Summary
Здесь мы показываем терапевтический потенциал антиангиогенных опухолевых нейтрофилов после их передачи в опухолевых мышей. Этот протокол может быть использован для манипулирования активностью нейтрофилов ex vivo и для последующей оценки их функциональности in vivo при разработке опухолей. Это подходящая модель для изучения потенциальных иммунотерапии на основе нейтрофилов.
Abstract
Вклад нейтрофилов в регуляцию опухолевого генеза становится все более внимания. Эти клетки неоднородны, и в зависимости от среды опухоли может обладать про- или противоопухолевой способности. Одним из важных цитокинов, регулирующих функции нейтрофилов в опухолевом контексте, являются интерфероны i типа. При наличии интерферонов нейтрофилы приобретают противоопухолевые свойства, в том числе цитотоксичность или стимуляцию иммунной системы. И наоборот, отсутствие интерферона сигнализации приводит к заметной проопухолевой активности, характеризующейся сильной стимуляцией опухолевого ангиогенеза. Недавно мы могли бы продемонстрировать, что проангиогенные свойства нейтрофилов зависят от активации никотинамидаф фосфорибозилтрансферазы (NAMPT) сигнальный путь в этих клетках. Ингибирование этого пути у опухолевых нейтрофилов приводит к их мощному антиангиогенного фенотипу. Здесь мы демонстрируем нашу недавно созданную модель, позволяющую in vivo оценивать опухолевый потенциал манипулируемых опухолевых нейтрофилов (TANs). Вскоре, про-ангиогенных опухолевых опухолей связанных нейтрофилов могут быть изолированы от опухолевых интерферон-дефицит мышей и повторно поляризованы в анти-ангиогенный фенотип путем блокирования NAMPT сигнализации. Ангиогенная активность этих клеток может быть впоследствии оценена с помощью аортического кольца. Антиангиогенные TANs могут быть переданы в опухолевых диких получателей типа и рост опухоли должны контролироваться в течение 14 дней. На день 14 мышей приносятся в жертву, опухоли удаляются и разрезаются с их васкуляризацией. В целом, наш протокол предоставляет новый инструмент для in vivo оценки ангиогенной способности первичных клеток, таких как опухолевые нейтрофилы, без необходимости использования искусственных моделей линии нейтрофилов. Vc
Introduction
Интерфероны типа I (IFNs) играют важную роль в стимуляции реакции хозяев на неоплазию, так какотсутствие сигнализации типа I IFN приводит к значительно повышенному росту опухоли 1. Одним из механизмов, участвующих в этом процессе является регуляция опухолевой активности опухолевых нейтрофилов, которая контролируется колони-стимулирующим фактором 3-го рецептора (CSF3R) вниз по течению сигнализации2. Колония-стимулирующий фактор 3 (CSF3), или гранулоцит колонии стимулирующий фактор, было показано, чтобы активировать сигнализации с участием никотинамида фосфорибозилтрансферазы (NAMPT)3,4. NAMPT является ограничение скорости ферментдля никотинамидад аденин динуклеотид синтез, который повышает гликолиза и регулирует ремонт ДНК, экспрессия генов, и стресс ответ содействия выживанию раковых клеток и пролиферации5. NAMPT является overexpressed в нескольких типах рака, в том числе колоректального, яичников, молочной железы, желудка, рака предстательной железы и глиомы6. NAMPT имеет важное значение не только для опухолевых клеток, но и для широкого спектра других типов клеток, которые присутствуют в опухолях, таких как миелоидные клетки - это диски их дифференциации4, ингибирует апоптоз и стимулирует выражение нескольких цитокинов или матричных деградирующих ферментов у макрофагов7.
Связанные с опухолями нейтрофилы представляют собой важные модуляторы роста опухоли. Функции TAN сильно зависят от типа I IFN доступности, так как эти цитокины премьер противоопухолевой активности нейтрофилов. Напротив, отсутствие IFNs поддерживает опухолевую активацию этих клеток, особенно их проангиогенные свойства. В согласии с этим, мыши, дефицит которых в IFNs развиваются значительно больше и лучше васкуляризированных опухолей, которые сильно проникли с про-опухолевых / про-ангиогенных нейтрофилов1,2,8, 9,10. Важно отметить, что такие проангиогенные TANs показывают повышенную активность NAMPT, предлагая свою существенную роль в про-опухолевой поляризации нейтрофилов.
Истощение нейтрофилов с использованием антител Ly6G или ингибирование их миграции (CXCR2 антитела) приводит к снижению ангиогенеза опухоли, роста и метастазов1,8. Тем не менее, генерируемые моноклональные антитела иммуногенны, а их введение связано с целым рядом опасных для жизни побочных эффектов11. Лечение с помощью небольших молекул, таких как ингибитор NAMPT FK866, который модулирует нейтрофил опухолевого генетики, может помочь избежать таких осложнений. К сожалению, фармакологическое системное ингибирование NAMPT, рядом с его терапевтическим воздействием на рост опухоли, приводит к тяжелым побочным эффектам, включая желудочно-кишечную токсичность и тромбоцитопению. Таким образом, системное применение ингибиторов NAMPT не представляется возможным12,13,14.
По этой причине мы предлагаем здесь протокол, в котором деятельность NAMPT блокируется непосредственно в изолированных TANs. Такие противоопухолевые нейтрофилы затем приемные передаются в опухолевый хозяин. Этот протокол поможет избежать системных токсических побочных эффектов соединений, в то время как его влияние на клетки-мишени будет устойчивым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, в том числе и животные, были одобрены регулирующими органами: LANUV (Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) и Regierungspr'sidium Тюбинген, Германия. Все манипуляции следует проводить в стерильных условиях (под ламинарным капотом) с использованием стерильных реагентов и инструментов (шприцы, ножницы, щипцы, одноразовые скальпели, блюда Петри).
ПРИМЕЧАНИЕ: Общая схема протокола отображается на рисунке 1.
1. Подготовка линии клеток меланомы B16F10
- Подготовка mycoplasma-отрицательных клеток, выращенных до 90% конфлюентного монослойного (примерно 10 х 106 клеток / T75 колба) в полном Iscove в модифицированных Dulbecco в среднем (IMDMc: IMDM 10% плода сыворотки крупного рогатого скота (FBS) 1% пенициллин-стрептомицин).
- Удалить среду, и промыть клетки с фосфатами буферного сольятого раствора (PBS). Нанесите 6 мл раствора отслоения клеток, содержащего протеолитические и коллагенолитические ферменты (см. таблицуматериалов), и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 2 мин.
- Стучите колбу осторожно, чтобы мобилизовать оставшиеся клетки адепта снизу. Соберите клеточную подвеску в трубках 15 мл и центрифугу при 300 х г в течение 7 мин и 20 градусов по Цельсию.
- Удалите супернатант, и повторно гранулы хорошо в 1 мл PBS. Добавьте 14 мл PBS и центрифуги (300 х г и 20 градусов по Цельсию в течение 7 мин).
- Удалите супернатант и resuspend гранулы в 1 мл PBS.
- Подсчитайте клетки, и повторно их концентрации 3 х 106/мл PBS (для шага 2) или 6 х 106/мл PBS (для шага 6) для инъекции. Держите клетки на льду максимум 30 мин.
2. Аллогенная модель опухоли у мышей
- Используйте 10 самок Ifnar1-/- мышей 8-12 недель, которые хранятся в специфических патогенных условиях (SPF).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши женского пола предпочтительнее в подкожной модели роста опухоли, так как мужчины более агрессивны и, таким образом, склонны к нарушениям опухолевого участка, который влияет на рост опухоли. - Бритькожу мыши на фланге с помощью электрической бритвы и дезинфицировать кожу тканью, влажной с 70% этанолом.
- Соберите подготовленные клетки меланомы B16F10 в концентрации 3 х 106/мл PBS (см. шаг 1) в шприц 1 мл и 0,4 х 19 мм иглы. Впрысните 100 мл подвески подкожно.
- Смешайте клетки задолго до каждой инъекции. Используйте иглы диаметром не менее 0,4 мм, чтобы не беспокоить опухолевые клетки.
- Поместите до 5 мышей в одну клетку и контролируйте размер опухоли (длина, ширина и глубина) с помощью калипера в течение 14 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно правилам животных, размер опухоли не должен превышать 15 мм в диаметре, мышей с большими или некротические / открытые опухоли должны быть принесены в жертву заранее. - На 14-й день жертвуйте мышами в камере CO 2.
- Дезинфекция кожи с 70% этанола и удалить опухоли с ножницами и щипками в стерильной чашке Петри. Храните опухоли в трубке 50 мл в полной модифицированной орел Медиум Dulbecco (DMEMc: DMEM 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина) на льду.
3. Изоляция TAN
- Поместите опухоли в стерильные 6-колодные пластины, 5 опухолей на скважину. Вырезать опухоли на 2-3 мм кусочки стерильными ножницами.
- Дайджест с 1 мл диспаса / коллагеназа D/DNase I раствор (0,2 мг/ 0,2 мг/100 мг в 1 мл DMEMc) на опухоль. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 во влажном инкубаторе, и смешать с 10 мл шприца без иглы каждые 15 минут 3 раза.
- Чтобы удалить непереваренные волокна, сетка клетки через 100 мкм фильтры в 15 мл труб (один хорошо на фильтр на трубку). Добавьте PBS до 15 мл, центрифуги труб на 460 х г, 4 КК в течение 5 минут, и удалить супернатант.
- Лизе эритроциты с буфером лизиса (NH4Cl 150 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 7.3, 20 c) путем добавления 1 мл в каждую трубку. Хорошо перемешать и объединить раствор из всех трубв в одну. Остановите реакцию через 2 минуты с 11 мл ледяного (4 кВ) DMEMc.
- Центрифуга при 460 х г,4 кв кв 5 мин, и удалить супернатант. Отрежь гранулы с 15 мл холодного PBS. Центрифуга при 460 х г,4 кв кв 5 мин, и удалить супернатант.
- Приостановите гранулы в 1 мл PBS. Добавьте 3 мл антител Fc-block (CD16/CD32, бульон 0,5 мг/мл) и инкубируйте на льду 15 мин.
- Добавить антитела: 10 мл Ly6G-PE (запас 0,2 мг/мл) и 10 мл CD11b-APC (запас 0,2 мг/мл). Добавьте 20 мл 6-диамидина-2-фенилолдола viability красителя (DAPI, бульон 5 мг/мл) и инкубировать на льду в темноте в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Еще одна комбинация жизнеспособности красителей и флуоресцентных конъюгатов антител могут быть использованы. - Добавьте PBS до 15 мл, центрифугу при 460 х г, 4 кв. м в течение 5 мин, и удалите супернатант.
- Приостановите гранулы в DMEMc до концентрации примерно 10 х 106/мл, и держать на льду.
- Сортировать CD11b- Ly6Gпривет жив (DAPI-отрицательный) нейтрофилов с флуоресценции активированных сортировки клеток (стратегия см. Рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите трубку с клеточной подвеской и трубку с DMEMc для отсортированных клеток при 4 градусах Цельсия. Используйте следующие оптимальные настройки сортировки: 70-мм сопло, пороговая скорость максимальных 22 000 событий в секунду и скорость потока 1-3. - Проверьте чистоту отсортированных нейтрофилов с помощью цитометра для рекомендуемой чистоты в размере 95%.
- Центрифуга отсортированы нейтрофилы на 460 х г, 4 кв кв в течение 5 мин, и удалить супернатант. Отрежь отсортированные клетки в DMEMc до концентрации 1 х 106/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемое количество нейтрофилов в одной 14-дневной опухоли B16F10 (диаметр 10 мм) составляет примерно 3 х 104 клетки.
4. Ингибирование NAMPT в TANs in vitro
- Подготовка fK866 (ингибитор NAMPT) в диметилсульфокид (DMSO) при конечной концентрации 100 мМ.
- Семена отсортированы нейтрофилы (шаг 3,11) в 2 скважины 96-хорошо U-дно пластины (1,5 х 105 нейтрофилов / хорошо). Добавить FK866 в интервенции хорошо (окончательная концентрация 100 нм), и равное количество DMEMc с DMSO в контроль хорошо. Инкубировать 2 ч при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 во влажном инкубаторе.
- Центрифуга при 460 х г,4 кв кв 5 мин, и удалить супернатант. Resuspend в 200 мл PBS в каждой скважине. Повторите 2 раза.
- Центрифуга при 460 х г,4 кв кв 5 мин, и удалить супернатант. Resuspend в коммерческих эндотелиальных клеток среды роста (дополнено 4 Л /мЛ эндотелиальной добавки роста клеток, 0,1 нг/мл рекомбинантный фактор эпидермального роста человека, 1 нг/мл рекомбинантных основных факторов роста фибробластов человека, 90 мкг/мл гепарин и 1 мкг/мл гидрокортизон) до конечной концентрации 0,2 х 106 клеток/мл (в 0,75 мл) (для шага 5) или в PBS до конечной концентрации 0,6 х 106 клеток/мл (в 0,25 мл) (для шага 6).
5. Оценка ангиогенных свойств TANs с использованием аортического кольца
- Вскрыть грудной аорты от мужского Пола C57BL/6J (WT) мыши. Очистите и нарежьте кольца шириной 0,5 мм. Поместите все кольца в колодец 24-хорошо пластины с 1 мл дополненной эндотелиальной среды роста клеток. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 во влажном инкубаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование молодых (младше 8 недель) мышей мужского пола для вскрытия аорты предпочтительнее, так как они дают более надежный ангиогенный ответ15. - Заполните скважины 96-хорошо плоской нижней пластины с 50 л растворило подвалм мембранной матрицы, пусть гель набор в течение 30 минут в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 влажный инкубатор, чтобы матрица полимеризации. Подготовьте не менее 3 скважин на состояние.
- Вложите кольца в растворимый подвал мембранной матрицы, поместив аортального кольца на верхней части твердого слоя матрицы, 1 кольцо в центре каждого колодца. Добавьте еще 50 л растворитой мембранной матрицы подвала, чтобы покрыть каждое кольцо.
- Поместите пластину в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 влажный инкубатор еще на 30 минут, чтобы полимеризация второго слоя матрицы.
- Добавьте 150 мл/ну дополненной эндотелиальной среды роста клеток и 2x104Ifnar1-/- TANs (контроль и FK866-обработанный) (шаг 4.4).
- Инкубировать тарелку в течение 14 дней при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 во влажном инкубаторе.
- Изображение с помощью стандартного фазово-контрастного микроскопа и оценки эндотелиального ветвления. Количественная оценка морфометрических и пространственных параметров сосуда, включая ветвящий индекс, может быть выполнена автоматически с помощью программы обработки изображений, предназначенной для научных изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты представительи изображены на рисунке 3.
6. Приемная передача обработанных нейтрофилов в аллогенной модели опухоли
- Подготовка B16F10 клетки меланомы (шаг 1.6) в PBS в концентрации 6 х 106 клеток / мл.
- Подготовьте 2 типа нейтрофилов: FK866-обработанные нейтрофилы и контролируйте необработанные нейтрофилы (шаг 4.4) в PBS при концентрации 6 х 105 клеток/мл. Смешайте нейтрофилы с клетками меланомы B16F10 (окончательное отношение нейтрофилов к опухолевым клеткам 1:10), чтобы иметь 2 типа клеточных смесей.
- Возьмите 10 самок wT мышей 8-12 недель, 5 в каждой группе. Побрить кожу на фланге с электрической бритвой, и дезинфицировать с 70% этанола.
- Вводят обеим группам мышей 100 л клеточной суспензии (шаг 6.2) с инсулиновым шприцем и иглой диаметром 0,4 мм. Поместите 1-5 мышей из одной группы в одну клетку.
- На второй день подготовьте 2 типа нейтрофилов: FK866-обработанные нейтрофилы и контролируйте необработанные нейтрофилы (шаг 4.4) в PBS при концентрации 6 х 105 клеток/мл. Впрысните 100 кЛ клеточной суспензии (шаг 6.4) т.е. в хвостовую вену с инсулиновым шприцем и иглой диаметром 0,4 мм, обеим группам мышей. Поместите мышей обратно в клетку.
7. Измерение роста опухоли, гистологическое обследование
- Мониторинг роста опухоли через день. Оцените размер опухоли с помощью калиперов и вычислите объем опухоли с помощью формулы V'4/3 "(h'w2)/8 (высота, ширина, ширина глубины).
- Пожертвование мышей в день 14 в камере CO 2. Удалить опухоли и измерить вес опухоли.
- Заморозить опухоли в оптимальном температурном соединении в жидком азоте, и хранить при -80 градусов по Цельсию.
- Оттапьте образцы до -20 градусов и подготовить 5 мм разделов с помощью криотоме. Дайте криокутам высохнуть в течение 30 мин при 20 градусах Цельсия. Исправьте секции в -20 градусов холодный ацетон в течение 2 мин и дайте им высохнуть в течение 30 мин при 20 градусах Цельсия.
- Блок с антителами Fc-блока (CD16/CD32, шток 0.5 мг/мл 1:500) в PBS для 1 ч при 20 c.
- Пятно с кроликом анти-мышь Laminin гамма антитела (1:1500 в PBS, 200 qL) для 1 ч при 20 градусов по Цельсию. Вымойте pbS три раза.
- Пятно со вторичным козьим антикливочным антителом (запас 0,5 мг/мл, 1:400 в PBS,), анти-мышь ЗСМА (1:500 в PBS) и 2 Зл DAPI (запас 5 мг/мл, 1:100 в PBS) в окончательном объеме 200 зл. антитела раствора. Инкубировать в течение 1 ч при 20 градусах по Цельсию в темноте. Вымойте pbS три раза.
- Сухие горки в течение 20 минут при 20 градусах по Цельсию в темноте. Гора с ангирусной монтажной средой для микроскопии и накрыта крышкой. Дайте ему высохнуть 1 ч в 37 градусов по Цельсию.
- Выполните микроскопическое обследование. Количественное выралакиализации путем подсчета общего числа (необязательно площадь) ламининаи сосудов и числа (области) SMAи развитых сосудов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения анализа изображений, возьмите все изображения в одинаковых условиях (свет, контрастность, увеличение). В этом случае параметры обработки фиксируются, а обработка изображений становится полностью автоматической. Результаты представительской работы изображены на рисунке 4 и рисунке 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя описанную здесь процедуру, Ifnar1-/- нейтрофилы были выделены из опухолей и обработаны ингибитором NAMPT FK866 за 2 ч. Необработанные Ifnar1-/- нейтрофилы были использованы в качестве контроля. Эффектность лечения оценивалась с помощью аортического кольца, который отражает ключевые шаги, связанные с ангиогенезом (деградация матрицы, миграция, распространение, реорганизация). Мы могли бы продемонстрировать, что FK866-обработанных нейтрофилов имеют значительно сниженную способность стимулировать формирование аорты ветви, по сравнению с необработанными клетками(рисунок 3A, 3B). FK866-обработанные анти-ангиогенные нейтрофилы были введены subcutaneously в опухолевых мышей (в день 0 фланга и день 2 i.v.). Мы могли бы наблюдать значительно нарушенный рост опухоли, по сравнению с мышами, вводимыми необработанным Ifnar1-/- нейтрофилы(рисунок 4A,4B). Гистологическое исследование извлеченных опухолей доказало значительное подавление ангиогенеза у опухолей, изолированных от мышей, обработанных TANs, по сравнению с теми, которые вводят необработанным Ifnar1-/- нейтрофилов ( Рисунок 5A ,B).
Рисунок 1. Схема протокола. Шаг 1. Приготовление линии клеток меланомы B16F10; 2. Аллогенная модель опухоли у мышей; 3. Изоляция Танов от опухолей; 4. Ингибирование NAMPT в TANs in vitro; 5. Оценка ангиогенных свойств ТаНо в аортном кольце; 6. Приемная передача обработанных нейтрофилов в аллогенной опухолевой модели; 7. Мониторинг роста опухоли, гистологическое обследование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Стратегия Gating для сортировки TANs. CD11bи Ly6Gпривет живые нейтрофилы сортируются из опухолей с чистотой 95%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Подавление ангиогенных свойств TANs после лечения FK866. Ангиогенные свойства отсортированных Ifnar1-/-TANs, обработанных FK866 или со средой, оценивались с помощью аорты- асссея. Формирование филиала контролировалось в течение 14 дней, репрезентативные результаты на день 14 представлены(A). Лечение FK866 значительно уменьшило количество эндотелиальных ветвей (B). Данные отображаются в виде медианного, межквартильного диапазона и мин-макса, зпл/0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Отсталость роста опухоли после приемной передачи FK866-обработанных нейтрофилов. Оценивалось влияние TANs на рост опухоли. TANs были изолированы, обработаны с FK866 и введены в опухолевых мышей, как описано выше. На днях 14 мышей были принесены в жертву, опухоли удалены и проанализированы. Ifnar1-/- Сравнивались TANs, обработанные FK866 и контрольом. (A) Рост опухоли был измерен, (B) масса опухоли и (C) размер были оценены. Данные отображаются в виде медианного, межквартильного диапазона и мин-макса, зпл/0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5. Подавленная тумороистская васкуляризация после приемной передачи ФК866-леченных нейтрофилов. Опухоли были выделены, как описано выше (рис 4). Созревание судов оценивалось с использованием антисма антител (зрелых сосудов) и антигамма-ламинина (эндотелиальных клеток). (A) Представитель окрашивания опухолей показаны: SMA (зеленый), ламинин (красный). Шкала баров: 50 мкм. (B) Количественная сосудистая опухоль после принятия передачи TANs культивируется с FK866 (зеленый) или средний (красный) Данные показаны как средний, межквартильный диапазон и мин-макс, ЗРП;0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несмотря на прогресс в хирургическом и фармакологическом лечении рака, успешная терапия остается проблемой. Поскольку иммунные клетки, как известно, играют важную роль в регуляции роста опухоли, новые методы, ингибирующие опухолевость таких клеток должны быть установлены. Здесь мы демонстрируем новый подход к подавлению роста опухоли с помощью приемной передачи антиангиогенных опухолевых нейтрофилов. Селективная таргетинг проангиогенной сигнализации NAMPT в TANs, используя ингибитор FK866, предотвращает побочные эффекты, которые наблюдаются при системном лечении FK866.
Наиболее важной частью протокола является необходимость использования свежеизолированных первичных нейтрофилов. Нейтрофилы являются короткоживущими клетками, переживающими апоптоз или активированными во время процедуры изоляции. Murine нейтрофилы должны храниться в 4-C средств массовой информации во всех этапах изоляции, в том числе сортировки клеток. Изоляция нейтрофилов должна быть выполнена как можно скорее, и эксперимент не следует приостанавливать. Использование Fc-block позволяет уменьшить неспецифическое окрашивание клеток с высоким выражением fc-receptor, как клетки NK. Мы также рекомендуем свести к минимуму количество флуоресцентных конъюгированных антител, чтобы упростить стратегию gating и избежать активации нейтрофилов из-за связывания антител.
Ограничивающим шагом протокола является изоляция живых нейтрофилов от опухолей из-за относительно низкого количества этих клеток в опухолях (не более 1% одиночных живых клеток в меланоме). Это может быть возможно только с помощью сортировки на основе цитометрии потока. В то же время, использование нейтрофилов крови для этого протокола следует избегать из-за лишь незначительной регуляции экспрессии NAMPT и их низкой функциональности, которая изменяется при прибытии опухолевых тканей16. Возможно, для того, чтобы использовать нейтрофилы крови, они должны быть ранее активированы с помощью опухолевых факторов роста.
Чтобы избежать нейтрофила апоптоза, рекомендуется кратковременное лечение FK866 (2-4 ч), так как оно не оказывает влияния на жизнеспособность TANs, в то время как длительное лечение вызывает нейтрофил апоптоз16. В целом, протокол демонстрирует потенциал ex vitro манипулируемых антиангиогенных нейтрофилов для функционального подавления роста опухоли в модели опухоли меланомы мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Наша работа была поддержана грантами от Deutsche Krebshilfe, Грант номер: 111647, и Немецкий научно-исследовательский совет (DFG), Номер гранта: JA 2461»2-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
