Summary
Hier presenteren we een protocol om precies te vormen hemogenic endoteel van menselijke pluripotente stamcellen in een feeder-en xeno-vrije voorwaarde. Deze methode zal hebben brede toepassingen in ziektemodel lering en screening voor therapeutische verbindingen.
Abstract
Het afleiden van functionele hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) van menselijke pluripotente stamcellen (Psc's) is een ongrijpbaar doel voor autologe transplantaties om hematologische en kwaadaardige wanorde te behandelen. Hemogenic endoteel (hij) is een vatbaar platform om functionele HSPCs te produceren door transcriptiefactoren of om lymfocyten op een robuuste manier te induceren. Nochtans, zijn de huidige methodes om af te leiden hij of kostbaar of veranderlijk in opbrengst. In dit protocol hebben we een kosteneffectieve en precieze methode vastgesteld om binnen 4 dagen te ontlenen aan een feeder-en xeno-vrije gedefinieerde conditie. De resulterende hij onderging een endothelial-aan-hematopoietische overgang en produceerde CD34+CD45+ clonogenic hematopoietische progenitoren. De potentiële capaciteit van ons platform voor het genereren van functionele HSPCs zal hebben brede toepassingen in ziektemodel lering en screening voor therapeutische verbindingen.
Introduction
De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen voor hematologische en immunologische aandoeningen is belemmerd door het ontbreken van robuuste platforms voor ziektemodel lering en high throughput drug screening met autologe hematopoietische stamcellen (HSCs) afgeleid van patiënt pluripotente stamcellen (Psc's). De doorbraak van geïnduceerde (i) PSC-technologie is een belofte om ziekten van de cellen van patiënten te modelleren, maar de oprichting van functionele HSCs van Patient iPSCs is ongrijpbaar. Om HSCs van menselijke psc's te ontlenen, is de juiste inductie van embryonale patroon en transcriptie Programma's sleutel1,2,3,4,5,6, 7,8. De recente vooruitgang in hematopoietische ontwikkeling heeft de rol van hemogenic endoteel (HE) in de ontwikkeling van het Comité van het beleid9aangetoond. Hij kan worden geïnduceerd uit psc's en is vatbaar voor downstream interventie, zoals genenoverdracht10,11,12,13. Met behulp van hij als een platform, de combinatie van 5 transcriptiefactoren (erg, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) met succes geïnduceerde functionele HSCs dat engraft op lange termijn en differentiëren in meerdere lineages14. Echter, variabele en inefficiënte generatie van hij uit Psc's hebben belemmerd de systematische manipulatie en analyse van cellen, samen met de off-the-shelf productie en grootschalige inductie van hematopoietische cellen voor klinisch gebruik.
Hier beschrijven we een kosteneffectieve en precieze methode om hem te ontlenen in 4 dagen met een feeder-en xeno-vrij gedefinieerde conditie. In deze methode, sferoïde vorming en spontane re-afvlakking op iMarix-511 zorgt voor een consistente dichtheid van PSC kolonies, die cruciaal is voor de efficiënte inductie van hij cellen.
Protocol
1. reagentia
- De lijnen van de cel (menselijk Psc's): Verkrijg of embryonale stamcellen (Ser's) of iPSC lijnen 409B2 en 201B7 (317-9)) en CBA11.
-
Reagentia voorbereiding
- PSC plating medium: Meng PSC onderhouds medium met 10 µ M Y-27632 en bewaar bij 4 °C.
- PSC sferoïde betegelen medium: mix PSC onderhoud medium met 625-1250 ng/mL humaan recombinant laminin-511 E8 fragment (LM511-E8) (afhankelijk van de cel lijn) net voor gebruik.
Opmerking: LM511-E8 kan worden gemengd in media15. Andere matrix, zoals full-length laminin-511 moet worden pre-coated, en zelfs deed, ze niet ondersteunen mesodermaal organoids aangehouden tijdens differentiatie proces. - Dag 0 differentiatie medium: mix Mesodermaal basale medium met 2 µ M CHIR99021, 80 ng/mL Bone morfogenetische Protein 4 (BMP4) en 80 ng/ml vasculaire endothelial growth factor (VEGF).
- Dag 2 het middel van de differentiatie: mengeling Hemogenic basis middel met 1 µ M SB431542, 80 ng/mL VEGF en 100 ng/mL de factor van de cel van de stam (SCF).
- Bereid fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) zonder calcium of magnesium (Zie tabel van materialen).
- 1 mM ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA) buffer: Voeg 1 mL 0,5 M EDTA toe aan 500 mL PBS.
- EHT medium: mix hematopoietische basale medium met 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL thrombopoietin (TPO), 50 ng/mL FMS-gerelateerde tyrosine kinase 3 ligand (flt-2 l), 20 ng/mL interleukin-6/interleukin-6 receptor alpha (IL-6/IL-6Rα), insuline-transferrin-selenium-amine, L-glutamine en penicilline/streptomycine/amfotericine B.
- FACS buffer: Meng PBS met 2% foetale kalf serum en 1 mM EDTA.
- Bereid magnetische scheidings buffer voor (Zie de lijst van materialen).
- Bereid cellulose media voor (Zie de materiaallijst).
2. PSC Kolonievorming
- Grow hPSCs tot 70-80% confluentie op een 0,5 µ g cm-2 LM511-E8-Coated 6-well plaat in mTeSR1 in een 37 °c incubator met 5% Co2.
-
PSC dissociatie (dag-4)
- Aspireren het medium en was de cellen met PBS tweemaal. Spoel de cellen met dissociatie oplossing. Incubeer bij 37 °C voor 15 min (de cellen zullen niet in deze tijd uitdrogen).
- Suspendeer de cellen in het PVC-onderhouds medium, breng de suspensie over naar een geschikte buis en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 3 min. aspireren de bovendrijvende en schort de cellen op in PSC plating medium.
- Plaat de PSC schorsing op een dichtheid van 48.000-70.000 cellen cm-2 (afhankelijk van de cel lijn) op een micro-gefabriceerd plastic vat en broeden 's nachts in de 37 ° incubator met 5% Co2.
Opmerking: Wij raden 100 l goed-1 van de cel schorsing in een 96-goed micro-gefabriceerd plastic vat. U zult typisch zaad 20.000 cellen goed-1 in een 96-well plaat tot ongeveer 100 sferoïden opbrengst. -
Tegels PSC sferoïden op LM511-E8 (Dag-3)
- Verzamel de PSC sferoïden in een conische buis van 15 mL door voorzichtig pipetten met behulp van P1000 micro pipetter en laat de sferoïden te staan bij kamertemperatuur voor 2 minuten om neerslag door de zwaartekracht. Aspireren de bovendrijvende.
- Schors in sferoïde plating medium, afzien van de schorsing in een niet-gecoate 6-well cultuur plaat op een dichtheid van 4-sferoïden cm-2 en cultuur in de incubator 37 ° c met 5% Co2 voor drie dagen.
3. Hemogenic inductie (dag 0)
- Aspireren het medium, voeg Day0 differentiatie medium en cultuur in de 37 °C incubator met 5% O2 en 5% Co2 (hypoxische incubator).
- Na twee dagen van cultuur in Day0 differentiatie medium, aspireren het medium, voeg dan Day2 differentiatie medium en cultuur in de hypoxische incubator.
4. isolatie van Hemogenic endoteel (dag 4)
- Twee dagen later, aspireren het medium en was de cellen met PBS tweemaal. Spoel de cellen met dissociatie oplossing. Incubeer in de incubator van 37 °C met 5% CO2 voor 30 min.
- Schors voorzichtig de cellen in 1 mM EDTA te scheiden van de single-cell niveau, de overdracht van de schorsing in een 50 mL kegelvormige buis en centrifugeer de cellen op 200 x g voor 3 min. aspireren de bovendrijvende en schorten de cel pellet met 300 µ l van magnetische scheiding Buffer.
- Voeg 100 µ L van CD34+ microkralen en zacht pipet. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Tot 20.000.000 cellen per 100 l CD34+ kralen kunnen gebruikt worden.
- Filter de schorsing door middel van een 40 µm cel zeef.
- Scheid de CD34+ cellen met behulp van een magnetische separator.
5. inductie van endothelial-to-hematopoietische overgang (EHT)
-
Fibronectine coating
- Bereid het vereiste volume van 5 µ g/mL fibronectine-coating oplossing door 1 mg/mL fibronectine in PBS te verdunnen.
- Doseer 0,5 mL van de deklaag oplossing in elk goed van een 24-goed cultuur plaat. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de gesorteerde CD34+ cellen bij 200 x g voor 3 min. hersuspendeer de Cell PELLET in 1 ml eht medium.
- Bepaal de levensvatbare cel dichtheid met de cel teller. Pas de dichtheid van de cellen aan op 200.000 cellen mL-1 door eht medium toe te voegen.
- Aspireren en gooi de coating oplossing van de fibronectine goed. Doseer 0,5 mL CD34+ cel suspensie in elk fibronectine goed.
- Incubatie in de hypoxische incubator voor een week.
6. flow Cytometry analyse van hematopoietische cellen
- Floating Cell collectie: Breng het kweekmedium over op een conische buis van 15 mL. Centrifugeer het medium bij 200 x g voor 3 min. aspireren de bovendrijvende.
-
Aanhangende cel collectie
- Was de cellen tweemaal met 0,5 mL PBS.
- Spoel de cellen met het scheiden van oplossing en aspireren de overtollige vloeistof.
- Incubeer de plaat in de incubator van 37 °C voor 5 min.
- Hersuspendeer de cellen in 1 mL FACS buffer.
- Meng de zwevende cellen en de aanhangende cellen.
- Centrifugeer de cellen bij 200 x g voor 3 min. aspireren de bovendrijvende. Opnieuw op te schorten in 50 µ L van FACS buffer. Incubeer de cellen met anti-CD34 en anti-CD45 antilichamen voor 1 h bij kamertemperatuur in het donker.
- Was de cellen tweemaal met PBS en centrifugeer bij 200 x g 3 min. aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer in 0,5 ml FACS buffer met 0,5 µ g/ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole.
- Meet CD34 en CD45 expressie door flow cytometer.
7. Colony vormende eenheid (CFU) assay van hematopoietische cellen
- Hematopoietische Cell collectie: Breng het medium van de cultuur naar een 15 mL conische buis. Spoel voorzichtig de put tweemaal met PBS.
- Centrifugeer de cellen bij 200 x g voor 3 min. aspireren de bovendrijvende. Hersuspendeer in 1 mL EHT medium. Bepaal het cel nummer met de cel teller.
- Voeg een suspensie volume equivalent van 10.000 cellen tot 3 mL van cellulose-gebaseerde media aangevuld met antibiotica en meng goed 5 keer met een 16 G of 18 G spuit.
- Verdeel de gehele cellulose-gebaseerde media opschorting in elk goed van een 6-goed plaat.
- Incubeer in de incubator van 37 °C met 5% CO2 voor twee weken terwijl het houden van vochtig. Niet verstoren de schotel. De kolonies zijn motie-gevoelig.
- Na twee weken, Tel de kolonies onder een microscoop.
Representative Results
Een schema van de vorming van PSC-kolonies is afgebeeld in Figuur 1a. PSC sferoïden worden gevormd op een micro-gefabriceerd plastic vat voor een dag. Als een representatief resultaat, 20.000 409B2 cellen kunnen worden behandeld per 96-goed van micro-gefabriceerde plastic vat, hoewel andere cellen lijnen kunnen een hogere dichtheid (30000-40000 cellen per 96-goed van micro-gefabriceerde plastic schip) vereisen. Deze sferen worden spontaan afgeplatte tot een bijna twee-dimensionale cultuur wanneer ze op een kweekschaal worden geplateerd in aanwezigheid van LM511-E8.
Een schematische van hemogenic inductie wordt geïllustreerd in Figuur 1b. Wanneer PSC kolonies groeien tot een diameter van 750 µm, wordt het medium sequentieel veranderd om mesodermaal organoids te induceren. De PSC kolonies zullen geleidelijk aan een zonnige side up structuur worden tijdens differentiatie tot mesodermaal organoids door sequentiële middellange verandering tot dag 4. Op dag 4, hemogenic endothelia worden gespecificeerd van mesodermaal organoids door magnetische sortering en vervolgens geplateerd op fibronectine in EHT medium. 5-10 miljoen CD34+CD45- cellen worden verwacht van sferoïden met 1.000.000 psc's (figuur 1c).
Men merkt op dat de cellen morfologisch van endothelial aan hematopoietische cellen (supplementaireVideo 1) veranderen. In Figuur 2awordt een representatief fase-contrast beeld van hematopoietische voorlopercellen op stimulatie met hematopoietische cocktail op dag 7 getoond. Hematopoietische cel kolonies ontstaan in de cultuur.
Een representatieve flow Cytometry plot is te zien in Figuur 2b. De hele cultuur wordt gestimuleerd met hematopoietische cocktail en op dag 7 wordt geanalyseerd voor de expressie van CD34 en CD45 doorstroming Cytometry. Hematopoietische voorlopercellen Express CD34 en CD45.
Een CFU assay toonde de generatie van granulocyten/macrofagen kolonies uit de CD34+ CD45+ hematopoietische voorlopercellen (figuur 2c). De geschatte kolonie nummer is 38 CFU-G/M per 10.000 cellen (figuur 2D)
Figuur 1: schematische betegeling PSC kolonies en daaropvolgende hematopoietische differentiatie via hemogenic endothelia. Aschematisch proces van de vorming van PSC-kolonies. Psc's worden gehandhaafd op een LM511-E8-met een laag bedekte 6-goed plaat in PSC onderhoudsmiddel. Op dag-4, cellen zijn losgemaakt en gescheiden van de single-cell-niveau met behulp van scheiden oplossing, vervolgens geplateerd op micro-gefabriceerd plastic vat in PSC onderhoud medium met Y-27632 en gekweekte 's nachts te vormen sferoïden. Op dag-3, sferoïden zijn geplateerd in PSC onderhoud medium met LM511-E8 en gekweekt voor drie dagen. Door dag 0, worden sferoïden spontaan afgevlakt aan een bijna twee-dimensionale cultuur. Schaal staven = 200 µm. (B) op dag 0 wordt het medium vervangen door Day0 differentiatie medium en gekweekt in de hypoxische incubator. Op dag 2 van de differentiatie, wordt het medium vervangen door Day2 differentiatie medium. Op dag 4 van de hemogenic endoteel verrijking, CD34+ cellen zijn magnetisch gesorteerd en gekweekt op een fibronectine 12-well plaat in eht medium voor 6 dagen. (C) representatieve flowcytometry perceel van CD45 en CD34 expressie van dag 4 cellen gesorteerd op CD34. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: analyse van hematopoietische eigendom. (A) representatief fase-contrast beeld van hematopoietische voorlopercellen na stimulatie met hematopoietische cocktail op dag 7. De bar van de schaal = 200 µm. (B) representatief Stroom Cytometry perceel van CD45 en CD34 uitdrukking van gehele cultuur op stimulatie met hematopoietische cocktail op dag 7. (C) representatieve fase-contrast beeld van een granulocyt/macrofagen kolonie gegenereerd vanaf dag 11 hematopoietische voorlopercellen. De staaf van de schaal = 500 µm. (D) aantal cfu's per 10.000 cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende video 1: eht video. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Onze feeder-en xeno-vrije gedefinieerde inductie methode biedt een nauwkeurig en kostenbesparend platform om de cellen op een schaalbare manier te induceren. De getrouwe vorming van hemogenic endoteel in conventionele protocollen10, 11,12,13,14 is belemmerd door gebrek aan nauwkeurige controle van de dichtheid en de grootte van de kolonie PSC, die de efficiëntie van morphogen/cytokine-gebaseerde gerichte differentiatie beïnvloedt. We hadden ervaren inconsistentie van hemogenic endoteel inductie in elke onafhankelijke partij van conventionele protocollen. Het nieuwe protocol maakt strakke regulering van PSC Colony dichtheid en grootte, aldus overwint de inconsistentie van hemogenic endoteel inductie.
We exploiteerde de uniforme vorming van sferoïden en vervolgens vervoerde een feeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde te vormen hij in een totaal van 4 dagen. Wij bevestigden gebruikend drie onafhankelijke cellen lijnen dat de sferoïde vorming de verenigbare vorming van hij cellen verzekert. Als representatief resultaat, de 409B2 cel lijnen leverde 12,7%-23,6% CD34+ cel-efficiëntie op basis van drie onafhankelijke experimenten. De kritieke factor aan tegel PSC sferoïden is LM511-E8. We raden u niet aan om dit te vervangen door andere matrix, zoals Matrigel of full-length laminin producten in onze ervaringen. Wij ervoeren dat mesodermaal organoids gemakkelijk van Matrigel werden losgemaakt en tijdens differentiatie proces verloren. En noch Matrigel of full-length laminin niet verankeren cellen zonder pre-coating.
De mogelijke beperking van dit protocol is dat we afhankelijk zijn van PSC Maintenance medium om Psc's te handhaven. We hebben getest andere media, zoals StemFit, maar we gecompromitteerd hemogenic inductie. Vermoedelijk cellen waren resistent om af te sluiten van pluripotente staat in onze korte tijd (4 dagen) inductie protocol. Als men Psc's in andere media handhaaft, adviseren wij het aanpassen van cellen in PSC onderhoudsmiddel en leiden een paar passages voorafgaand aan differentiatie. Dit platform zal de systematische manipulatie en analyse van cellen, en de off-the-shelf productie en grootschalige inductie van hematopoietische cellen voor potentiële klinische gebruik. Een lange-termijn doel van dit systeem is het model van immunodeficiëntie ziekten in de vermenselijkte Muismodellen om de verantwoordelijke cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken en drug screenings te voeren.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken Alina Li en Seiko Benno voor hun technische assistentie. We willen ook graag mevrouw Harumi Watanabe bedanken voor het verstrekken van administratieve bijstand en Dr. Peter Karagiannis voor het bewerken van het papier. Dit werk werd ondersteund door het kern centrum voor iPS Cell Research van onderzoekscentrum Network voor de realisatie van regeneratieve geneeskunde van de Japan Agency voor medisch onderzoek en ontwikkeling (AMED) [M.K.S.], het programma voor hardnekkige ziekten onderzoek gebruik. Ziekte-specifieke iPS cellen van AMED (17935423) [M.K.S.] en centrum voor innovatieprogramma van het Agentschap van de wetenschap en van de technologie van Japan (JST) [R.O. en M.K.S.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5 M EDTA |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
| 6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B |
| anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
| anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
| CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
| CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
| Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
| Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
| FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
| Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
| Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
| IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
| iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
| MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
| Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
| mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
| SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
| SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
| Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
| TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
| Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |
References
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
- Lancrin, C., et al. The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage. Nature. 457, 892-895 (2009).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Ng, E. S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros. Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).
- Batta, K., et al. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).
- Sturgeon, C. M., et al. Defining the path to hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).
- Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
- Blaser, B. W., Zon, L. I. Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium. Blood. , (2018).
- Speck, N., Dzierzak, E. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nature imunology. , (2008).
- Niwa, A., et al. A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors. PLoS One. 6, e22261 (2011).
- Sturgeon, C. M., et al. Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).
- Ditadi, A., et al. Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages. Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7, 41165 (2017).
