Här beskriver vi en enkel konfokalmikroskopi Imaging metod för att visualisera in situ lokalisering av celler som utsöndring av cytokin interferon gamma i murin sekundära lymfoida organ. Detta protokoll kan förlängas för visualisering av andra cytokiner i olika vävnader.
Cytokiner är små proteiner som utsöndras av celler och förmedlar cell cells kommunikation som är avgörande för effektivt immunsvar. En egenskap hos cytokiner är deras pleiotropism, eftersom de produceras av och kan påverka en mängd olika celltyper. Som sådan är det viktigt att förstå inte bara vilka celler som producerar cytokiner, men också i vilken miljö de gör det, för att definiera mer specifika Therapeutics. Här beskriver vi en metod för att visualisera cytokinproduktion in situ efter bakteriell infektion. Denna teknik förlitar sig på Imaging cytokin-producerande celler i sin inhemska miljö genom konfokala mikroskopi. För att göra detta, är vävnads sektioner färgas för markörer av flera celltyper tillsammans med en cytokin fläck. Nyckeln till denna metod, cytokin sekretion blockeras direkt in vivo innan skörd vävnaden av intresse, möjliggör detektion av cytokin som samlats inuti de producerande cellerna. Fördelarna med den här metoden är flera. För det första, den mikromiljö där cytokiner produceras bevaras, som i slutändan skulle kunna informera om de signaler som krävs för cytokin produktion och de celler som påverkas av dessa cytokiner. Dessutom ger denna metod en indikation på placeringen av cytokinproduktionen in vivo, eftersom den inte förlitar sig på artificiell in vitro-återstimulering av de producerande cellerna. Emellertid, det är inte möjligt att samtidigt analysera cytokin nedströms signalering i celler som tar emot cytokin. På samma sätt motsvarar de observerade cytokinsignalerna endast det tidsfönster under vilket cytokinsekretion blockerades. Medan vi beskriver visualiseringen av cytokin interferon (IFN) gamma i mjälten efter mus infektion av intracellulära bakterier Listeria monocytogenes, denna metod skulle kunna anpassas till visualisering av någon cytokin i de flesta organ.
Iscensätt ett effektivt immunsvar mot en patogen kräver komplex integration av signaler som visas av en mängd olika immunceller som ofta sprids mellan organismen. För att kommunicera, dessa celler producerar små lösliga proteiner med flera biologiska funktioner som fungerar som immunmodulerande namngivna cytokiner. Cytokiner kontroll cell rekrytering, aktivering och spridning och därmed är kända för att vara viktiga aktörer i främjandet av immunsvar1. Effektiva immunsvar kräver cytokiner att släppas i ett mycket organiserat spatiotemporal mönster som förbinder specifika celler för att inducera specifika signaler. Därför är det viktigt att studera cytokin produktion och dess signalering in situ, med hänsyn till den mikromiljö där cytokiner produceras.
Auktor (L. monocytogenes) är en grampositiv intracellulär bakterie som används som en utmärkt modell för att studera immunsvar mot intracellulära patogener hos möss. En cytokin, IFN gamma (IFNγ) produceras snabbt, inom 24 h efter L. monocytogenes infektion. Det är nödvändigt för patogenen clearance, som möss utslagen för IFNγ är mycket mottagliga för L. monocytogenes infektion2. Ifnγ är pleiotropiska och produceras av flera celler efter infektion3. Medan IFNγ produceras av Natural Killer (NK) celler krävs för direkt anti-bakteriell aktivitet4, ifnγ från andra källor har visat sig ha andra funktioner. Faktum är att vi och andra nyligen funnit att ifnγ produceras av CD8 + t-celler har en specifik funktion i direkt reglera T celldifferentiering5,6,7. Som sådan, förstå vilka celler producerar IFNγ (och i vilken mikromiljö) är avgörande för att dissekera dess funktion.
Den vanligaste tekniken för att studera cytokinproduktion förlitar sig på intracellulär cytokin färgning analyseras av flödescytometri. Denna metod möjliggör samtidig detektering av flera cytokiner kombinerat med cell ytan markörer i ett enda prov, vilket ger ett mycket användbart verktyg för att studera cytokin produktion. Men med hjälp av ovannämnda teknik innebär att förlora all rumslig information. Dessutom förlitar sig cytokin upptäckt ofta på in vitro-återstimulering för att möjliggöra cytokindetektion. Som sådan, kapaciteten hos en given cell för att producera en cytokin analyseras, och det inte nödvändigtvis korrelerar med faktisk cytokin sekretion in situ. Andra metoder använder reporter möss för vilka fluorescerande proteinuttryck korrelerar med cytokin transkription och möjliggör visualisering på en enda cellnivå8. Även om denna metod kan spåra cytokin transkription in situ, det finns ett begränsat antal cytokin-reporter möss tillgängliga. Dessutom kan transkription, översättning och sekretion ibland kopplas bort, och fluorescerande proteiner har en annan halveringstid än den cytokin de rapporterar, vilket gör denna metod ibland inte tillräcklig för in situ cytokin visualisering.
Här beskriver vi en metod för att visualisera in situ cytokin produktion av konfokalmikroskopi vid enkel cell upplösning. Denna teknik möjliggör visualisering av den cellulära källan och omgivande nisch inom vävnaden. Detta protokoll beskriver specifikt visualisering av IFNγ produktion i mjälten av L. monocytogenes infekterade möss, med fokus här på ifnγ produktion av NK-celler och antigen specifika CD8+ T-celler. Emellertid, det kan utökas och anpassas till karakterisering av någon cytokin produktion i samband med andra situationer där cytokiner produceras såsom infektion, inflammation eller autoimmuna sjukdomar, så länge den riktade cytokin kan behållas i celler av intracellulär proteintransport hämmare.
I detta manuskript presenterar vi en metod för att visualisera produktionen av IFNγ i mjälten efter L. monocytogenes infektion hos möss. Detta protokoll är enkelt och kan anpassas till andra vävnader och utlöser cytokiner, men följande aspekter måste övervägas. Celler ofta snabbt utsöndrar de cytokiner de producerar, och cytokiner snabbt plockas upp av angränsande celler. Det är så svårt att upptäcka cytokiner på plats. En vanlig metod för att snabbt åter initiera cytokin produktion är att åter stimulera cellerna ex vivo följt av cytokin detektion i medierna genom enzymkopplad immunosorbent assay. I detta sammanhang förloras all information om den rumsliga lokaliseringen av de cytokinproducerande cellerna. Dessutom, cytokin produktion efter omstimulering inte nödvändigtvis reflektera om cytokiner faktiskt produceras och utsöndras in vivo, utan snarare indikerar kapaciteten hos en viss cellpopulation att producera cytokiner. Därför kommer båda metoderna att ge olika information och man bör överväga vilken information som är mest värdefull för deras experiment.
För att upptäcka intracellulära cytokiner, vår metod använder en intracellulär proteintransport hämmare att fälla cytokiner inuti celler och öka signaldetektering. Emellertid, det är viktigt att notera att dessa hämmare påverkar den normala transporten av proteiner från endotelceller nätmagen (re) till Golgi apparaten och att den sekretoriska vesikeln försämra deras frisättning, vilket kan orsaka toxicitet. Som en följd, BFA, eller andra hämmare, bör användas under en kort tid, vanligtvis inte mer än några timmar. Därför, det är viktigt att hitta rätt balans mellan inhibitor dos och tid för behandling för att optimera nivån av cytokiner fångade inuti cellen utan att orsaka allvarliga cytotoxiska effekter. Dessa variabler kan skilja sig mellan cytokiner och administreringsväg för BFA. I vår infektions modell administrerades BFA intraperitonealt för att ge en snabb systemisk dispersion, men det kan också levereras intravenöst.
De mest använda intracellulära proteintransport hämmare är BFA, används här, och monensin (MN). Dessa hämmare används ofta otydligt att ackumulera och studera cytokin produktion men de har små skillnader i deras verkningsmekanismer. MN hämmar transporten av proteiner inom Golgi apparaten därmed ackumulera proteiner i Golgi17 medan BFA förhindrar coatomer protein Complex-I rekrytering, hämma retrograd förflyttning av proteiner till endoplasmatiska Retikulum (er) och därigenom främja ackumulering av cytokiner i ER18. Som sådan, att välja den bästa intracellulära proteintransport hämmare kommer att bero på olika faktorer, såsom cytokin som ska upptäckas. Till exempel, det har visats i lipopolysackarid-inducerad intracellulär färgning av monocyter att BFA är mer effektivt att mäta cytokinerna IL-1 β, IL-6 och TNF än MN19.
Detta protokoll innebär visualisering av cytokin in situ av konfokalmikroskopi och därför finns det bara ett begränsat antal markörer än vad som kan användas för att studera de cytokinproducerande cellerna och deras mikromiljö. Det är också nödvändigt att överväga att proteintransport hämmare såsom BFA eller MN stör det normala uttrycket av flera proteiner och därmed deras användning när man studerar det samtidiga uttrycket av vissa aktiverings cell yta markörer måste kontaktas Noggrant. Till exempel BFA men inte MN blockerar uttrycket av CD69 i murin lymfocyter20. Trots denna begränsning, konfokalmikroskopi Imaging möjliggör sub-cellulära lokalisering av cytokiner, samt riktningen av cytokin sekretion i cellen. De data som genereras med hjälp av detta protokoll tyder på att NK-celler tenderar att utsöndra IFN-y i ett diffust mönster medan CD8+ t celler verkar rikta IFNγ sekretion mot andra CD8+ t-celler som är i direkt interaktion med dem5.
Sammanfattningsvis är detta protokoll lämpligt att visualisera en mängd olika cytokiner på plats och identifiera producerande celler och deras mikromiljö efter många triggers såsom infektion eller autoimmunitet. Den information som erhålls är avgörande för att förstå vikten av in vivo rumsliga orkestrering av olika celltyper och cytokin de producerar, nödvändigt för ett effektivt immunsvar.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Kennedy Institute Imaging Facility personal för teknisk assistans med Imaging. Detta arbete stöddes av bidrag från Kennedy Trust (till AG), och bioteknik och biologiska vetenskaper forskningsrådet (BB/R015651/1 till AG).
Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |||
Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |||
L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |||
Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |||
D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |||
Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |||
O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |||
Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml | ||
Microscope slides – Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |||
anti-CD169 – AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
||
anti-F4/80 – APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
||
anti-B220 – PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
||
anti-IFNg – biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml | ||
anti-IFNg – BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
||
anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/ml | ||
anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
Streptavidin – PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
||
streptavidin – FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |||
Cover glasses 22x40mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |||
Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |||
Imaris – Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||||
Confocal microscope – Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||||
Cryostat – CM 1900 UV | Leica | ||||
Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |||
PBS 1X | Life Technologies Ltd | 20012068 | |||
BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |||
GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||||
RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||||
Insulin syringe, with needle, 29G | VWR International | BDAM324824 | |||
C57BL/6 wild type mice | Charles River |