Sammenlignende lesjoner analyse gjennom en målrettet sekvensering Approach

Summary

Denne artikkelen beskriver en metode for å identifisere klonal og subclonal endringer mellom forskjellige prøver fra en gitt pasient. Selv om eksperimenter beskrevet her fokus på en bestemt tumor type, tilnærmingen er bredt gjelder for andre solide svulster.

Abstract

Vurdering intra-tumoral heterogenitet (i) er av overordnet betydning for å forutse svikt i målrettede terapier og design følgelig effektive anti-tumor strategier. Selv om bekymringer er ofte reist på grunn av forskjeller i utvalg behandling og dybde av dekning, neste generasjons sekvensering av solide svulster har unraveled en svært variabel grad av i over tumor typer. Å fange de genetiske Relatedness mellom primære og metastatisk lesjoner gjennom identifisering av klonal og subclonal populasjoner er avgjørende for utformingen av terapi for fremskritt-stadium sykdommer. Her rapporterer vi en metode for sammenlignende lesjoner analyse som gjør det mulig for identifisering av klonal og subclonal populasjoner mellom ulike eksemplarer fra samme pasient. Den eksperimentelle tilnærmingen som beskrives her integrerer tre veletablerte tilnærminger: histologiske analyse, høy dekning multi-lesjon sekvensering, og immunophenotypic analyser. For å minimere virkningene på påvisning av subclonal hendelser ved upassende prøve behandling, vi utsatt vev til forsiktig patologisk undersøkelse og neoplastic celle berikelse. Kvalitetskontrollert DNA fra neoplastic lesjoner og normal vev ble deretter utsatt for høy dekning sekvensering, rettet mot koding regionene i 409 relevante kreft gener. Mens vi bare ser på et begrenset genomisk rom, gjør vår tilnærming det mulig å evaluere omfanget av heterogenitet blant somatiske endringer (nukleotid mutasjoner og kopierings nummer variasjoner) i forskjellige lesjoner fra en gitt pasient. Gjennom sammenlignende analyse av sekvensering data, var vi i stand til å skille klonal g. subclonal endringer. Flertallet av i. er ofte tilskrevet passasjer mutasjoner; Derfor brukte vi også immunhistokjemi til å forutsi funksjonelle konsekvenser av mutasjoner. Selv om denne protokollen har blitt brukt på en bestemt tumor type, forventer vi at metodikken beskrevet her er bredt gjelder for andre solide tumor typer.

Introduction

Ankomsten av neste generasjon sekvensering (NGS) har revolusjonert måten kreft er diagnostisert og behandlet¹. NGS koplet til fler regionale sekvensering har eksponert en høy grad av intra-tumoral heterogenitet (i) i solide svulster², noe som forklarer delvis svikt i målrettet terapi på grunn av tilstedeværelsen av subclones med ulike medikament følsomhet² . En viktig utfordring utgjøres av Genova-Wide sekvensering studier er nødvendigheten av å skille mellom passasjer (dvs. nøytral) og driver mutasjoner i enkelte kreft^tre. Flere studier har faktisk vist at i visse svulster er passasjer mutasjoner rede for flertallet av i., mens driver endringer har en tendens til å bli bevart blant lesjoner av samme person⁴. Det er også viktig å merke seg at store mutational byrde (som sett i lungekreft og melanom) ikke nødvendigvis innebærer en stor subclonal mutational byrde². Derfor kan en høy grad av i... bli funnet i svulster med lav mutational byrde.

Metastaser er ansvarlig for mer enn 90% av kreft-relaterte dødsfall over hele verden⁵; Derfor er det å fange opp de mutational heterogenitet av driver gener blant primær-og metastatisk lesjoner avgjørende for utformingen av effektive terapier for avanserte fase sykdommer. Klinisk sekvensering er vanligvis utført på nukleinsyre syrer fra fast vev, som gjengir Genova hele leting vanskelig på grunn av dårlig DNA-kvalitet. På den annen side er hensikten med klinisk sekvensering å identifisere praktiske mutasjoner og/eller mutasjoner som kan forutsi respons/fungere bedre til en gitt terapeutisk diett. Som det står, kan sekvensering begrenses til en mindre brøkdel av Genova for rettidig utvinning av klinisk relevant informasjon. Overgangen fra DNA-profilering med lav gjennomstrømning (f.eks. sanger sekvensering) til NGS har gjort det mulig å analysere hundrevis av kreft relevante gener på en høy deknings dybde, noe som gjør det mulig å oppdage subclonal hendelser. Her rapporterer vi en metode for sammenlignende lesjoner analyse som gjør det mulig for identifisering av klonal og subclonal populasjoner mellom ulike eksemplarer fra samme individ. Metoden beskrevet her integrerer tre veletablerte tilnærminger (histologiske analyse, høy-dekning multi-lesjon sekvensering, og immunophenotypic analyser) for å forutsi funksjonelle konsekvenser av variantene identifisert. Tilnærmingen er skjematisk beskrevet i figur 1 og har blitt anvendt på studiet av 5 metastatisk tilfeller av solide pseudopapillary svulster (SPNer) i bukspyttkjertelen. Mens vi beskriver prosessering og analyse av formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vevsprøver, kan den samme fremgangsmåten påføres genetisk materiale fra fersk-frosset vev.

Protocol

Materialet som ble brukt i studien ble samlet inn under en spesifikk protokoll som ble godkjent av den lokale etikk komitéen. Skriftlig informert samtykke fra alle pasientene var tilgjengelig.

1. histologiske og immunophenotypical revisjon av vevsprøver

Merk: en ekspert patologen er ansvarlig for aktiviteter beskrevet heretter.

1. Histopathological revisjon av Utvalgte tilfeller i henhold til veletablerte diagnostiske kriterier.
   1. Bruk mikrotomen til å kutte 4 − 5 μm tykke deler av vevet fra representative FFPE vev blokker og Monter seksjonene på standard histologi slides.
   2. Utfør hematoksylin og eosin farging for hvert lysbilde ved hjelp av et automatisert vev lysbilde Stainer (tabell av materialer).
   3. Se gjennom den histopathological diagnosen for de valgte tumor tilfellene i henhold til WHO diagnostiske kriterier.
      Merk: på dette stadiet, kan patologen identifisere morfologisk forskjellige områder av svulsten innenfor samme vev delen. Det er mulig å høste disse områdene separat (se pkt. 2). Histologiske likhet med tumor og normale celler for SPNer er gitt i figur 2.
   4. Utfør immunhistokjemiske farging for etablerte markører for å utfylle histologiske analyse og anslå immunophenotypic heterogenitet.
      Merk: patologen kan identifisere immunophenotypically forskjellige områder av svulsten i samme vevs seksjon. Det er mulig å høste disse områdene separat (se pkt. 2).
2. Evaluer neoplastic cellularitet av tumor vevs delen og Planlegg manuell microdissection tilsvarende.
   Merk: Dette er en patologen-genererte estimat av tumor cellularitet.
   1. Hvis neoplastic celleinnhold i vevs delen er høyere enn 70%, er manuell microdissection ikke obligatorisk; gå direkte til trinn 3,1.
      Merk: mål 70% av neoplastic celleinnhold for å (i) sikre tilstrekkelig følsomhet for mutant allel frekvens estimater og (II) til å muligens validere klonal mutasjoner ved mindre følsomme metoder (f.eks. kapillær sekvenser).
   2. Hvis neoplastic celleinnholdet i vevet delen er lavere enn 70%, er microdissection nødvendig og gå videre til trinn 2.
3. Evaluer vevs deler fra FFPE-blokken der ikke-neoplastic vev er samplet. Dette vevet brukes som en kilde til germline DNA.
   Merk: blod er en alternativ kilde til germline DNA. I dette tilfellet, Fortsett med DNA-ekstraksjon som anbefaler i notatet av trinn 4,1.
   1. Hvis bare ikke-neoplastic vev er synlig i vevs delen (figur 2D), er manuell microdissection ikke nødvendig; gå direkte til trinn 3,1.
   2. Hvis betydelig forurensning fra neoplastic celler er tilstede i vevet delen, deretter manuell microdissection er nødvendig; gå til del 2.

2. manuell microdissection

Merk: denne metoden gjelder for ulike solide tumor typer, og det er ment å øke neoplastic celler innhold av vevsprøver. Alternativt kan denne metoden brukes til å høste morfologisk og/eller immunophenotypically forskjellige områder innenfor samme vev delen.

1. Ved hjelp av en mikrotomen, kutt opp til ti 4 − 6 μm tykke FFPE tumor vev seksjoner og montere dem på uncharged lysbilder.
   Merk: Hvis bare én 1 mm² reir av kreftceller er synlig i prøven, bør 10 vevs lysbilder kuttes og utsettes for manuelle microdissection for å oppnå MÅLRETTET mengde DNA (40 ng); Dette forutsatt at 1 mm² klyngen inneholder mellom 700 og 1000 tumor kjerner.
2. Ruge lysbilder ved 60 ° c i 10 min.
3. Plasser lysbildene i et stativ, og utfør følgende vasker: xylen i 20 min, 100% etanol i 10 min, 80% etanol i 10 min, 70% etanol i 10 min, destillert vann i 1 min, hematoksylin counterstain for 10 s, vann fra springen i 1 min.
4. På en standard invertert mikroskop, bruk en 27 G nål på en sprøyte som microdissection verktøyet og samle representative klynger av tumorceller. Høste minst ti 1 mm² klynger av celler for å sikre den nødvendige MENGDEN av DNA for sekvensering.
   Merk: Hvis morfologisk forskjellige områder er ment å analyseres som forskjellige enheter, bruker du microdissection-verktøyet til å høste disse områdene separat.
5. Plasser høstes klynger i 1,5 mL rør (tabell av materialer) tidligere fylt med 20 μL av protease K og 180 μL av lyseringsbuffer (tabell over materialer, begge inkludert i DNA-ekstraksjon Kit) og bland med virvlingen.

3. bearbeiding av vev uten tidligere microdissection

Merk: denne prosedyren brukes for vev blokker som inneholder bare ikke-neoplastic celler (kilde til germline DNA) eller inneholde minst 70% av morfologisk homogene kreftceller.

1. Ved hjelp av en mikrotomen kuttes opp til seks 4 − 5 μm tykke deler av vevet fra utvalgte FFPE vev blokker. Plasser vevs rullene i 1,5 mL rør som beskrevet i trinn 2,5.

4. DNA-ekstraksjon fra normale og neoplastic celler

1. Rens DNA fra normalt og neoplastic vev ved hjelp av DNA FFPE vev Extraction Kit (tabell av materialer) i henhold til produsentens instruksjoner.
   Merk: Når blodet brukes som en kilde til germline nukleinsyre syre, rense DNA ved hjelp av en DNA blod utvinning Kit (tabell av materialer).
2. DNA-kvantifisering og kvalitetskontroll
   1. For å kvantifisere mengden av dobbel-strandet (dsDNA), legge til en alikvot av DNA-prøven til en løsning som inneholder en fluorescerende nukleinsyre syre flekken (tabell av materialer) og måle slippes ut fluorescens ved hjelp av en stasjonære Fluorometer (tabell over materialer ).
      Merk: analysen måler intensiteten av fluorescerende signal som slippes ut fra fluorescerende fargestoffer knyttet til dsDNA og bestemmer mengden av DNA ved hjelp av en standard kurve.
   2. Bruk en microvolume spektrofotometer (tabell med materialer) for å måle 260/280-og 260/230-forholdene i prøven for å kvalifisere DNA. "Pure" DNA bør ha en 260/280 på 1,8 og en 260/230 i størrelsesområdet 1,8 − 2.2.
      Merk: Spektrofotometriske evaluering av prøven er ment å dokumentere tilstedeværelsen av kjemiske forurensninger (f.eks. fenol) som påvirker nedstrøms reaksjoner. I tilfelle forurensning på grunn av kjemiske reagenser, Utfør et oppryddings trinn ved hjelp av et Kol onne BAS ert sett.

5. biblioteks forberedelser og kvantifisering

Merk: skjematisk flytskjema for biblioteks forberedelser og kvantifisering trinn er rapportert i Figur 3.

1. DNA bibliotek forberedelse (4 primer bassenger satt opp for hver prøve)
   Merk: de 4 primer bassengene tilhører kreft panelet rapportert iTabell av materialer. Hvert basseng inneholder primer par som er designet for et multiplekset mål utvalg av 409 gener. En link til listen over gener komponere NGS panelet er gitt iTabell av materialer.
   1. Klargjør fire DNA-mål forsterknings reaksjoner for hver prøve, ett per primer basseng. For hver primer Pool (tabell av materialer), tilsett i en 0,2 ml tube (tabell av materialer): 4 μL av Master mix (tabell av materialer, inkludert i biblioteket Kit), 10 μL av High Fidelity primer Pool mix (tabell over materialer, inkludert i kreft panel bibliotek), og 6 μL av DNA (10 ng totalt).
   2. Forsterk målområdene for hver primer Pool separat i fire 1,5 mL rør som kjører følgende program: Hold ved 99 ° c i 2 min (aktivering av Hot-Start polymerase), 16 sykluser (denaturere ved 99 ° c for 15 s, anneal og forlenger ved 60 ° c i 8 min) , hold ved 4 ° c.
      Merk: stoppe punkt. Lagre mål forsterknings reaksjoner ved 4 ° c over natten eller ved-20 ° c i lengre tid.
   3. Delvis fordøyelse av amplicons Tupper
      Merk: manualen som leveres av NGS produsent sett forutser et trinn der de forskjellige forsterknings reaksjonene fra hver prøve kombineres før delvis fordøyelse. Unngå at trinn og fortsette å behandle hver forsterkning fordøyelsen separat.
      1. Tilsett 2 μL av spesifikk fordøyelsen mix (tabell av materialer, inkludert i biblioteket Kit) til hver forsterket pool av hver prøve (det totale volumet av hver 0,2 ml rør er 22 μL). Vortex grundig og sentrifuger hvert rør for å samle dråper.
      2. Legg rørene i den termiske cycler og Kjør følgende program: 50 ° c i 10 min, 55 ° c i 10 min, 60 ° c i 20 min, 10 ° c hold (for opp til 1 h).
         Merk: stoppe punkt. Lagre plate ved-20 ° c i lengre perioder.
   4. Ombinde adaptere for å amplicons og rense.
      Merk: Bruk en annen strekkode verks kort for hver prøve når sekvensering flere biblioteker på en enkelt brikke. Alle fire forsterknings reaksjoner fra samme prøve må motta samme strekkode.
      1. Klargjør adaptere (tabell med materialer, sett med strekkode adaptere). For hver strekkode X klargjør du en blanding av P1-adapter og unike strekkode adaptere (tabell av materialer) ved en endelig fortynning av 1:4. Bland 4 μL vann med 2 μL av P1-adapter og 2 μL av unike strekkode adaptere. Bruk 2 μL av denne strekkode adapter blandingen til nedstrøms passasjer.
      2. Utfør ligation reaksjonen ved å legge til hver forsterket pool av hver prøve i denne rekkefølgen: 4 μL av bryteren løsning (tabell av materialer, inkludert i biblioteket Kit), 2 μL av strekkode adapter mix og 2 ΜL av DNA-Ligase (tabell over materialer, inkludert i bibliotek settet) (totalt volum = 30 μL).
      3. Vortex grundig og kort sentrifuger for å samle dråper.
      4. Legg hvert rør inn i den termiske cycler og Kjør følgende program: 22 ° c i 30 min, 68 ° c i 5 min, 72 ° c i 5 min, 4 ° c hold (for opptil 24 h).
         Merk: stoppe punkt. Lagre plate ved-20 ° c i lengre perioder.
   5. Bibliotek rensing og forsterkning
      1. Sentrifuger hvert rør og deretter overføre hver Barcoded prøve i en 1,5 mL tube. Tilsett 45 μL av perle BAS ert rense reagens (tabell over materialer) for hvert utvalg. Pipet opp og ned 5x å blande perle suspensjonen med DNA.
      2. Ruge blandingen i 5 min ved romtemperatur (RT), og Plasser hvert rør i en magnetisk rack og ruge i 2 min. Fjern forsiktig og kast supernatanten uten å forstyrre pellet.
      3. Legg i hvert rør 150 μL av fersk 70% etanol. Vask perlene flytte hvert rør side til side av de to posisjonene til magneten. Kast supernatanten og Vær oppmerksom på at du ikke forstyrrer pellet.
      4. Gjenta prosedyrene som er beskrevet i trinn 5.1.5.3, og hold deretter rørene i magneten og lufttørke perlene ved RT i 5 minutter.
      5. Fjern rør med renset biblioteker av hver primer basseng fra magnet og tilsett 50 μL av høy kvalitet PCR mix (tabell av materialer) og 2 μL av biblioteket forsterkning primer mix (tabell av materialer, inkludert i biblioteket Kit) til perler pellet av hvert rør.
      6. Vortex hver 1,5 mL rør og kort sentrifuger for å samle dråper.
      7. Plasser 1,5 mL rør i magneten i 2 minutter og Overfør forsiktig supernatanten (~ 50 μL) fra hvert rør til et nytt 0,2 mL rør uten å forstyrre pellet-slangen.
      8. Forsterke bibliotekene i hver primer Pool kjører følgende program: Hold ved 98 ° c for 2 min for å aktivere enzymet, 5 sykluser (denaturere ved 98 ° c for 15 s, anneal og forlenge ved 64 ° c 1 min), hold ved 4 ° c. Lagre prøver ved-20 ° c.
   6. Rensing av forsterket bibliotek
      1. Sentrifuger hvert rør for å samle innholdet på bunnen og overføre hver forsterket biblioteket prøven til en 1,5 mL tube.
      2. Tilsett 25 μL av perle BAS ert rense reagens. Pipet opp og ned 5x å blande perle suspensjonen med DNA.
      3. Ruge blandingen i 5 min ved RT, og plasser rørene inn i magneten i 5 min.
      4. Overfør forsiktig supernatanten, som inneholder amplicons, fra hvert rør til nye rør uten å forstyrre pellet.
      5. Tilsett 60 μL av perle BAS ert rense reagens til supernatanten av hvert rør og Pipet opp og ned for å blande perle fjæring og DNA.
      6. Ruge blandingen i 5 min ved RT og plasser rørene i magneten i 3 min.
      7. Kast supernatanten fra hvert rør og Vær oppmerksom på at du ikke forstyrrer pellet.
         Merk: amplicons er bundet til perlene.
      8. Legg i hvert rør 150 μL av fersk 70% etanol. Vask perlene flytte rørene side til side i de to posisjonene til magneten. Kast supernatanten og Vær oppmerksom på at du ikke forstyrrer pellet.
      9. Gjenta prosedyren i trinn 5.1.6.8 og lufttørke perlene ved RT i 3 min. unngå overdreven tørking av perlene.
      10. Fjern rørene fra magneten og tilsett 50 μL av lav Tris EDTA (TE) (tabell av materialer, inkludert i biblioteket Kit) til pellet å spre perlene.
      11. Pipet blandingen opp og ned flere ganger og ruge ved RT i 2 min.
      12. Plasser rørene i magneten i minst 2 min og forsiktig Overfør supernatanten, som inneholder amplicons, til nye rør uten å forstyrre perlene.
2. Bibliotek kvantifisering
   1. Bruk et fragment analyse instrument (tabell av materialer) for å kjøre en DNA-chip i henhold til høy følsomhet DNA Kit protokoll.

6. biblioteker pooling og sekvensering kjøre

1. Fortynne hvert bibliotek til 100 pM med nuklease-fritt vann. Kombiner 10 μL av hver 100 pM bibliotekene for en enkelt kjøre i et enkelt rør. Bland de kombinerte bibliotekene ved pipettering og Fortsett til templating og sekvensering.
2. Planlagt Kjørings opprettelse
   Merk: en typisk kjøre inkluderer fire prøver som kan lastes på to forskjellige typer halvleder chip (ion PI chip eller ion 540 chip) basert på Sequencer tilgjengelig i laboratoriet (ion Proton system eller GeneStudio S5 system, tabell over materialer). Disse systemene produserer vanligvis 80 000 000 leser per Run.
   1. Åpne torrent Browser på en datamaskin som er koblet til sekvensering systemet (f. eks, ion Chef system) og planlegge en ny kjøre ved hjelp av den generelle malen for det valgte programmet (AmpliSeqDNA).
   2. Bytt til kategorien kits i planen. Velg ion Proton system eller ion GeneStudio S5 system fra instrumentet rullegardinlisten basert på sekvensering systemet som brukes.
   3. Avhengig av sekvensering systemet, velger du riktig chip (PI chip for ion Proton Systems; 540 chip for ion GeneStudio S5 Systems) fra chip type rullegardinlisten.
   4. Velg ion AmpliSeq 2,0 Library Kit fra rullegardinlisten Library Kit .
   5. Velg ion Chef knappen for Template Kit, velg deretter riktig Chef Kit (ion PI Hi-Q Chef Kit for PI chip eller ion 540 Kit-Chef for 540 chip) fra mal Kit dropdown listen.
   6. Velg riktig sekvensering Kit (ion PI Hi-Q sekvensering 200 Kit for PI chip eller ion S5 sekvensering Kit for 540 chip) fra sekvensering Kit rullegardinlisten, og velg deretter IonXpress fra strekkode sett rullegardinlisten.
   7. Bytt til plugin kategorien og velg deknings analyse plugin.
   8. Bytt til kategorien plan. Velg GRCh37/hg19-Genova fra rullegardinlisten referanse bibliotek. Fra rullegardinlisten for målområder velger du det aktuelle panelet som skal være i rekkefølge.
   9. Angi hvor mange strekkoder som skal være i rekkefølge, og etiketten for eksempel rørene for biblioteket i de aktuelle feltene.
   10. Angi strekkode navnet og eksempel navnet for hvert bibliotek.
3. Eksempel biblioteker fortynning og lasting.
   1. Fortynne aksjen bibliotek med nuklease-ledig vann å 25 pM for PI flis eller 32 pM for 540 flis.
   2. Pipet 50 μL av hvert utvannet bibliotek til bunnen av det aktuelle bibliotek prøve røret.
   3. Slå på sekvensering systemet og følg instruksjonene på skjermen for å laste inn alle nødvendige reagenser og importere kjøreplanen.
   4. Last bibliotek prøve røret som inneholder de grupperte bibliotekene, og start klonal forsterknings program.
      Merk: Ion Chef system krever to sjetonger for å være forberedt per Run.
4. Sekvensering på ion Proton eller ion GeneStudio s5.
   1. Slå på sekvensering systemet og følg instruksjonene på skjermen for å initialisere sekvensering og importere kjøreplanen.
   2. Last inn sekvensering chip etter å fjerne den fra sekvensering systemet.
      Merk: Vær jordet før du plukker opp en chip for å unngå chip skade på grunn av elektrostatisk utladning. Chip håndtering/posisjonering sammen med eksempler på vellykket/mislykket lasting er rapportert i Figur 4.
   3. Steng chip kupé lokket og vent til chip status -ikonet indikerer "Ready".
   4. Tøm avfallsbeholderen når den første kjøringen er ferdig, og deretter sekvensen gjenværende chip så snart som mulig.

7. mutasjoner og kopier tall variasjoner (CNVs) analyse

Merk: justering av sekvensering data til GRCh37/hg19 menneskelige referanse-Genova utføres automatisk en gang angitt i planen (trinn 6.2.8).

1. Bruk den Deknings analyse plugin (tabell over materialer) utgang for å verifisere dybden av dekning og ensartethet.
2. Utføre varianten ringer ved hjelp av torrent varianten oppringer plugin (tabell av materialer), velge germline eller somatiske arbeidsflyt som passer.
3. Last ned filtrerte varianter variant Call format (VCF) filer. Kommenter varianter ved hjelp av variant effekt-VEP (programvare⁶ og NCBI RefSeq database).
4. Last sekvensering data på ion reporter programvare ved hjelp av ion reporter Uploader plugin og bruke omfattende Cancer panel svulst-normal pair arbeidsflyt for å analysere data for å anslå CNVs.
5. Manuelt filtrere mutasjoner og CNVs basert på score tildelt av programvaren og verifisere dem visuelt med Integrative Genomics Viewer (IGV)⁷.
   1. Inspiser justeringen visuelt for uvanlige lyder (på grunn av for eksempel mispriming, overamplification eller leser Soft-klipping) som kan generere artefactual samtaler.
   2. Verifiser CNVs ved å inspisere normalisert dekning for alle amplicons over et gitt gen mot normalisert dekning av Baseline.
      Merk: Dette bidrar til å korrigere falske samtaler på grunn av segmentering programvare, som noen ganger kaller en CNV basert på symmetrisk unormal dekning av få amplicons på slutten av ett gen og i begynnelsen av påfølgende genet.
6. Indeksering av somatiske mutasjoner
   1. For hvert tilfelle, indeks mutasjon anrop fra sekvensering av normal vev/blod, primær tumor og metastaser.
   2. Flagg som germline og forkaste samtaler som også er tydelig fra sekvensering data av germline DNA.
   3. Flag som klonal/grunnlegger av mutasjoner som er delt mellom alle lesjoner i en gitt pasient.
   4. Flagg som subclonal/progressor mutasjoner som oppdages i noen, men ikke alle lesjoner av en gitt pasient.

8. Immunophenotypic analyse: immunhistokjemi for relevant protein uttrykk

Merk: immunhistokjemi ble brukt til å validere funksjonelle konsekvenser av inaktivere mutasjoner i tumor Suppressor gener.

1. Bruk en mikrotomen, kutt 3 − 4 μm tykke FFPE vev seksjoner og Monter dem på ladet slides og ruge slides ved 60 ° c i 10 min.
2. Plasser lysbildene i et stativ, og utfør følgende trinn: xylen i 10 min, xylen i 10 min, 95% etanol for 4 min, 95% etanol i 4 min, 70% etanol i 4 min, 70% etanol i 4 min, destillert vann i 4 min.
3. Utføre antigen gjenfinning basert på indikasjon av antistoffer ' s produsenter (tabell av materialer).
   1. Plasser lysbildene i et rack med den spesifikke antigen henting løsning og senk i et vannbad på sub-kokende temperaturer.
   2. Fjern lysbildene fra badet og kjøre vann fra springen for å kjøle seg ned i 10 min.
4. Plasser lysbildene i et nytt rack med 3% H₂O₂ i 1x Tris-bufret Saline (TBS) for 20 min at RT for å deaktivere endogene peroxidases.
5. Plasser lysbildene i et nytt rack og vask 3x med TBS og 0,1% av mellom 20 (TBST).
6. Bruk en PAP-penn (tabell med materialer) til å tegne en hydrofobe sirkel rundt lysbilde montert vev.
7. Plasser lysbildene i et fuktig kammer og utføre blokkering for 1 time ved RT ved hjelp av 5% storfe serum albumin (BSA) i TBST som blokkerende løsning.
8. Ruge lysbilder med primære antistoffer (tabell av materialer) i et fuktig kammer over natten ved 4 ° c. Fortynne primære antistoff med blokkerende løsning som anbefalt.
9. Plasser lysbildene i et nytt stativ og vask 3x med TBST.
10. Ruge lysbilder med spesifikke sekundære antistoffer (anti-mus eller anti-kanin) (4 − 5 dråper for 1 lysbilde) i 30 min ved RT i et fuktig kammer.
11. Plasser lysbildene i et nytt stativ og vask 3x med TBST og etter i destillert vann.
12. Forbered 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) løsning fortynning 1 dråpe i 1 mL fortynnings buffer (tabell med materialer). Ruge glir maksimalt for 5 min kontroll under mikroskopet.
13. Bruk en positiv kontroll til å beregne inkubasjonstid ved å følge utviklingen av reaksjonen under mikroskopet.
    Merk: hvert antistoff trenger en bestemt inkubasjonstid.
14. Inaktiv DAB (Stopp kromogen utfelling) ved submerging lysbilder i destillert vann.
15. Counterstain lysbilder ved å Immerging dem i et nytt rack med hematoksylin for 10 s og skyll med vann fra springen.
16. Plasser lysbildene i et stativ, og utfør følgende trinn: 70% etanol for 4 min, 70% etanol for 4 min, 95% etanol for 4 min, 95% etanol i 4 min, xylen i 10 min, xylen i 10 min.
17. Seal lysbilder sette et par dråper montering medium (tabell av materialer) på hver vev lysbilde og dekk med dekkglass.
18. Påfør press på dekkglass for å flytte overflødig medium og luftbobler vekk fra vevet og ut fra dekkglass og lufttørke.
19. Evaluer og score fargeresultater under invertert mikroskop med en ekspert patologen.
    Merk: poengsystemet vil avhenge av den spesifikke antigener, som informasjon i litteraturen kanskje allerede eksisterer. Hvis informasjon ikke er tilgjengelig i litteraturen, utlede et scoring system ved hjelp av uttrykk for antigen i normalt vev som referanse.

Representative Results

Arbeidsflyten for studien er illustrert i figur 1. Multi-lesjoner (n = 13) sekvensering av 5 SPN tilfeller rettet mot koding sekvenser av 409 Cancer relaterte gener identifisert totalt 27 somatiske mutasjoner i 8 gener (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1og FGFR3). Mutasjoner ble definert som grunnlegger/klonal når de deles mellom alle lesjoner av en gitt pasient, og progressor/subclonal når oppdaget i noen, men ikke alle lesjoner av en gitt pasient (figur 5a, B). Overall, flertallet av punkt mutasjoner identifisert på tvers av kohort var klonal hendelser, som inkluderte mutasjoner av CTNNB1, KDM6A, TET1, og FLT1. Konsekvent, immunhistokjemiske farging for β-catenin (protein produkt av CTNNB1) og KDM6A var homogen blant de ulike lesjoner i tilfellene med mutasjoner av de tilsvarende gener (figur 6A, B). Den moderate farging for KDM6A i mutert prøver antydet at genetisk endring var sannsynlig å endre funksjon snarere enn protein uttrykk. KDM6A tap av funksjon i bukspyttkjertelen svulster er knyttet til oppregulering av hypoksi markør GLUT1⁸, og følgelig GLUT1 ble overexpressed i tilfeller bærer KDM6A mutasjoner (figur 6C). Subclonal mutasjoner ble funnet å påvirke BAP1, SMAD4, TP53, og FGFR3. Immunhistokjemi for BAP1 og TP53 bekreftet at mutasjoner i disse genene ble subclonal (figur 6D, E). Analysen av kopier av tall variasjon (CNV) ble utført med data fra sekvensering og avslørte endringer i alle prøvene som ble analysert som vist i figur 7a. I motsetning til punkt mutasjoner var flertallet av CNV endringer subclonal (figur 7b).

Figur 1: Flow diagram av analysen utført på metastatisk lesjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: representative histologi av normal og tumor vev.
(A, B) Tumor vev (T) ved siden av normalt vev (N). I disse to vev seksjoner, svulsten og normal vev er identifiserbare som separate og godt lukkede områder. (C) klynger av normale bukspyttkjertel celler (N *) kan ses som innebygd i tumorvevet (T). (D) morfologi av normalt bukspyttkjertel vev. Scale bar representerer 1 mm.

Figur 3: skjematisk flytskjema av biblioteket forberedelse og kvantifisering protokollen trinn.

Figur 4: Ion Proton chip lasting og kjører.
(A) chip retning og plassering i chip klemmen (venstre). Metal tab tilbake erstatning (høyre). (B) heatmaps viser tettheten av bibliotekene i to forskjellige chip belastninger. Eksempel av en fint lessing tettheten (topp) på grunn av en heldig klonal forsterkning av biblioteker, resulterer inne 94% lessing av det flis overflate med sekvensering partikler (139 000 000 leser, Final produksjon 90 000 000 leser etter automatisk kvalitet filterene). Eksempel av en fattig lessing (bunnen) på grunn av en ineffektiv klonal forsterkning av biblioteker, resulterer inne 40% lessing av det flis overflate med sekvensering partikler (59 000 000 leser, Final produksjon 12 000 000 leser etter automatisk kvalitet filterene).

Figur 5: somatiske endringer i metastatisk lesjoner.
(A) somatiske mutasjoner identifisert i matchet primære/metastatisk lesjoner. (B) totalt somatiske mutasjoner vises per sak, inkludert endringer som deles mellom alle lesjoner (grunnlegger/klonal) og de som oppdages i ett eller flere, men ikke alle prøvene for et gitt tilfelle (progressor/subclonal). Antallet individuelle metastatisk lesjon (m) sekvensert per sak er indikert. Dette tallet har blitt publisert på nytt fra Amato et al.⁸. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: Immunostaining for β-catenin, KDM6A, GLUT1, BAP1 og TP53 i primære og metastatisk lesjoner.
(A) representative immunhistokjemiske bilder som viser kjernefysisk akkumulering av β-catenin i alle prøver (primær og metastatisk) fra en SPN-bærende mutasjon av CTNNB1. (B) immunhistokjemiske farging av lesjoner fra en metastatisk SPN-lager klonal mutasjon av KDM6A. (C) OVERUTTRYKTE av GLUT1 i en SPN-bærende KDM6A mutasjon, mens ingen immunoreactivity ble observert i vill type vev. (D, E) BAP1 og TP53 uttrykks data betegner at mutasjoner i disse to genene er subclonal. Skala linjer representerer 100 μm og innfelt forstørrelse er 600X. Dette tallet er modifisert fra Amato et al.⁸.

Figur 7: somatiske kopi nummer endringer i metastatisk lesjoner.
(A) den virtuelle Karyotype visningen viser plassering, nærhet og kopi nummer status for endrede gener i et representativt tilfelle. Den coloring ordningen med kromosom band er følgende: svart og grå = Giemsa positiv, lys rød = centromeren, lilla = variabelt område. Endringer er kommentert i henhold til fargekoder presentert i figuren. Forkortelser: CNV, Kopier nummer variasjon; P, primær SPN; L (a-c), leveren metastaser. (B) total somatiske endringer (gener berørt av cnv) vises per sak, inkludert endringer som deles mellom alle lesjoner (grunnlegger/klonal) og de som oppdages i ett eller flere (men ikke alle) av prøvene for en gitt sak (progressor/subclonal). Antallet individuelle metastatisk lesjon (m) sekvensert per sak er indikert. Dette tallet har blitt publisert på nytt fra Amato et al.⁸. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vår metode gjør det mulig å identifisere molekylære endringer involvert i progresjon av solide svulster gjennom integrering av vertikale data (dvs. morfologi, DNA-sekvensering, og immunhistokjemi) fra forskjellige lesjoner av en gitt pasient. Vi demonstrerte evnen til vår metode for å oppdage klonal og subclonal hendelser i en mutational lydløs tumor type (dvs. SPN, solid-pseudopapillary neoplasma i bukspyttkjertelen) ved forhører koding sekvenser av 409 kreft relevante gener⁸. En fordel med amplicon målrettede sekvensering tilnærming som brukes her er ensartethet av dekningen (90% mål baser dekkes 100 prosent, 95% dekkes 20x) over avhørt regioner (15 992) på en typisk gjennomsnittlig dekning dybde på 1000x. Høy dybde-av-dekning koblet til neoplastic celle berikelse gjennom microdissection garanterer høy følsomhet for påvisning av lav allel frekvens hendelser. Som vi tidligere har vist⁹, den målrettede sekvensering tilnærmingen gjør påvisning av mutasjoner ned til en 2% allel frekvens på DNA-prøver fra FFPE vev. Som et eksempel, i dagens arbeid var vi i stand til å identifisere en 4% allel frekvens TP53 missense mutasjon som en subclonal hendelse i et metastatisk eksemplar (figur 5) og validert denne forekomsten av immunhistokjemi (figur 6). Vår protokoll forutser den sekvensering av matchet tumor og germline DNA for å identifisere somatiske hendelser og følgelig redusere den falske oppdagelsen rate av subclonal mutasjoner av kreft-bare rørledning¹⁰. Når matchet germline DNA er ikke tilgjengelig, kan man vurdere å vedta mer konservative parametre i analysen av sekvensering data, inkludert strenge filtre basert på minimum dybde på dekning samt begrensende varianter ringer til "hot-spots mutasjoner" og mutasjoner har i stor grad kommentert i tilgjengelige databaser. Sekvensering germline DNA sammen matchet svulster har også fordelen av muliggjør nøyaktig påvisning av Kopier-nummer variasjoner (CNV). Alternativt kan bassenger med kjønn matchet diploid genomer brukes til å redusere støy fra sekvensering data og Letter påvisning av CNV. I tillegg til inkludering av germline DNA, endret vi biblioteket protokollen for å redusere primer Pool ubalanse og forbedre CNV ringer. I henhold til den opprinnelige protokollen, bør de fire amplicon bassengene som produseres fra hver DNA-prøve etter multiplex PCR blandes sammen, og de resterende trinnene vil bli utført i ett rør per prøve. Dette fører imidlertid til svingninger i per basseng bety deknings dybde på grunn av det faktum at multiplex PCR kan ha ulik effektivitet på tvers av ulike rør. Det var ingen Pool kvantifisering/normalisering skritt å gjøre rede for denne effekten i den opprinnelige protokollen. For å unngå ovennevnte svingninger, bestemte vi oss for å holde hver av de fire amplicon bassengene atskilt gjennom hele biblioteket produksjons protokollen, før de kunne kvantifisert. Ved kvantifisering, kan den samme mengden av hver av de fire bassengene for hver DNA prøven bli lagt til den endelige biblioteket bassenget, slik at den endelige gjennomsnittlige dekningen var så ensartet som mulig.

Vurderingen av intra-tumor heterogenitet (i) på genetisk nivå har viktige kliniske implikasjoner, men på samme måte utgjør nye utfordringer². En stor utfordring er faktisk nødvendigheten av å skille mellom driver mutasjoner og Stokastisk hendelser (dvs. passasjer mutasjoner). Skillet mellom fører og passasjer mutasjoner er ofte oppnås beregningsmessig, men ikke uten fordommer. Mens systematisk funksjonalisering av oppdagede varianter er kostbare og tidkrevende, funksjonelle konsekvenser av genetiske varianter kan evalueres, i hvert fall for et delsett av gener, ved immunhistokjemiske analyse av tilsvarende protein eller, indirekte, ved å måle uttrykk for surrogat markører av protein dysfunksjon. Vår protokoll har blitt brukt på FFPE vev, som representerer den viktigste kilden til materialer i den kliniske innstillingen ennå posing utfordringer for sekvensering; kvaliteten på isolerte nukleinsyre syrer bør alltid evalueres før sekvensering¹¹. Selv om målrettede sekvensering har den store fordelen av å være kostnadseffektiv og ikke svært krevende i forhold til beregningsorientert krav, har den store ulempen med forhører bare en begrenset del av Genova, som trolig fører til å undervurdere intra-tumor heterogenitet. Videre er denne tilnærmingen ikke vurderer relevante epigenetic og transcriptomic forskjeller mellom metastasering og primære svulster som nylig har blitt vist å oppveie genetiske forskjeller i visse tumor typer^{4,12, 13 i år}. Imidlertid ville man forutse at teknologiske fremskritt vil snart muliggjøre integrering av en rikere vertikal data Ensemble for en bedre vurdering av i. Vår tilnærming foretrekker dybde til fysisk dekning av Genova, som begrenser vår evne til å bygge riktig SNV-baserte phylogenies. Likevel gir vår metode muligheten til å utforske genetiske Relatedness i kliniske prøver med passende følsomhet og spesifisitet på grunn av integrering av molekylære og histopathological analyser. Vi har med hell brukt denne protokollen på en bestemt tumor type (f. eks, SPN) og forutsi at metoden vil fungere på samme måte på andre solide tumor typer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939BA	Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit	Fisher Scientific	NC9959336	Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4627	Library quantification
Anti-BAP1	Santa Cruz Biotechnology	sc-28383	Antibody
Anti-GLUT1	Thermo Scientific	RB-9052	Antibody
Anti-KDM6A	Cell Signaling	#33510	Antibody
Anti-p53	Novocastra	NCL-L-p53-DO7	Antibody
Anti-βcatenin	Sigma-Aldrich	C7207	Antibody
Blocking Solution	home made	-	5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution	home made	-	3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra	Leica	70937891	Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1	Leica Biosystems	AR9961	Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2	Leica Biosystems	AR9640	EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear	Eppendorf	951010006	Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021	Tubes
Ethanol	DIAPATH	A0123	IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H­4000	Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase	Vector Laboratories	SK­4105	HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7401­50	Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase	Vector Laboratories	MP­7402­50	Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV)	Broad Institute	-	https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel	Thermofisher Scientific	4477685	Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0	Thermofisher Scientific	4480441	Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument	Thermofisher Scientific	4484177	Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip	Thermofisher Scientific	A26771 or A27766	Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef	Thermofisher Scientific	A27198 or A30011	Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit	Thermofisher Scientific	A26433 or A30011	Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System	Thermofisher Scientific	4476610 or A38196	Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair	Thermofisher Scientific	4487118	Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin	Thermofisher Scientific	4487118	Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin	Thermofisher Scientific	4483643	Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit	Thermofisher Scientific	4474517	Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermofisher Scientific	ND-2000	DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database	NCBI	-	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity	Fisher Scientific	12532-016 or 12532-024	SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Quiagen	51106 0r 51104	DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue	Quiagen	56404	DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermofisher Scientific	Q32866	DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermofisher Scientific	Q32850	Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST	home made	-	Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film	Sakura Europe	6172	Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software	EMBI-EBI	-	http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres	Carlo Erba	492306	IHC deparaffinization reagent