Summary
Hier beschrijven we een eenvoudige confocale beeldvormings methode om de in-situ lokalisatie van cellen die het cytokine interferon gamma in Murine secundaire lymfoïde organen afscheidende te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid voor de visualisatie van andere cytokines in diverse weefsels.
Abstract
Cytokines zijn kleine eiwitten uitgescheiden door cellen, bemiddel celcelcommunicatie die cruciaal zijn voor effectieve immuunresponsen. Een kenmerk van cytokines is hun pleiotropisme, omdat ze worden geproduceerd door en kunnen invloed hebben op een veelheid van celtypen. Als zodanig is het belangrijk om niet alleen te begrijpen welke cellen cytokines produceren, maar ook in welke omgeving zij dit doen, om specifiekere therapieën te definiëren. Hier beschrijven we een methode om de productie van cytokine in situ te visualiseren na bacteriële infectie. Deze techniek is gebaseerd op beeldvormende cytokine-producerende cellen in hun eigen omgeving door confocale microscopie. Om dit te doen, weefsel secties zijn gekleurd voor markers van meerdere celtypen samen met een cytokine vlek. Sleutel tot deze methode, cytokine secretie wordt direct geblokkeerd in vivo voor het oogsten van het weefsel van belang, waardoor detectie van de cytokine die zich in de producerende cellen verzameld. De voordelen van deze methode zijn meervoudig. Ten eerste wordt de micro-omgeving waarin cytokines worden geproduceerd bewaard, wat uiteindelijk kan informeren over de signalen die nodig zijn voor de productie van cytokine en de cellen die door deze cytokines worden beïnvloed. Bovendien geeft deze methode een indicatie van de locatie van de productie van cytokine in vivo, omdat deze niet afhankelijk is van kunstmatige in-vitro herstimulatie van de producerende cellen. Het is echter niet mogelijk om gelijktijdig cytokine downstream signalering te analyseren in cellen die de cytokine ontvangen. Evenzo komen de waargenomen cytokine signalen alleen overeen met het tijdvenster waarin de cytokine secretie werd geblokkeerd. Hoewel we de visualisatie beschrijven van het cytokine interferon (IFN) gamma in de milt na muis infectie door de intracellulaire bacteriën Listeria monocytogenes, kan deze methode mogelijk worden aangepast aan de visualisatie van elke cytokine in de meeste organen.
Introduction
Het indelen van een efficiënte immuunrespons tegen een pathogeen vereist een complexe integratie van signalen die worden weergegeven door een verscheidenheid aan immuuncellen die vaak worden verspreid onder het organisme. Om te communiceren, deze cellen produceren kleine oplosbare eiwitten met meerdere biologische functies die fungeren als immunomodulatoren met de naam cytokines. Cytokines controle cel werving, activering en proliferatie en daarom staat bekend als belangrijke spelers in de bevordering van immuunresponsen1. Effectieve immuunresponsen vereisen cytokines om te worden vrijgelaten in een zeer georganiseerd spatiotemporele patroon dat specifieke cellen verbindt om specifieke signalen te induceren. Daarom is het cruciaal om de productie van cytokine en de signalering ervan in situ te bestuderen, rekening houdend met de micro-omgeving waarin cytokines worden geproduceerd.
Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) is een gram-positieve intracellulaire bacterie die wordt gebruikt als een prime-model om immuunresponsen te bestuderen op intracellulaire pathogenen bij muizen. Een cytokine, IFN gamma (IFNγ) wordt snel geproduceerd, binnen 24 h na L. monocytogenes infectie. Het is noodzakelijk voor de klaring van pathogenen, omdat muizen die zijn uitgeschakeld voor IFNγ zeer gevoelig zijn voor L. monocytogenes infectie2. IFNγ is pleiotrope en geproduceerd door meerdere cellen na infectie3. Hoewel IFNγ geproduceerd door Natural Killer (NK) cellen vereist is voor directe anti-bacteriële activiteit4, is aangetoond dat ifnγ uit andere bronnen andere functies heeft. Sterker nog, wij en anderen hebben onlangs geconstateerd dat ifnγ geproduceerd door CD8 + T-cellen een specifieke functie heeft in het direct reguleren van T-celdifferentiatie5,6,7. Als zodanig, begrijpen welke cellen produceren IFNγ (en in welke micro-omgeving) is cruciaal voor het ontleden van de functie.
De meest voorkomende techniek om de productie van cytokine te bestuderen, is gebaseerd op intracellulaire cytokine kleuring geanalyseerd door flow cytometrie. Deze methode maakt gelijktijdige detectie van meerdere cytokines in combinatie met celoppervlak markeringen binnen een enkel monster mogelijk, wat een uiterst nuttig hulpmiddel biedt om cytokine productie te bestuderen. Echter, met behulp van de bovengenoemde techniek impliceert het verliezen van ruimtelijke informatie. Daarnaast vertrouwt cytokine detectie vaak op in vitro re-stimulatie om cytokine detectie mogelijk te maken. Als zodanig, de capaciteit van een bepaalde cel om een cytokine te produceren wordt geanalyseerd, en het niet noodzakelijkerwijs correleren met werkelijke cytokine secretie in situ. Andere methoden gebruiken reporter muizen waarvoor fluorescerende eiwit expressie correleert met cytokine transcriptie en maakt visualisatie mogelijk op één cel niveau8. Hoewel deze methode cytokine-transcriptie in situ kan volgen, zijn er een beperkt aantal cytokine-reporter muizen beschikbaar. Bovendien kunnen transcriptie, vertaling en secretie soms ontkoppeld worden, en fluorescerende eiwitten hebben een verschillende halfwaardetijd dan de cytokine die ze rapporteren, waardoor deze methode soms niet voldoende is voor in situ cytokine visualisatie.
Hier beschrijven we een methode om in situ cytokine productie te visualiseren door confocale microscopie bij een enkele celresolutie. Deze techniek maakt de visualisatie van de cellulaire bron en de omringende niche in het weefsel mogelijk. Dit protocol beschrijft specifiek de visualisatie van de IFNγ-productie in de milt van L. monocytogenes geïnfecteerde muizen, die zich hier richten op ifnγ-productie door NK-cellen en antigeen-specifieke CD8+ T-cellen. Echter, het kan worden uitgebreid en aangepast aan de karakterisering van een cytokine productie in de context van andere situaties waar cytokines worden geproduceerd, zoals infectie, ontsteking of auto-immuunziekten, zolang de beoogde cytokine kan worden bewaard in cellen door intracellulaire eiwit transport remmer.
Protocol
Alle experimenten met muizen waren in overeenstemming met de Britse wet op de wetenschappelijke procedures van 1986.
1. adoptie overdracht van antigene-specifieke CD8+ T-cellen in muizen
- Isolaat ovalbumine (OVA)-specifieke CD8+ T-cellen (OTI) met een groene fluorescerende proteïne (OTI-GFP) of rood fluorescerende proteïne (OTI-RFP) uit lymfeklieren suspensie van T-cel receptor transgene muizen9,10 met een muis CD8+ T cell isolation Kit conform de fabricage instructies. Bereid de celsuspensie voor door lymfeklieren te slaan met behulp van een zuiger van de spuit, zoals eerder beschreven11.
- Breng OTI-GFP-of OTI-RFP-cellen (3 x 106 -cellen) over in C57BL/6 wilde muizen ontvangers met een intraveneuze injectie zoals beschreven door Cahalan, et al.12. Gebruik muizen die meestal 6 – 12 weken oud zijn.
Opmerking: Deze stap is optioneel en alleen vereist voor het traceren van antigeen-specifieke CD8+ T cellen.
2. Listeria monocytogenes infectie
- Uit te breiden L. monocytogenes genetisch gemodificeerd tot Express OVA (LM-OVA)13 tot een exponentiële fase van de groei in Bouillon hart infusie bij 37 °c onder voorzichtige opwinding tot de OD600 bereikt 0,08 – 0.1, zoals eerder beschreven in referentie 14.
- Injecteer 100 μL (maximaal volume = 200 μL) van 0,1 – 0,5 LD50 LM-OVA verdund in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door middel van een intraveneuze injectie met een 29 G insulinespuit, in C57BL/6 wild type muizen ontvangers met OTI-GFP of OTI-RFP cellen, indien geïndiceerd.
Opmerking: In onze handen komt 0,1 x LD50 LM-OVA overeen met 2 x 104 kolonie vormende eenheden (CFU). L. monocytogenes genetisch gemodificeerd om te Express OVA wordt gebruikt voor het activeren van de eerder overgedragen OTI CD8+ T cellen, maar andere stammen van L. monocytogenes kunnen worden gebruikt.
3. behandeling met Brefeldin A (BFA) om de secretie van cytokine te blokkeren
- Injecteer 250 μg BFA in 200 μL PBS intraperitoneaal 6 h vóór het opofferen van de muis met behulp van een insulinespuit van 29 G.
Opmerking: Gelyofiliseerd BFA wordt voor het eerst geresuspendeerd in dimethylsulfoxide (DMSO) om de voorraad van 25 mg/mL concentratie te bereiden. De BFA wordt vervolgens in PBS bij kamertemperatuur (RT) verdund om kristallisatie voorafgaand aan de injectie te voorkomen. Remming van cytokine secretie induceert accumulatie van IFNγ in cellen. Dit is cruciaal voor de detectie van cytokine.
4. de milt oogsten
- Euthaniseer de muizen met behulp van de stijgende concentratie van CO2 gevolgd door cervicale dislocatie.
Opmerking: Volg de richtlijnen van de lokale instelling voor humane euthanasie van muizen. - Reinig de buik met 70% ethanol, maak een incisie met een schaar om een 1 – 2 cm door de huid te knippen op de linkerflank van de muis, waar de milt zich bevindt. Maak voorzichtig een incisie in het peritoneum om de milt bloot te leggen en neem het uit met een pincet. Oogst de milt, wees voorzichtig niet te knijpen met een tang of snijd het om te voorkomen dat de milt architectuur verstoren.
5. fixatie van de milt met Paraformaldehyde (PFA)
- Bereid de fixatieve oplossing door het mengen van 3,75 mL PBS en 3,75 mL 0,2 M L-lysine. Voeg 21 mg natrium m-periodate toe en meng goed. Voeg vervolgens 2,5 mL 4% PFA en 20 μL van 12 N NaOH toe.
Opmerking: Gebruik de fixatieve oplossing op dezelfde dag en gooi het teveel weg. Niet bewaren. Deze fixatie stap is belangrijk als het monster fluorescerende eiwitten zoals GFP bevat. Gebruik geen PFA dat sporen van methanol bevat, omdat het fluorescerende eiwitten denatureert.
Let op: PFA is giftig en moet met voorzichtigheid worden behandeld. - Dompel de milt in de fixeer-en oplossing voor een minimum van 4 h, meestal 16 – 20 h bij 4 °C onder zachte opwinding.
- Gooi de fixatieve oplossing weg en voeg 5 mL PBS gedurende 5 minuten bij RT onder zachte opwinding.
- Vervang de PBS door 5 ml verse PBS Incubeer gedurende 1 uur bij 4 °c onder zachte opwinding.
- Vervang de PBS met 5 mL 30% sucrose, inbroed voor 12 – 24 uur.
Opmerking: Deze methode helpt bij het handhaven van de weefsel morfologie. Na incubatie met de sacharoseoplossing moet het orgel aan de onderkant van de put zinken.
6. invriezen en snijden
- Zet droogijs in een grote recipiënt en plaats een kleinere recipiënt binnen met ongeveer 50 mL zuivere methanol en een paar stukjes droogijs.
- Droog de milt voorzichtig af op een pluisvrij doekje.
- Plaats de milt in een basis mal met een druppel van optimale snijtemperatuur (OCT) op de bodem. Wees voorzichtig om geen bubbels te produceren. Voeg een LGO toe over de milt.
- Met een tang, stort de basis mal op het oppervlak van de methanol en zorg ervoor dat deze de LGO niet aanraakt. het weefsel zo snel mogelijk invriezen om artefacten te minimaliseren.
- Wanneer het bevroren is, gaat u verder met snijden.
Opmerking: Bevroren milt kan gedurende enkele maanden bij-80 °C worden gehouden. -
Sectie het weefsel met behulp van een cryomicrotome.
- Stel de kamertemperatuur op de cryostaat in op-21 °C. Snijd secties van de gewenste dikte (meestal rond 10 μm). Dit protocol werkt met diktes tot 30 μm.
- Verzamel secties op glas Microscoop dia's (Zie de tabel van de materialen) en Inspecteer visueel.
Opmerking: Secties kunnen gedurende enkele maanden bij-80 °C worden bewaard.
7. immunofluorescentie kleuring
- Laat de sectie naar RT komen.
- Teken een cirkel met een vloeistof Blokker (bijv. PAP-pen) rond de weefsel sectie. Trek buiten de LGO of het zal niet vasthouden.
- Na het drogen, Hydrateer het monster door het plaatsen van PBS op de weefsel sectie gedurende 5 minuten.
Opmerking: Het volume dat op de sectie wordt geplaatst, is afhankelijk van de grootte van de sectie. Meestal gebruiken we 100 – 300 μL. Laat de delen niet drogen zodra ze opnieuw gehydrateerd zijn. - Spoel ten minste tweemaal met PBS om er zeker van te zijn dat de sectie goed aan de glijbaan wordt gehecht.
-
Voeg blokkerende oplossing toe aan de sectie om niet-specifieke binding van antilichamen te verkleinen.
- Bereid blokkerende oplossing als volgt: PBS met 0,1% Triton X100, 2% foetaal kalf serum (FCS), 2,5 μg/mL FC receptor blocker (anti-muis CD16/32). Voeg vervolgens 2 – 5% normaal serum toe van de soort van elk secundair antilichaam van het kleurings paneel.
Opmerking: Als de antilichamen direct geconjugeerd/biotinyated zijn, voeg dan 5% normaal serum toe van de soorten van elk primair antilichaam. Als een primair antilichaam en een van de secundaire antilichamen afkomstig zijn van dezelfde soort (bijv. primair antilichaam dat in konijn en secundair konijn anti-rat wordt verhoogd), gebruik dan niet de normale serum soort omdat het het achtergrond signaal zal verhogen. - Verwijder voorzichtig de PBS uit de sectie door aspiratie en voeg 100 μL van de blokkerende oplossing per monster sectie toe. Inincuberen in een natte kamer met een minimum van 1 uur bij RT.
- Bereid blokkerende oplossing als volgt: PBS met 0,1% Triton X100, 2% foetaal kalf serum (FCS), 2,5 μg/mL FC receptor blocker (anti-muis CD16/32). Voeg vervolgens 2 – 5% normaal serum toe van de soort van elk secundair antilichaam van het kleurings paneel.
-
Vlek met primaire antilichamen.
- Verdun de primaire antilichamen tegen de optimale concentratie in de blokkerende oplossing. De algemene uitgangspunt concentratie antilichamen is 5 μg/mL, maar het moet worden geoptimaliseerd voor elk antilichaam en weefsel.
Opmerking: Als de antilichamen direct worden geconjugeerd, centrifugeer de antilichaammix op 17,135 x g (13,500 rpm) gedurende 15 minuten bij 4 °c voordat u deze gebruikt. Fluoroforen kunnen neerslaan. Deze stap zal de neerslag pellet en zo voorkomen dat niet-specifieke afzetting van de neergeprecipiteerde antilichamen op de glijbaan. - Vervang de blokkerende oplossing door de primaire antilichaammix voor elk monster.
- Inincuberen gedurende 4 uur bij RT of 's nachts (OVN) bij 4 °C in een overdekte natte kamer.
- Verdun de primaire antilichamen tegen de optimale concentratie in de blokkerende oplossing. De algemene uitgangspunt concentratie antilichamen is 5 μg/mL, maar het moet worden geoptimaliseerd voor elk antilichaam en weefsel.
-
Voer wassen uit.
- Bereid de Wasbuffer voor door 2% FCS toe te voegen aan PBS.
- Was 4 keer met wasbuffer: één snelle (zonder incubatie), één voor 10 min en twee gedurende 5 min. Voer vervolgens een laatste wasbeurt uit met PBS gedurende 5 minuten.
-
Kleuring met secundaire antilichamen.
- Verdun de secundaire antilichamen van belang bij de optimale concentratie in de blokkerende oplossing. Centrifugeer de mix, zoals beschreven voor de primaire antilichamen.
- Verwijder de uiteindelijke reinigingsoplossing. Voeg de secundaire antilichaammix bovenop de sectie toe en incuberen gedurende 1 – 4 uur bij RT in een overdekte natte kamer.
- Was 4 keer met wasbuffer: één snelle (zonder incubatie), één voor 10 min en twee gedurende 5 min. Voer vervolgens een laatste wasbeurt uit met PBS gedurende 5 minuten.
- Verwijder de uiteindelijke reinigingsoplossing. Laat de PBS verdampen, maar doe de sectie niet te droog. Plaats een druppel van het afdekmedium bovenop het monster en leg het afdekglas er voorzichtig bovenop. Het afdekmedium moet de hele sectie herstellen. Laat het polymerase OVN bij RT beschermd tegen licht.
Opmerking: Teken een cirkel rond de sectie aan de achterzijde van de dia voordat u het afdekmedium toepast. Zodra het afdekmedium is aangebracht, kan het weefsel moeilijk te zien zijn. - Bewaar de glaasjes in het donker op 4 °C tot ze klaar zijn voorbeeld.
8. beeldvorming en analyse
- Voer Imaging van de kleuring uit met een confocale Microscoop.
Opmerking: In dit protocol werd een omgekeerde spectrale laser scanning-microscoop gebruikt (Zie de tabel met materialen), samen met de doelstellingen 10X/na 0,40 of 60x/na 1,4 (voor analyse van cytokine sub-cellulaire lokalisatie). Golflengten van excitatie en emissie worden voor elke de en fluorescerende eiwitten in de materiaal tabelweergegeven. - Voer analyses en kwantificering uit zoals vereist met beeldverwerkingssoftware (bijvoorbeeld Imaris of Fiji).
Representative Results
IFNγ geproduceerd binnen de eerste 24 h na een infectie met Listeria monocytogenes is van cruciaal belang om de verspreiding van dit pathogeen te beheersen. Met dit protocol kunnen we niet alleen visualiseren welke cellen IFNγ produceren, maar ook of ze zich in een specifieke micro omgeving bevinden. Om ons te helpen de architectuur van de milt te afbakenen, hebben we gelabelde cellen bekend om een bepaalde locatie binnen de milt. De marker F4/80 labels alle macrofagen en markeert de rode pulp. De marker B220 Labels B cellen en markeert B celfollikels rond de T Cell zone. De marker CD169 labels marginale zone macrofagen, rond de witte pulp (Figuur 1). De meeste OTI cellen, of ze nu IFNγ of niet uitdrukken, zijn aanwezig in de witte pulp en als zodanig zijn alle afbeeldingen die van de witte pulp, tenzij aangegeven.
Een kritieke stap in dit protocol is het gebruik van BFA voor de remming van de secretie van cytokine. De detectie van IFNγ door NK-cellen was inderdaad sterk aangetast wanneer muizen niet werden behandeld met BFA (Figuur 2). Met behulp van ons protocol, we konden vinden dat ten minste twee celtypen produceren ifnγ 24 h na infectie — NK cellen en antigeen-specifieke CD8+ T cellen (Figuur 3) — vergelijkbaar met wat eerder is gevonden door flow flowcytometrieonderzoeken3.
In situ beeldvorming van IFNγ producerende cellen bleek dat de productie van IFNγ niet verspreid over de milt, maar geconcentreerd in discrete gebieden (Figuur 4). Inderdaad, we vonden dat T cellen werden geactiveerd door de milt (gemarkeerd door T-cel clustering), en dit niet noodzakelijkerwijs correleren met IFNγ productie. Een waarschijnlijke verklaring is dat de ifnγ-productie beperkt is tot de locatie van de geïnfecteerde cellen15,16en T-cel activering — vertegenwoordigd door clustering — kan worden ondersteund door beide geïnfecteerde (ifnγ-positief) en niet-geïnfecteerde (ifnγ negatieve) antigeen-cellen presenteren. Andere vlekken zullen nodig zijn om de exacte locatie te lokaliseren en een indicatie te krijgen van het mechanisme dat de IFNγ-productie beperkt tot dit gebied en de relatie met antigeen overdracht. Interessant genoeg vonden we dat geactiveerde, geclusterde, antigeen-specifieke T-cellen zich in de witte pulp van de milt bevinden, maar ze produceren alleen IFNγ in regio's waar NK-cellen met hen samenkomen (Figuur 5). Als zodanig, de aanwezigheid van NK-cellen afbakenen een specifieke micro-omgeving in de witte pulp, waarin geclusterde T-cellen produceren IFNγ in tegenstelling tot geclusterde T-cellen in het andere deel van de witte pulp. Dit suggereert dat de activering van de T-cel niet volstaat om de productie van IFNγ op dit tijdstip te dicteren.
Een andere interessante functie gemarkeerd door ons protocol is de verschillende sub-cellulaire lokalisatie van IFNγ in NK versus CD8+ T cellen5. Zoals getoond in Figuur 6, terwijl de ifnγ-LOKALISATIE in NK-cellen wordt verspreid in de cytosol, REKRUTEREN CD8+ T-cellen vaak ifnγ naar een andere T-cel.
Figuur 1: markeringen die de milt-architectuur markeren. Muizen werden geïnfecteerd met 2 x 104 CFU LM-OVA en inslapen 24 h post infectie. De spleen werd explanted en verwerkt zoals beschreven in het protocol. A) de secties werden gekleurd voor NK-cellen (anti-NCR1 gevolgd door anti-geit IgG-FITC; groen), OTI-RFP-cellen (rood) en macrofagen (anti-F4/80-APC; magenta). RP = rode pulp; WP = witte pulp. Schaalbalk = 200 μm. (b) secties werden gekleurd voor B-cellen (anti-B220-Pacific Blue; Blauw), OTI-GFP-cellen (in rood weergegeven GFP-signaal) en macrofagen in de marginale zone (anti-CD169-Alexa647; magenta). RP = rode pulp; BF = B cel follikel; TZ = T celzone. Schaalbalk = 50 μm. Dit is een representatief beeld van 3 onafhankelijke experimenten (N = 4). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: BFA-behandeling zorgt voor de detectie van intracellulaire IFNγ in situ. De nγ-productie is beperkt tot specifieke gebieden in de sple-muizen werden geïnfecteerd met 2 x 104 CFU LM-OVA en behandeld met BFA (a) of onbehandeld (B) na 18 uur. muizen werden geëuseerd 24 h post infectie. De spleen werd explanted en verwerkt zoals beschreven in het protocol. Secties werden gekleurd voor NK-cellen (anti-NCR1 gevolgd door anti-geit IgG-FITC; groen), OTI-RFP cellen (rood) en IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyaan). Schaalbalk = 5 μm. Dit is een representatieve afbeelding van de NK-cel-rijke gebieden van 3 onafhankelijke experimenten (N = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: IFNγ producerende cellen in de milt. Muizen werden geïnfecteerd met 2 x 104 CFU LM-OVA wanneer geïndiceerd en behandeld met BFA na 18 h. muizen werden geëuseerd 24 h post infectie. De spleen werd explanted en verwerkt zoals beschreven in het protocol. Secties werden gekleurd voor NK-cellen (anti-NCR1 gevolgd door anti-geit IgG-FITC; groen), OTI-RFP cellen (rood) en IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyaan). A) representatief beeld van een milt van een niet-geïnfecteerde naïeve muis om aan te tonen dat er geen IFNγ-niet-specifieke kleuring is. Witte lijnen afbakenen de witte pulp. WP = witte pulp; RP = rode pulp. B) representatief beeld van de witte pulp van de milt van een met LM-OVA besmette muis, waarbij de invasie van NK-cellen aan de witte pulp en de productie van IFNγ door NK-cellen, OTI-cellen en niet-gelabelde cellen wordt weergegeven. Afbeeldingen zijn representatief voor 4 onafhankelijke experimenten (N = 4). Schaal staven = 70 μm (A); en 20 μm (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: IFNγ-productie is beperkt tot specifieke gebieden in de milt na LM-OVA-infectie. Muizen werden geïnfecteerd met 2 x 104 CFU LM-OVA en behandeld met BFA na 18 h. muizen werden geëuseerd 24 h post infectie. De spleen werd explanted en verwerkt zoals beschreven in het protocol. Alle secties waren gekleurd voor B-cellen (B220-Pacific Blue AB, Blue) en IFNγ (anti-IFNγ-Biotine gevolgd door streptavidin-PE; cyaan). OTI-GFP-cellen (GFP-signaal in rood weergegeven). Cyaan lijnen komen overeen met gebieden met een hoge IFNγ-productie. Dit zijn representatieve beelden van 4 onafhankelijke experimenten (N = 4). A) de secties werden gekleurd voor marginale zone macrofagen (anti-CD169-Alexa 647, magenta). Schaalbalk = 50 μm.B) de secties werden voor alle macrofagen gekleurd (F4/80). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: IFNγ-productie door GEACTIVEERDE OTI-cellen vindt plaats in een specifieke micro-omgeving. Muizen werden geïnfecteerd met 2 x 104 CFU LM-OVA en behandeld met BFA na 18 h. muizen werden geëuseerd 24 h post infectie. Milt werden explanted en verwerkt zoals beschreven in het protocol. Secties werden gekleurd voor NK-cellen (anti-NCR1 gevolgd door anti-geit IgG-FITC; groen), OTI-RFP cellen (rood) en IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyaan). Groene en rode lijnen markeren respectievelijk NK-en OTI-celzones. Witte pijl geeft voorbeelden aan van T-celclusters die geen IFNγ produceren. Groene pijlen voorbeelden van T-celclusters die IFNγ produceren. Schaalbalk = 100 μm. Dit is een representatief beeld van vier onafhankelijke experimenten (N = 4). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: subcellulaire lokalisatie van IFNγ in NK-cellen en T-cellen. Muizen werden geïnfecteerd met 2 x 104 CFU LM-OVA en behandeld met BFA na 18 h. muizen werden geëuseerd 24 h post infectie. De spleen werd explanted en verwerkt zoals beschreven in het protocol. Alle secties waren gekleurd voor IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyaan). Witte lijnen afbakenen celranden en witte pijlen toont directionaliteit van secretie. Dit is een representatief beeld van twee onafhankelijke experimenten (N = 5). (A)-OTI-RFP-cellen worden in het rood weergegeven. Schaalbalk = 5 μm. (B) secties werden gekleurd voor NK-cellen (anti-NCR1 gevolgd door anti-geit IgG-FITC; groen. Schaalbalk = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
In dit manuscript presenteren we een methode om de IFNγ-productie in de milt te visualiseren na een infectie van L. monocytogenes bij muizen. Dit protocol is eenvoudig en kan worden aangepast aan andere weefsels en cytokine triggers, maar de volgende aspecten moeten worden overwogen. Cellen vaak snel afscheiden van de cytokines die ze produceren, en cytokines worden snel opgepikt door naburige cellen. Het is als zodanig moeilijk om cytokines in situ te detecteren. Een veelgebruikte methode om de cytokine productie snel opnieuw te initiëren, is de cellen ex vivo opnieuw te stimuleren, gevolgd door cytokine detectie in de media door enzym-gebonden immunosorptie test. In deze context gaat alle informatie over de ruimtelijke lokalisatie van de cytokine-producerende cellen verloren. Bovendien weerspiegelt de productie van cytokine na herstimulatie niet noodzakelijkerwijs of cytokines daadwerkelijk worden geproduceerd en uitgescheiden in vivo, maar geeft het de capaciteit van een bepaalde celpopulatie aan om cytokines te produceren. Daarom zullen beide methoden verschillende informatie bieden en moet men overwegen welke informatie het meest waardevol is voor hun experiment.
Om intracellulaire cytokines te detecteren, gebruikt onze methode een intracellulaire eiwit transport remmer om cytokines in cellen te vangen en signaaldetectie te verhogen. Echter, het is belangrijk op te merken dat deze remmers van invloed zijn op het normale transport van eiwitten uit het endotheel reticulum (re) naar het Golgi-apparaat en naar de secretoire blaasje die hun vrijlating aantasten, wat toxiciteit kan veroorzaken. Als gevolg daarvan, BFA, of een andere remmer, moet worden gebruikt voor een korte periode van tijd, meestal niet meer dan een paar uur. Vandaar, het is belangrijk om de juiste balans tussen de dosis van de remmer en de tijd van de behandeling te vinden om het niveau van cytokines gevangen in de cel te optimaliseren zonder ernstige cytotoxische effecten veroorzaken. Deze variabelen kunnen verschillen tussen cytokinen en de toedieningsweg voor de BFA. In ons infectie model werd de BFA intraperitoneaal toegediend om een snelle systemische dispersie te bieden, maar het kan ook intraveneus worden geleverd.
De meest gebruikte intracellulaire eiwit transport remmers zijn BFA, hier gebruikt, en monensin (MN). Deze remmers worden vaak gebruikt om te accumuleren en te studeren cytokine productie, maar ze hebben kleine verschillen in hun mechanismen van actie. MN remt het transport van eiwitten binnen het Golgi-apparaat en verzamelt dus eiwitten in de Golgi17 terwijl BFA coatomer-eiwit complex-I Recruitment voorkomt, remming van de retrograde beweging van eiwitten naar het endoplasmisch reticulum (er) en daarmee het bevorderen van accumulatie van cytokines in de ER18. Als zodanig, het kiezen van de beste intracellulaire eiwit transport inhibitor zal afhangen van verschillende factoren, zoals de cytokine worden gedetecteerd. Bijvoorbeeld, het is aangetoond in lipopolysaccharide-geïnduceerde intracellulaire kleuring van monocyten dat BFA is efficiënter voor het meten van de cytokines IL-1β, IL-6 en TNF dan MN19.
Dit protocol omvat de visualisatie van de cytokine in situ door confocale microscopie en daarom zijn er slechts een beperkt aantal markers dan kan worden gebruikt om de cytokine-producerende cellen en hun micro-omgeving te bestuderen. Het is ook noodzakelijk om te bedenken dat eiwit transport remmers zoals BFA of MN de normale expressie van verschillende eiwitten verstoren en daarom het gebruik ervan bij het bestuderen van de gelijktijdige uitdrukking van bepaalde activerings celoppervlak markeringen moet worden benaderd Zorgvuldig. Bijvoorbeeld, BFA maar niet MN blokkeert de uitdrukking van CD69 in lymfklier lymfocyten20. Ondanks deze beperking, confocale beeldvorming maakt subcellulaire lokalisatie van cytokines, evenals de richting van de cytokine secretie binnen de cel. De gegevens die met dit protocol worden gegenereerd, suggereren dat NK-cellen de neiging hebben om IFN-y in een diffuus patroon af te scheiden terwijl CD8+ t-cellen de IFNγ-secretie lijken te richten op andere CD8+ t-cellen die in directe interactie met hen zijn5.
Tot slot, dit protocol is geschikt voor het visualiseren van een verscheidenheid van cytokines in situ en identificeren van de productiecellen en hun micro-omgeving na vele triggers zoals infectie of auto-immuniteit. De verkregen informatie is instrumentaal om te begrijpen het belang van de in vivo ruimtelijke orkestratie van verschillende celtypen en de cytokine die zij produceren, noodzakelijk voor een efficiënte immuunrespons.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken het personeel van het Kennedy Institute Imaging Facility voor technische assistentie bij Imaging. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Kennedy Trust (naar A.G.), en de biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council (BB/R015651/1 aan A.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |
| Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |
| L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |
| D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |
| Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |
| O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |
| Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml |
| Microscope slides - Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |
| anti-CD169 - AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
| anti-F4/80 - APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
| anti-B220 - PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/mL Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
| anti-IFNg - biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL |
| anti-IFNg - BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
| anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/mL |
| anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/mL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Streptavidin - PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mL Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
| Streptavidin - FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mlL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Cover glasses 22 mm x 40 mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |
| Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |
| Imaris - Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Confocal microscope - Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||
| Cryostat - CM 1900 UV | Leica | ||
| Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |
| PBS 1x | Life Technologies Ltd | 20012068 | |
| BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |
| GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||
| RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||
| Insulin syringe, with needle, 29 G | VWR International | BDAM324824 | |
| C57BL/6 wild type mice | Charles River |
References
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Kubota, K., Kadoya, Y. Innate IFN-gamma-producing cells in the spleen of mice early after Listeria monocytogenes infection: importance of microenvironment of the cells involved in the production of innate IFN-gamma. Frontiers in Immunology. 2 (26), (2011).
- Dunn, P. L., North, R. J. Early gamma interferon production by natural killer cells is important in defense against murine listeriosis. Infection and Immunity. 59 (9), 2892-2900 (1991).
- Krummel, M. F., et al. Paracrine costimulation of IFN-gamma signaling by integrins modulates CD8+ T cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), 11585-11590 (2018).
- Curtsinger, J. M., Agarwal, P., Lins, D. C., Mescher, M. F. Autocrine IFN-gamma promotes naive CD8+ T cell differentiation and synergizes with IFN-alpha to stimulate strong function. Journal of Immunology. 189 (2), 659-668 (2012).
- Hosking, M. P., Flynn, C. T., Whitton, J. L. Antigen-specific naive CD8++ T cells produce a single pulse of IFN-gamma in vivo within hours of infection, but without antiviral effect. Journal of Immunology. 193 (4), 1873-1885 (2014).
- Croxford, A. L., Buch, T. Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned. Immunology. 132 (1), 1-8 (2011).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8++ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. Journal of Visualized Experiments. (9), 409 (2007).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. Journal of Visualized Experiments. (7), 265 (2007).
- Pope, C., et al. Organ-specific regulation of the CD8+ T cell response to Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 166 (5), 3402-3409 (2001).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance. Current Protocols in Microbiology. 31, 1-7 (2013).
- Kang, S. J., Liang, H. E., Reizis, B., Locksley, R. M. Regulation of hierarchical clustering and activation of innate immune cells by dendritic cells. Immunity. 29 (5), 819-833 (2008).
- Chang, S. R., et al. Characterization of early gamma interferon (IFN-gamma) expression during murine listeriosis: identification of NK1.1+ CD11c+ cells as the primary IFN-gamma-expressing cells. Infection and Immunity. 75 (3), 1167-1176 (2007).
- Mollenhauer, H. H., Morre, D. J., Rowe, L. D. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1031 (2), 225-246 (1990).
- Helms, J. B., Rothman, J. E. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature. 360 (6402), 352-354 (1992).
- Schuerwegh, A. J., Stevens, W. J., Bridts, C. H., De Clerck, L. S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes. Cytometry. 46 (3), 172-176 (2001).
- Nylander, S., Kalies, I. Brefeldin A, but not monensin, completely blocks CD69 expression on mouse lymphocytes: efficacy of inhibitors of protein secretion in protocols for intracellular cytokine staining by flow cytometry. Journal of Immunology Methods. 224 (1-2), 69-76 (1999).
