Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Sammenlignende læsioner analyse gennem en målrettet sekvensering tilgang

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/59844
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 1, 1, 1,2, 1,2
1ARC-Net Research Centre, University and Hospital Trust of Verona, 2Department of Diagnostics and Public Health, Section of Pathology, University and Hospital Trust of Verona, 3Department of Medicine (DIMED), Surgical Pathology and Cytopathology Unit, University of Padua

Summary

Denne artikel beskriver en metode til at identificere klonale og subklonale ændringer blandt forskellige prøver fra en given patient. Selv om de eksperimenter, der er beskrevet her fokusere på en bestemt tumortype, tilgangen er stort set gælder for andre solide tumorer.

Abstract

Vurdering intra-tumoral heterogenitet (ITH) er af afgørende betydning for at foregribe svigt af målrettede terapier og design i overensstemmelse hermed effektive anti-tumor strategier. Selv om bekymringer er ofte rejst på grund af forskelle i prøve behandling og dybde dækning, næste generations sekvensering af solide tumorer har trævlet en meget varierende grad af ITH på tværs af tumortyper. Indfangning af den genetiske slægtskab mellem primære og metastatiske læsioner gennem identifikation af klonale og subklonale populationer er afgørende for udformningen af terapier for Advance-scene sygdomme. Her rapporterer vi en metode til komparativ læsioner analyse, der giver mulighed for identifikation af klonale og subklonale populationer blandt forskellige prøver fra den samme patient. Den eksperimentelle fremgangsmåde, der er beskrevet her, integrerer tre veletablerede tilgange: histologisk analyse, High-dækning multi-læsion sekventering, og immunophenotypic analyser. For at minimere virkningerne på påvisning af subklonale hændelser ved uhensigtsmæssig prøve behandling, underkastes vi væv til omhyggelig patologisk undersøgelse og neoplastisk celle berigelse. Kvalitetskontrolleret DNA fra neoplastiske læsioner og normalt væv blev derefter udsat for høj dæknings rækkefølge, som var rettet mod kodnings områderne for 409 relevante kræft gener. Mens vi kun ser på et begrænset genomområde, gør vores tilgang det muligt at evaluere omfanget af heterogenitet blandt somatiske ændringer (enkelt-nukleotidmutationer og kopi-nummer variationer) i særskilte læsioner fra en given patient. Gennem komparativ analyse af sekvensering data, vi var i stand til at skelne klonal vs. subklonale ændringer. Størstedelen af ITH tilskrives ofte passager mutationer; Derfor har vi også brugt immun histokemi til at forudsige funktionelle konsekvenser af mutationer. Mens denne protokol er blevet anvendt til en bestemt tumortype, vi forventer, at den metode, der er beskrevet her, er stort set gælder for andre solide tumortyper.

Introduction

Fremkomsten af næste generation sekventering (NGS) har revolutioneret den måde, kræft er diagnosticeret og behandlet1. NGS koblet til multiregional sekvensering har afsløret en høj grad af intra-tumoral heterogenitet (ITH) i solide tumorer2, hvilket i del forklarer svigt af målrettede terapi på grund af tilstedeværelsen af subkloner med forskellige stof følsomhed2 . En vigtig udfordring i forbindelse med genomundersøgelser er nødvendigheden af at skelne mellem passager (dvs. neutral) og driver mutationer i individuelle kræftformer3. Flere undersøgelser har faktisk vist, at i visse tumorer, passager mutationer tegner sig for størstedelen af ITH, mens føreren ændringer tendens til at blive bevaret blandt læsioner af den samme individuelle4. Det er også vigtigt at bemærke, at stor Mutations byrde (som det ses i lungekræft og melanom) ikke nødvendigvis indebærer en stor subklonal Mutations byrde2. Derfor kan en høj grad af ITH findes i tumorer med lav Mutations byrde.

Metastaser er ansvarlige for mere end 90% af cancerrelaterede dødsfald på verdensplan5; Derfor er det afgørende for udformningen af effektive terapier for avancerede sygdomme at opfange de mutationale heterogenitet af driver gener blandt primære og metastatiske læsioner. Klinisk sekvensering udføres generelt på nukleinsyrer fra fast væv, hvilket gør Genome-udforskning vanskelig på grund af dårlig DNA-kvalitet. På den anden side er hensigten med klinisk sekvensering at identificere handlingsrettede mutationer og/eller mutationer, der kan forudsige reaktionsevne/manglende respons på et givent terapeutisk regime. Som det ser ud, kan sekvensering begrænses til en mindre del af genomet til rettidig ekstraktion af klinisk relevante oplysninger. Overgangen fra DNA-profilering med lav gennemløb (f. eks. sanger sekvensering) til NGS har gjort det muligt at analysere hundredvis af kræft relevante gener ved en høj dæknings dybde, hvilket giver mulighed for påvisning af subklonale hændelser. Her rapporterer vi en metode til komparativ læsioner analyse, der giver mulighed for identifikation af klonale og subklonale populationer blandt forskellige prøver fra den samme person. Den metode, der er beskrevet her, integrerer tre veletablerede tilgange (histologisk analyse, multi læsions sekvensering med høj dækning og immunophenotypiske analyser) for at forudsige de funktionelle konsekvenser af de identificerede variationer. Fremgangsmåden er skematisk beskrevet i figur 1 og er blevet anvendt til studiet af 5 metastatiske tilfælde af solide pseudopapillær neoplasmer (SPN'er) i bugspytkirtlen. Mens vi beskriver behandling og analyse af formalin-faste paraffin indlejrede (FFPE) vævsprøver, kan den samme procedure anvendes på genetisk materiale fra fersk frosset væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Det materiale, der blev anvendt i undersøgelsen, blev indsamlet i henhold til en specifik protokol, som blev godkendt af den lokale etiske komité. Der forelå et skriftligt informeret samtykke fra alle patienter.

1. histologisk og immunophenotypisk revision af vævsprøver

Bemærk: en ekspert patolog er ansvarlig for de nedenfor beskrevne aktiviteter.

  1. Histopatologisk revision af udvalgte tilfælde i henhold til veletablerede diagnostiske kriterier.
    1. Brug mikrotomen til at klippe 4 − 5 μm tykke vævs sektioner fra repræsentative FFPE-vævs blokke, og monter sektionerne på standard histologiske slides.
    2. Udfør hematoxylinlegemer og eosin farvning for hvert dias ved hjælp af en automatiseret vævs slide Stainer (tabel over materialer).
    3. Gennemgå den histopatologiske diagnose af de udvalgte tumor tilfælde efter WHO'S diagnostiske kriterier.
      Bemærk: på dette tidspunkt kan patologen identificere morfologisk adskilte områder af tumoren inden for samme vævs sektion. Det er muligt at høste disse områder separat (Se afsnit 2). Histologisk lighed af tumor og normale celler for SPN'er er angivet i figur 2.
    4. Udfør immun Histokemisk farvning for etablerede markører for at supplere histologisk analyse og anslå immunophenotypisk heterogenitet.
      Bemærk: patologen kan identificere immunophenotypisk adskilte områder af tumoren inden for samme vævs sektion. Det er muligt at høste disse områder separat (Se afsnit 2).
  2. Vurder neoplastisk cellularitet af tumor vævs afsnittet og Planlæg manuel mikrodissektion i overensstemmelse hermed.
    Bemærk: Dette er en patolog-genereret estimat af tumor cellularitet.
    1. Hvis neoplastisk celleindhold i vævs sektionen er højere end 70%, er manuel mikrodissektion ikke obligatorisk; gå direkte til trin 3,1.
      Note: Target 70% af neoplastisk celleindhold for at (i) sikre tilstrækkelig følsomhed for mutant allel frekvens estimater og (II) for eventuelt at validere klonale mutationer ved mindre følsomme metoder (f. eks. kapillar sekvens).
    2. Hvis neoplastisk celleindhold i vævs sektionen er lavere end 70%, er microdissection nødvendig og gå til trin 2.
  3. Evaluer vævs sektioner fra FFPE-blokken, hvor ikke-neoplastisk væv er blevet udtaget. Dette væv bruges som en kilde til kimcelle DNA.
    Bemærk: blod er en alternativ kilde til kimcelle DNA. I dette tilfælde fortsættes med DNA-ekstraktion som anbefalet i noten til trin 4,1.
    1. Hvis kun ikke-neoplastisk væv er synligt i vævs afsnittet (figur 2D), er manuel mikrodissektion ikke nødvendig. gå direkte til trin 3,1.
    2. Hvis der er betydelig kontaminering fra neoplastiske celler i vævs sektionen, er manuel mikrodissektion nødvendig. gå til afsnit 2.

2. manuel mikrodissektion

Bemærk: denne metode er gældende for forskellige solide tumortyper, og det er hensigten at øge neoplastiske celler indhold af vævsprøver. Alternativt kan denne metode bruges til at høste morfologisk og/eller immunophenotypisk adskilte områder inden for samme vævs sektion.

  1. Ved hjælp af en mikrotom, skæres op til ti 4 − 6 μm tyk FFPE tumor vævs sektioner og montere dem på ikke-ladede slides.
    Bemærk: Hvis kun én 1 mm2 reden af kræftceller er synlig i prøven, skal 10 vævs glas skæres og underkastes manuel mikrodissektion for at opnå den målrettede mængde DNA (40 ng); Dette forudsætter, at 1 mm2 klynge indeholder mellem 700 og 1000 tumor kerner.
  2. Inkubatglas sene ved 60 °C i 10 min.
  3. Placer slides i et rack, og udføre følgende vaske: xylen for 20 min, 100% ethanol i 10 min, 80% ethanol i 10 min, 70% ethanol i 10 min, destilleret vand i 1 min, hematoxylinlegemer counterstain til 10 s, Tap vand i 1 min.
  4. På en standard inverteret mikroskop, bruge en 27 G nål på en sprøjte som mikrodissektions værktøj og indsamle repræsentative klynger af tumorceller. Høst mindst ti 1 mm2 klynger af celler for at sikre den nødvendige mængde DNA til sekvensering.
    Bemærk: Hvis morfologisk adskilte områder er beregnet til at blive analyseret som forskellige enheder, skal du bruge mikrodissektions værktøjet til at høste disse områder separat.
  5. Placer høstede klynger i 1,5 mL rør (tabel over materialer), der tidligere var fyldt med 20 μl proteasehæmmere K og 180 μl lysis-buffer (tabel over materialer, begge inkluderet i DNA-ekstraktions sættet) og blandes ved vortexing.

3. behandling af væv uden forudgående mikrodissektion

Bemærk: denne procedure anvendes til vævs blokke, der kun indeholder ikke-neoplastiske celler (kilde til kimcelle DNA) eller indeholder mindst 70% af morfologisk homogene kræftceller.

  1. Ved hjælp af en mikrotom skæres op til seks 4 − 5 μm tykke vævs sektioner fra udvalgte FFPE vævs blokke. Placer vævs ruller i 1,5 mL rør som beskrevet i trin 2,5.

4. DNA-ekstraktion fra normale og neoplastiske celler

  1. Rense DNA fra normal og neoplastisk væv ved hjælp af DNA FFPE vævs ekstraktions Kit (tabel over materialer) i henhold til producentens anvisninger.
    Bemærk: når blodet bruges som en kilde til kimcelle-nukleinsyre, renser du DNA ved hjælp af et DNA-blodekstraktions udstyr (tabel over materialer).
  2. DNA-kvantificering og kvalitetskontrol
    1. For at kvantificere mængden af dobbeltstrenget (dsdna), tilsættes en alikvot af DNA-prøven til en opløsning, der indeholder en fluorescerende nukleinsyre bejdsning (tabel over materialer) og måler udledt fluorescens ved hjælp af et stationære fluorometer (tabel over materialer ).
      Bemærk: analysen måler intensiteten af det fluorescerende signal, der udsendes fra fluorescerende farvestoffer knyttet til dsDNA og bestemmer mængden af DNA ved hjælp af en standardkurve.
    2. Brug et mikrovolumen Spektrofotometer (tabel over materialer) til at måle 260/280-og 260/230-forholdet for prøven for at kvalificere DNA. "Pure" DNA skal have en 260/280 af 1,8 og en 260/230 i intervallet 1.8 − 2.2.
      Bemærk: spektrofotometrisk vurdering af prøven er beregnet til at dokumentere tilstedeværelsen af kemiske forurenende stoffer (f. eks. phenol), der påvirker downstream-reaktionerne. I tilfælde af kontaminering på grund af kemiske reagenser skal du udføre et oprydnings trin ved hjælp af et kolonne baseret sæt.

5. klargøring og kvantificering af biblioteker

Bemærk: det skematiske rutediagram over bibliotekets forberedelses-og kvantificerings trin rapporteres i figur 3.

  1. DNA bibliotek forberedelse (4 primer puljer oprettet for hver prøve)
    Bemærk: de 4 primer-puljer tilhører kræft panelet, som rapporteres iTabel over materialer. Hver pulje indeholder primer par, der er designet til en multiplexed mål udvælgelse af 409 gener. Et link til listen over gener, der komponerer NGS-panelet, findes iTabel over materialer.
    1. Forbered fire DNA-målforstærknings reaktioner for hver prøve, én pr. primer-pulje. For hver primer-pulje (tabel over materialer) tilsættes et 0,2 ml rør (tabel over materialer): 4 μl Master Mix (tabel over materialer, inkluderet i Biblioteks sættet), 10 μl high fidelity primer pool mix (tabel over materialer, der er inkluderet i Cancer panel) og 6 μL DNA (10 ng i alt).
    2. Amplificere målregioner af hver primer pulje separat i fire 1,5 mL rør, der kører følgende program: hold ved 99 °C i 2 min (aktivering af Hot-start polymerase), 16 cyklusser (denature ved 99 °C for 15 s, anneal og forlænge ved 60 °C i 8 min) , hold ved 4 °C.
      Bemærk: stoppunkt. Opbevar målforstærknings reaktioner ved 4 °C natten over eller ved-20 °C i længere tid.
    3. Delvis nedbrydning af amplikoner slutter
      Bemærk: manualen, der leveres af NGS Manufacturer kit, forudser et trin, hvor de forskellige forstærknings reaktioner fra hver prøve kombineres før delvis fordøjelse. Undgå dette trin og holde behandling hver forstærkning fordøjelsen separat.
      1. Der tilsættes 2 μL specifik fordøjelsesmix (tabel over materialer, inkluderet i Biblioteks sættet) til hver forstærket pulje af hver prøve (den totale volumen af hvert 0,2 ml rør er 22 μl). Vortex grundigt og centrifuge hvert rør til at indsamle dråber.
      2. Læg rørene i den termiske variator og Kør følgende program: 50 °c i 10 min, 55 °c i 10 min, 60 °c i 20 min, 10 °c hold (i op til 1 time).
        Bemærk: stoppunkt. Opbevar pladen ved-20 °C i længere perioder.
    4. Ligate adaptere til amplikoner og rense.
      Bemærk: Brug en anden stregkode adapter til hver prøve, når du sekvensering af flere biblioteker på en enkelt chip. Alle fire forstærknings reaktioner fra samme prøve skal have samme stregkode.
      1. Forbered adaptere (tabel over materialer, stregkode adaptere Kit). For hver stregkode X, Forbered en blanding af P1 adapter og unikke stregkode adaptere (tabel over materialer) ved en endelig fortynding af 1:4. Bland 4 μL vand med 2 μL P1 adapter og 2 μL unikke stregkode adaptere. Brug 2 μL af dette stregkode adapter mix til downstream-passager.
      2. Udfør ligationsreaktionen ved at tilsætte hver forstærket pulje af hver prøve i denne rækkefølge: 4 μL switch-opløsning (tabel over materialer, inkluderet i Biblioteks sættet), 2 μl stregkode adapter mix og 2 μl DNA-Ubiquitinligase (tabel over materialer, inkluderet i Biblioteks sættet) (samlet volumen = 30 μL).
      3. Vortex grundigt og centrifugeres kortvarigt for at indsamle dråber.
      4. Læg hvert rør i den termiske variator og Kør følgende program: 22 °c i 30 min, 68 °c i 5 min, 72 °c i 5 min, 4 °c hold (i op til 24 timer).
        Bemærk: stoppunkt. Opbevar pladen ved-20 °C i længere perioder.
    5. Rensning og forstærkning af bibliotek
      1. Centrifuger hvert rør og overfør derefter hver Barcoded prøve i et 1,5 mL rør. Tilsæt 45 μL perler baseret rensnings reagens (tabel over materialer) til hver pulje af hver prøve. Pipet op og ned 5x for at blande perlen suspension med DNA.
      2. Blandingen inkubates i 5 minutter ved stuetemperatur (RT), og anbring derefter hvert rør i et magnetisk stativ og Inkuber i 2 min. forsigtigt fjerne og kassere supernatanten uden at forstyrre pellet.
      3. Tilsæt i hvert rør 150 μL frisk 70% ethanol. Vask perlerne flytte hver tube side-til-side af de to positioner af magneten. Kassér supernatanten og Vær opmærksom på ikke at forstyrre pellet.
      4. Gentag procedurerne beskrevet i trin 5.1.5.3 og derefter holde rørene i magneten og luft-tørre perlerne på RT i 5 min.
      5. Fjern rørene med rensede biblioteker af hver grund pulje fra magneten, og tilsæt 50 μL high-fidelity PCR mix (tabel over materialer) og 2 μl Biblioteks forstærknings primer mix (tabel over materialer, inkluderet i Biblioteks sættet) til perlerne pellet af hvert rør.
      6. Vortex hvert 1,5 mL rør og centrifugeres kortvarigt for at indsamle dråber.
      7. Placer 1,5 mL-rørene i magneten i 2 min, og Overfør forsigtigt supernatanten (~ 50 μL) fra hvert rør til et nyt 0,2 mL rør uden at forstyrre pellet.
      8. Amplify biblioteker af hver primer pulje kører følgende program: hold ved 98 °C i 2 min at aktivere enzymet, 5 cyklusser (denature ved 98 °C i 15 s, anneal og forlænge ved 64 °C 1 min), hold ved 4 °C. Opbevar prøverne ved-20 °C.
    6. Rensning af forstærket bibliotek
      1. Centrifuger hvert rør for at samle indholdet i bunden og overføre hver forstærket Biblioteks prøve til et 1,5 mL rør.
      2. Tilsæt 25 μL perler baseret rensnings reagens. Pipet op og ned 5x for at blande perlen suspension med DNA.
      3. Blandingen inkuberes i 5 minutter ved RT, og anbring derefter rørene i magneten i 5 minutter.
      4. Overfør forsigtigt supernatanten, som indeholder amplicons, fra hvert rør til nye rør uden at forstyrre pellet.
      5. Tilsæt 60 μL perler-baseret rensning reagens til supernatanten af hvert rør og pipet op og ned for at blande perle suspension og DNA.
      6. Blandingen inkuberes i 5 minutter ved RT, og derefter placeres rørene i magneten i 3 min.
      7. Kassér supernatanten fra hvert rør og Vær opmærksom på ikke at forstyrre pellet.
        Bemærk: amplikoner er bundet til perlerne.
      8. Tilsæt i hvert rør 150 μL frisk 70% ethanol. Vask perlerne flytte rørene side-til-side i de to positioner af magneten. Kassér supernatanten og Vær opmærksom på ikke at forstyrre pellet.
      9. Gentag proceduren i trin 5.1.6.8 og lufttørre perlerne på RT i 3 min. undgå overdreven tørring af perlerne.
      10. Fjern rørene fra magneten og tilsæt 50 μL lav Tris EDTA (TE) (tabel over materialer, inkluderet i Biblioteks sættet) til pellet for at sprede perlerne.
      11. Pipet blandingen op og ned flere gange og Inkuber ved RT i 2 min.
      12. Anbring rørene i magneten i mindst 2 minutter og Overfør forsigtigt supernatanten, som indeholder amplicons, til nye rør uden at forstyrre perlerne.
  2. Kvantificering af bibliotek
    1. Brug et fragment analyseinstrument (tabel over materialer) til at køre en DNA-chip i henhold til HØJFØLSOM DNA-pakke protokol.

6. biblioteker pooling og sekvensering køre

  1. Fortynd hvert bibliotek til 100 pM med nuklease frit vand. Kombiner 10 μL af hver 100 pM-biblioteker for et enkelt løb i et enkelt rør. Bland de kombinerede biblioteker ved pipettering og Fortsæt til templating og Sequencing.
  2. Oprettelse af planlagt kørsel
    Bemærk: et typisk løb omfatter fire prøver, der kan indlæses på to forskellige typer af halvlederchip (ion PI chip eller ion 540 chip) baseret på sequenceren til rådighed i laboratoriet (ion proton system eller GeneStudio S5 system, tabel over materialer). Disse systemer producerer typisk 80.000.000 læsninger pr. kørsel.
    1. Åbn torrent-browseren på en computer, der er sluttet til sekvens systemet (f. eks. Ionkok-systemet), og Planlæg et nyt løb ved hjælp af den generiske skabelon for det valgte program (AmpliSeqDNA).
    2. Skift til fanen kits i planen. Vælg ion proton system eller ion genestudio S5 system fra instrument dropdown listen baseret på det sekvensering system, der anvendes.
    3. Afhængigt af sekvens systemet skal du vælge den relevante chip (PI-chip til ion proton-systemer; 540 chip til ion GeneStudio S5-systemer) fra rullelisten chip type .
    4. Vælg ion AmpliSeq 2,0 Library kit på rullelisten Biblioteks pakke .
    5. Vælg knappen ion chef for Template kit, og vælg derefter det relevante CHEFSÆT (ion pi Hi-Q chef kit til PI chip eller ion 540 Kit-chef for 540 chip) på rullelisten skabelon pakke .
    6. Vælg den relevante sekvensering Kit (ion pi Hi-Q sekventering 200 kit til pi chip eller ion S5 sekventering Kit for 540 chip) fra sekventering kit dropdown liste, og vælg derefter ionxpress fra stregkode sættet dropdown liste.
    7. Skift til fanen plugin , og vælg dækningsanalyse -plugin'et.
    8. Skift til fanen plan. Vælg GRCh37/hg19 genom fra rullelisten reference bibliotek. Vælg det relevante panel, der skal sorteres, på rullelisten målregioner .
    9. Indstil antallet af stregkoder, der skal sorteres, og etiketten på bibliotekets prøveglas i de relevante felter.
    10. Angiv stregkode navnet og eksempel navnet for hvert bibliotek.
  3. Prøve biblioteker fortynding og lastning.
    1. Fortynd bestanden bibliotek med nuclease-fri vand til 25 pM for PI chip eller 32 pM for 540 chip.
    2. Pipet 50 μL af hvert fortyndet bibliotek til bunden af den relevante Biblioteks prøve slange.
    3. Tænd for sekvensering system og følg instruktionerne på skærmen for at indlæse alle nødvendige reagenser og for at importere Run planen.
    4. Indlæs Biblioteks prøverøret, der indeholder de poolede biblioteker og start klonal amplifikationprogram.
      Bemærk: Ionkok-systemet kræver, at der forberedes to chips pr. kørsel.
  4. Sekvensering af ion proton eller ion GeneStudio S5.
    1. Aktivér sekvensering, og følg instruktionerne på skærmen for at initialisere sekvensering og for at importere kørsels planen.
    2. Indlæs sekvensningschippen efter at have fjernet den fra sekvensningssystemet.
      Bemærk: Vær jordet, før du opfanger en chip for at undgå spån skader på grund af elektrostatisk afladning. Spån håndtering/-positionering sammen med eksempler på vellykket/mislykket indlæsning rapporteres i figur 4.
    3. Luk låget til spån rummet, og vent, indtil chip status ikonet angiver "klar".
    4. Tøm affaldsbeholderen, når den første løbetur er færdig, og sekvens derefter den resterende chip så hurtigt som muligt.

7. analyse af mutationer og kopi-nummer variationer (CNVs)

Bemærk: justering af sekvensering af data til GRCh37/hg19 Human reference genom udføres automatisk, når det er angivet i planen (trin 6.2.8).

  1. Brug modulet dækningsanalyse (tabel over materialer) til at verificere dæknings dybden og ensartetheden.
  2. Udfør varianten opkald ved hjælp af torrent variant caller plugin (tabel over materialer), vælge kimcelle eller somatiske workflow efter behov.
  3. Hent filtrerede varianter af VCF-filer (variant Call format). Annoter varianter ved hjælp af programmet variant Effect-prædiktor (VEP)6 og NCBI refseq-databasen.
  4. Indlæs sekvensering data på ion reporter software ved hjælp af ion reporter Uploader plugin og bruge den omfattende kræft panel tumor-normal par workflow til at analysere data for at estimere cnvs.
  5. Manuelt filtrere mutationer og Cnv'er baseret på scores tildelt af softwaren og verificere dem visuelt med Integrative Genomics Viewer (IGV)7.
    1. Visuelt inspicere tilpasningen for usædvanlige læsninger (på grund af, for eksempel, mispriming, over amplifikation eller læser Soft-klipning), der kan generere arteffaktiske opkald.
    2. Bekræft cnvs ved at inspicere den normaliserede dækning for alle amplikoner på tværs af et givent gen mod den normaliserede dækning af grundlinjen.
      Bemærk: Dette hjælper med at korrigere falske opkald på grund af segmenterings softwaren, som undertiden kalder en cnv baseret på symmetrisk unormal dækning af få amplikoner ved slutningen af et gen og i begyndelsen af det efterfølgende gen.
  6. Indeksering af somatiske mutationer
    1. For hvert enkelt tilfælde kaldes indeks mutation fra sekvens af normalt væv/blod, primær tumor og metastaser.
    2. Flag som kimcelle og kassere de opkald, der også fremgår af sekvensering data af kimcelle DNA.
    3. Flag som klonal/grundlægger de mutationer, der deles blandt alle læsioner af en given patient.
    4. Flag som subklonal/progressor mutationer, der påvises i nogle, men ikke alle læsioner af en given patient.

8. immunophenotypic-analyse: Immunhistokemi for relevant protein ekspression

Bemærk: immun histokemi blev brugt til at validere de funktionelle konsekvenser af inaktiverende mutationer i tumor suppressor gener.

  1. Ved hjælp af en mikrotom skæres 3 − 4 μm tykke FFPE-vævs sektioner og monteres på opladede slides og inkubatglas ved 60 °C i 10 minutter.
  2. Placer diasene i et rack, og Udfør følgende trin: xylen i 10 min, xylen i 10 min, 95% ethanol i 4 min, 95% ethanol i 4 min, 70% ethanol i 4 min, 70% ethanol i 4 min, destilleret vand i 4 min.
  3. Udfør antigen udtagning baseret på indikation af antistof fabrikanter (tabel over materialer).
    1. Placer diasene i et rack med den specifikke antigen-hentningsvæske og Nedsænk i et vandbad ved sub-kogende temperaturer.
    2. Fjern slides fra badet og kørelednings vand for at køle ned i 10 min.
  4. Placer slides i et nyt rack med 3% H2O2 i 1x Tris-BUFFERED Saline (TBS) i 20 min ved rt for at inaktivere endogene peroxidaser.
  5. Placer slides i et nyt stativ og vask 3x med TBS og 0,1% af Tween 20 (TBST).
  6. Brug en PAP pen (tabel over materialer) til at tegne en hydrofobe cirkel omkring slide-monteret væv.
  7. Placer gliderne i et fugtigt kammer, og Udfør blokering i 1 time ved RT med 5% bovint serumalbumin (BSA) i TBST som blokerende opløsning.
  8. Der inkubates med primære antistoffer (tabel af materialer) i et fugtigt kammer natten over ved 4 °c. Fortynd primært antistof med blokerende opløsning som anbefalet.
  9. Placer slides i et nyt stativ og vask 3x med TBST.
  10. Incubate slides med specifikke sekundære antistoffer (anti-mus eller anti-kanin) (4 − 5 dråber for 1 slide) i 30 min ved RT i et fugtigt kammer.
  11. Placer slides i et nyt stativ og vask 3x med TBST og efter i destilleret vand.
  12. Forbered 3, 3 '-diaminobenzidin (DAB) opløsningen fortynding 1 dråbe i 1 mL fortyndingsbuffer (tabel over materialer). Incubate glider maksimum for 5 min kontrol under mikroskop.
  13. Brug en positiv kontrol til at beregne inkubationstiden ved at følge udviklingen af reaktionen under mikroskopet.
    Bemærk: hvert antistof har brug for en specifik inkubationstid.
  14. Inaktiv DAB (stop kromogen nedbør) ved at nedsænke slides i destilleret vand.
  15. Counterstain slides ved at imfusionere dem i et nyt rack med hematoxylinlegemer til 10 s og derefter skylles med ledningsvand.
  16. Placer diasene i et rack, og Udfør følgende trin: 70% ethanol i 4 min, 70% ethanol i 4 min, 95% ethanol i 4 min, 95% ethanol i 4 min, xylen i 10 min, xylen i 10 min.
  17. Seal slides sætte et par dråber af monterings medium (tabel over materialer) på hvert væv slide og dække med coverslip.
  18. Påfør Tryk på dæksedlen for at flytte overskydende medium og luftbobler væk fra vævet og ud fra dæksedlen og lufttørre.
  19. Evaluere og score farvning resultater under inverteret mikroskop med en ekspert patolog.
    Bemærk: pointsystemet vil afhænge af de specifikke antigener, som der allerede findes oplysninger om i litteraturen. Hvis der ikke foreligger oplysninger i litteraturen, udledes et scoringssystem ved hjælp af udtryk af antigenet i normalt væv som reference.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Undersøgelsens workflow er illustreret i figur 1. Multi-læsioner (n = 13) sekvensering af 5 SPN-tilfælde rettet mod kodnings sekvenserne af 409 cancerrelaterede gener identificerede i alt 27 somatiske mutationer i 8 gener (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1og FGFR3). Mutationer blev defineret som grundlægger/klon, når de deles blandt alle læsioner af en given patient, og progressor/subclonal når detekteres i nogle, men ikke alle læsioner af en given patient (figur 5a, B). Samlet set var størstedelen af de punktmutationer, der blev identificeret på tværs af kohorten, klonale hændelser, som inkluderede mutationer af CTNNB1, KDM6A, TET1 og FLT1. Konsekvent var immun Histokemisk farvning af β-køreledning (proteinprodukt af CTNNB1) og KDM6A homogen blandt de forskellige læsioner i tilfælde med mutationer af de tilsvarende gener (figur 6A, B). Den moderate farvning af KDM6A i muterede prøver tydede på, at genetisk modifikation sandsynligvis ville ændre funktion frem for protein udtryk. KDM6A tab af funktion i bugspytkirtlen tumorer er forbundet til docetaxels opregulering af hypoxi markør GLUT18, og derfor GLUT1 blev overudtrykt i tilfælde med KDM6A mutationer (figur 6c). Subklonale mutationer viste sig at påvirke BAP1, SMAD4, TP53 og FGFR3. Immunhistokemi for BAP1 og TP53 bekræftede, at mutationer i disse gener var subklonale (figur 6D, E). Analyse af kopier-nummer variation (CNV) blev udført ved hjælp af sekvensering af data og afslørede ændringer i alle de analyserede enheder som vist i figur 7a. Forskelligt fra punktmutationer, var de fleste CNV-ændringer subklonale (figur 7b).

Figure 1
Figur 1: flow diagram af analysen udført på metastatiske læsioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentativ histologi af normale og tumor væv.
(A, B) Tumor vævet (T) ved siden af det normale væv (N). I disse to vævs sektioner er tumoren og det normale væv identificerbare som separate og velafgrænsede områder. C) klynger af normale pancreasceller (N *) kan ses som indlejret i tumorvævet (T). D) morfologi af normalt pancreasvæv. Skala bjælke repræsenterer 1 mm.

Figure 3
Figur 3: skematisk flowdiagram af biblioteket forberedelse og kvantificering protokol trin.

Figure 4
Figur 4: ion proton chip lastning og løb.
(A) spån retning og placering i spån klemmen (venstre). Metal tab tilbage udskiftning (højre). B) Heatmaps, som viser bibliotekernes tæthed i to forskellige spån belastninger. Eksempel på en god belastnings tæthed (top) på grund af en vellykket klonal forstærkning af biblioteker, hvilket resulterer i 94% lastning af chip overfladen med sekventering partikler (139.000.000 læser, endeligt output 90.000.000 læser efter automatisk kvalitets filtrering). Eksempel på en dårlig belastning (bund) på grund af en ineffektiv klonal forstærkning af biblioteker, hvilket resulterer i 40% lastning af chippen overflade med sekventering partikler (59.000.000 læser, endelige output 12.000.000 læser efter automatisk kvalitet filtrering).

Figure 5
Figur 5: somatiske ændringer i metastatiske læsioner.
A) somatiske mutationer identificeret i matchede primære/metastatiske læsioner. B) der vises samlede somatiske mutationer pr. tilfælde, herunder ændringer, der deles mellem alle læsioner (grundlægger/klonal), og dem, som påvises i en eller flere, men ikke alle prøveeksemplarer for en given sag (progressor/subclonal). Antallet af individuelle metastatisk læsion (m) sekventeret pr. sag er indiceret. Dette tal er blevet genudgives fra Amato et al.8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: immun farvning af β-køreledningen, KDM6A, GLUT1, BAP1 og TP53 i primære og metastatiske læsioner.
A) repræsentative immunhistokemiske billeder, der viser nuklear akkumulering af β-køreledning i alle enheder (primære og metastatiske) fra en SPN-bærende mutation af CTNNB1. B) immun Histokemisk farvning af læsioner fra en metastatisk SPN-bærende klonal mutation af KDM6A. C) overekspression af GLUT1 i et SPN med KDM6A-mutation, hvorimod der ikke blev observeret immunoreaktivitet i vildtype væv. (D, E) BAP1-og TP53-udtryks data angiver, at mutationer i disse to gener er subklonale. Skala søjler repræsenterer 100 μm og indstiset forstørrelse er 600X. Dette tal er blevet modificeret fra Amato et al.8.

Figure 7
Figur 7: ændringer i det somatiske kopi nummer i metastatiske læsioner.
(A) den virtuelle karyotype visning viser placering, nærhed og kopi nummer status af ændrede gener i en repræsentativ sag. Farveskemaet for kromosomale bånd er følgende: sort og grå = Giemsa positiv, lys rød = centromere, lilla = variabel region. Ændringer er kommenteret i henhold til de farvekoder præsenteret i figuren. Forkortelser: CNV, kopi nummer variation; P, primært SPN; L (a-c), levermetastaser. B) de samlede somatiske ændringer (gener, der berøres af cnv) vises pr. tilfælde, herunder ændringer, der deles af alle læsioner (grundlægger/klonal), og dem, som påvises i en eller flere (men ikke alle) af enhederne for en given sag (progressor/subclonal). Antallet af individuelle metastatisk læsion (m) sekventeret pr. sag er indiceret. Dette tal er blevet genudgives fra Amato et al.8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vores metode gør det muligt at identificere molekylære ændringer, der er involveret i progression af solide tumorer gennem integration af lodrette data (dvs. morfologi, DNA-sekvensering og immun histokemi) fra forskellige læsioner af en given patient. Vi demonstrerede evnen af vores metode til at opdage klonale og subklonale hændelser i en Mutations tavse tumortype (dvs. SPN, solid-pseudopapillær neoplasma i bugspytkirtlen) ved at forhør kodning sekvenser af 409 kræft relevante gener8. En fordel ved den amplicon-baserede målrettede sekvensering tilgang, der anvendes her er ensartetheden af dækningen (90% Target baser er dækket 100x, 95% er dækket 20x) på tværs afhørt regioner (15.992) ved en typisk gennemsnitlig dæknings dybde på 1000x. Høj dybde-af-dækning koblet til neoplastisk celle berigelse gennem microdissection garanterer høj følsomhed for påvisning af lav allel frekvens hændelser. Som vi tidligere har vist9, den målrettede sekvensering tilgang tillader påvisning af mutationer ned til en 2% allel frekvens på DNA-prøver fra FFPE væv. Som et eksempel, i det nuværende arbejde, vi var i stand til at identificere en 4% allel frekvens TP53 missense mutation som en subklononal hændelse i en metastatisk prøve (figur 5) og valideret denne forekomst af Immunhistokemi (figur 6). Vores protokol forudser sekventering af matchede tumor og kimcelle DNA for at identificere somatiske begivenheder og dermed reducere den falske opdagelse sats af subklonale mutationer af kræft-kun pipeline10. Når matchet kimcelle DNA ikke er tilgængelig, kan man overveje at vedtage mere konservative parametre i analysen af sekvensering data, herunder strenge filtre baseret på minimal dybde dækning samt begrænse varianter kalder "hot-spots mutationer" og mutationer udførligt kommenteret i tilgængelige databaser. Sekventering kimcelle DNA sammen med matchede tumorer har også den fordel, at muliggøre nøjagtig påvisning af kopi-nummer variationer (cnv). Alternativt kan puljer af køns matchede diploide genomer bruges til at reducere støj fra sekvensering data og lette påvisning af CNV. Ud over medtagelsen af kimcelle DNA, vi modificeret biblioteket protokol til at reducere primer pulje ubalance og forbedre cnv opkald. Ifølge den oprindelige protokol skal de fire amplikonen-puljer, der fremstilles af hver DNA-prøve efter multiplex-PCR, blandes sammen, og de resterende trin vil blive udført i ét rør pr. prøve. Dette medfører dog udsving i den gennemsnitlige dæknings dybde for hver pulje, fordi multiplex PCR kan have forskellig effektivitet på tværs af forskellige rør. Der var ingen pulje kvantificering/normalisering trin til at højde for denne effekt i den oprindelige protokol. For at undgå de ovenfor beskrevne udsving besluttede vi at holde hver af de fire amplikonen pools adskilt i hele bibliotekets produktions protokol, indtil de kunne kvantificeres. Ved kvantificering kunne den samme mængde af hver af de fire puljer for hver DNA-prøve tilføjes til den endelige Biblioteks pulje, hvilket sikrer, at den endelige gennemsnitlige dækning var så ensartet som muligt.

Vurderingen af intra-tumor heterogenitet (ITH) på genetisk niveau har vigtige kliniske konsekvenser, men tilsvarende udgør nye udfordringer2. En stor udfordring er faktisk nødvendigheden af at skelne mellem driver mutationer og stokastiske hændelser (dvs. passager mutationer). Sondringen mellem føreren og passager mutationer er ofte udført beregningsmæssigt, men ikke uden bias. Mens systematisk funktionalisering af detekterede varianter er bekostelig og tidskrævende, kan funktionelle konsekvenser af genetiske varianter evalueres, i det mindste for en delmængde af gener, ved immunohistokemisk analyse af det tilsvarende protein eller indirekte ved at måle udtryk for surrogatmarkører for protein dysfunktion. Vores protokol er blevet anvendt på FFPE væv, som repræsenterer den vigtigste kilde til materialer i den kliniske indstilling, men udgør udfordringer for sekvensering; kvaliteten af isolerede nukleinsyrer bør altid evalueres før sekvens11. Selv om målrettet sekvensering har den største fordel ved at være omkostningseffektiv og ikke meget krævende med hensyn til beregningskrav, har den den største ulempe ved kun at afhøres en begrænset del af genomet, hvilket sandsynligvis fører til undervurdering intra-tumor heterogenitet. Desuden er denne fremgangsmåde ikke overvejer relevante epigenetiske og transkriptomic forskelle mellem metastase og primære tumorer, der for nylig er blevet påvist at opveje genetiske forskelle i visse tumortyper4,12, 13. Man kunne dog forestille sig, at teknologiske fremskridt snart vil muliggøre integration af et rigere vertikalt data ensemble for en bedre vurdering af ITH. Vores tilgang foretrækker dybde til fysisk dækning af genomet, hvilket begrænser vores evne til at opbygge ordentlige SNV-baserede fylogenier. Men vores metode giver mulighed for at udforske genetisk relatthed i kliniske prøver med passende følsomhed og specificitet på grund af integration af molekylære og histopatologiske analyser. Vi har med succes anvendt denne protokol på en bestemt tumortype (f. eks SPN) og forudsige, at metoden vil ligeledes arbejde på andre solide tumortyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev støttet af det italienske Cancer Genomprojekt (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; 12182 til AS og 18178 til VC), RP7 tilskud fra Det Europæiske Fællesskab (cam-Pac No 602783 til AS). Finansieringsorganerne havde ingen rolle i indsamlingen, analysen og fortolkningen af data eller i skrivningen af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies G2939BA  Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit Fisher Scientific NC9959336 Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4627 Library quantification
Anti-BAP1 Santa Cruz Biotechnology sc-28383 Antibody
Anti-GLUT1 Thermo Scientific RB-9052 Antibody
Anti-KDM6A Cell Signaling #33510 Antibody
Anti-p53 Novocastra NCL-L-p53-DO7 Antibody
Anti-βcatenin Sigma-Aldrich C7207 Antibody
Blocking Solution home made - 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution home made - 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra Leica 70937891 Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1 Leica Biosystems AR9961 Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2 Leica Biosystems AR9640 EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear Eppendorf 951010006 Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021 Tubes
Ethanol DIAPATH A0123 IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H­4000 Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Laboratories SK­4105 HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7401­50 Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7402­50 Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV) Broad Institute - https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Thermofisher Scientific 4477685 Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermofisher Scientific 4480441 Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument Thermofisher Scientific 4484177 Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip Thermofisher Scientific A26771 or A27766 Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef Thermofisher Scientific A27198 or A30011 Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit Thermofisher Scientific A26433 or A30011 Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System Thermofisher Scientific 4476610 or A38196 Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair Thermofisher Scientific 4487118 Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin Thermofisher Scientific 4487118 Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit Thermofisher Scientific 4474517 Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermofisher Scientific ND-2000 DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity Fisher Scientific 12532-016 or 12532-024 SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit Quiagen 51106 0r 51104 DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue Quiagen 56404 DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer Thermofisher Scientific Q32866 DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermofisher Scientific Q32850 Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST home made - Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film Sakura Europe 6172 Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software EMBI-EBI - http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres Carlo Erba 492306 IHC deparaffinization reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  2. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
  3. Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
  4. Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
  5. Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
  6. McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
  7. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
  8. Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
  9. Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).
  10. Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
  11. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
  12. Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
  13. Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).

Tags

Adfærd problem 153 intra-tumor heterogenitet metastaser biomarkører klonal målrettet sekvensering immun histokemi "driver" ændringer subklonal
Sammenlignende læsioner analyse gennem en målrettet sekvensering tilgang
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vicentini, C., Mafficini, A.,… More

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter