Summary
Målet med denne protokollen er å manipulere fargen mønstre av hopping edderkopper og andre svært små Leddyr med maling for å studere spørsmål knyttet til seksuelle valg, seksuelle kannibalisme, predasjon, puppen, eller andre felt av animalsk farge.
Abstract
Innen atferdsmessige økologi, er mange eksperimenter utformet for å undersøke evolusjonære formålene med fargerike trekk i sammenheng med seksuelle valg og predasjon. Metodene er ulike, men hovedsakelig består av å endre farge mønstre av individer med ulike fargestoffer. Slike teknikker har blitt brukt på tvers av mange virveldyr, spesielt i fugler, men har forblitt underutviklet for virvelløse dyr på grunn av vanskeligheten med å effektivt manipulere farge i små organismer. I stedet, for å manipulere utseendet av virvelløse dyr, har forskere vanligvis endret belysningen miljøet for å filtrere ut visse bølgelengder. Imidlertid påvirker en slik metode ikke bare fenotypiske trekk av interesse, men hele utseendet til den enkelte og dens omkringliggende. Her skalerer ned teknikkene tidligere brukt på fargerike fugler, presenterer vi måter å manipulere fargene små leddyr, bruker like symbolske men lite studert arter: den fargerike hopping edderkopper.
Introduction
Dyr har ofte forseggjort farge mønstre som de viser under seksuelle møter, agonistic møter, eller for å avskrekke predasjon. Disse personlighetstrekk kanskje befordre beskjed å beholdere som det Oskar ' individ kvalitet som make1, kampen evne som konkurransedeltager2, eller palatability som prey artikkel3. For å forstå de adaptive formålene med fargerike trekk, har forskerne utformet eksperimenter som involverer manipulering av farger på ulike måter. Noen forskere har brukt fargede lokkefugl stimuli som modeller4,5,6,7,8, bilder9eller videoer10,11, 12 som presenteres for mottakere i atferds eksperimenter. Andre, spesielt når du bruker virvelløse dyr, har manipulert belysningen miljøet for å påvirke utseendet på fargene på levende individer13,14,15,16, 17. alle disse manipulasjoner, mens geniale, har ulempen med å fjerne potensielt viktige naturlige atferd og/eller påvirker mye mer enn trekk av interesse. I store virveldyr, slik som fugler, forskere svært ofte manipulere farge direkte på levende dyr (omtalt i Hill og McGraw, 200618). Individuelle fjær eller nebb har blitt direkte farget med markører2,19,20,21,22,23,24, fargestoffer som inneholder hydrogenperoksid ofte brukt i håret lighteners25,26,27, eller ulike malinger inkludert neglelakk28. I virvelløse dyr, slike studier som manipulerer farge mønstre direkte på levende dyr er forholdsvis sjeldne, men har fortsatt gitt enorm innsikt i funksjonen og utviklingen av farge29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38, 39. Selv arthropod studier synes å være partisk mot større dyr som lettere kan håndteres og males, slik at farge mønstre i svært små arter relativt lite studert.
Her beskriver vi en delikat farge manipulasjon teknikk som ble utviklet for svært små dyr arter. Nærmere bestemt innebærer denne metoden manipulere ansikts farging av mannlig hopping edderkopper under et mikroskop for å undersøke viktigheten av slike fargerike trekk i sammenheng med kompis valg og seksuelle kannibalisme. I dette tilfellet brukte vi Habronattus pyrrithrix (samlet fra Phoenix, AZ, USA) som modell arter (figur 1). Vi har publisert resultatene av eksperimentell arbeid ved hjelp av noen av disse teknikkene andre steder38,39, men her beskriver vi metodene i mer detalj enn det som er gjort tidligere, på en måte som bør gjøre dem tilgjengelig for andre forsøke å gjenskape dem eller tilpasse dem til bruk på andre svært små dyr. Slike protokoller bør åpne opp eksperimentelle muligheter på dyr som kan være så fargerik som den mest symbolske fugler, men som vanligvis lite studert.
Protocol
1. forberedelse av utstyret
- Velg passende maling.
- For vellykket program, bruk maling som er hurtigtørkende og har en tekstur som er lett manipuleres med tynnere. Produkter som har blitt brukt med hell inkluderer ikke-vanntett eyeliners som kan være tynnet med vann, og emalje maling som kan tynnet med emalje tynnere (tabell av materialer).
- Når du maler edderkopper, bør du tenke på at ryggskjoldet av de fleste artene har en herdet Exoskeleton mens den myke buken ofte strekker seg og constricts med fôring40.
- Emalje maling produsere en solid, herdet belegg på den malte overflaten; Derfor, Påfør dem på harde deler av cuticle (f. eks, ryggskjoldet, Ben, pedipalpene). Slike emalje belegg er mindre effektive for edderkopp abdomens fordi de skrelle av av edderkoppen som magen endrer form med fôring.
- I kontrast, eyeliners ikke produserer en herdet belegg, men heller sive inn i den fargede kropps skalaer; som sådan, bruk dem på både harde og myke kroppsdeler (inkludert edderkopp abdomens).
Merk: i de kommende trinnene, er den mest delikate teknikken presenteres som består av maleriet ansiktet og pedipalpene av edderkopper; emalje maling brukes, som er den mest generaliserings metoden på grunn av farge mangfoldet av emalje maling tilgjengelig.
- Før testing maling på levende dyr, hvis mulig, først måle Spectral egenskaper av malingen (bare påføres papir eller en annen overflate) ved hjelp av en UV-VIS refleksjon spektrofotometer å sikre at det ikke er noen uønskede UV-topper i spekteret som ville være usynlig for mennesker, men muligens synlig for de studerte arter.
- Bruk et dissekere mikroskop koblet til et kamera og en datamaskin for enklere å ta bilder av utfallet av manipulasjon for dokumentasjon og økende replicability (tabell over materialer).
- Slå på mikroskopet, datamaskinen og programvaren som behandler kamerainngangen.
- Velg den aktuelle zoomen der det endelige bildet vil bli tatt.
- Stick et insekt montering PIN eller en liten spiker (med hodet pekte utover) i en ball av ikke-herding modellering leire (omtrent på størrelse med en drue). (Den levende edderkoppen som skal males vil bli midlertidig montert på hodet av denne pinnen i trinn 3,1 nedenfor). Plasser modellering leire og PIN under mikroskopet for å justere målene slik at de grovt fokus på hodet av pinnen (der edderkoppen skal monteres).
- Sørg for at målene er på riktig avstand for maleren øyne, og at kameraet ikke er hindrer synsfeltet under maling (som tilfellet er hvis kameraet er montert i en av okulars, hindrer dybde persepsjon).
- Overfør edderkoppen inn i en ren plast snap-cap hetteglass (rundt 12 DRAM, uten webbing eller dødt byttedyr).
- Forbered montering og maling utstyr.
- Plasser en ekstra tynn insekt feste pinne inn i en ball av ikke-herding modellering leire (i tillegg til den som brukes i trinn 1.2.3) og plassere dem på venstre side av mikroskopet (for høyre hånds mennesker). Denne pinnen vil bli brukt til å forsiktig justere posisjonene til edderkopp bena og pedipalpene (etter behov) under maling.
- Få et lite stykke absorberende papir (for eksempel et papir håndkle), et stykke hvitt skriveren papir, maling til å søke (her, emalje maling), separate beholdere med maling tynnere (ett for hver farge pluss en holdt transparent og ren), individuelle mikro børster for hver farge (se tabell over materialer), og en mikro børste som bare skal brukes med ren tynnere, alt plassert på en organisert måte på høyre side av mikroskopet (for høyrehendt mennesker).
- Bruk en tannpirker, tilsett en dråpe maling i en åpen plast rett (for eksempel en liten Petri parabol eller hetteglass cap) og tilsett maling tynnere, for eksempel med en liten sprøyte. Bland de to med tannpirker til høyre konsistens (når malingen er helt homogenisert, men ikke for rennende) ved å teste den på den hvite skriveren papir med en mikro pensel.
Merk: i visse tilfeller, hvis malingen tørker raskt, forberede den med litt mer væske enn ønsket for påføring, og la børstene suge i potten av malingen tynnere til senere bruk (trinn 4). - Sett en størrelse dråpe vannbasert lim (se tabell over materialer) på et hjørne av skriverpapiret.
Merk: Dette må være den siste fasen av preparatet og neste trinn må skje umiddelbart etter dette, slik at limet ikke tørker ut.
2. anesthetizing edderkoppen
- Med edderkoppen i hetteglasset og en hånd cupped over åpningen for å hindre flukt, sakte legge CO2 gass til edderkoppen tredje par ben strekker seg til 180 grader.
- Bruk en tid med eksponering til CO2 av ca 20 sekunder til 1,5 minutter, avhengig av den gjennomsnittlige størrelsen på arten og på den enkelte edderkopp. Vi har funnet utvidelsen av den tredje par ben å være en pålitelig indikator på riktig nivå av anestesi i H. pyrrithrix, men dette sannsynligvis varierer mellom arter. Hvis du bruker disse teknikkene med en annen art for første gang, må du først teste anestesi på noen få eksemplarer for å vurdere deres respons.
- Gi edderkopper så lite CO2 som mulig for å oppnå den nødvendige nivå av anestesi. Mens de korte periodene med anestesi beskrevet her produserte ingen dødelighet (og ingen merkbar atferdsdata forskjeller fra ikke-anesthetized edderkopper), gi alle dyrene i et eksperiment like nivåer av anestesi (inkludert humbug kontroller).
- Hold hetteglasset lukket etter tilsetning av CO2 for å opprettholde edderkoppen under anestesi; Derfor, ta med denne gangen når du beregner hvor lenge edderkoppen er eksponert for CO2.
- Når edderkoppen er fjernet fra hetteglasset for å begynne farge manipulasjon, vil det være fullt anesthetized for ca 1 til 2 minutter; gjør derfor følgende trinn (avsnitt 3-6) omgående. På grunn av denne begrensede tiden vinduet, forsøke følgende maling metode med døde eksemplarer først (for praksis) før du forsøker å male levende edderkopper.
3. montering av edderkoppen under mikroskopet
- Legg en svært liten mengde lim på hodet av montering PIN eller spiker i modellering leire utarbeidet i synsfeltet av mikroskopet.
Merk: Bruk den minste mengden av lim som gjør det mulig å opprettholde edderkoppen på plass for å sikre at jeg) edderkoppen ikke glir av Pinhead (Hvis for mye lim brukes), og II) edderkoppen klarer å frigjøre seg selv etter Waking Up. - Skyv forsiktig den anesthetized edderkoppen fra hetteglasset på bordet med den ventrale siden opp.
Merk: fordi edderkopper ' abdomens er myke, forsiktighet bør utvises ikke å trykke eller slippe edderkopper på bordet, da dette kan føre til skade. - Trykk forsiktig på Pinhead (med lim) på edderkoppen brystbenet (det sentrale området der edderkoppen Ben feste til kroppen) slik at edderkoppen vil litt sprette og forlenge bena under det lille trykket påføres. For ekstra kontroll over trykket påføres, hold modellering leire med begge hender, har begge hendene steadied fast mot bordet.
- Omplasser modellering leire under mikroskopet slik at området for å male vender opp og i fokus.
4. maleri edderkoppen
- Vurdere maling konsistens før berøre pensel til edderkoppen.
- Test malingen konsistens (bruk absorberende papir for å tørke av børster hvis de ble opprettholdt i tynnere), justere igjen om nødvendig, og alltid først prøve å bruke maling på skriverpapiret å kontrollere for malingen mengden som finnes i børsten hår.
- Med høyre og mens du ser gjennom mikroskopet, ta spissen av børsten i synsfeltet, og sørg (en gang) at børsten hårene ikke inneholder for mye maling, i så fall tørk noe av det på skriverpapiret.
- Test malingen konsistens på edderkoppen.
- Berøre edderkoppen med penselen på det største området som må males over. Dette vil informere maleren om konsistens og mengde maling er riktig (dvs.når malingen litt og langsomt soaks inn i håret/skalaer av edderkoppen).
- Hvis ingen maling blir brukt, suge børsten inn i malingen og gå tilbake til trinn 4,1 for å gjenta prosedyren.
- Hvis malingen soaks i raskt og søl over på et område som ikke skal dekkes av maling, og forutsatt at utslippet er minimal og at den enkelte kan fortsatt ta del i forsøket, tørk børsten på absorberende papir og gå tilbake til trinn 4,1 for å gjenta prosedyren.
Merk: denne typen flytende søl kan ikke repareres. Hvis utslippet når chelicerene eller øynene, eller andre deler som kan være dødelig eller giftig for den enkelte, bør du vurdere å plassere edderkoppen umiddelbart i fryseren for å euthanize den før den våkner opp og ekskludere edderkoppen fra eksperimentet.
- Berøre edderkoppen med penselen på det største området som må males over. Dette vil informere maleren om konsistens og mengde maling er riktig (dvs.når malingen litt og langsomt soaks inn i håret/skalaer av edderkoppen).
- Paint alle områder som trenger farger følgende trinn 4,1 og 4,2.
- Hvis male ansiktet av edderkoppen, bruk den ekstra tynne pinnen med venstre hånd for å holde nede foran bena og pedipalpene (slik at de vil være ute av veien for pensel). Dette gjøres best mens du ser gjennom mikroskopet for å unngå å skade edderkoppen vedheng. I tillegg, hvis male ansiktet av edderkoppen, og avhengig av børster som brukes til å male, vurdere å male begge sider av ansiktet før du prøver å male den sentrale delen mellom øynene-begge malte områder kan slås sammen ved å holde børsten parallelt med edderkoppen ansiktet og indusere kapillær handling.
Merk: Når du maler ansiktet til edderkoppen, er det enklest å først male siden nærmest den dominerende hånden, og deretter rotere ballen av leire (med montert edderkopp) rundt under mikroskopet for å male den andre siden, etterfulgt av midten. - Når du maler pedipalpene eller ben, sørg for å ikke røre noen skjøter hvis malingen er en herding en (for eksempel emalje maling), og sørg for ikke å bruke maling til mannens sperm levering organer (på undersiden av den som går i pedipalpene).
- Hvis male ansiktet av edderkoppen, bruk den ekstra tynne pinnen med venstre hånd for å holde nede foran bena og pedipalpene (slik at de vil være ute av veien for pensel). Dette gjøres best mens du ser gjennom mikroskopet for å unngå å skade edderkoppen vedheng. I tillegg, hvis male ansiktet av edderkoppen, og avhengig av børster som brukes til å male, vurdere å male begge sider av ansiktet før du prøver å male den sentrale delen mellom øynene-begge malte områder kan slås sammen ved å holde børsten parallelt med edderkoppen ansiktet og indusere kapillær handling.
5. ta edderkoppen bilde
- Bytt målsettingen til kameramodus.
- Ta et bilde ved hjelp av dataprogramvaren, og pass på at den valgte zoomen er den som er valgt på mikroskopet, slik at det er mulig å legge til en Skalerings linje.
6. frigjøre edderkoppen fra pinnen eller spiker
- Når edderkoppen starter flytter, avholde nålen i den grad at det edderkopp ' forside ben berører det edderkopp ' flasken.
- La edderkoppen slipper seg selv, og om nødvendig, forsiktig skråning pinnen for å hjelpe edderkoppen trekke seg bort fra tørket lim.
- Hvis edderkoppen våkner opp før maleriet er ferdig, la edderkoppen minst 15 minutter å komme seg før de anesthetized igjen. Hvis dette er gjort, må du sørge for at alle grupper får samme nivå av anestesi (inkludert humbug-behandlet individer, hvis aktuelt).
Merk: edderkopper ser ut til å gjenoppta sin normale atferd raskt etter manipulasjon (< 15min), men vi anbefaler en standardisere hviletid på 12 timer før du bruker edderkoppen i en atferds test.
- Hvis edderkoppen våkner opp før maleriet er ferdig, la edderkoppen minst 15 minutter å komme seg før de anesthetized igjen. Hvis dette er gjort, må du sørge for at alle grupper får samme nivå av anestesi (inkludert humbug-behandlet individer, hvis aktuelt).
7. analyse av edderkopper atferd
- Sammenligne atferden til unmanipulated, humbug-behandlet, og manipulert for å vurdere den potensielle toksisitet av programmet (som kan variere etter spesifikk maling type, farge, bruksområde, og studere arter). Relevant opptreden å sammenligne kunne inkludere aktivitet rate, type av aktivitet utført, hell inne utføre spesifikk aktivitetene (e.g., fanger prey), etc.
- Bruk humbug-behandlet edderkopper som en del av eksperimentell design (for eksempel mottar malingen programmet på et ikke-synlig område eller ha nøytral-farget maling brukes på de samme områdene) for å bare endre fargen på den enkelte mens kontrollerende for andre faktorer (f.eks.håndteringstid, lukt, overflatestruktur osv.).
Merk: Hvis male ben eller pedipalpene, vurdere muligheten for at dette kan forstyrre sensoriske hår (utbredt på edderkopp ben og pedipalpene, se Foelix 201040) og, i disse tilfellene humbug-behandlede menn bør ha nøytral-farget maling påføres samme områdene som en kontroll. - Når du utvikler nye metoder, sammenligne malte edderkopper med unmanipulated edderkopper å vurdere om farge-manipulert individer fortsatt oppfører seg normalt.
- Bruk humbug-behandlet edderkopper som en del av eksperimentell design (for eksempel mottar malingen programmet på et ikke-synlig område eller ha nøytral-farget maling brukes på de samme områdene) for å bare endre fargen på den enkelte mens kontrollerende for andre faktorer (f.eks.håndteringstid, lukt, overflatestruktur osv.).
8. måle refleksjon egenskaper av farge manipulasjon på malt motivet
- Når euthanized (etter edderkopper var involvert i et eksperiment eller spesielt euthanized for dette formålet, se note nedenfor), måle Spectral egenskaper av farge manipulasjon ved hjelp av en standard bærbare UV-VIS spektrofotometer (tabell over materialer ), spesielt for områder større enn 1 mm i diameter.
- For mindre områder, bruk en spesialbygd microspectrophotometer (en UV-VIS spektrofotometer rutet gjennom et mikroskop) for enklere og mer presise målinger, selv om optikk i mikroskopet skar ut UV-lys, noe som betyr at målingene er begrenset til synlige bølgelengder fra mennesker (se Taylor et al. 201141).
- I tilfeller der farge-manipulert områder er svært små og UV refleksjon data er nødvendig, bruk kommersielt tilgjengelige UV-VIS microspectrophotometers, selv om de er dyrere (se Taylor et al. 201442).
Merk: lyskilden til UV-VIS Spektrofotometrene inneholder UV-lys og kan være farlig for dyrenes øyne (inkludert vår) så Spectral tiltak bør bare gjøres etter at dyrene er euthanized og ikke bare anesthetized. For emalje-malte edderkopper, kan dette gjøres etter at edderkopper har vært brukt i eksperimenter siden malingen ikke slites av (se representative resultater nedenfor). For vannbasert maling som kan noen ganger visne etter dager eller uker, kan et sett med edderkopper bli ofret for måling på den tiden da deres motpart ville være involvert i et eksperiment (for å fange data som reflekterer den faktiske farge manipulasjon som brukes i eksperiment). Rapportering av Spectral egenskaper av maling vil tillate replikering av andre forskere som kanskje vil gjenskape farge manipulasjon, men har ikke tilgang til de samme spesifikke malingsprodukter.
Representative Results
Effektiviteten av farge-manipulasjon
Ved hjelp av disse teknikkene, ulike grader av farge manipulasjon er effektive, inkludert skjuler farger helt eller redusere eller forsterke deres intensitet. Dette fremgår av både fotografier og målinger av Spectral refleksjon (figur 2, Figur 3og Figur 4). Her viser vi farge-manipulert mannlig Habronattus pyrrithrix sammenlignet med naturlige røde møtte menn. Spectral egenskaper ble målt ved hjelp av en UV-VIS spektrofotometer (se tabell av materialer) som kan presist måle fargede områder så lite som mm i diameter. Målingene ble tatt i forhold til en diffus refleksjon hvit standard (se tabell over materialer).
I sjeldne tilfeller (5 av 108 hanner malt med svart eyeliner 1 (se tabell over materialer) på deres ansikt), begynte den vannløselige eyeliner å slites av edderkopper ansikter etter en uke eller to. Dette ble ikke observert for det andre merket av eyeliner (eyeliner 2; se tabell over materialer). I begge tilfeller ble edderkopp bur sprayet med vann tre til fem ganger per uke. Ulike betingelser for vedlikehold kan påvirke slitasjen på vannbasert maling. Emaljen malingen var fortsatt intakt for alle manipulert menn (n = 221), selv for de som fortsatt er i live etter 6 måneder.
Potensiell toksisitet av farge manipulasjon
Man bør unngå å få maling på edderkopper øyne for ikke å hindre deres visjon, eller på deres chelicerene, munndeler og andre orifices, og muligens andre myke kroppsdeler for å hindre mulig inntak og forgiftning. Man bør også være forsiktig med å male ledd eller deler som inneholder sensoriske hår (for eksempel bena og pedipalpene) for ikke å begrense deres mobilitet eller sensoriske system. Men hvis en slik farge manipulasjoner på disse kroppens regioner er nødvendig, eller hvis det er noen tvil om muligheten for subtile negative effekter, er det da best å bruke maling til enkeltpersoner i alle behandlings kategorier. På denne måten vil man unngå utilsiktet manipulere sensoriske systemer av individer på måter som kan være partisk mot en av behandlingene bare. For eksempel, i et eksperiment med menn manipulert vist i Figur 4, var målet å øke og redusere antall røde flekker vises av menn under frieri. Siden noen menn ville få sine naturlige røde ansikter skjult med grå emalje maling (for å redusere mengden av røde vises), de andre menn som vi ønsket å opprettholde et rødt ansikt ble malt rødt over sine naturlig rødt ansikt med samme produkt som grå-ansikt Menn. Tilsvarende, siden vi ønsket å legge røde flekker på pedipalp på enkelte menn for å øke mengden av røde farge flekker vises, grå maling ble brukt til å dekke pedipalp av andre hanner, slik at alle menn ville bli malt på dette følsomme området (se Figur 4) . Selv om å foretrekke, kan denne strategien ikke alltid være gjennomførbart. For eksempel, i et annet eksperiment, den røde fargen ble fjernet ved hjelp av en svart eyeliner gi samme Spectral eiendommen som den underliggende cuticle av hannen, mens de andre mannlige fargene intakt og naturlig (figur 2). I dette tilfellet, for naturlig ser menn, samme mengde eyeliner ble brukt til området på toppen av deres ryggskjoldet rett bak deres fremre median øyne (et område som ikke er godt synlig for kvinner), å kontrollere for potensiell lukt eller generell toksisitet av Produktet. Men plasseringen der malingen påføres kan påvirke edderkopper annerledes. Derfor, for å vurdere subtile forskjeller i veien eller plasseringen der malingen ble brukt kan ha på integriteten av edderkoppen, oppførselen til begge typer menn i en sammenheng som var relevant for våre hypoteser (i forhold til kompis valg og seksuelle kannibalisme) ble sammenliknet. Hanner ble satt to-av-to i nærvær av en kvinne, og vi sammenlignet deres forsinkelse for å bli aktiv, deres forsinkelse å frieri, og den totale varigheten de tilbrakte frieri med generelle lineære blandet effekt modeller (ved hjelp av funksjonen lmer med R-pakken lme443 i R versjon 3.5.244 med kvinnelig identitet som en tilfeldig effekt, og bruker maksimal sannsynlighet kriterium for å få p-verdier). I dette tilfellet avslører alle sammenligninger ingen forskjeller mellom behandlingene (se tabell 1), og det ble derfor konkludert med at vi ikke innførte en skjevhet i favør av den ene eller den andre behandlings kategorien.
I begge tilfeller, når du har svært likebehandling kategorier (Figur 4), eller bare humbug behandlet individer (figur 2 og Figur 3), bør forskerne vurdere hvordan deres modell arter er påvirket av malingen de bruker og sikre at de fortsatt oppfører seg på en lignende og økologisk relevant måte. Man kan registrere data for å vurdere mulige effekter av toksisitet så mye som mulig, for eksempel ved å sammenligne aktivitets frekvenser mellom behandlede og unmanipulated individer. Våre edderkopper malt med emalje maling som i Figur 4 ble sammenlignet med unmanipulated menn i en ellers identisk sammenheng. Spesielt, hanner ble introdusert enkeltvis til en kvinnelig bur og deres forsinkelse å forlate hetteglasset, forsinkelse til frieri og frieri rate (før copulation, og før de ble angrepet eller kannibalisert) ble sammenlignet. Det ble ikke funnet noen forskjeller (ved bruk av lignende lineære blandede effekt modeller som ovenfor), og vi konkluderte derfor med at våre malte hanner oppførte seg naturlig (tabell 2).
Til slutt er det viktig å merke seg at noen edderkopper i eksperimenter (vanligvis kvinner) som kannibalisert farge-manipulert hanner aldri syntes å lide av negative effekter. Edderkopper fordøye sitt bytte eksternt, vanligvis forlater malte områder av cuticle bak. Men hvis tilpasse denne metoden for andre systemer der farge-manipulert dyr vil bli fortært, bør man vurdere den potensielle risikoen for toksisitet.
Figur 1 . Voksne mannlige Habronattus pyrrithrix illustrerer hvor lite deres fargede kroppen regioner. Fotografert av Lyle buss. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Eksperimentell farge manipulasjon brukes til å skjule rød ansikts farging i Habronattus pyrrithrix. (A) den intakte røde ansiktsfarge før farge manipulasjon. (B) den ansiktsfarge av samme hann etter skjuler den naturlige røde fargen med svart eyeliner 1. (C) representative refleksjon Spectra for den naturlige røde ansiktet, den naturlige underliggende svart cuticle, og det røde ansiktet malt med svart eyeliner 2. Modifisert fra Taylor og McGraw 201339. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Eksperimentell farge manipulasjon brukes til å redusere størrelsen og rødhet i den røde ansikts plasteret av mannlige Habronattus pyrrithrix. (A) intakt rød ansiktsfarge før farge manipulasjon. (B) ansikts fargen til samme hann etter påføring av fortynnet svart eyeliner (Urban Decay) til fremre del av ansiktet, og ikke-fortynnet svart eyeliner langs kantene av ansikts plasteret for å redusere størrelsen på det røde området. (C) betyr Spectral kurver av humbug-behandlet kontroll hanner (n = 21) og farge-manipulert menn (n = 21), sammenlignet med befolkningen mener (n = 57) og 10 drabbest menn fra en tidligere studie41. Figur gjengitt fra Taylor et al. 201438. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Eksperimentell farge manipulasjon brukes til å endre fargen på den røde ansikts flekk av mannlige Habronattus pyrrithrix. Habronattus pyrrithrix hanner malt med (A) rød, (B) rød og grå, og (C) grå emalje maling over deres naturlige røde ansikt og naturlig krem-farget pedipalpene. (D) betyr Spectral kurver for unmanipulated menn (n = 9), og menn med ansiktet dekket med rød emalje maling (n = 9). Ved å bruke en lysere rød over edderkoppen ansikt, vi effektivt forbedret sin røde ansiktsfarge. Fordi emalje maling fullt dekker de underliggende skalaer, farge kan også endres helt, slik tilfellet er med den grå emalje. (E) i dette eksperimentet, rød og grå emalje maling ble valgt å være matchet for total lysstyrke (total refleksjon over omfanget av bølgelengder synlig for disse edderkopper). Forskjeller i omfanget av Y-aksene i D og E skyldes ulike teknikker (for eksempel avstand til prøven og størrelsen på områdene målt) for å måle fargeprøver på papir (E) vs. direkte målinger av farger på forsiden av edderkoppen (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| N | Avhengig variabel | P | T | Rød-ansikt | ± SE | Svart-ansikt | ± SE | nFID |
| 202b | Mann forsinkelse å forlate parabolen | 0,35 for alle | -0,93 til en | 140,0 for alle | 23,9 for alle | 109,8 for alle | 23,9 for alle | 102 for alle |
| 179c | Mannlig forsinkelse til retten | 0,74 for alle | 0,33 for alle | 983,4 for alle | 127,1 for alle | 1031,0 for alle | 126,5 for alle | 95 for alle |
| 204en | Mann frieri innsats | 0,52 for alle | 0,63 for alle | 181,2 for alle | 24,4 for alle | 203,0 for alle | 24,4 for alle | 102 for alle |
| 204en | Mann frieri innsats før eventuelle angrep | 0,41 for alle | 0,68 for alle | 89,0 for alle | 15,7 for alle | 97,5 for alle | 15,7 for alle | 102 for alle |
Tabell 1. Effekt av mannlig ansikt farge manipulasjon på atferd, når malt med svart eyeliner vs humbug behandlet (figur 2). Strukturen i hver modell er gitt, samt gjennomsnittlig anslag i sekunder (± SE) for hver behandling gruppe. N = antall menn, p og t = p-verdi og t-verdi for mannlig behandling, nFID = antall nivåer i den tilfeldige effekten kvinnelig identitet. en egen Ut av 104 mannlige testene utført, 102 ble vellykket registrert, fører til 204 unike menn observert. b2 hanner ble kannibalisert av den kvinnelige før noen gang forlater Petri parabolen. c25 menn ble kannibalisert av den kvinnelige før noen gang frieri den kvinnelige.
| N | Avhengig variabel | P | T | Unmanipulated | ± SE | Malt | ± SE |
| 32en | Mann forsinkelse å forlate parabolen | 0,87 for alle | -0,17 til en | 380,8 for alle | 143,1 for alle | 345,4 for alle | 152,4 for alle |
| 31b | Mannlig forsinkelse til retten | 0,93 for alle | -0,09 til en | 502,6 for alle | 105,8 for alle | 488,1 for alle | 116,6 for alle |
| 31b | Mann frieri innsats | 0,74 for alle | -0,33 til en | 2324,3 for alle | 455,0 for alle | 2102,1 for alle | 484,4 for alle |
| 31b | Mann frieri innsats før eventuelle angrep | 0,68 for alle | 0,42 for alle | 1495,1 for alle | 450,8 for alle | 1770,1 for alle | 479,9 for alle |
Tabell 2. Effekt av mannlig ansikt farge manipulasjon på atferd, når malt med rød eller grå emalje maling (n = 15, Figur 4) vs. unmanipulated menn (n = 17). Strukturen i hver modell er gitt, samt gjennomsnittlig anslag i sekunder (± SE) for hver behandling gruppe. N = antall hanner, p og t = p-verdi og t-verdi for mannlig behandling. en17 unmanipulated hanner ble sammenlignet med en undergruppe av alle malte menn i eksperimentet vårt (n = 221). Nærmere bestemt ble de sammenlignet med 15 malte hanner (5 røde (figur 2a), 5 røde og grå (figur 2b), og 5 grå (figur 2C)) testet i samme sammenheng (i nærvær av en kvinnelig) og i samme spesifikke tidsperiode. Dette er viktig fordi unmanipulated menn ble testet mot slutten av eksperimentet (i august og september 2018), som tilsvarer slutten av deres naturlige avl sesongen og hvor menn er generelt mindre aktive. Holde alle disse andre variablene lik tillater oss å sammenligne maleriet behandling uten å innføre andre fordommer. b En mannlig (alle grå) var kannibalisert før noen gang frieri den kvinnelige.
Discussion
Her viser vi at fargene i bittesmå kroppsdeler av leddyr kan effektivt manipuleres ved hjelp av fargestoffer som makeup og emalje maling.
Det for det første betenkelig steg å oppnå slik delikat manipulasjon er å bli kjøpedyktig nakkens liten dyrene det vanligvis kan ikke være behersket inne ettall ' hånd. Her, for å kunne male sensitive områder som hopping edderkopp ansikt, anesthetized vi individer med CO2 og montert dem på hodet av en PIN. Dette gjør at arbeidet nær edderkoppen øyne med mindre stress enn edderkoppen ville trolig oppleve hvis det var våken (med lys fra mikroskopet skinner inn i ansiktene deres under maleriet prosessen).
Metoden krever også får god kvalitet mikro børster, og mest kritisk, passende coloring stoffer. Det vanskeligste trinnet i å påføre maling uten søl, men med god dekning er å få riktig konsistens. Derfor må fargestoffene være lett fortynnet med en tynnere, og lett tørket ut for tykkelse. Ulike typer maling kan brukes; her, resultatene er presentert med vannløselige (ikke-vanntett) eyeliners og emalje maling. Ikke-vanntett eyeliners har fordelen av å være lett flytende når den blandes med vann. Men dette handler av med fortynning av pigmentering (som kanskje ikke eller kan være ønskelig (se for eksempel Figur 3)). Emalje maling har en konsistens som lett kan styres ved å legge emalje tynnere, samtidig som det gir full dekning. Men denne karakteristiske handler av med mulighet for å opprettholde hår eller skalere strukturen i kroppen del malt. I tillegg er emalje maling langvarig. Ulempen med dette er at emalje maling og tynnere avgir sterke lukter under påføring og før tørking. En ekstra vanskelighetsgrad om farging stoffer kan være å finne den rette skyggen, med rett Spectral egenskaper. Det er for eksempel vanskelig å få rød eyeliner til å bruke parallelt med svart eyeliner, som eyeliners er ofte mer rosa enn rødt. Det er også vanskelig å få sminke pulver (eller pigmenter) som ikke inneholder noen glitter (som noen ganger kan være bare synlig under mikroskopet). Mange makeup produkter reflekterer også UV-lys som, mens usynlig for forskere, kan være iøynefallende for dyrene studert.
Manipulering av farging av leddyr ved direkte bruk fargestoffer på deres kroppsdeler kommer med fordeler og ulemper sammenlignet med andre metoder. Dens viktigste begrensningen er at man ikke kan absolutt avvise muligheten for noen subtile toksisitet effekter. Imidlertid kan man sikre ikke å innføre skjevheter mot en behandling gruppe ved å bruke maling til alle behandlings kategorier, og/eller man kan teste om malingen forstyrrer atferd av interesse. Med metodene som presenteres her, samlet vi nok bevis til å antyde at malingen programmet førte til ubetydelig til ingen negativ effekt (tabell 1 og tabell 2). Den største fordelen med denne metoden er at små flekker av farge kan være målrettet, deres farge "fjernet" (se figur 2), laget duller (Figur 3) eller lysere (Figur 4), isolert fra resten av kroppen farging og individets Miljø. Dette kontraster med den vanligste alternative metoden som består av å manipulere lysforholdene, og dermed endre det visuelle utseendet til hele den enkelte og dens omgivelser. Faktisk, selv når det ikke spesifikt manipulere lysforhold, kan man med hell manipulere farge og se begrenset eller ingen effekter av denne manipulasjon Hvis belysningen miljøet ikke er hensiktsmessig39. Derfor er det viktig å måle og vurdere lys miljøet der noen eksperimenter vil bli gjennomført (dvs. måle Irradians) og sørg for å matche det til naturlige lysforhold (for eksempel ved hjelp av full spektrum lyspærer som etterligner naturlig lys i fangenskap). Overall, ved hjelp av mikro børster og et mikroskop, tillater denne protokollen for mer presis manipulering av ørsmå farge flekker enn de fleste andre direkte coloring metoder som har blitt brukt tidligere på virvelløse dyr. De fleste tidligere studier har brukt dyr med farge flekker som er relativt store i forhold til ansiktene til hopping edderkopper (f. eks manipulasjon av Butterfly Wing Colors29,34,35, likene av voksen hemipterans (' true bugs ')30,36 og gresshopper31, eller bena av relativt store ulv edderkopper32,33,37). Metodene som presenteres her åpner opp muligheter til å studere det fantastiske mangfoldet av farge flekker på dyr som er lite studert på grunn av sin lille størrelse.
Lignende teknikker kan brukes på andre leddyr som kan være immobilisert eller anesthetized og for områder der malingen ikke ville påvirke mobiliteten eller helsen til den enkelte (dvs. ekskludere områder som ledd, strukturer som hår eller arolia som er nødvendig for passende bevegelse, munndeler eller andre orifices som puste konstruksjoner). Disse teknikkene kan også utvides til å omfatte en større palett av fargestoffer, maling og makeups som er allment tilgjengelig.
Til slutt kan disse delikate teknikkene brukes ikke bare til å manipulere farge på små organismer, men også å manipulere mønstre (for eksempel striper) i relativt større organismer. Dette bør være fordelaktig for en rekke forskere som kan tilpasse våre metoder til egne studier av seksuelle valg, kommunikasjon, aposematic byttedyr signaler, og andre sammenhenger der dyrene bruker farge.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra National Science Foundation (IOS-1557867 til LAT), Florida Museum of Natural History, og entomologi og Nematology Department ved University of Florida. Publisering gebyr av denne artikkelen ble finansiert delvis av University of Florida Open Access Publishing Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CO2 tank | AirGas (Radnor, PA) | #CD 50 | to anesthesize spiders |
| Enamel paint thinner | Testors (Vernon Hills, IL) | 75611792569 | to thin enamel paint |
| Flat enamel paint | Testors (Vernon Hills, IL) | red: 075611115009, black: 075611114903, white: 075611116808 | can be thinned with enamel paint thinner |
| Light microscope | Zeiss (Jena, Germany) | stemi 508 | to paint small areas with precision |
| Light microscope camera | Zeiss (Jena, Germany) | Axiocam 105 color | to take picture before and after manipulation for documentation |
| Light microscope camera software | Zeiss (Jena, Germany) | Zen 2 blue edition | to process pictures taken before and after manipulation |
| Liquid liner eyeliner, shade “Perversion” | Urban Decay (Costa Mesa, CA) | (discontinued) | non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 2 |
| MegaLiner liquid eyeliner, black | WetnWild (Los Angeles, CA) | SKU# 871A | non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 1 |
| Micro brushes | MicroMark (Berkeley Heights, NJ) | #84648 | to allow precise painting of small areas |
| Non-hardening modelling clay | Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC) | 18165 | to stick small nail or insect pin in and flexily adjust their angles |
| Small nail or insect mounting pins | BioQuip (Rancho Dominguez, CA) | #1208B7 | to glue spiders on as well as moving away spider’s appendages in front of the area to paint |
| Small plastic containers such as the lids of snap-cap insect collection vials | BioQuip (Rancho Dominguez, CA) | #8912 | to mix paint and thinner to the right consistency |
| Small syringe | Fisher Scientific | 1482910F | to transfer small amount of enamel thinner |
| Spectralon white standard | Labsphere Inc. (North Sutton, NH) | WS-1-SL | to measure spectral properties of colors |
| UV-VIS spectrophotometer | Ocean Optics (Dunedin, FL) | USB 2000 (spectrophotometer) with PX-2 (light source) | to measure spectral properties of colors |
| Water soluble school glue | Elmer's (High Point, NC) | #E304 | to mount the spiders onto a nail/pin |
| Wood toothpicks | Up&Up, Target Corporation (Minneapolis, MN) | #253-05-0125 | to transfer drops of enamel paint |
References
- Baeta, R., Faivre, B., Motreuil, S., Gaillard, M., Moreau, J. Carotenoid trade-off between parasitic resistance and sexual display: an experimental study in the blackbird (Turdus merula). Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 275 (1633), 427-434 (2008).
- Ninnes, C. E., Webb, S. L., Andersson, S. Are red bishops red enough? On the persistence of a generalized receiver bias in Euplectes. Behavioral Ecology. 28 (1), 117-122 (2017).
- Mappes, J., Marples, N., Endler, J. A. The complex business of survival by aposematism. Trends in Ecology & Evolution. 20 (11), 598-603 (2005).
- Clark, D. L., Macedonia, J. M., Rowe, J. W., Kamp, K., Valle, C. A. Responses of Galápagos Lava Lizards (Microlophus bivittatus) to Manipulation of Female Nuptial Coloration on Lizard Robots. Herpetologica. 73, (2017).
- Finkbeiner, S. D., Briscoe, A. D., Reed, R. D. Warning signals are seductive: Relative contributions of color and pattern to predator avoidance and mate attraction in Heliconius butterflies. Evolution. 68 (12), 3410-3420 (2014).
- Moore, M. P., Martin, R. A. Intrasexual selection favours an immune-correlated colour ornament in a dragonfly. Journal of Evolutionary Biology. 29 (11), 2256-2265 (2016).
- Nokelainen, O., Valkonen, J., Lindstedt, C., Mappes, J. Changes in predator community structure shifts the efficacy of two warning signals in Arctiid moths. Journal of Animal Ecology. 83 (3), 598-605 (2014).
- Yewers, M. S. C., Pryke, S., Stuart-Fox, D. Behavioural differences across contexts may indicate morph-specific strategies in the lizard Ctenophorus decresii. Animal Behaviour. 111, 329-339 (2016).
- Baldwin, J., Johnsen, S. The male blue crab, Callinectes sapidus, uses both chromatic and achromatic cues during mate choice. The Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1184 (2012).
- Künzler, R., Bakker, T. C. M. Female preferences for single and combined traits in computer animated stickleback males. Behavioral Ecology. 12 (6), 681-685 (2001).
- Landmann, K., Parzefall, J., Schlupp, I. A sexual preference in the Amazon molly, Poecilia formosa. Environmental Biology of Fishes. 56 (3), 325-331 (1999).
- Nelson, X. J., Jackson, R. R. A predator from East Africa that chooses malaria vectors as preferred prey. PLoS ONE. 1 (1), e132 (2006).
- Bajer, K., Molnár, O., Török, J., Herczeg, G. Female European green lizards (Lacerta viridis) prefer males with high ultraviolet throat reflectance. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (12), 2007-2014 (2010).
- Gerlach, T., Sprenger, D., Michiels, N. K. Fairy wrasses perceive and respond to their deep red fluorescent coloration. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 281 (1787), 20140787 (2014).
- Girard, M. B., Elias, D. O., Kasumovic, M. M. The role of red coloration and song in peacock spider courtship: insights into complex signaling systems. Behavioral Ecology. 29 (6), 1234-1244 (2018).
- Lim, M. L. M., Land, M. F., Li, D. Sex-specific UV and fluorescence signals in jumping spiders. Science. 315 (5811), 481 (2007).
- Xu, M., Fincke, O. M. Ultraviolet wing signal affects territorial contest outcome in a sexually dimorphic damselfly. Animal Behaviour. 101, 67-74 (2015).
- Hill, G. E., McGraw, K. J. Bird coloration: function and evolution. 2, Harvard University Press. 137-200 (2006).
- Chaine, A. S., Roth, A. M., Shizuka, D., Lyon, B. E. Experimental confirmation that avian plumage traits function as multiple status signals in winter contests. Animal Behaviour. 86 (2), 409-415 (2013).
- Hasegawa, M., Arai, E. Experimentally reduced male ornamentation increased paternal care in the Barn Swallow. Journal of Ornithology. 156 (3), 795-804 (2015).
- Lawes, M. J., Pryke, S. R., Andersson, S., Piper, S. E. Carotenoid status signaling in captive and wild red-collared widowbirds: independent effects of badge size and color. Behavioral Ecology. 13 (5), 622-631 (2002).
- Quesada, J., et al. Plumage coloration of the blue grosbeak has no dual function - A test of the armament-ornament model of sexual selection. The Condor. 115 (4), 902-909 (2013).
- Safran, R. J., et al. The maintenance of phenotypic divergence through sexual selection: An experimental study in barn swallows Hirundo rustica. Evolution. 70 (9), 2074-2084 (2016).
- Tringali, A., Bowman, R. Plumage reflectance signals dominance in Florida scrub-jay, Aphelocoma coerulescens, juveniles. Animal Behaviour. 84 (6), 1517-1522 (2012).
- Jerónimo, S., et al. Plumage color manipulation has no effect on social dominance or fitness in zebra finches. Behavioral Ecology. 29 (2), 459-467 (2018).
- Hill, G. E. Plumage coloration is a sexually selected indicator of male quality. Nature. 350 (6316), 337-339 (1991).
- Wolfenbarger, L. L. Female mate choice in northern cardinals: is there a preference for redder males? The Wilson Bulletin. 111 (1), 76-83 (1999).
- ten Cate, C., Verzijden, M. N., Etman, E. Sexual imprinting can induce sexual preferences for exaggerated parental traits. Current Biology. 16 (11), 1128-1132 (2006).
- Davis, A. K., Cope, N., Smith, A., Solensky, M. J. Wing color predicts future mating success in male monarch butterflies. Annals of the Entomological Society of America. 100 (2), 339-344 (2007).
- Exnerová, A., et al. Avoidance of aposematic prey in European tits (Paridae): learned or innate? Behavioral Ecology. 18 (1), 148-156 (2006).
- Forsman, A., Appelqvist, S. Visual predators impose correlational selection on prey color pattern and behavior. Behavioral Ecology. 9 (4), 409-413 (1998).
- Hebets, E. A. Subadult experience influences adult mate choice in an arthropod: exposed female wolf spiders prefer males of a familiar phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (23), 13390 (2003).
- Hebets, E. A., Cuasay, K., Rivlin, P. K. The role of visual ornamentation in female choice of a multimodal male courtship display. Ethology. 112 (11), 1062-1070 (2006).
- Kingsolver, J. G. Experimental manipulation of wing pigment pattern and survival in western white butterflies. The American Naturalist. 147 (2), 296-306 (1996).
- Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. In the eyes of the beholders: Female choice and avian predation risk associated with an exaggerated male butterfly color. The American Naturalist. 176 (6), 768-784 (2010).
- Prudic, K. L., Skemp, A. K., Papaj, D. R. Aposematic coloration, luminance contrast, and the benefits of conspicuousness. Behavioral Ecology. 18 (1), 41-46 (2006).
- Rutledge, J. M., Miller, A., Uetz, G. W. Exposure to multiple sensory cues as a juvenile affects adult female mate preferences in wolf spiders. Animal Behaviour. 80 (3), 419-426 (2010).
- Taylor, L. A., Clark, D. L., McGraw, K. J. Natural variation in condition-dependent display colour does not predict male courtship success in a jumping spider. Animal Behaviour. 93, 267-278 (2014).
- Taylor, L. A., McGraw, K. J. Male ornamental coloration improves courtship success in a jumping spider, but only in the sun. Behavioral Ecology. 24 (4), 955-967 (2013).
- Foelix, R. Biology of spiders. Third edn. , Oxford University Press. (2010).
- Taylor, L. A., Clark, D. L., McGraw, K. J. Condition dependence of male display coloration in a jumping spider (Habronattus pyrrithrix). Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1133-1146 (2011).
- Taylor, L. A., Maier, E. B., Byrne, K. J., Amin, Z., Morehouse, N. I. Colour use by tiny predators: jumping spiders show colour biases during foraging. Animal Behaviour. 90, 149-157 (2014).
- Bates, D., Maechler, M., Bolker, B., Walker, S. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. https://www.R-project.org (2018).
