Summary
Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.
Abstract
İntra-tümöral heterojenitenin (ITH) değerlendirilmesi, hedeflenen tedavilerin başarısızlığını tahmin etmek ve buna göre etkili anti-tümör stratejileri tasarlamak için büyük önem taşımaktadır. Numune işleme ve kapsama derinliğindeki farklılıklar nedeniyle sık sık endişeler dile getirilse de, solid tümörlerin yeni nesil dizilemesi tümör tipleri arasında son derece değişken derecede ITH'yi ortaya çıkardı. Klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesi yoluyla primer ve metastatik lezyonlar arasındaki genetik ilişkinin yakalanması, ileri evre hastalıklar için tedavilerin tasarlanması nda kritik öneme sahiptir. Burada, aynı hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesine olanak tanıyan karşılaştırmalı lezyonlar analizi için bir yöntem sunduk. Burada açıklanan deneysel yaklaşım, histolojik analiz, yüksek kapsama lı multi-lezyon dizilemesi ve immünopopnotipik analizler olmak üzere üç köklü yaklaşımı bütünleştirir. Uygun olmayan numune işleme ile subklonal olayların saptanması üzerindeki etkileri en aza indirmek için, dokuları dikkatli patolojik inceleme ve neoplastik hücre zenginleştirme tabi tetkik. Daha sonra neoplastik lezyonlar dan ve normal dokulardan kaliteli kontrollü DNA, 409 ilgili kanser geninin kodlama bölgelerini hedefleyerek yüksek kapsama alanına tabi tutuldu. Yaklaşımımız sadece sınırlı bir genomik alana bakarken, belirli bir hastanın farklı lezyonlarındaki somatik değişiklikler (tek nükleotit mutasyonları ve kopya numarası varyasyonları) arasındaki heterojenliğin derecesini değerlendirmeyi sağlar. Sıralama verilerinin karşılaştırmalı analizi sayesinde, klonal ve subklonal değişiklikleri ayırt edebildik. ITH çoğunluğu genellikle yolcu mutasyonları atfedilir; bu nedenle, mutasyonların fonksiyonel sonuçlarını tahmin etmek için immünohistokimyayı da kullandık. Bu protokol belirli bir tümör tipine uygulanmış olsa da, burada açıklanan metodolojinin diğer solid tümör tipleri için genel olarak geçerli olduğunu öngörüyoruz.
Introduction
Yeni nesil sıralama gelişiyle (NGS) kanserler teşhis ve tedavi yolu devrim yarattı1. Çok bölgesel sıralamaya bağlı NGS, solid tümörlerde yüksek derecede intra-tümöral heterojenite (ITH) maruz kalmıştır2, bu da kısmen farklı ilaç duyarlılığı 2 ile subklonların varlığı nedeniyle hedeflenen tedavinin başarısızlığını açıklar2 . Genom çapında sıralama çalışmalarının yarattığı önemli bir sorun, bireysel kanserlerde yolcu (yani nötr) ve sürücü mutasyonlarını birbirinden ayırma zorunluluğudur3. Çeşitli çalışmalar gerçekten göstermiştir ki, bazı tümörlerde, yolcu mutasyonları ITH çoğunluğu için hesap, sürücü değişiklikleri aynı bireysel lezyonlar arasında korunmuş olma eğilimindediriken 4. Ayrıca büyük mutasyonal yük (akciğer kanserleri ve melanom görüldüğü gibi) mutlaka büyük bir subklonal mutasyonyükü anlamına gelmez dikkat etmek önemlidir2. Bu nedenle, düşük mutasyonyükü olan tümörlerde yüksek derecede ITH bulunabilir.
Metastazlar dünya çapında kansere bağlı ölümün %90'ından sorumludur5; bu nedenle, primer ve metastatik lezyonlar arasında sürücü genlerinin mutasyonel heterojenliğini yakalamak ileri evre hastalıklar için etkili tedavilerin tasarlanması açısından kritik öneme sahiptir. Klinik sıralama genellikle sabit dokulardan gelen nükleik asitler üzerinde yapılır, bu da dna kalitesinin düşük olması nedeniyle genom çapında keşifleri zorlaştırır. Diğer taraftan, klinik sıralamanın amacı, belirli bir terapötik rejime yanıt verme/yanıt vermeme yi öngörebilecek eyleme geçirilebilir mutasyonları ve/veya mutasyonları belirlemektir. Haliyle, dizileme, klinik olarak ilgili bilgilerin zamanında çıkarılması için genomun daha küçük bir kısmıyla sınırlandırılabilir. Düşük iş türünde DNA profilleme (örneğin, Sanger Sıralama) NGS geçiş mümkün kapsama yüksek bir derinlikte kanserle ilgili genlerin yüzlerce analiz etmek için yaptı, hangi subklonal olayların tespiti için izin verir. Burada, aynı bireyden farklı örnekler arasında klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesine olanak tanıyan karşılaştırmalı lezyonlar analizi için bir yöntem sunduk. Burada açıklanan yöntem, tanımlanan varyasyonların fonksiyonel sonuçlarını tahmin etmek için üç köklü yaklaşımı (histolojik analiz, yüksek kapsamalı multi-lezyon dizilemesi ve immünopnotipik analizler) entegre eder. Yaklaşım şematik olarak Şekil 1'de tanımlanmıştır ve pankreasın 5 metastatik solid psödopapiller neoplazm olgusu (SPN) olgusu çalışmaya uygulanmıştır. Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku örneklerinin işlenmesi ve analizini açıklarken, aynı prosedür taze dondurulmuş dokudan gelen genetik materyale de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışmada kullanılan malzeme yerel etik komitesi tarafından onaylanan özel bir protokol altında toplanmıştır. Tüm hastaların yazılı bilgilendirilmiş onayı mevcuttu.
1. Doku örneklerinin histolojik ve immünfenotipik revizyonu
NOT: Bundan sonra açıklanan faaliyetlerden uzman bir patolog sorumludur.
- Seçilen olguların köklü tanı kriterlerine göre histopatolojik revizyonu.
- Temsili FFPE doku bloklarından 4−5 μm kalınlığında doku kesitlerini kesmek ve bölümleri standart histoloji slaytlarına monte etmek için mikrotomu kullanın.
- Otomatik doku slayt boyası(Tablo Malzemeler)kullanarak her slayt için hematoksilin ve eozin boyama gerçekleştirin.
- Seçilen tümör olgularının histopatolojik tanısını WHO tanı kriterlerine göre gözden geçirin.
NOT: Bu aşamada, patolog aynı doku bölümü içinde tümörün morfolojik olarak farklı alanlarını belirleyebilir. Bu alanların ayrı ayrı hasat edilebilmektedir (bkz. bölüm 2). Tümör ve spn'ler için normal hücrelerin histolojik benzerliği Şekil 2'deverilmiştir. - Histolojik analizi tamamlamak ve immünophenotipik heterojeniteyi tahmin etmek için kurulan belirteçler için immünohistokimyasal boyama yapın.
NOT: Patolog aynı doku bölümü içinde tümörün immünfenotipik farklı alanlarını belirleyebilir. Bu alanların ayrı ayrı hasat edilebilmektedir (bkz. bölüm 2).
- Tümör doku bölümünün neoplastik hücreselliğini değerlendirin ve manuel mikrodiseksiyonu buna göre planlayın.
NOT: Bu tümör hücreselliği bir patolog tarafından oluşturulan bir tahmindir.- Doku bölümünün neoplastik hücre içeriği %70'in üzerindeyse, manuel mikrodiseksiyon zorunlu değildir; doğrudan adım 3.1'e taşıyın.
NOT: (i) mutant alel frekansı tahminleri için yeterli hassasiyeti sağlamak ve (ii) klonal mutasyonları daha az hassas metodolojilerle doğrulamak için (örn. kılcal sıralama) neoplastik hücre içeriğinin %70'ini hedefleyin. - Doku bölümünün neoplastik hücre içeriği %70'in altındaysa mikrodiseksiyon gereklidir ve adım 2'ye geçilir.
- Doku bölümünün neoplastik hücre içeriği %70'in üzerindeyse, manuel mikrodiseksiyon zorunlu değildir; doğrudan adım 3.1'e taşıyın.
- Neoplastik olmayan dokunun örneklendiği FFPE bloğundaki doku kesitlerini değerlendirin. Bu doku germline DNA kaynağı olarak kullanılır.
NOT: Kan, mikroplaline DNA'nın alternatif bir kaynağıdır. Bu durumda, adım 4.1 notunda tavsiye edilen DNA ekstraksiyonu ile devam edin.- Doku bölümünde sadece neoplastik olmayan doku görülebiliyorsa(Şekil 2D),manuel mikrodiseksiyona gerek yoktur; doğrudan adım 3.1'e taşıyın.
- Doku bölümünde neoplastik hücrelerden önemli kontaminasyon varsa, manuel mikrodiseksiyon gereklidir; bölüm 2'ye geçin.
2. Manuel mikrodisseksiksiyon
NOT: Bu yöntem çeşitli solid tümör tipleri için geçerlidir ve doku örneklerinin neoplastik hücre içeriğini artırmak için tasarlanmıştır. Alternatif olarak, bu yöntem morfolojik ve / veya immünfenotipik farklı alanlarda aynı doku bölümü içinde hasat için kullanılabilir.
- Bir mikrotom kullanarak, on 4−6 μm kalınlığında FFPE tümör doku kesitleri kesip şarjsız slaytlar üzerine monte edin.
NOT: Örnekte sadece 1 mm2 yuva kanser hücresi görülebiliyorsa, hedeflenen DNA miktarını (40 ng) elde etmek için 10 doku slaytı kesilerek manuel mikrodizisetabi tutulmalıdır; bu 1 mm2 küme 700 ve 1000 tümör çekirdekleri arasında içerdiğini varsayarsak. - 60 °C'de 10 dk kuluçkaya yayılın.
- Bir rafa slaytlar yerleştirin ve aşağıdaki yıkar gerçekleştirmek: 20 dakika için ksilen, 10 dakika için% 100 etanol, 10 dakika için% 80 etanol, 10 dakika için% 70 etanol, 1 dakika için distile su, 10 sin için hematoksilin karşı leke, 1 dk için musluk suyu.
- Standart ters mikroskopta, mikrodisese aracı olarak şırınga üzerinde 27 G iğne kullanın ve tümör hücrelerinin temsili kümelerini toplayın. Sıralama için gerekli miktarda DNA sağlamak için en az on 1 mm2 hücre toplayarak hasat edin.
NOT: Morfolojik olarak farklı alanların farklı varlıklar olarak analiz edilmesi amaçlanıyorsa, bu alanları ayrı ayrı toplamak için mikrodiseksiyon aracını kullanın. - Daha önce 20 μL proteaz K ve 180 μL lysis tampon(Malzeme Tablosu, dna ekstraksiyon kitinde yer alan Tablo) ile doldurulmuş 1,5 mL tüpler(Malzeme Tablosu)ve girdap ile karıştırın.
3. Önceki mikrodiszeksiyon olmadan dokuların işlenmesi
NOT: Bu işlem sadece neoplastik olmayan hücreler (germline DNA kaynağı) içeren veya morfolojik homojen kanser hücrelerinin en az %70'ini içeren doku blokları için kullanılır.
- Seçilen FFPE doku bloklarından altı adet 4−5 μm kalınlığında doku kesiti olan bir mikrotom kullanılarak. Adım 2.5'te açıklandığı gibi doku parşömenlerini 1,5 mL tüplere yerleştirin.
4. Normal ve neoplastik hücrelerden DNA çıkarma
- Üreticinin talimatlarına göre DNA FFPE doku çıkarma kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak normal ve neoplastik dokudaki DNA'yı arındırın.
NOT: Kan germin nükleik asit kaynağı olarak kullanıldığında, DNA kan çıkarma kiti(Tablo Malzemeler)kullanarak DNA'yı arındırın. - DNA nicelik ve kalite kontrolü
- Çift iplikçikli (dsDNA) miktarını ölçmek için, floresan nükleik asit lekesi(Malzeme Tablosu)içeren bir çözeltiye DNA örneğinin bir aliquot'unu ekleyin ve bir tezgah üstü florometre (Malzeme Tablosu) kullanarak yayılan floresanölçeri ölçün ).
NOT: Test, dsDNA'ya bağlı floresan boyalardan yayılan floresan sinyalin yoğunluğunu ölçer ve standart bir eğri kullanarak DNA miktarını belirler. - DNA'yı nitelemek için numunenin 260/280 ve 260/230 oranlarını ölçmek için mikro hacimsi spektrofotometre(Malzeme Tablosu)kullanın. "Saf" DNA 1.8 260/280 ve 1.8−2.2 aralığında bir 260/230 olmalıdır.
NOT: Numunenin spektrofotometrik değerlendirmesi, akış aşağı reaksiyonlarını etkileyen kimyasal kirleticilerin (örn. fenol) varlığını kanıtlamayı amaçlamaktadır. Kimyasal reaktiflerden kaynaklanan kontaminasyon durumunda, kolon tabanlı bir kit kullanarak bir temizleme adımı atın.
- Çift iplikçikli (dsDNA) miktarını ölçmek için, floresan nükleik asit lekesi(Malzeme Tablosu)içeren bir çözeltiye DNA örneğinin bir aliquot'unu ekleyin ve bir tezgah üstü florometre (Malzeme Tablosu) kullanarak yayılan floresanölçeri ölçün ).
5. Kütüphane hazırlama ve niceleme
NOT: Kütüphane hazırlama ve niceleme adımlarının şematik akış şeması Şekil 3'teve da belirtilmemiştir.
- DNA kitaplığı hazırlama (her örnek için 4 astar havuzu)
NOT: 4 astar havuzu kanser paneline aitMalzeme Tablosu. Her havuz, 409 genden oluşan çok katlı hedef seçimi için tasarlanmış astar çiftleri içerir. NGS panelini oluşturan genler listesine bir bağlantıMalzeme Tablosu.- Her örnek için dört DNA hedef amplifikasyon reaksiyonu hazırlayın, astar havuzu başına bir tane. Her astar havuzu için(Malzeme Tablosu),0,2 mL'lik bir tüp(Malzeme Tablosu):4 μL ana karışım (Kütüphane kitinde yer alanMalzeme Tablosu),10 μL yüksek sadakatli astar havuzu karışımı (Malzeme Tablosu, kanser paneli kütüphanesi) ve 6 μL DNA (toplam 10 ng).
- Aşağıdaki programı çalıştıran dört adet 1,5 mL tüpte her astar havuzunun hedef bölgelerini ayrı ayrı yükseltin: 99 °C'de 2 dakika (sıcak başlangıç polimerazın aktivasyonu), 16 döngü (99 °C'de 15 s, anneal ve 60 °C'de 8 dk boyunca uzatın) , 4 °C'de tutun.
NOT: Durma noktası. Hedef amplifikasyon reaksiyonlarını gece boyunca 4 °C'de veya -20 °C'de daha uzun süre saklayın. - Amfikonsların kısmi sindirimi sona erer
NOT: NGS üretici kiti tarafından sağlanan kılavuz, kısmi sindirimden önce her numuneden farklı amplifikasyon reaksiyonlarının biraraya geldiği bir adım öngörmektedir. Bu adımdan kaçının ve her amplifikasyon sindirim ayrı ayrı işleme tutun.- Her numunenin güçlendirilmiş havuzuna (her 0,2 mL borunun toplam hacmi 22 μL'dir) özel sindirim karışımının 2 μL'sini(Kitaplıkkitinde yer alan Malzeme Tablosu) ekleyin. Girdap iyice ve damlacıkları toplamak için her tüp santrifüj.
- Tüpleri termal döngüye yükleyin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 10 dk için 50 °C, 10 dk için 55 °C, 20 dk için 60 °C, 10 °C (1 saate kadar) tutun.
NOT: Durma noktası. Plakayı -20 °C'de daha uzun süre saklayın.
- Amplicons için ligate adaptörleri ve arındırmak.
NOT: Tek bir yonga üzerinde birden fazla kitaplık sıralarken her örnek için farklı bir barkod bağdaştırıcısı kullanın. Aynı örnekten alınan dört amplifikasyon reaksiyonu da aynı barkodu almalıdır.- Adaptörleri hazırlayın(Malzeme Tablosu,barkod adaptörleri kiti). Her barkod X için, 1:4 son seyreltme de P1 adaptörü ve benzersiz barkod adaptörleri(Malzeme Tablosu)bir karışımını hazırlayın. 4 μL suyu 2 μL P1 adaptörü ve 2 μL benzersiz barkod adaptörleri ile karıştırın. Akış aşağı geçişleri için bu barkod adaptör karışımı 2 μL kullanın.
- Bu sırada her numunenin her yükseltilmiş havuzuna ekleyerek ligasyon reaksiyonu gerçekleştirin: 4 μL anahtar çözeltisi(Kitaplıkkitinde yer alan Malzeme Tablosu), 2 μL barkod adaptör karışımı ve 2 μL DNA ligase (Malzeme Tablosu, kütüphane kiti) (toplam hacim = 30°L).
- Damlacıkları toplamak için iyice ve kısaca santrifüj girdap.
- Her tüpü termal döngüce yükleyin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 30 dk için 22 °C, 5 dk için 68 °C, 5 dk için 72 °C, 4 °C (24 saate kadar).
NOT: Durma noktası. Plakayı -20 °C'de daha uzun süre saklayın.
- Kütüphane temizliği ve amplifikasyon
- Her tüpü santrifüj edin ve sonra her barkodlu numuneyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Her numunenin her havuzuna 45°L boncuk bazlı saflaştırma reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Boncuk süspansiyonu DNA ile karıştırmak için 5 kat yukarı ve aşağı boru.
- Karışımı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın, ardından her tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve 2 dk. Peleti bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
- Her tüpe 150 μL taze %70 etanol ekleyin. Mıknatısın iki pozisyonunun her tüpünü yan yana hareket ettiren boncukları yıkayın. Supernatant atın ve pelet rahatsız etmemek için dikkat edin.
- Adım 5.1.5.3'te açıklanan prosedürleri tekrarlayın ve tüpleri mıknatısta tutun ve boncukları 5 dakika boyunca RT'de havakurutun.
- Mıknatıstan her astar havuzunun saflaştırılmış kütüphaneleri ile tüpleri çıkarın ve boncuk peletine 50 μL yüksek sadakatli PCR Mix(Malzeme Tablosu)ve 2 μL kütüphane amplifikasyon astar karışımı(Malzeme Tablosu, kütüphane kitinde yer alan) ekleyin her tüp.
- Girdap her 1.5 mL tüp ve kısaca damlacıkları toplamak için santrifüj.
- Mıknatısın içine 1,5 mL tüpler yerleştirin ve her tüpten süpernatantı (~50 μL) peleti bozmadan yeni bir 0,2 mL tüpe dikkatlice aktarın.
- Aşağıdaki programı çalıştıran her astar havuzunun kütüphanelerini yükseltin: enzimi etkinleştirmek için 2 dk için 98 °C'de tutun, 5 döngü (15 s için 98 °C'de denatüre, anneal ve 64 °C 1 dk'da uzatın), 4 °C'de tutun. Örnekleri -20 °C'de saklayın.
- Güçlendirilmiş kütüphanenin arınması
- En alttaki içeriği toplamak ve güçlendirilmiş her kütüphane örneğini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarmak için her tüpü santrifüj edin.
- Boncuk bazlı saflaştırma reaktifi 25 μL ekleyin. Boncuk süspansiyonu DNA ile karıştırmak için 5 kat yukarı ve aşağı boru.
- Karışımı RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve tüpleri mıknatısın içine 5 dk yerleştirin.
- Peleti rahatsız etmeden her tüpten yeni tüplere ampliconiçeren süpernatant'ı dikkatlice aktarın.
- Boncuk süspansiyonu ve DNA'yı karıştırmak için her tüpün supernatant'ına 60°L boncuk bazlı saflaştırma reaktifi ekleyin ve yukarı ve aşağı borular ekleyin.
- Karışımı RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve tüpleri 3 dk mıknatısa yerleştirin.
- Her tüpten supernatant atın ve pelet rahatsız değil dikkat edin.
NOT: Amfikonlar boncuklara bağlıdır. - Her tüpe 150 μL taze %70 etanol ekleyin. Mıknatısın iki pozisyonunda tüpleri yan yana hareket ettiren boncukları yıkayın. Supernatant atın ve pelet rahatsız etmemek için dikkat edin.
- Adım 5.1.6.8'de işlemi tekrarlayın ve 3 dk.
- Tüpleri mıknatıstan çıkarın ve boncukları dağıtmak için pelete 50 μL düşük Tris EDTA (TE) (Kütüphane kitinde yer alanMalzeme Tablosu)ekleyin.
- Karışımı birkaç kez yukarı ve aşağı pipet ve 2 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
- Tüpleri en az 2 dakika mıknatısa yerleştirin ve amfikononları içeren süpernatant'ı boncukları rahatsız etmeden yeni tüplere dikkatlice aktarın.
- Kütüphane nicelleştirme
- Yüksek duyarlılıklı DNA kiti protokolüne göre bir DNA çipi çalıştırmak için bir parça analiz aleti(Malzeme Tablosu)kullanın.
6. Kütüphaneler havuzlama ve sıralama çalışması
- Her kütüphaneyi çekirdeksiz suyla 100 pM'ye seyreltin. Tek bir tüpte tek bir çalışma için her 100 pM kitaplıktan 10 μL'yi birleştirin. Pipetleme ile kombine kitaplıkları karıştırın ve templating ve sıralama devam edin.
- Planlı çalıştırma oluşturma
NOT: Tipik bir çalışma, laboratuvarda bulunan sıralayıcıya (Ion Proton Sistemi veya GeneStudio S5 Sistemi, Malzeme Tablosu)dayalı iki farklı tipte yarı iletken yongaya (Iyon PI çip veya Iyon 540 çip) yüklenebilen dört numune içerir. Bu sistemler genellikle çalıştırıbaşına 80 milyon okuma üretir.- Torrent Tarayıcısını sıralama sistemine bağlı bir bilgisayarda açın (örn. Iyon Şef Sistemi) ve seçili uygulama (AmpliSeqDNA) için genel şablonu kullanarak yeni bir çalışma planlayın.
- Planın Kitleri sekmesine geçin. Kullanılan sıralama sistemine göre enstrüman açılır listesinden Ion Proton Sistemi veya Ion GeneStudio S5 Sistemini seçin.
- Sıralama sistemine bağlı olarak, Chip Type açılır listesinden uygun çipi (Ion Proton Sistemleri için PI çipi; Ion GeneStudio S5 Systems için 540 yonga) seçin.
- Kitaplık Kiti açılır listesinden Ion AmpliSeq 2.0 Kitaplık Kiti'ni seçin.
- Şablon Kiti için Ion Chef düğmesini seçin ve ardından Şablon Kiti açılır listesinden uygun Şef Kiti'ni (PI çipi için Ion PI Hi-Q Chef Kit veya 540 çip için Ion 540 Kit-Chef) seçin.
- Sıralama Kiti açılır listesinden uygun sıralama kitini (PI çipi için Ion PI Hi-Q Sıralama 200 Kiti veya 540 çip için Ion S5 Sıralama Kiti) seçin ve ardından Barkod Seti açılır listesinden IonXpress'i seçin.
- Eklenti sekmesine geçin ve Kapsam Analizi eklentisini seçin.
- Plan sekmesine geçin. Referans Kitaplığı açılır listesinden GRCh37/hg19 genomunu seçin. Hedef Bölgeler açılır listesinden sıralanacak uygun paneli seçin.
- Sıralanacak barkod sayısını ve kitaplık örnek tüplerinin etiketini uygun alanlara ayarlayın.
- Her kitaplığın barkod adını ve örnek adını ayarlayın.
- Örnek kitaplıklar seyreltme ve yükleme.
- Stok kitaplığını pi çip için 25 pM'ye veya 540 çip için 32 pM'ye kadar nükleaziçermeyen su yla seyreltin.
- Her seyreltilmiş kitaplığın 50°L'lik kısmını uygun kitaplık örnek tüpünün altına kadar pipet.
- Sıralama sistemini açın ve gerekli tüm reaktifleri yüklemek ve çalışma planını almak için ekrandaki yönergeleri izleyin.
- Havuzlu kitaplıkları içeren kitaplık örnek tüpünü yükleyin ve klonal amplifikasyon programını başlatın.
NOT: Ion Chef Sistemi her koşuda iki fiş hazırlanmasını gerektirir.
- Ion Proton veya Ion GeneStudio S5'te sıralama.
- Sıralama sistemini açın ve sıralamayı başlatma ve çalışma planını almak için ekrandaki yönergeleri izleyin.
- Sıralama yongasını sıralama sisteminden çıkardıktan sonra yükleyin.
NOT: Elektrostatik deşarj nedeniyle talaş hasarından kaçınmak için bir çipi almadan önce topraklanmalıdır. Fiş işleme/konumlandırma ve başarılı/başarısız yükleme örnekleri Şekil 4'tebildirilmiştir. - Yonga bölmesinin kapağını kapatın ve Chip Durumu simgesi "Hazır" gösterene kadar bekleyin.
- İlk çalıştırma tamamlandığında atık kabıboşaltın, ardından kalan fişi mümkün olan en kısa sürede sıralayın.
7. Mutasyonlar ve kopya-sayı varyasyonları (CNVs) analizi
NOT: Sıralama verilerinin GRCh37/hg19 insan referans genomuna hizalanması planda (adım 6.2.8) ayarlandıktan sonra otomatik olarak gerçekleştirilir.
- Kapsama derinliğini ve tekdüzeliği doğrulamak için Kapsam Analizi eklentisini(Malzeme Tablosu)çıktısını kullanın.
- Torrent varyant arayan eklentisini(Malzeme Tablosu)kullanarak, germline veya somatik iş akışını uygun şekilde seçerek varyant aramasını gerçekleştirin.
- Filtre uygulanmış varyantları Varyant Arama Biçimi (VCF) dosyalarını indirin. Variant Effect Predictor (VEP) yazılımı6 ve NCBI RefSeq veritabanını kullanarak açıklama lı varyantları açıklama.
- Ion Reporter yükleyici eklentisini kullanarak Ion Reporter Yazılımındaki sıralama verilerini yükleyin ve CNVs'leri tahmin etmek için verileri analiz etmek için Kapsamlı Kanser Paneli tümör normal çifti iş akışını kullanın.
- Yazılım tarafından atanan puanlara göre mutasyonları ve CNV'leri el ile filtreleyin ve bunları Entegre Genomik Görüntüleyici (IGV)7ile görsel olarak doğrulayın.
- Dizilişi görsel olarak, artefakt çağrıları oluşturabilecek olağandışı okumalar (örneğin, yanlış telaffuz, aşırı amplifikasyon veya yumuşak kırpma okumaları nedeniyle) için hizalamayı denetleyin.
- Temel innormalleştirilmiş kapsama karşı belirli bir gen genelinde tüm amplicons için normalleştirilmiş kapsama inceleyerek CNVs doğrulayın.
NOT: Bu, bazen bir genin sonunda ve ardışık genin başında birkaç amfikonssimetrik anormal kapsama dayalı bir CNV çağıran segmentasyon yazılımı nedeniyle yanlış çağrıların düzeltilmesine yardımcı olur.
- Somatik mutasyonların indekslemi
- Her olguda indeks mutasyonu normal doku/kan, primer tümör ve metastaz dizilimi nden kaynaklanır.
- Germline olarak işaretle ve germline DNA'sının veri sıralamaverileri de belirgindir aramaları atın.
- Belirli bir hastanın tüm lezyonları arasında paylaşılan mutasyonları klonal/kurucu olarak işaretle.
- Subklonal/ilerleme veya belirli bir hastanın tüm lezyonlarında değil de bazılarında saptanan mutasyonlar olarak bayrak.
8. İmmünopnotisik analiz: ilgili protein ekspresyonu için immünohistokimya
NOT: İmmünohistokimya, tümör baskılayıcı genlerdeki mutasyonların aktive edici sonuçları doğrulamak için kullanıldı.
- Bir mikrotom kullanarak, 3−4 μm kalınlığında FFPE doku kesitleri kesip yüklü slaytlara monte edin ve 60 °C'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- Slaytları bir rafa yerleştirin ve aşağıdaki adımları yapın: 10 dk için ksilen, 10 dakika için ksilen, 4 dk için %95 etanol, 4 dk için %95 etanol, 4 dk için %70 etanol, 4 dk için %70 etanol, 4 dk için distile su.
- Antikor üreticilerinin endikasyonuna göre antijen alımı gerçekleştirin(Malzeme Tablosu).
- Belirli antijen alma çözeltisi ile bir rafa slaytlar yerleştirin ve sub-kaynama sıcaklıklarda bir su banyosu batırın.
- Banyodan slaytlar çıkarın ve 10 dakika soğuması için musluk suyu çalıştırın.
- Endojen peroksidazları inaktive etmek için slaytları RT'de 20 dakika boyunca 1x Tris tamponlu salinde (TBS) %3 H2O2 ile yeni bir rafa yerleştirin.
- Slaytları yeni bir rafa yerleştirin ve TBS ile 3 kat yıkayın ve Tween 20'nin %0,1'ini (TBST) yıkayın.
- Slayta monte edilmiş dokunun etrafına hidrofobik bir daire çizmek için PAP kalemi(Malzeme Tablosu)kullanın.
- Slaytları nemli bir odaya yerleştirin ve tbst'de %5 büyükbaş serum albumin (BSA) kullanarak 1 saat boyunca rt'de engelleme yi engelleyin.
- Bir gecede 4 °C'de nemli bir odada birincil antikorlarla(Malzeme Tablosu)kuluçka yada slaytlar. Tavsiye edilen blokaj çözeltisi ile birincil antikor seyreltin.
- Slaytları yeni bir rafa yerleştirin ve TBST ile 3x yıkayın.
- Nemli bir odada RT'de 30 dakika boyunca spesifik ikincil antikorlarla (anti-fare veya anti-tavşan) (1 slayt için 4−5 damla) ile inküböz slaytlar.
- Yeni bir rafa slaytlar yerleştirin ve TBST ile 3x yıkayın ve distile suda sonra.
- 3,3'-diaminobenzidin (DAB) çözeltisi seyreltme 1 mL seyreltme tampon (Malzeme Tablosu). Mikroskop altında 5 dakika kontrol için en fazla 5 dakika inküböz slaytlar.
- Mikroskop altında reaksiyon gelişimini izleyerek kuluçka süresini hesaplamak için pozitif bir kontrol kullanın.
NOT: Her antikor belirli bir kuluçka süresine ihtiyaç duyar. - Distile suya slaytlar batırarak inaktif DAB (kromojen yağış durdurun).
- 10 s hematoksilin ile yeni bir rafa daldırma ve daha sonra musluk suyu ile durulayın tarafından Counterstain slaytlar.
- Slaytları bir rafa yerleştirin ve aşağıdaki adımları yapın: 4 dk için %70 etanol, 4 dk için %70 etanol, 4 dk için %95 etanol, 4 dk için %95 etanol, 10 dakika ksilen, 10 dakika ksilen.
- Her doku slaytına birkaç damla montaj ortamı(Malzeme Tablosu)koyarak ve kapak lı kapaklı slaytları kapatın.
- Aşırı orta ve hava kabarcıklarını dokudan uzaklaştırıp kapak ve hava kurusundan uzaklaştırmak için kapak kaymasına basınç uygulayın.
- Ters mikroskop altında yapılan boyama sonuçlarını uzman bir patolog ile değerlendirin ve skorlandırın.
NOT: Puanlama sistemi, literatürdeki bilgilerin zaten mevcut olabileceği belirli antijenlere bağlıdır. Literatürde bilgi yoksa, referans olarak normal dokudaki antijenifadesini kullanarak bir puanlama sistemi türetin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çalışma iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir. 409 kanserle ilişkili genin kodlama dizilerini hedefleyen 5 SPN olgunun çoklu lezyonlar (n = 13) dizilimi 8 gende toplam 27 somatik mutasyon tespit edilir(CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1, ve FGFR3). Mutasyonlar, belirli bir hastanın tüm lezyonları arasında paylaşıldığında kurucu/klonal, belirli bir hastanın tüm lezyonlarında değil de tüm lezyonlarda tespit edildiğinde ilerleme/subklonal olarak tanımlanmıştır(Şekil 5A,B). Genel olarak, kohort genelinde saptanan nokta mutasyonlarının çoğu CTNNB1, KDM6A, TET1 ve FLT1mutasyonlarını içeren klonal olaylardır. Tutarlı olarak β-katenin (CTNNB1protein ürünü) ve KDM6A için immünohistokimyasal boyama karşılık gelen genlerin mutasyonu olan olguların çeşitli lezyonları arasında homojendi(Şekil 6A,B). Mutasyona uğramış örneklerde KDM6A için ılımlı boyama genetik değişiklik protein ekspresyonu yerine fonksiyonu değiştirmek olası olduğunu ileri sürdü. Pankreas tümörlerinde KDM6A fonksiyon kaybı hipoksi belirteci GLUT18'indikdüzenlenmesi ile ilişkilidir ve buna bağlı olarak GLUT1 KDM6A mutasyonu taşıyan olgularda aşırı ifade edilmiştir (Şekil 6C). Subklonal mutasyonların BAP1, SMAD4, TP53 ve FGFR3'ü etkilediği saptadı. BAP1 ve TP53 immünohistokimyası bu genlerdeki mutasyonların subklonal olduğunu doğrulamıştır(Şekil 6D,E). Kopya-sayı varyasyonu (CNV) analizi sıralama verileri kullanılarak gerçekleştirildi ve Şekil 7A'dagösterildiği gibi analiz edilen tüm örneklerde değişiklikler ortaya çıktı. Nokta mutasyonlarından farklı olarak, CNV değişikliklerinin çoğu subklonaldır (Şekil 7B).
Şekil 1: Metastatik lezyonlar üzerinde yapılan analizin akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Normal ve tümör dokularının temsili histolojisi.
(A, B) Tümör dokusu (T) normal dokuya bitişik (N). Bu iki doku kesitinde tümör ve normal dokular ayrı ve iyi kapalı alanlar olarak tanımlanabilir. (C) Normal pankreas hücrelerinin kümeleri (N*) tümör dokusu (T) içine gömülü olarak görülebilir. (D) Normal pankreas dokusunun morfolojisi. Ölçek çubuğu 1 mm'yi temsil emz.
Şekil 3: Kütüphane hazırlama ve niceleme protokolü adımının şematik akış şeması.
Şekil 4: Iyon proton çip yükleme ve çalışıyor.
(A) Talaş yönü ve talaş kıskacına yerleştirilmesi (solda). Metal sekme geri değiştirme (sağda). (B) İki farklı yonga yüklemesinde kütüphanelerin yoğunluğunu gösteren ısı haritaları. Kütüphanelerin başarılı bir klonal amplifikasyonu nedeniyle iyi bir yükleme yoğunluğu (üst) örneği, fiş yüzeyinin sıralama parçacıklarıyla %94 yüklenmesiyle sonuçlanır (139 milyon okuma, otomatik kalite filtrelemeden sonra son çıktı 90 milyon okuma). Kütüphanelerin verimsiz klonal amplifikasyonu nedeniyle zayıf bir yükleme (alt) örneği, fiş yüzeyinin sıralama parçacıklarıyla %40 yüklenmesiyle sonuçlanır (59 milyon okuma, otomatik kalite filtrelemeden sonra son çıktı 12 milyon okuma).
Şekil 5: Metastatik lezyonlarda somatik değişiklikler.
(A) Eşleşen primer/metastatik lezyonlarda saptanan somatik mutasyonlar. (B) Tüm lezyonlar (kurucu/klonal) arasında paylaşılan değişiklikler ve belirli bir vakadaki örneklerin tümünün (progressor/subklonal) değil, bir veya daha fazla sında saptanan değişiklikler de dahil olmak üzere, her vakada total somatik mutasyonlar görüntülenir. Vaka başına sıralanmış tek tek metastatik lezyon (m) sayısı belirtilir. Bu rakam Amato ve ark.8'denyeniden yayınlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Primer ve metastatik lezyonlarda β-katenin, KDM6A, GLUT1, BAP1 ve TP53 için immünboyama.
(A) TÜM ÖRNEKLERDE (primer ve metastatik) β-katenin nükleer birikimini gösteren temsili immünohistokimyasal görüntüler, CTNNB1'in SPN rulman mutasyonundan. (B) Lezyonların immünohistokimyasal boyanması KDM6A'nın klonal mutasyonunu taşıyan metastatik SPN. (C) KDM6A mutasyonu taşıyan bir SPN'de GLUT1 aşırı ekspresyonu, yabani tip dokuda immünreaktivite gözlenmedi. (D, E) BAP1 ve TP53 ekspresyonu verileri bu iki gendeki mutasyonların subklonal olduğunu gösterir. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil ediyor ve inset büyütme 600X'tir. Bu rakam Amato ve ark.8'dendeğiştirilmiştir.
Şekil 7: Metastatik lezyonlarda somatik kopya-sayı değişiklikleri.
(A) Sanal karyotip görünümü, temsili bir durumda değiştirilmiş genlerin konumunu, yakınlığını ve kopya numarası durumunu gösterir. Kromozom bantlarının boyama şeması aşağıdaki gibidir: siyah ve gri = Giemsa pozitif, açık kırmızı = centromere, mor = değişken bölge. Değişiklikler, şekil olarak sunulan renk kodlarına göre açıklamalı olarak açıklanır. Kısaltmalar: CNV, kopya numarası varyasyonu; P, primer SPN; L(a-c), karaciğer metastazları. (B) Tüm lezyonlar (kurucu/klonal) arasında paylaşılan değişiklikler ve belirli bir vaka için örneklerin bir veya daha fazlasında (ama hepsi değil) saptanan değişiklikler de dahil olmak üzere, her vakada total somatik değişiklikler (CNV'den etkilenen genler) görüntülenir (progressor/subclonal). Vaka başına sıralanmış tek tek metastatik lezyon (m) sayısı belirtilir. Bu rakam Amato ve ark.8'denyeniden yayınlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yöntemimiz, katı tümörlerin ilerlemesinde rol oynayan moleküler değişikliklerin, belirli bir hastanın farklı lezyonlarından dikey verilerin (yani morfoloji, DNA dizilemesi ve immünohistokimya) entegrasyonu yoluyla belirlenmesini sağlar. 409 kanserle ilgili genin kodlama dizilerini sorgulayarak mutasyonel sessiz tümör tipinde (yani, SPN, pankreasın solid-psödopapiller neoplazmı) klonal ve subklonal olayları tespit etme yöntemimizin yeteneğini gösterdik8. Burada kullanılan amplicon tabanlı hedefli sıralama yaklaşımının bir avantajı, 1000x'in tipik ortalama kapsama derinliğinde sorgulanan bölgelerde (15.992) kapsama alanının tekdüzeliğidir (%90 hedef bazlar 100x, %95'i 20x'tir) kapsamaktadır. Mikrodisese ile neoplastik hücre zenginleştirme ile birleşen yüksek kapsama derinliği, düşük alel frekansı olaylarının tespiti için yüksek hassasiyeti garanti eder. Daha önce de gösterdiğimiz gibi9, hedeflenen sıralama yaklaşımı FFPE dokudna örnekleriüzerinde% 2 alel frekansı aşağı mutasyonların tespiti sağlar. Örnek olarak, bu çalışmada metastatik bir örnekte(Şekil 5)subklonal bir olay olarak %4'lük alel frekansı TP53 missense mutasyonu tanımlayabildik ve bu oluşumu immünohistokimya ile doğrulayabildik (Şekil 6). Protokolümüz, somatik olayları belirlemek ve buna göre sadece boru hattı10kanserlerin subklonal mutasyonlarının yanlış saptanma oranını azaltmak için eşleşen tümör ve germline DNA'nın dizilemesi öngörmektedir. Eşleşen germline DNA mevcut olmadığında, bir "sıcak nokta mutasyonlar" çağıran varyantları sınırlayan yanı sıra kapsama minimum derinliğe dayalı sıkı filtreler de dahil olmak üzere, sıralama verilerinin analizinde daha muhafazakar parametreler benimseyerek düşünebilirsiniz ve mevcut veritabanlarında yaygın olarak açıklamalı mutasyonlar. Eşleşen tümörlerin yanı sıra germline DNA dizilimi de kopya numarası varyasyonları (CNV) doğru algılama sağlayan avantajı vardır. Alternatif olarak, cinsiyete uygun diploid genom havuzları, verilerin sıralanmasından kaynaklanan gürültüyü azaltmak ve CNV'nin algılanmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir. Germline DNA dahil ek olarak, astar havuzu dengesizliğini azaltmak ve CNV arama geliştirmek için kütüphane protokolü değiştirildi. Orijinal protokole göre, multipleks PCR'den sonra her DNA örneğinden üretilen dört amplicon havuzu birlikte karıştırılmalı ve kalan adımlar numune başına bir tüp halinde yapılmalıdır. Bu ancak havuz başına çok katlı PCR farklı tüpler arasında farklı verimlilik olabilir gerçeği nedeniyle kapsama derinliği ortalama dalgalanmalar neden olur. Özgün protokolde bu etkiyi hesaba katmak için havuz niceleme/normalleştirme adımı yoktu. Yukarıda açıklanan dalgalanmaları önlemek için, dört amplicon havuzunun her birini tüm kütüphane üretim protokolü boyunca ayrı tutmaya karar verdik, ta ki sayısallaştırılana kadar. Niceleme göre, her DNA örneği için dört havuzun her biri için aynı miktarda son kütüphane havuzuna eklenebilir ve böylece son ortalama kapsama alanı mümkün olduğunca düzgün olmalıdır.
İntra-tümör heterojenitesi (ITH) genetik düzeyde değerlendirilmesi önemli klinik etkileri vardır ama benzer yeni sorunlar teşkil2. Önemli bir sorun gerçekten sürücü mutasyonları ve stokastik olaylar (yani, yolcu mutasyonları) arasında ayrım gereğidir. Sürücü ve yolcu mutasyonları arasındaki ayrım genellikle hesaplamalı olarak gerçekleştirilir, ancak önyargılar olmadan değil. Tespit edilen varyantların sistematik işlevselleştirilmesi maliyetli ve zaman alıcı olmakla birlikte, genetik varyantların fonksiyonel sonuçları, en azından bir gen alt kümesi için, ilgili proteinin immünohistokimyasal analizi veya dolaylı olarak, protein disfonksiyonunun vekil belirteçlerinin ekspresyonunu ölçerek. Protokolümüz FFPE dokularına uygulanmıştır, bu da klinik ortamdaki ana malzeme kaynağını temsil eder, ancak sıralama için zorluklar ortaya koymuştur; izole nükleik asitlerin kalitesi her zaman sıralama dan önce değerlendirilmelidir11. Hedeflenen sıralama, hesaplama gereksinimleri açısından uygun maliyetli ve son derece talepkar olmamak gibi büyük bir avantaja sahip olmasına rağmen, genomun sadece sınırlı bir kısmını sorgulamanın büyük bir dezavantajına sahiptir ve bu da büyük olasılıkla hafife almaya yol açar. tümör içi heterojenite. Ayrıca, bu yaklaşım metastaz ve primer tümörler arasında ilgili epigenetik ve transkripsiyonel farklılıklar dikkate alınmadığı için son zamanlarda bazı tümör tiplerinde genetik farklılıklardan daha ağır bastığı gösterilmiştir4,12, 13. yıl. Ancak, teknolojik gelişmelerin yakında ITH'nin daha iyi değerlendirilmesi için daha zengin bir dikey veri topluluğunun entegrasyonuna olanak sağlayacağı öngörülüyor. Yaklaşımımız, derinliği genomun fiziksel kapsamına tercih eder, bu da uygun SNV tabanlı filojenler oluşturma yeteneğimizi sınırlar. Ancak yöntemimiz, moleküler ve histopatolojik analizlerin entegrasyonu sayesinde klinik örneklerde genetik akrabalığı uygun hassasiyet ve özgüllükle keşfetme imkanı sağlamaktadır. Bu protokolü belirli bir tümör tipine (örneğin, SPN) başarıyla uyguladık ve yöntemin benzer şekilde diğer solid tümör tipleri üzerinde de işe yaraacağını öngörüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Çalışma İtalyan Kanser Genom Projesi (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Hibe No. 12182 AS ve 18178 VC), FP7 Avrupa Topluluğu Hibe (Cam-Pac No 602783 AS). Finansman kuruluşlarının verilerin toplanması, analizi ve yorumlanmasında veya makalenin yazımında hiçbir rolü yoktur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | - | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | - | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | - | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software - uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | - | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | - | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | - | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
- Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
- McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
- Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).
- Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
- Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).
