Summary
Questo articolo descrive un metodo per identificare le alterazioni clonali e subclonali tra campioni diversi di un determinato paziente. Anche se gli esperimenti qui descritti si concentrano su un tipo di tumore specifico, l'approccio è ampiamente applicabile ad altri tumori solidi.
Abstract
Valutare l'eterogeneità intra-tumorale (ITH) è di fondamentale importanza per anticipare il fallimento delle terapie mirate e progettare strategie antitumorali di conseguenza efficaci. Anche se le preoccupazioni sono spesso sollevate a causa delle differenze nell'elaborazione del campione e nella profondità della copertura, il sequenziamento di prossima generazione dei tumori solidi ha svelato un grado altamente variabile di ITH in tutti i tipi di tumore. Catturare la correlazione genetica tra le lesioni primarie e metastatiche attraverso l'identificazione delle popolazioni clonali e subclonali è fondamentale per la progettazione di terapie per le malattie in fase avanzata. Qui, riportiamo un metodo per l'analisi delle lesioni comparative che consente l'identificazione delle popolazioni clonali e subclonali tra campioni diversi dello stesso paziente. L'approccio sperimentale qui descritto integra tre approcci consolidati: analisi istologica, sequenziamento multi-lesiona ad alta copertura e analisi immunofenotipiche. Al fine di ridurre al minimo gli effetti sulla rilevazione di eventi subclonali mediante un'elaborazione inappropriata dei campioni, abbiamo sottoposto i tessuti a un attento esame patologico e all'arricchimento delle cellule neoplastiche. Il DNA controllato dalla qualità delle lesioni neoplastiche e dei tessuti normali è stato poi sottoposto a sequenziamento ad alta copertura, mirando alle regioni di codifica di 409 geni tumorali rilevanti. Sebbene solo guardando uno spazio genomico limitato, il nostro approccio consente di valutare l'entità dell'eterogeneità tra alterazioni somatiche (mutazioni a singolo nucleotide e variazioni del numero di copie) in lesioni distinte da un determinato paziente. Attraverso un'analisi comparativa dei dati di sequenziamento, siamo stati in grado di distinguere le alterazioni clonale e subclonali. La maggior parte dell'ITH è spesso attribuita alle mutazioni dei passeggeri; pertanto, abbiamo anche usato l'immunoistochimica per prevedere le conseguenze funzionali delle mutazioni. Mentre questo protocollo è stato applicato a un tipo di tumore specifico, prevediamo che la metodologia qui descritta è ampiamente applicabile ad altri tipi di tumore solido.
Introduction
L'avvento del sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha rivoluzionato il modo in cui i tumori vengono diagnosticati e trattati1. NGS accoppiato al sequenziamento multiregionale hanno esposto un alto grado di eterogeneità intra-tumorale (ITH) in tumori solidi2, che spiega in parte il fallimento della terapia mirata a causa della presenza di subcloni con diversa sensibilità farmacologica2 . Una sfida importante posta dagli studi di sequenziamento a livello di genoma è la necessità di distinguere tra mutazioni passeggeri (cioè neutre) e del conducente nei singoli tumori3. Diversi studi hanno infatti dimostrato che, in alcuni tumori, le mutazioni dei passeggeri rappresentano la maggior parte dello ITH, mentre le alterazioni del conducente tendono ad essere conservate tra le lesioni dello stesso individuo4. È anche importante notare che un grande onere mutazionale (come si è visto nei tumori polmonari e nel melanoma) non implica necessariamente un grande onere mutazionale subclonale2. Pertanto, un alto grado di ITH può essere trovato in tumori con basso carico mutazionale.
Le metastasi sono responsabili di oltre il 90% della morte per cancro in tutto il mondo5; pertanto, catturare l'eterogeneità mutazionale dei geni del conducente tra lesioni primarie e metastatiche è fondamentale per la progettazione di terapie efficaci per le malattie in fase avanzata. Il sequenziamento clinico viene generalmente eseguito su acidi nucleici provenienti da tessuti fissi, il che rende difficile l'esplorazione in tutta il genoma a causa della scarsa qualità del DNA. D'altra parte, l'intento del sequenziamento clinico è quello di identificare mutazioni e/o mutazioni utilizzabili che potrebbero prevedere la reattività/non risposta a un determinato regime terapeutico. Così com'è, il sequenziamento può essere limitato a una frazione minore del genoma per l'estrazione tempestiva di informazioni clinicamente rilevanti. La transizione dalla profilazione del DNA a bassa velocità (ad esempio, Sanger Sequencing) a NGS ha reso possibile analizzare centinaia di geni rilevanti per il cancro ad un'elevata profondità di copertura, il che consente il rilevamento di eventi subclonali. Qui, riportiamo un metodo per l'analisi delle lesioni comparative che consente l'identificazione delle popolazioni clonali e subclonali tra campioni diversi dallo stesso individuo. Il metodo qui descritto integra tre approcci consolidati (analisi istologica, sequenziamento multi-lesiona ad alta copertura e analisi immunofenotipiche) per prevedere le conseguenze funzionali delle variazioni identificate. L'approccio è schematicomente descritto nella Figura 1 ed è stato applicato allo studio di 5 casi metastatici di neoplasmi pseudoppillari (STEN) solidi del pancreas. Mentre descriviamo l'elaborazione e l'analisi di campioni di tessuto incorporato in paraffina fissata a formalina (FFPE), la stessa procedura può essere applicata al materiale genetico proveniente da tessuto fresco congelato.
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Protocol
Il materiale utilizzato nello studio è stato raccolto nell'ambito di un protocollo specifico, che è stato approvato dal comitato etico locale. Era disponibile il consenso informato scritto da parte di tutti i pazienti.
1. Revisione istologica e immunofenotipica dei campioni di tessuto
NOTA: Un patologo esperto è responsabile delle attività descritte di seguito.
- Revisione istopatologica dei casi selezionati secondo criteri diagnostici ben consolidati.
- Utilizzare il microtoma per tagliare sezioni di tessuto spesso 4x5 m da blocchi di tessuto FFPE rappresentativi e montare le sezioni su vetrini di istologia standard.
- Eseguire la colorazione ematossilina ed eosina per ogni diapositiva utilizzando una scala di scorrimento di tessuto automatizzato (Tabella dei materiali).
- Rivedere la diagnosi istopatologica dei casi tumorali selezionati in base ai criteri diagnostici dell'OMS.
NOTA: In questa fase, il patologo potrebbe identificare aree morfologicamente distinte del tumore all'interno della stessa sezione di tessuto. È possibile raccogliere tali aree separatamente (cfr. sezione 2). La somiglianza istologica del tumore e delle cellule normali per gli SPN è riportata nella figura 2. - Eseguire la colorazione immunoistochimica per marcatori stabiliti per integrare l'analisi istologica e stimare l'eterogeneità immunofenotipica.
NOTA: Il patologo potrebbe identificare aree immunofenotipicamente distinte del tumore all'interno della stessa sezione tissutale. È possibile raccogliere tali aree separatamente (cfr. sezione 2).
- Valutare l'cellularità neoplastica della sezione del tessuto tumorale e pianificare di conseguenza la microdissezione manuale.
NOTA: Questa è una stima generata dal patologo della cellularità tumorale.- Se il contenuto di cellule neoplastiche della sezione tissutale è superiore al 70%, la microdissezione manuale non è obbligatoria; passare direttamente al punto 3.1.
NOTA: target il 70% del contenuto di cellule neoplastiche al fine di (i) garantire un'adeguata sensibilità per le stime di frequenza allele mutanti e (ii) per convalidare eventualmente le mutazioni clonali con metodologie meno sensibili (ad esempio, sequenziamento capillare). - Se il contenuto di cellule neoplastiche della sezione tissutale è inferiore al 70%, la microdissezione è necessaria e passare al passaggio 2.
- Se il contenuto di cellule neoplastiche della sezione tissutale è superiore al 70%, la microdissezione manuale non è obbligatoria; passare direttamente al punto 3.1.
- Valutare le sezioni tissutali del blocco FFPE in cui è stato campionato il tessuto non neoplastico. Questo tessuto è usato come fonte di DNA germinale.
NOTA: Il sangue è una fonte alternativa di DNA germinale. In questo caso, procedere con l'estrazione del DNA come consigliato nella nota del passo 4.1.- Se solo il tessuto non neoplastico è visibile nella sezione dei tessuti (Figura 2D), la microdissezione manuale non è necessaria; passare direttamente al punto 3.1.
- Se nella sezione dei tessuti è presente una sostanziale contaminazione da cellule neoplastiche, è necessaria una microdissezione manuale; passare alla sezione 2.
2. Microdisezione manuale
NOTA: Questo metodo è applicabile a vari tipi di tumore solido, ed è destinato ad aumentare il contenuto di cellule neoplastiche di campioni di tessuto. In alternativa, questo metodo può essere utilizzato per raccogliere aree morfologicamente e/o immunofenotipicamente distinte all'interno della stessa sezione tissutale.
- Utilizzando un microtoma, tagliare fino a dieci sezioni di tessuto tumorale FFPE di spessore 4,6 m e montarle su vetrini non caricati.
NOTA: Se nel campione è visibile solo un nido di 1 mm2, 10 vetrini devono essere tagliati e sottoposti a microdissezione manuale per ottenere la quantità mirata di DNA (40 ng); questo supponendo che 1 mm2 cluster contiene tra 700 e 1000 nuclei tumorali. - Incubare i vetrini a 60 gradi centigradi per 10 min.
- Mettere i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti oli: xilene per 20 min, 100% etanolo per 10 min, 80% etanolo per 10 min, 70% etanolo per 10 min, acqua distillata per 1 min, acqua distillata per 1 min, ematoxilina per 10 s, acqua del rubinetto per 1 min.
- Su un microscopio invertito standard, utilizzare un ago da 27 G su una siringa come strumento di microdissezione e raccogliere cluster rappresentativi di cellule tumorali. Raccogliere un minimo di dieci 1 mm2 cluster di cellule per garantire la quantità necessaria di DNA per il sequenziamento.
NOTA: Se le aree morfologicamente distinte sono destinate ad essere analizzate come entità diverse, utilizzare lo strumento microdissezione per raccogliere tali aree separatamente. - Collocare i cluster raccolti in tubi da 1,5 mL (Tabella dei Materiali) precedentemente riempiti con 20 gradi di proteasi K e 180 l di tampone di lisi ( Tabella deimateriali, entrambi inclusi nel kit di estrazione del DNA) e mescolare mediante vortice.
3. Elaborazione di tessuti senza microdissezione precedente
NOTA: Questa procedura viene utilizzata per i blocchi di tessuto che contengono solo cellule non neoplastiche (fonte di DNA germinale) o contengono almeno il 70% delle cellule tumorali morfologicamente omogenee.
- Utilizzando un microtoma tagliato fino a sei sezioni di tessuto spesso 4x5 m da blocchi di tessuto FFPE selezionati. Posizionare le pergamene dei tessuti in tubi da 1,5 mL come descritto al punto 2.5.
4. Estrazione del DNA da cellule normali e neoplastiche
- Purificare il DNA dal tessuto normale e neoplastico utilizzando il kit di estrazione dei tessuti DNA FFPE (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: Quando il sangue viene utilizzato come fonte di acido nucleico germinale, purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del sangue del DNA (Tabella dei materiali). - Quantificazione del DNA e controllo di qualità
- Per quantificare la quantità di doppia filamento (dsDNA), aggiungere un'aliquota del campione di DNA a una soluzione contenente una macchia di acido nucleico fluorescente (Tabella dei materiali) e misurare la fluorescenza emessa utilizzando un fluorometro da banco ( Tabella dei materiali ) e misurare la fluorescenza emessa utilizzando un fluorometro da banco ( Tabella deimateriali ).
NOTA: Il test misura l'intensità del segnale fluorescente emesso da coloranti fluorescenti attaccati a dsDNA e determina la quantità di DNA utilizzando una curva standard. - Utilizzare uno spettrofotometro a microvolume (Tabella dei materiali) per misurare i rapporti 260/280 e 260/230 del campione per qualificare il DNA. Il DNA "puro" dovrebbe avere un 260/280 di 1,8 e un 260/230 compreso tra 1,8 e 2,2.
NOTA: La valutazione spettrofotometrica del campione ha lo scopo di dimostrare la presenza di contaminanti chimici (ad esempio, fenolo) che influiscono sulle reazioni a valle. In caso di contaminazione dovuta a reagenti chimici, eseguire una fase di pulizia utilizzando un kit basato su colonne.
- Per quantificare la quantità di doppia filamento (dsDNA), aggiungere un'aliquota del campione di DNA a una soluzione contenente una macchia di acido nucleico fluorescente (Tabella dei materiali) e misurare la fluorescenza emessa utilizzando un fluorometro da banco ( Tabella dei materiali ) e misurare la fluorescenza emessa utilizzando un fluorometro da banco ( Tabella deimateriali ).
5. Preparazione e quantificazione della biblioteca
NOTA: il diagramma di flusso schematico delle fasi di preparazione e quantificazione della libreria è riportato nella figura 3.
- Preparazione della libreria del DNA (4 pool di primer allestiti per ogni campione)
NOTA: Le 4 piscine di primer appartengono al pannello del cancro riportatoTabella dei materiali. Ogni piscina contiene coppie di primer che sono progettati per una selezione bersaglio multiplexed di 409 geni. Un link all'elenco dei geni che compongono il pannello NGS è fornito inTabella dei materiali.- Preparare quattro reazioni di amplificazione del bersaglio del DNA per ogni campione, uno per pool di primer. Per ogni pooldiprimer ( Table of Materials ), aggiungere in un tubo da 0,2 mL (Tabella dei materiali): 4 -L di master mix (Tabella dei materiali, incluso nel kit di libreria), 10 -L di miscela di piscine primer ad alta fedeltà ( Tabella deimateriali, incluso nel libreria del pannello contro il cancro) e 6 ldi di DNA (10 ng in totale).
- Amplifica le regioni di destinazione di ciascuna piscina di primer separatamente in quattro tubi da 1,5 mL che eseguono il seguente programma: tenere a 99 gradi per 2 min (attivazione della polimerasi di avvio caldo), 16 cicli (denaturare a 99 gradi centigradi per 15 s, anneal ed estendere a 60 s per 8 min) , tenere premuto a 4 gradi centigradi.
NOTA: punto di arresto. Conservare le reazioni di amplificazione bersaglio a 4 gradi centigradi o a -20 gradi centigradi per un tempo più lungo. - La digestione parziale delle estremità degli amplificatori
NOTA: Il manuale fornito dal kit produttore NGS prevede un passo in cui le diverse reazioni di amplificazione da ogni campione vengono combinate prima della digestione parziale. Evitare questo passaggio e continuare a elaborare ogni digestione dell'amplificazione separatamente.- Aggiungere 2 -L di miscela di digestione specifica (Tabella dei materiali, incluso nel kit di libreria) ad ogni pool amplificato di ogni campione (il volume totale di ogni tubo da 0,2 mL è 22). Vorticare accuratamente e centrifugare ogni tubo per raccogliere goccioline.
- Caricare i tubi nel ciclore termico ed eseguire il seguente programma: 50 S per 10 min, 55 Gradi centigradi per 10 min, 60 gradi centigradi per 20 min, 10 gradi centigradi (fino a 1 h).
NOTA: punto di arresto. Conservare la piastra a -20 gradi centigradi per periodi più lunghi.
- Ligate adattatori per amplificare e purificare.
NOTA: utilizzare un adattatore di codice a barre diverso per ogni campione quando si sequenziano più librerie su un singolo chip. Tutte e quattro le reazioni di amplificazione dello stesso campione devono ricevere lo stesso codice a barre.- Preparare adattatori (Tabella dei materiali, kit di adattatori per codici a barre). Per ogni codice a barre X, preparare una combinazione di adattatori P1 e adattatori di codice a barre unici (Tabella dei materiali) con una diluizione finale di 1:4. Mescolare 4 l'acqua con 2 l'audio dell'adattatore P1 e 2 l. di adattatori di codici a barre unici. Utilizzare 2 l di questa combinazione di adattatori di codici a barre per i passaggi a valle.
- Eseguire la reazione di legatura aggiungendo ad ogni pool amplificato di ogni campione in questo ordine: 4 l. di soluzione switch (Tabella dei materiali, incluso nel kit di libreria), 2 l of bar adapter mix e 2 l di DNA ligase(Tabella dei materiali, incluso in il kit della biblioteca) (volume totale : 30 l).
- Vorticare accuratamente e brevemente centrifugare per raccogliere goccioline.
- Caricare ogni tubo nel ciclore termico ed eseguire il seguente programma: 22 s per 30 min, 68 S per 5 min, 72 S per 5 min, 4 gradi centigradi (fino a 24 h).
NOTA: punto di arresto. Conservare la piastra a -20 gradi centigradi per periodi più lunghi.
- Purificazione e amplificazione della biblioteca
- Centrifugare ogni tubo e quindi trasferire ogni campione con codice a barre in un tubo da 1,5 mL. Aggiungete 45 l di reagente di purificazione a base di perline (Tabella dei materiali) ad ogni pool di ogni campione. Pipet su e giù 5x per mescolare la sospensione del tallone con il DNA.
- Incubare il composto per 5 min a temperatura ambiente (RT), quindi posizionare ogni tubo in un rack magnetico e incubare per 2 min. Rimuovere e scartare con attenzione supernatante senza disturbare il pellet.
- Aggiungere in ogni tubo 150 l di fresco 70% etanolo. Lavare le perline muovendo ogni tubo da un lato all'altro delle due posizioni del magnete. Scartare il supernatante e prestare attenzione a non disturbare il pellet.
- Ripetere le procedure descritte nel passaggio 5.1.5.3, quindi mantenere i tubi nel magnete e asciugare all'aria le perline a RT per 5 min.
- Rimuovere i tubi con librerie purificate di ogni piscina di primer dal magnete e aggiungere 50 -L di miscela PCR ad alta fedeltà (Tabella dei materiali) e 2 l of library amplificazione primer mix ( Tabella deimateriali, incluso nel kit di libreria) per il pellet di perline di per ogni tubo.
- Vorticare ogni tubo da 1,5 ml e centrifugare brevemente per raccogliere goccioline.
- Mettere 1,5 mL di tubi nel magnete per 2 min e trasferire con attenzione il supernatanto (50 dollari l) da ogni tubo a un nuovo tubo da 0,2 mL senza disturbare il pellet.
- Amplificare le librerie di ogni pool di primer che eseguono il seguente programma: tenere a 98 gradi centigradi per 2 minuti per attivare l'enzima, 5 cicli (denaturaa a 98 gradi centigradi per 15 s, anneal ed estendere a 64 gradi centigradi), tenere a 4 gradi centigradi. Conservare i campioni a -20 gradi centigradi.
- Purificazione della biblioteca amplificata
- Centrifugare ogni tubo per raccogliere il contenuto nella parte inferiore e trasferire ogni campione di libreria amplificata in un tubo da 1,5 mL.
- Aggiungere 25 -L di purificatione a base di perline. Pipet su e giù 5x per mescolare la sospensione del tallone con il DNA.
- Incubare il composto per 5 min a RT, quindi mettere i tubi nel magnete per 5 min.
- Trasferire con attenzione il supernatante, che contiene gli amplicons, da ogni tubo a nuovi tubi senza disturbare il pellet.
- Aggiungere 60 l di reagente di purificazione a base di perline al supernatore di ogni tubo e pipet su e giù al fine di mescolare sospensione del tallone e DNA.
- Incubare il composto per 5 min a RT e quindi mettere i tubi nel magnete per 3 min.
- Scartare il supernatante da ogni tubo e prestare attenzione a non disturbare il pellet.
NOTA: gli amplificatori sono legati alle perline. - Aggiungere in ogni tubo 150 l di fresco 70% etanolo. Lavare le perline muovendo i tubi da un lato all'altro nelle due posizioni del magnete. Scartare il supernatante e prestare attenzione a non disturbare il pellet.
- Ripetere la procedura nel passaggio 5.1.6.8 e asciugare all'aria le perline a RT per 3 min. Evitare un'eccessiva essiccazione delle perline.
- Togliere i tubi dal magnete e aggiungere 50 - L di basso Tris EDTA (TE) (Tavolo dei materiali, incluso nel kit di libreria) al pellet per disperdere le perline.
- Pipet la miscela su e giù più volte e incubare a RT per 2 min.
- Posizionare i tubi nel magnete per almeno 2 min e trasferire con attenzione il supernatante, che contiene gli amplificatori, a nuovi tubi senza disturbare le perline.
- Quantificazione biblioteca
- Utilizzare uno strumentodianalisi dei frammenti ( Tabella dei materiali ) per eseguire un chip di DNA secondo il protocollo del kit DNA ad alta sensibilità.
6. Esecuzione di pooling e sequenziamento delle librerie
- Diluire ogni biblioteca a 100 pM con acqua priva di nuclenon. Unire 10 librerie da 100 pM per una singola conduzione in un unico tubo. Mescolare le librerie combinate con il pipeting e procedere alla creazione di modelli e sequenzia.
- Creazione pianificata di esecuzione
NOTA: una tipica esecuzione comprende quattro campioni che possono essere caricati su due diversi tipi di chip semiconduttore (chip Ion PI o chip Ion 540) in base al sequencer disponibile in laboratorio (Ion Proton System o GeneStudio S5 System, Table of Materials). Questi sistemi producono in genere 80 milioni di letture per esecuzione.- Aprire il Browser Torrent su un computer collegato al sistema di sequenziamento (ad esempio, Ion Chef System) e pianificare una nuova esecuzione utilizzando il modello generico per l'applicazione selezionata (AmpliSeqDNA).
- Passare alla scheda Kit del piano. Selezionare Ion Proton System o Ion GeneStudio S5 System dall'elenco a discesa degli strumenti in base al sistema di sequenziamento in uso.
- A seconda del sistema di sequenziamento, selezionare il chip appropriato (chip PI per Ion Proton Systems; chip 540 per Ion GeneStudio S5 Systems) dall'elenco a discesa Chip Type .
- Selezionare Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit dall'elenco a discesa Library Kit.
- Selezionare il pulsante Ion Chef per Template Kit, quindi selezionare il kit Chef appropriato (Ion PI Hi-Q Chef Kit per chip PI o Ion 540 Kit-Chef per 540 chip) dall'elenco a discesa Template Kit.
- Selezionare il kit di sequenziamento appropriato (Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit per chip PI o Ion S5 Sequencing Kit per 540 chip) dall'elenco a discesa Kit di sequenziamento, quindi selezionare IonXpress dall'elenco a discesa Set di codici a barre.
- Passare alla scheda Plugin e selezionare il plug-in Analisi copertura.
- Passare alla scheda Piano, selezionare il genoma GRCh37/hg19 dall'elenco a discesa Libreria riferimenti. Dall'elenco a discesa Aree di destinazione, selezionare il pannello appropriato da sequenziare.
- Impostare il numero di codici a barre da sequenziare e l'etichetta dei tubi campione della libreria nei campi appropriati.
- Impostare il nome del codice a barre e il nome di esempio per ogni libreria.
- Librerie di esempio di luito e caricamento.
- Diluire la libreria di stock con acqua priva di nuclenonazione a 25 pM per chip PI o 32 pM per chip 540.
- Pipet 50 - L di ogni libreria diluita sul fondo del tubo campione di libreria appropriata.
- Attivare il sistema di sequenziamento e seguire le istruzioni visualizzate per caricare tutti i reagenti necessari e importare il piano di esecuzione.
- Caricare il tubo di esempio della libreria contenente le librerie in pool e avviare il programma di amplificazione clonale.
NOTA: il sistema Ion Chef richiede due chip da preparare per ogni corsa.
- Sequenziamento su Ion Proton o Ion GeneStudio S5.
- Attivare il sistema di sequenziamento e seguire le istruzioni visualizzate per inizializzare la sequenza e importare il piano di esecuzione.
- Caricare il chip di sequenziamento dopo averlo rimosso dal sistema di sequenziamento .
NOTA: Essere a terra prima di raccogliere un chip per evitare danni al truciolo dovuti a scarica elettrostatica. La gestione/posizionamento dei trucioli insieme agli esempi di caricamento riuscito/non riuscito sono riportati nella Figura 4. - Chiudere il coperchio del vano chip e attendere che l'icona Stato chip indichi "Pronto".
- Svuotare il contenitore dei rifiuti al termine della prima esecuzione, quindi sequenziare il chip rimanente il prima possibile.
7. Analisi delle mutazioni e delle variazioni dei numeri di copia (CNV)
NOTA: l'allineamento dei dati di sequenziamento al genoma di riferimento umano GRCh37/hg19 viene eseguito automaticamente una volta impostato nel piano (passaggio 6.2.8).
- Utilizzare l'output del plug-in Analisi di copertura (Tabella dei materiali) per verificare la profondità di copertura e uniformità.
- Eseguire la chiamata variante utilizzando il plug-in chiamante variante Torrent (Tabella dei materiali), selezionando il flusso di lavoro germinale o somatico in base alle esigenze.
- Scaricare i file variante filtrati Variant Call Format (VCF). Annotare le varianti utilizzando il software VEP (Variant Effect Predictor)6 e il database NCBI RefSeq.
- Caricare i dati di sequenziamento sul software Ion Reporter utilizzando il plug-in di caricamento di Ion Reporter e utilizzare il flusso di lavoro di coppia tumora-normale Comprehensive Cancer Panel per analizzare i dati al fine di stimare CNV.
- Filtra manualmente le mutazioni e i CNV in base ai punteggi assegnati dal software e verificali visivamente con integrative Genomics Viewer (IGV)7.
- Controllare visivamente l'allineamento per letture insolite (a causa, ad esempio, di disdurante, sovraamplificazione o letture soft-clipping) che possono generare chiamate artefatti.
- Verificare i CNV ispezionando la copertura normalizzata per tutti gli ampi di un determinato gene rispetto alla copertura normalizzata della linea di base.
NOTA: Questo aiuta a correggere le false chiamate a causa del software di segmentazione, che a volte chiama una CNV basata su una copertura simmetricamente anormale di pochi amplificatori alla fine di un gene e all'inizio del gene successivo.
- Indicizzazione delle mutazioni somatiche
- Per ogni caso, chiamate di mutazione dell'indice dal sequenziamento del tessuto normale/ sangue, tumore primario e metastasi.
- Bandiera come germinale e scartare le chiamate che sono evidenti anche dai dati di sequenziamento del DNA germinale.
- Bandiera come clonale/fondatore le mutazioni che sono condivise tra tutte le lesioni di un dato paziente.
- Bandiera come subclonale/progresso o le mutazioni che vengono rilevate in alcune ma non tutte le lesioni di un dato paziente.
8. Analisi immunofenotipica: immunohistochimica per l'espressione proteica rilevante
NOTA: L'immunoistochimica è stata utilizzata per convalidare le conseguenze funzionali dell'inattivazione delle mutazioni nei geni soppressori tumorali.
- Utilizzando un microtome, tagliare le sezioni di tessuto FFPE di spessore 3,4 m e montarle su vetrini caricati e incubare i vetrini a 60 gradi centigradi per 10 min.
- Mettere i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti passaggi: xilene per 10 min, xilene per 10 min, 95% etanolo per 4 min, 95% etanolo per 4 min, 70% etanolo per 4 min, 70% etanolo per 4 min, acqua distillata per 4 min.
- Eseguire il recupero dell'antigene in base all'indicazione dei produttori di anticorpi (Tabella dei materiali).
- Mettere i vetrini in un rack con la soluzione specifica di recupero dell'antigene e immergersi in un bagno d'acqua a temperature sotto-ebolliche.
- Rimuovere i vetrini dal bagno e far funzionare l'acqua del rubinetto per raffreddare per 10 min.
- Posizionare i vetrini in un nuovo rack con 3% H2O2 in 1x salina tampo nel buffer Tris (TBS) per 20 min a RT al fine di inattivare perossidi endogene.
- Collocare i vetrini in un nuovo rack e lavare 3x con TBS e lo 0,1% di Tween 20 (TBST).
- Utilizzare una penna PAP (Tabella dei materiali) per disegnare un cerchio idrofobico intorno al tessuto montato su slitta.
- Posizionare i vetrini in una camera umida ed eseguire il blocco per 1 h a RT utilizzando 5% albumin a siero bovino (BSA) in TBST come soluzione di blocco.
- Incubare i vetrini con anticorpi primari (Tabella dei materiali) in una camera umida durante la notte a 4 gradi centigradi. Diluire l'anticorpo primario con la soluzione di blocco come raccomandato.
- Mettere i vetrini in un nuovo rack e lavare 3x con TBST.
- Incuba vetrini con anticorpi secondari specifici (anti-topo o anti-coniglio) (4o5 gocce per 1 scivolo) per 30 min a RT in una camera umida.
- Mettere i vetrini in un nuovo rack e lavare 3x con TBST e dopo in acqua distillata.
- Preparare la soluzione 3,3'-diaminobenzidine (DAB) diluindo 1 goccia in 1 mL di tampone di diluizione (Tabella dei materiali). Incubare i vetrini al massimo per 5 min di controllo al microscopio.
- Utilizzare un controllo positivo per calcolare il tempo di incubazione seguendo lo sviluppo della reazione al microscopio.
NOTA: ogni anticorpo ha bisogno di un tempo di incubazione specifico. - DAB inattivo (temperatura cromogena stop) sommergendo i vetrini nell'acqua distillata.
- Controstain scivoli immergendoli in un nuovo rack con ematossitale per 10 s e poi risciacquare con acqua del rubinetto.
- Mettere i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti passaggi: 70% etanolo per 4 min, 70% etanolo per 4 min, 95% etanolo per 4 min, 95% etanolo per 4 min, xilene per 10 min, xilene per 10 min.
- Sigillare le vetrine mettendo un paio di gocce di supporto di montaggio (Tabella dei materiali) su ogni vetrine del tessuto e coprire con coperchio.
- Applicare la pressione sul coperchio per spostare il mezzo in eccesso e le bolle d'aria lontano dal tessuto e fuori dal coperchio e l'aria secca.
- Valutare e valutare i risultati della colorazione al microscopio invertito con un patologo esperto.
NOTA: Il sistema di punteggio dipenderà dagli antigeni specifici, per i quali le informazioni nella letteratura potrebbero già esistere. Se le informazioni non sono disponibili in letteratura, derivare un sistema di punteggio utilizzando l'espressione dell'antigene nel tessuto normale come riferimento.
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Representative Results
Il flusso di lavoro di studio è illustrato nella Figura 1. Il sequenziamento di 5 casi SPN mirati alle sequenze di codifica di 409 geni correlati al cancro ha identificato un totale di 27 mutazioni somatiche in 8 geni (CTNNB1, KDM6A, BA1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1e FGFR3). Le mutazioni sono state definite come fondatore/clonale quando condivise tra tutte le lesioni di un determinato paziente e progressor/subclonali quando rilevate in alcune ma non in tutte le lesioni di un determinato paziente (Figura 5A,B). Nel complesso, la maggior parte delle mutazioni puntiformi identificate nella coorte erano eventi clonali, che includevano mutazioni di CTNNB1, KDM6A, TET1 e FLT1. Costantemente, la colorazione immunoistochimica per la z-catenina (prodotto proteico di CTNNB1) e La KDM6A era omogenea tra le diverse lesioni dei casi con mutazioni dei geni corrispondenti (Figura 6A,B). La colorazione moderata per KDM6A negli esemplari mutati ha suggerito che l'alterazione genetica avrebbe probabilmente alterato la funzione piuttosto che l'espressione proteica. KDM6Una perdita di funzione nei tumori pancreatici è associata all'upregolazione del marcatore di ipossia GLUT18e di conseguenza GLUT1 è stata sovraespressa nei casi in cui sono state riportate mutazioni KDM6A (Figura 6C). Si è scoperto che le mutazioni subclonali colpiscono BAP1, SMAD4, TP53 e FGFR3. L'immunohistochimica per BAP1 e TP53 ha confermato che le mutazioni in tali geni erano subclonali (Figura 6D,E). L'analisi della variazione del numero di copie (CNV) è stata eseguita utilizzando i dati di sequenziamento e ha rivelato alterazioni in tutti i campioni analizzati come illustrato nella Figura 7A. A differenza delle mutazioni puntiformi, la maggior parte delle alterazioni della CNV erano subclonali (Figura 7B).
Figura 1: Diagramma di flusso dell'analisi condotta sulle lesioni metastatiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentativa istologia dei tessuti normali e tumorali.
(A, B) Tessuto tumorale (T) adiacente al tessuto normale (N). In queste due sezioni tissutali, il tumore e i tessuti normali sono identificabili come aree separate e ben confinate. (C) I cluster delle normali cellule pancreatiche (N) possono essere visti come incorporati all'interno del tessuto tumorale (T). (D) Morfologia del tessuto pancreatico normale. La barra della scala rappresenta 1 mm.
Figura 3: Diagramma di flusso schematico del passaggio del protocollo di preparazione e quantificazione della libreria.
Figura 4: caricamento e funzionamento di chip di protoni ionici.
(A) Direzione del chip e posizionamento nel morsetto del chip (a sinistra). Sostituzione posteriore della linguetta metallica (a destra). (B) Heatmap che mostrano la densità delle librerie in due diversi carichi di chip. Esempio di una buona densità di carico (in alto) grazie ad un'amplificazione clonale di successo delle librerie, con conseguente caricamento del 94% della superficie del chip con particelle di sequenziamento (139 milioni di letture, uscita finale 90 milioni di letture dopo il filtraggio automatico della qualità). Esempio di un carico inadeguato (in basso) a causa di un'amplificazione clonale inefficiente delle librerie, con conseguente caricamento del 40% della superficie del chip con particelle di sequenziamento (59 milioni di letture, uscita finale 12 milioni di letture dopo il filtraggio automatico della qualità).
Figura 5: Alterazioni somatiche nelle lesioni metastatiche.
(A) Mutazioni somatiche identificate in lesioni primarie/metastatiche corrispondenti. (B) Vengono visualizzate mutazioni somatiche totali per caso, comprese le alterazioni condivise tra tutte le lesioni (fondatore/clonale) e quelle rilevate in uno o più campioni, ma non in tutti i campioni per un determinato caso (progressor/subclonal). Viene indicato il numero di singole lesioni metastatiche (m) sequenziate per caso. Questa figura è stata ripubblicata da Amato et al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immunostaining per la catena di z, KDM6A, GLUT1, BAP1 e TP53 nelle lesioni primarie e metastatiche.
(A) Immagini immunohistochimiche rappresentative che mostrano l'accumulo nucleare di z-catenina in tutti gli esemplari (primario e metastatico) da una mutazione portante SPN del CTNNB1. (B) Colorazione immunosintochimica delle lesioni da un SPN metastatico che porta la mutazione clonale di KDM6A. (C) Sovraespressione di GLUT1 in una mutazione KDM6A cuscinetto, mentre non è stata osservata alcuna immunoreattività nel tessuto selvatico. (D, E) I dati delle espressioni BAP1 e TP53 denotano che le mutazioni in questi due geni sono subclonali. Le barre della scala rappresentano 100 m e l'ingrandimento a instagula è 600x. Questa cifra è stata modificata da Amato et al.8.
Figura 7: Modifiche del numero di copia somatico nelle lesioni metastatiche.
(A) La vista virtuale del cariotipo mostra la posizione, la prossimità e lo stato del numero di copia dei geni alterati in un caso rappresentativo. Lo schema di colorazione delle bande cromosomiche è il seguente: nero e grigio - Giemsa positivo, rosso chiaro , centromero, viola e regione variabile. Le alterazioni sono annotate in base ai codici colore presentati in cifre. Abbreviazioni: CNV, copia variazione del numero; P, SPN primario; L(a-c), metastasi epatiche. (B) Vengono visualizzate alterazioni somatiche totali (geni affetti da CNV) per caso, comprese le alterazioni condivise tra tutte le lesioni (fondatore/clonale) e quelle rilevate in uno o più (ma non in tutti) dei campioni per un determinato caso (progressor/subclonal). Viene indicato il numero di singole lesioni metastatiche (m) sequenziate per caso. Questa figura è stata ripubblicata da Amato et al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il nostro metodo consente l'identificazione delle alterazioni molecolari coinvolte nella progressione dei tumori solidi attraverso l'integrazione di dati verticali (ad esempio, morfologia, sequenziamento del DNA e immunosofologia) da lesioni distinte di un determinato paziente. Abbiamo dimostrato la capacità del nostro metodo di rilevare eventi clonali e subclonali in un tipo di tumore silenzioso mutazionale (cioè SPN, neopolismo pseudoppillare del pancreas) interrogando le sequenze di codifica di 409 geni rilevanti per il cancro8. Un vantaggio dell'approccio di sequenziamento mirato basato su amplicon utilizzato in questo caso è l'uniformità della copertura (90% basi target sono coperte 100x, 95% sono coperti 20volte) in tutte le regioni interrogate (15,992) a una profondità media di copertura tipica di 1000x. L'elevata profondità di copertura accoppiata all'arricchimento delle cellule neoplastiche attraverso la microdissezione garantisce un'elevata sensibilità per il rilevamento di eventi a bassa frequenza allelia. Come abbiamo già dimostrato9, l'approccio di sequenziamento mirato consente di rilevare le mutazioni fino a una frequenza allele del 2% su campioni di DNA provenienti da tessuto FFPE. Ad esempio, nel presente lavoro siamo stati in grado di identificare una mutazione di rilevamento delle frequenze alleari del 4% tP53 come evento subclonale in un campione metastatico (Figura 5) e abbiamo convalidato questa occorrenza mediante immunohistochimica (Figura 6). Il nostro protocollo prevede il sequenziamento del tumore abbinato e del DNA germinale al fine di identificare gli eventi somatici e di conseguenza ridurre il falso tasso di rilevamento delle mutazioni subclonali dell'oleodotto solo cancro10. Quando il DNA germinale corrispondente non è disponibile, si potrebbe considerare l'adozione di parametri più conservativi nell'analisi dei dati di sequenziamento, compresi i filtri rigorosi basati sulla profondità minima di copertura, nonché la limitazione delle varianti che chiamano "mutazioni hot-spot" e mutazioni ampiamente annotate nei database disponibili. Il sequenziamento del DNA germinale insieme ai tumori abbinati ha anche il vantaggio di consentire la rilevazione accurata delle variazioni del numero di copie (CNV). In alternativa, i pool di genomi diploidi corrispondenti al genere potrebbero essere utilizzati per ridurre il rumore proveniente dai dati di sequenziamento e facilitare il rilevamento della CNV. Oltre all'inclusione del DNA germinale, abbiamo modificato il protocollo della biblioteca per ridurre lo squilibrio del pool di primer e migliorare le chiamate CNV. Secondo il protocollo originale, le quattro pool di amplicon prodotte da ogni campione di DNA dopo la MULTIPLEx PCR dovrebbero essere mescolate insieme e i passaggi rimanenti verrebbero eseguiti in un tubo per campione. Ciò causa tuttavia fluttuazioni nella profondità di copertura media per pool a causa del fatto che la PCR multiplex può avere un'efficienza diversa tra tubi diversi. Non è stato necessario alcun passaggio di quantificazione/normalizzazione dei pool per tenere conto di questo effetto nel protocollo originale. Per evitare le fluttuazioni sopra descritte, abbiamo deciso di tenere ciascuno dei quattro pool di amplificatori separati in tutto il protocollo di produzione della biblioteca, fino a quando non potevano essere quantificati. Al momento della quantificazione, la stessa quantità di ciascuno dei quattro pool per ogni campione di DNA potrebbe essere aggiunta al pool di librerie finale, assicurando che la copertura media finale fosse il più uniforme possibile.
La valutazione dell'eterogeneità intra-tumorale (ITH) a livello genetico ha importanti implicazioni cliniche, ma pone allo stesso modo nuove sfide2. Una delle principali sfide è infatti la necessità di distinguere tra mutazioni del conducente ed eventi stocastici (cioè mutazioni dei passeggeri). La distinzione tra mutazioni del conducente e dei passeggeri è spesso compiuta computazionalmente, ma non senza pregiudizi. Mentre la funzionalizzazione sistematica delle varianti rilevate è costosa e richiede molto tempo, le conseguenze funzionali delle varianti genetiche potrebbero essere valutate, almeno per un sottoinsieme di geni, mediante l'analisi immunoistochimica della proteina corrispondente o, indirettamente, misurando l'espressione di marcatori surrogati di disfunzione proteica. Il nostro protocollo è stato applicato ai tessuti FFPE, che rappresenta la principale fonte di materiali in ambito clinico ma che pone sfide per il sequenziamento; la qualità degli acidi nucleici isolati deve essere sempre valutata prima del sequenziamento11. Sebbene il sequenziamento mirato abbia il grande vantaggio di essere conveniente e non molto esigente in termini di requisiti computazionali, ha il principale svantaggio di interrogare solo una parte limitata del genoma, il che porta probabilmente a sottovalutare l'eterogeneità intra-tumorale. Inoltre, questo approccio non sta considerando rilevanti differenze epigenetiche e trascrittomiche tra metastasi e tumori primari che sono stati recentemente dimostrati per superare le differenze genetiche in alcuni tipi di tumore4,12, 13. Tuttavia, si potrebbe prevedere che i progressi tecnologici consentiranno presto l'integrazione di un insieme di dati verticale più ricco per una migliore valutazione dello ITH. Il nostro approccio preferisce la profondità alla copertura fisica del genoma, che limita la nostra capacità di costruire una corretta filogenia basata su SNV. Tuttavia, il nostro metodo offre l'opportunità di esplorare la parentela genetica nei campioni clinici con un'adeguata sensibilità e specificità a causa dell'integrazione di analisi molecolari e istopatologiche. Abbiamo applicato con successo questo protocollo su un tipo di tumore specifico (ad esempio, SPN) e prevediamo che il metodo funzionerà in modo simile su altri tipi di tumore solido.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto dal Progetto Italiano Cancro Genoma (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Ricerca Italiana Cancro (AIRC; Sovvenzione da 12182 a AS e 18178 a VC), FP7 European Community Grant (Cam-Pac N. 602783 ad AS). Le agenzie di finanziamento non hanno avuto alcun ruolo nella raccolta, nell'analisi e nell'interpretazione dei dati o nella stesura del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | - | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | - | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | - | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software - uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | - | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | - | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | - | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
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