 1 x 106/mL.
NOTA: Il numero previsto di neutrofili in un tumore B16F10 di 14 giorni (diametro 10 mm) è di circa 3 x 104 cellule.
4. Inibizione NAMPT nei TAN in vitro
- Preparare lo stock di FK866 (inibitore NAMPT) in dimeillfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di 100 mM.
- Neutrofili smistati di semi (passaggio 3.11) in 2 pozze di una piastra u-inferiore di 96 pozze (1,5 x 105 neutrofili/pozzo). Aggiungere FK866 nel pozzo di intervento (concentrazione finale di 100 nM) e una quantità uguale di DMEMc con DMSO nel pozzo di controllo. Incubare per 2 h a 37 , 5% DI CO2 in un'incubatrice umida.
- Centrifuga a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatante. Risospendere in 200 mL di PBS in ogni pozzo. Ripetere 2 volte.
- Centrifuga a 460 x g, 4 gradi centigradi per 5 min, e rimuovere il supernatante. Risospendere nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali commerciali (completato con 4 integratori di crescita delle cellule endoteliali l/mL, 0,1 ng/mL recombinante fattore di crescita eepidermica umana, 1 fattore di crescita del fibroblasto di base umano ricombinante di 1 ng/mL, 90 g/mL di eparina e 1 g/mL hydrocortisone) ad una concentrazione finale di 0,2 x 106 cellule/mL (in 0,75 mL) (per il passaggio 5) o in PBS alla concentrazione finale di 0,6 x 106 cellule/mL (in 0,25 mL) (per il passaggio 6).
5. Stima delle proprietà angiogeniche delle TAN utilizzando il saggio dell'anello aortico
- Dissezionare l'aorta toracica da un topo maschio C57BL/6J (WT). Pulire e tagliare in anelli di 0,5 mm di larghezza. Mettere tutti gli anelli in un pozzo di una piastra di 24 pozze con 1 mL di mezzo di crescita cellulare endoteliale integrato. Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 in un'incubatrice umida.
NOTA: L'uso di topi maschi giovani (di meno di 8 settimane) per la dissezione dell'aorta è preferibile, poiché danno una risposta angiogenica più robusta15. - Riempire i pozze della piastra piatta da 96 pozzecon 50, con 50 gradi di matrice di membrana sotterranea solubile, lasciare che il gel sia impostato per 30 min in un'incubatrice umida di 37 gradi, 5% di CO2 per consentire alla matrice di polimerizzare. Preparare almeno 3 pozzi per condizione.
- Incorporare gli anelli in matrice di membrana seminterrato solubile posizionando un anello aortico sulla parte superiore dello strato di matrice solida, 1 anello al centro di ogni pozzo. Aggiungere altri 50 - L di matrice di membrana seminterrato solubile per coprire ogni anello.
- Collocare la piastra in un'incubatrice umida di 37 gradi centigradi per altri 30 min per consentire la polimerizzazione del secondo strato di matrice.
- Aggiungere 150 mL/podi di media di crescita delle cellule endoteliali integrate e 2x104Ifnar1-/- TAN (controllo e Trattato FK866) (passaggio 4.4).
- Incubare la piastra per 14 giorni a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 in un'incubatrice umida.
- Immagine con un microscopio a contrasto di fase standard e stimare la ramificazione endoteliale. La valutazione quantitativa dei parametri morfometrici e spaziali della nave, incluso l'indice di diramazione, può essere eseguita automaticamente utilizzando il programma di elaborazione delle immagini progettato per le immagini scientifiche.
NOTA: i risultati rappresentativi sono illustrati nella figura 3.
6. Trasferimento adottivo di neutrofili trattati nel modello tumorale allogenico
- Preparare le cellule di melanoma B16F10 (passaggio 1,6) in PBS a una concentrazione di 6 x 106 cellule/mL.
- Preparare 2 tipi di neutrofili: neutrofili trattati da FK866 e controllano i neutrofili non trattati (passaggio 4.4) in PBS ad una concentrazione di 6 x 105 cellule/mL. Mescolare i neutrofili con le cellule del melanoma B16F10 (il rapporto tra neutrofili e cellule tumorali finali 1:10) per avere 2 tipi di miscele cellulari.
- Prendere 10 topi WT femminili 8-12 settimane di età, 5 in ogni gruppo. Rasare la pelle sul fianco con un rasoio elettrico e disinfettare con 70% etanolo.
- Iniettare 100 l della sospensione cellulare (passaggio 6.2) sottocutaneamente con una siringa di insulina e un ago di 0,4 mm di diametro, a entrambi i gruppi di topi. Mettere 1-5 topi dello stesso gruppo in una gabbia.
- Al giorno 2, preparare 2 tipi di neutrofili: neutrofili trattati da FK866 e controllare i neutrofili non trattati (passaggio 4.4) in PBS ad una concentrazione di 6 x 105 cellule/mL. Iniettare 100 l di sospensione cellulare (passaggio 6.4) i.v. nella vena posteriore con una siringa di insulina e un ago di 0,4 mm di diametro, a entrambi i gruppi di topi. Rimettere i topi nella gabbia.
7. Misurazione della crescita tumorale, esame istologico
- Monitorare la crescita del tumore a giorni alterni. Valutare la dimensione del tumore con le pinze e calcolare il volume del tumore con la formula V , 4 /3 , ( h , w2)/ 8 (h - altezza, w - larghezza, profondità " larghezza).
- Sacrificare i topi al giorno 14 nella camera CO 2. Rimuovere i tumori e misurare i pesi del tumore.
- Congelare i tumori in una temperatura di taglio ottimale composto in azoto liquido, e conservare a -80 gradi centigradi.
- Scongelare i campioni fino a -20 gradi centigradi e preparare sezioni da 5 mm con un criotome. Lasciare asciugare i criocuts per 30 min a 20 gradi centigradi. Fissare le sezioni in acetone freddo -20 gradi per 2 min e lasciarle asciugare per 30 min a 20 gradi centigradi.
- Blocco con anticorpi Fc-block (CD16/CD32, stock 0,5 mg/mL 1:500) in PBS per 1 h a 20 gradi centigradi.
- Macchie con anticorpo gamma Laminin (1:1500 in PBS, 200 l) per 1 h a 20 gradi centigradi. Lavare con PBS tre volte.
- Macchia con anticorpo secondario anti-coniglio di capra (stock 0,5 mg/mL, 1:400 in PBS,), anti-topo sMA (1:500 in PBS) e 2 L di DAPI (stock 5 mg/mL, 1:100 in PBS) in un volume finale di 200 l di soluzione anticorpale. Incubare per 1 h a 20 gradi centigradi al buio. Lavare con PBS tre volte.
- Scivoli asciutti per 20 minuti a 20 gradi centigradi al buio. Montare con anidroso supporto di montaggio per microscopia e coprire con un coperchio. Lasciare asciugare 1 h in 37 gradi centigradi.
- Eseguire un esame microscopico. Quantificare la vascolarizzazione contando il numero totale (opzionalmente area) dei vasi Laminin e il numero (area) di SMA- vasi sviluppati.
NOTA: per eseguire l'analisi delle immagini, scattare tutte le immagini nelle stesse condizioni (luce, contrasto, ingrandimento). In questo caso, i parametri di elaborazione sono fissi e l'elaborazione delle immagini diventa completamente automatica. I risultati rappresentativi sono illustrati nella Figura 4 e nella Figura 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizzando la procedura descritta qui, i neutrofili Ifnar1-/- sono stati isolati dai tumori e trattati con l'inibitore NAMPT FK866 per 2 h. I neutrofili non trattati -/- sono stati usati come controllo. L'effettività del trattamento è stata valutata utilizzando il saggio dell'anello aortico, che riflette i passaggi chiave coinvolti nell'angiogenesi (degradazione della matrice, migrazione, proliferazione, riorganizzazione). Potremmo dimostrare che i neutrofili trattati con FK866 hanno una capacità significativamente ridotta per stimolare la formazione di rami aortici, rispetto alle cellule non trattate (Figura 3A, 3B). I neutrofili anti-angiogenici trattati con FK866 sono stati iniettati sottocutaneamente in topi portatori di tumore (giorno 0 fianco e giorno 2 i.v.). Potremmo osservare una crescita tumorale significativamente compromessa, rispetto ai topi iniettati con neutrofili non trattati Ifnar1-/- (Figura 4A, 4B). L'esame istologico dei tumori estratti ha dimostrato la significativa soppressione dell'angiogenesi nei tumori isolati da topi trattati con TAN trattati con FK866, rispetto a quelli iniettati con ifnar1non trattati - Figura 5A ,B.
come illustrato nella Figura 1. Lo schema del protocollo. Passo 1. Preparazione della linea cellulare del melanoma B16F10; 2. modello tumorale allogenico nei topi; 3. Isolamento dei TAN dai tumori; 4. inibizione del NAMPT nei TAN in vitro; 5. Stima delle proprietà angiogeniche delle TAN nell'assaggio dell'anello aortico; 6. trasferimento adottivo di neutrofili trattati nel modello tumorale allogenico; 7. Monitoraggio della crescita del tumore, esame istologico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 2. Strategia di Gating per l'ordinamento TAN. CD11b- I neutrofilihi alive ly6G sono ordinati da tumori con la purezza del 95%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella figura 3. Soppressione delle proprietà angiogeniche dei TAN dopo il trattamento con FK866. Le proprietà angiogeniche di Ifnar1ordinati -/-TAN trattati con FK866 o con mezzo sono stati stimati utilizzando il saggio dell'anello di aorta. La formazione di filiali è stata monitorata per 14 giorni, i risultati rappresentativi al giorno 14 sono presentati (A). Il trattamento con FK866 ha ridotto significativamente il numero di rami endoteliali (B). I dati vengono visualizzati come mediana, intervallo interquartile e min-max, .p<0.05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 4. Ritardazione della crescita tumorale dopo il trasferimento adottivo di neutrofili trattati con FK866. È stata valutata l'influenza dei TAN sulla crescita del tumore. I TAN sono stati isolati, trattati con FK866 e iniettati nei topi portatori di tumore come descritto sopra. Al giorno 14 topi sono stati sacrificati, tumori rimossi e analizzati. Ifnar1-/- Sono stati confrontati con FK866 rispetto ai controlli. (A) È stata misurata la crescita del tumore, (B) è stata stimata la massa tumorale e (C)la dimensione. I dati vengono visualizzati come mediana, intervallo interquartile e min-max, .p<0.05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 5. Vascolarizzazione tumorale soppressa dopo il trasferimento adottivo di neutrofili trattati con FK866. I tumori sono stati isolati come descritto sopra (Figura 4). La maturazione dei vasi è stata valutata utilizzando anticorpi anti-SMA (vasi maturi) e lamininina anti-gamma (cellule endoteliali). (A) La colorazione rappresentativa dei tumori è: SMA (verde), laminina (rosso). Barre della scala: 50 m. (B) Quantificazione della vascolarizzazione tumorale dopo il trasferimento adottivo di TAN coltivati con FK866 (verde) o medio (rosso) I dati sono indicati come mediana, gamma interquartile e min-max, .p<0.05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nonostante i progressi nel trattamento chirurgico e farmacologico del cancro, la terapia di successo rimane una sfida. Poiché le cellule immunitarie sono noti per svolgere un ruolo importante nella regolazione della crescita del tumore, dovrebbero essere stabiliti nuovi metodi che inibiscono la tumorigenicità di tali cellule. Qui dimostriamo un nuovo approccio per sopprimere la crescita tumorale attraverso il trasferimento adottivo di neutrofili anti-angiogenici associati al tumore. Il targeting selettivo della segnalazione NAMPT pro-angiogenica nei TAN, utilizzando l'inibitore FK866, previene gli effetti collaterali, che si osservano al trattamento sistemico dell'FK866.
La parte più critica del protocollo è la necessità di utilizzare neutrofili primari appena isolati. I neutrofili sono cellule di vita breve, sottoposte ad apoptosi o attivati durante la procedura di isolamento. I neutrofili murini devono essere tenuti in supporti a 4 gradi centigradi durante tutte le fasi di isolamento, compreso lo smistamento delle cellule. L'isolamento dei neutrofili deve essere eseguito il prima possibile e l'esperimento non deve essere messo in pausa. L'uso di Fc-block permette di ridurre la colorazione non specifica delle cellule con alta espressione Fc-receptor, come le cellule NK. Si consiglia inoltre di ridurre al minimo il numero di anticorpi coniugati fluorescenti per semplificare la strategia di gating ed evitare l'attivazione di neutrifili a causa del legame degli anticorpi.
Il passo limitante del protocollo è l'isolamento dei neutrofili vivi dai tumori a causa di una quantità relativamente bassa di queste cellule nei tumori (non più dell'1% delle singole cellule vive nel melanoma). Ciò potrebbe essere possibile solo utilizzando l'ordinamento basato su citometria del flusso. Allo stesso tempo, l'uso di neutrofili nel sangue per questo protocollo dovrebbe essere evitato a causa solo di una minore regolazione dell'espressione NAMPT e della loro bassa funzionalità, che viene alterata all'arrivo del tessuto tumorale16. Forse, al fine di utilizzare neutrofili del sangue, dovrebbero essere attivati in precedenza utilizzando fattori di crescita derivati dal tumore.
Per evitare l'apoptosi neutrofila, viene suggerito un breve trattamento con FK866 (2-4 h), in quanto non ha alcuna influenza sulla vitalità delle TAN, mentre un trattamento prolungato induce l'apoptosi neutrofila16. In sintesi, il protocollo dimostra il potenziale dei neutrofili anti-angiogenici manipolati ex vitro per sopprimere funzionalmente la crescita tumorale nel modello tumorale del melanoma dei topi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il nostro lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Deutsche Krebshilfe, Grant Number: 111647, e German Research Council (DFG), Grant Number: JA 2461/2-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
