Her beskriver vi en simpel Konfokal billedbehandlings metode for at visualisere in situ-lokalisering af celler, der udskiler cytokininterferon gamma i murine sekundære lymfoide organer. Denne protokol kan udvides til visualisering af andre cytokiner i forskellige væv.
Cytokiner er små proteiner udskilt af celler, medierer celle-celle kommunikation, der er afgørende for effektiv immunrespons. Et karakteristisk træk ved cytokiner er deres pleiotropisme, da de produceres af og kan påvirke et væld af celletyper. Som sådan er det vigtigt at forstå, ikke kun hvilke celler der producerer cytokiner, men også i hvilket miljø de gør det, for at definere mere specifikke Therapeutics. Her beskriver vi en metode til at visualisere cytokinproduktion in situ efter bakteriel infektion. Denne teknik er afhængig af billeddannelse cytokinproducerende celler i deres oprindelige miljø ved Konfokal mikroskopi. For at gøre det, er vævs sektioner plettet for markører af flere celletyper sammen med en cytokinbejdser. Nøglen til denne metode, cytokinsekretion blokeres direkte in vivo før høst væv af interesse, giver mulighed for påvisning af cytokin, der ophobes inde i producerende celler. Fordelene ved denne metode er flere. For det første bevares det mikromiljø, hvor cytokiner produceres, som i sidste ende kan oplyse om de signaler, der kræves for cytokinproduktionen og de celler, der berøres af disse cytokiner. Desuden giver denne metode en indikation af placeringen af cytokin-produktionen in vivo, da den ikke er afhængig af kunstig in vitro-stimulering af de producerende celler. Det er dog ikke muligt samtidig at analysere cytokin downstream-signalering i celler, der modtager cytokin. På samme måde svarer de observerede cytokinsignaler kun til det tidsvindue, hvor cytokinsekretionen blev blokeret. Mens vi beskriver visualisering af cytokin interferon (IFN) gamma i milten efter muse infektion af de intracellulære bakterier Listeria monocytogenes, denne metode kunne potentielt tilpasses til visualisering af enhver cytokin i de fleste organer.
Orkestratering af et effektivt immunrespons mod et patogen kræver kompleks integration af signaler, der vises af en række immunceller, som ofte spredes mellem organismen. For at kommunikere, producerer disse celler små opløselige proteiner med flere biologiske funktioner, der fungerer som immunomodulatorer ved hjælp af cytokiner. Cytokiner kontrol celle rekruttering, aktivering og spredning og dermed er kendt for at være centrale aktører i fremme af immunrespons1. Effektive immunrespons kræver, at cytokiner frigives i et meget organiseret spatiotemporale mønster, der forbinder bestemte celler for at fremkalde specifikke signaler. Det er derfor afgørende at studere cytokinproduktionen og dens signalering in situ under hensyntagen til det mikromiljø, hvor cytokiner produceres.
Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) er en gram-positiv intracellulær bakterie, der anvendes som en prime model til at studere immunresponser på intracellulære patogener i mus. En cytokin, IFN gamma (IFNγ) produceres hurtigt, inden for 24 timer efter L. monocytogenes infektion. Det er nødvendigt for patogen clearance, som mus slået ud for IFNγ er meget modtagelige for L. monocytogenes infektion2. IFNγ er pleiotropic og produceres af flere celler efter infektion3. Mens IFNγ produceret af Natural Killer (NK) celler er påkrævet for direkte anti-bakteriel aktivitet4, ifnγ fra andre kilder har vist sig at have andre funktioner. Faktisk, vi og andre for nylig konstateret, at ifnγ produceret af CD8 + T celler har en specifik funktion i direkte regulerer T Celledifferentiering5,6,7. Som sådan, at forstå, hvilke celler producerer IFNγ (og i hvilket mikromiljø) er afgørende for at dissekere sin funktion.
Den mest almindeligt forekommende teknik til undersøgelse af cytokin-produktionen er afhængig af intracellulær cytokinfarvning analyseret af flowcytometri. Denne metode giver mulighed for samtidig påvisning af flere cytokiner kombineret med celleoverflade markører i en enkelt prøve, hvilket giver et yderst nyttigt værktøj til at studere cytokinproduktion. Men ved hjælp af ovennævnte teknik indebærer at miste enhver geografisk information. Desuden er cytokindetektion ofte afhængig af in vitro re-stimulation for at muliggøre cytokindetektion. Som sådan analyseres kapaciteten af en given celle til fremstilling af en cytokin, og den er ikke nødvendigvis korrelerer med den faktiske cytokinsekretion in situ. Andre metoder bruger reporter mus, som fluorescerende protein udtryk korrelerer med cytokintransskription og giver mulighed for visualisering på et enkelt celleniveau8. Selv om denne metode kan spore cytokin transkription in situ, der er et begrænset antal cytokin-reporter mus til rådighed. Desuden kan transskription, oversættelse og sekretion undertiden være uforbundne, og fluorescerende proteiner har en anden halveringstid end cytokin de rapporterer, hvilket gør denne metode undertiden ikke tilstrækkelig for in situ cytokin visualisering.
Her beskriver vi en metode til visualisering af in situ-cytokinproduktion ved Konfokal mikroskopi ved enkelt celle opløsning. Denne teknik muliggør visualisering af den cellulære kilde og omgivende niche i vævet. Denne protokol beskriver specifikt visualisering af IFNγ produktion i milten af L. monocytogenes inficerede mus, med fokus her på ifnγ produktion af NK celler og antigen specifikke CD8+ T celler. Det kan dog udvides og tilpasses til karakterisering af enhver cytokinproduktion i forbindelse med andre situationer, hvor cytokiner produceres, såsom infektion, inflammation eller autoimmune sygdomme, så længe den målrettede cytokin kan bevares i celler af intracellulær protein transport hæmmer.
I dette manuskript præsenterer vi en metode til at visualisere IFNγ produktion i milten efter L. monocytogenes infektion i mus. Denne protokol er enkel og kan tilpasses til andre væv og cytokinudløsere, men følgende aspekter skal overvejes. Cellerne udskiller ofte hurtigt de cytokiner, de producerer, og cytokiner bliver hurtigt hentet af tilstødende celler. Det er så vanskeligt at påvise cytokiner in situ. En fælles metode til hurtig genoptagelse af cytokin-produktionen er at stimulere cellerne ex vivo efterfulgt af cytokindetektion i medierne ved enzym relateret immunosorbent analyse. I denne sammenhæng går alle oplysninger om den geografiske lokalisering af de cytokinproducerende celler tabt. Desuden afspejler cytokinproduktionen efter genstimulering ikke nødvendigvis, om cytokiner faktisk produceres og udskilles in vivo, men indikerer snarere, at en given cellepopulation har kapacitet til at producere cytokiner. Derfor vil begge metoder give forskellige oplysninger, og man bør overveje, hvilke oplysninger der er mest værdifulde for deres eksperiment.
For at detektere intracellulære cytokiner, bruger vores metode en intracellulær protein transport hæmmer til at fælde cytokiner i cellerne og øge signaldetektering. Det er dog vigtigt at bemærke, at disse inhibitorer påvirker den normale transport af proteiner fra endotel reticulum (re) til Golgi-apparatet og til det sekretoriske vesikelprotein, der hæmmer deres frigivelse, hvilket kan forårsage toksicitet. Som en konsekvens, BFA, eller anden inhibitor, bør anvendes i en kort periode, typisk ikke mere end et par timer. Derfor er det vigtigt at finde den rette balance mellem inhibitor dosis og behandlings tidspunkt for at optimere niveauet af cytokiner fanget inde i cellen uden at forårsage alvorlige cytotoksiske virkninger. Disse variabler kan variere mellem cytokiner og administrationsvej for BFA. I vores infektion model, BFA blev administreret intraperitonealt for at give en hurtig systemisk dispersion, men det kan også leveres intravenøst.
De mest almindeligt anvendte intracellulære protein transport hæmmere er BFA, der anvendes her, og monensin (MN). Disse hæmmere bruges ofte uden forskel til at akkumulere og studere cytokin produktion, men de har små forskelle i deres virkningsmekanismer. MN hæmmer transport af proteiner i Golgi-apparatet og akkumulerer dermed proteiner i Golgi17 , mens BFA forebygger koatomer protein kompleks-i rekruttering, hvilket hæmmer proteinets tilbage bevægelse til endoplasmatiske reticulum (er) og derved fremme akkumulering af cytokiner i ER18. Som sådan, vælge den bedste intracellulære protein transport inhibitor vil afhænge af forskellige faktorer, såsom cytokin at blive opdaget. For eksempel er det blevet påvist i lipopolysaccharid-induceret intracellulær farvning af monocytter, at BFA er mere effektiv til at måle cytokinerne IL-1β, IL-6 og TNF end MN19.
Denne protokol omfatter visualisering af cytokin in situ ved Konfokal mikroskopi, og derfor er der kun et begrænset antal markører, end det kan bruges til at studere de cytokinproducerende celler og deres mikromiljø. Det er også nødvendigt at overveje, at protein transport hæmmere såsom BFA eller MN forstyrrer den normale ekspression af flere proteiner og dermed deres anvendelse, når man studerer den samtidige ekspression af visse aktiverings celleoverflade markører skal gribes an Omhyggeligt. For eksempel blokerer BFA men ikke MN udtrykket af CD69 i murine lymfocytter20. På trods af denne begrænsning giver konfokale Imaging mulighed for subcellulær lokalisering af cytokiner samt retningen af cytokinsekretionen i cellen. De data, der genereres ved hjælp af denne protokol tyder på, at NK-celler har tendens til at udskiller IFN-y i et diffust mønster, mens CD8+ t- celler synes at dirigere IFNγ sekretionen mod andre CD8+ t-celler, der er i direkte interaktion med dem5.
Afslutningsvis, denne protokol er egnet til at visualisere en række cytokiner in situ og identificere producerende celler og deres mikromiljø efter mange udløsere såsom infektion eller autoimmunitet. De indhentede oplysninger er medvirkende til at forstå betydningen af in vivo rumlige orkestrering af forskellige celletyper og cytokin de producerer, nødvendige for en effektiv immunrespons.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Kennedy Institute Imaging Facility personale for teknisk assistance med Imaging. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Kennedy Trust (til A.G.), og bioteknologi og biologisk videnskab Forskningsråd (BB/R015651/1 til A.G.).
Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |||
Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |||
L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |||
Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |||
D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |||
Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |||
O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |||
Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml | ||
Microscope slides – Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |||
anti-CD169 – AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
||
anti-F4/80 – APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
||
anti-B220 – PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
||
anti-IFNg – biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml | ||
anti-IFNg – BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
||
anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/ml | ||
anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
Streptavidin – PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
||
streptavidin – FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |||
Cover glasses 22x40mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |||
Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |||
Imaris – Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||||
Confocal microscope – Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||||
Cryostat – CM 1900 UV | Leica | ||||
Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |||
PBS 1X | Life Technologies Ltd | 20012068 | |||
BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |||
GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||||
RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||||
Insulin syringe, with needle, 29G | VWR International | BDAM324824 | |||
C57BL/6 wild type mice | Charles River |