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Neuroscience

Culturas de fatias flutuantes de curto prazo do cérebro humano adulto

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/59845
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 4, 4, 5, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Summary

Um protocolo para preparar culturas de fatias flutuantes do cérebro humano adulto é apresentado. O protocolo é uma variação do método de cultura de fatia amplamente utilizado usando inserções de membrana. É simples, rentável, e recomendado para a execução de ensaios de curto prazo destinadas a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade.

Abstract

Organotypic, ou culturas da fatia, foram empregados extensamente para modelar aspectos do sistema nervoso central que funciona in vitro. Apesar do potencial das culturas de fatias na neurociência, estudos usando tecido nervoso adulto para preparar tais culturas ainda são escassos, particularmente os de seres humanos. O uso do tecido humano adulto para preparar culturas da fatia é particular atrativo realçar a compreensão de neuropatologias humanas, porque prendem as propriedades originais típicas do cérebro humano maduro que falta nas fatias produzidas do roedor (geralmente neonatal) tecido nervoso. Este protocolo descreve como usar o tecido cerebral coletado de doadores humanos vivos submetidos a cirurgia cerebral ressectiva para preparar culturas de fatias de curto prazo e flutuantes. Procedimentos para manter e realizar ensaios bioquímicos e de biologia celular usando essas culturas também são apresentados. Os resultados representativos demonstram que a laminação cortical humana típica está preservada nas fatias após 4 dias in vitro (DIV4), com presença prevista dos tipos principais da pilha neural. Além disso, as fatias no DIV4 passam por uma morte celular robusta quando desafiadas com um estímulo tóxico (H2O2),indicando o potencial deste modelo para servir como uma plataforma em ensaios de morte celular. Este método, uma alternativa mais simples e econômica ao protocolo amplamente utilizado usando inserções de membrana, é recomendado principalmente para a execução de ensaios de curto prazo destinados a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade. Finalmente, embora o protocolo seja dedicado ao uso de tecido cortical coletado de pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico da epilepsia do lobo temporal farmacoresistente, argumenta-se que o tecido coletado de outras regiões/condições cerebrais também deve ser consideradas como fontes para produzir culturas similares da fatia livre-flutuando.

Introduction

O uso de amostras humanas na pesquisa é inequivocamente uma ótima opção para estudar patologias cerebrais humanas, e técnicas modernas abriram novas maneiras de experimentação robusta e ética usando tecido derivado do paciente. Métodos como culturas organotípicas/fatias preparadas a partir do cérebro humano adulto têm sido cada vez mais utilizados em paradigmas como optogenética1,eletrofisiologia2,3,4,5, plasticidade 6,7,8,9, neurotoxicidade/neuroproteção10,11,12,13,terapia celular14, triagem de drogas15,16,17, genética e edição de genes12,18,19,20,entre outros, como estratégia para melhor compreender doenças neurológicas durante a idade adulta.

A compreensão dos mecanismos subjacentes às patologias cerebrais humanas depende de estratégias experimentais que exigem um grande número de sujeitos. Por outro lado, no caso de culturas de fatias, embora o acesso a amostras humanas ainda seja difícil, a possibilidade de gerar até 50 fatias de uma única amostra corticana contorna parcialmente a exigência de recrutamento de múltiplos voluntários, aumentando número de réplicas e ensaios realizados por tecido coletado21.

Vários protocolos para culturas organotípicas/fatias cerebrais foram descritos, que vão desde os rascunhos clássicos de oculo22,23 até tubo de rolo24,25,26,membranas semipermeáveis interface27,28,29,30,e fatias flutuantes31,32. Dependendo das particularidades de um projeto experimental, cada técnica tem suas próprias vantagens e desvantagens. A curto prazo, as culturas de fatias de flutuação livre de cérebros humanos adultos é, em alguns casos, vantajosa sobre o método usado por Stoppini et al.27, se considerar o fato de que, embora a sobrevivência celular a longo prazo in vitro é geralmente uma grande preocupação ao avaliar um método de cultura, em muitos experimentos apenas curtos períodos de tempo na cultura são necessários12,31,32,33,34,35. Nestas circunstâncias, o uso de culturas free-floating apresenta a vantagem de ser mais simples e mais eficaz na redução de custos, assim como assemelhando-se mais exatamente à condição humana original do tecido do que as fatias mantidas na cultura sobre 2-3 semanas.

Apesar do potencial das culturas de fatia para a neurociência, estudos usando tecido nervoso adulto para preparar tais culturas ainda são escassos, particularmente de seres humanos. Este artigo descreve um protocolo para usar o tecido cerebral coletado de doadores humanos vivos submetidos a cirurgia cerebral ressectiva para preparar culturas de fatias flutuantes. Procedimentos para manter e realizar ensaios bioquímicos e de biologia celular usando essas culturas são detalhados. Este protocolo foi provado valioso para analisar a viabilidade e a função neuronal nas investigações nos mecanismos das neuropatologias lig à idade adulta.

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Protocol

Tecidos cerebrais adultos vivos foram obtidos de pacientes submetidos a neurocirurgia resectiva para o tratamento da epilepsia do lobo temporal farmacoresistente (Figura 1A). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital de Clínicas da Faculdade de Medicina Ribeirão Preto (17578/2015), e os pacientes (ou sua pessoa responsável legal) concordaram e assinaram os termos de consentimento informado. A coleta do tecido foi feita pela equipe de neurocirurgia do Centro de Cirurgia de Epilepsia (CIREP - Hospital de Clínicas da Faculdade de Medicina Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brasil).

1. Esterilização de materiais

NOTA: Todo o material e soluções devem ser esterilizados antes do uso.

  1. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas e material de corte vibratome (suporte de faca, disco de espécime, bandeja tampão) em um forno esterilizante seco por 4 h a 180 °C.
  2. Esterilizar material ou equipamento sensível à temperatura por irradiação UV ou gama.
  3. Esterilizar mídia e soluções por autoclavation ou filtração através de membranas poros de 0,22 μm.

2. Preparação de soluções

  1. Prepare 15-20 mL de solução de transporte: 50% v/v Hanks' solução de sal equilibrado (HBSS) pH 7,4, 50% v/v médio basal para manutenção de pós-natal e neurônios cerebrais adultos (Tabela de Materiais), complementado com 10 mm 4-(2-hidroxyethyl)-1- ácido piperazineethanesulfonic (Hepes), 3 mg/mL glicose, e 33 μg/mL gentamicin.
    NOTA: A solução de transporte deve ser refrigerada e oxigenada (borbulhando com gás carbogênio) por pelo menos 20 minutos antes da coleta de amostras.
  2. Prepare 300 mL de solução de corte (HBSS complementado com 10 mM HEPES e 3 mg/mL de glicose) e refresque-o em um freezer ao ponto de formação inicial de cristal.
  3. Prepare 20 mL de meio de cultura: meio basal para manutenção de neurônios cerebrais pós-natais e adultos (Tabela de Materiais)complementados com 1% derivado da glutamina L (Tabela de Materiais),2% de suplemento para cultura neural (Tabela de Materiais), 1% penicilina/estreptomicina e 0,25 μg/mL amphotericin B.

3. Criação do aparelho de corte

NOTA: Este protocolo é idealmente realizado com o auxílio de um colega devido à logística de coleta de amostras na sala cirúrgica.

  1. Em um balde de gelo adicionado a sal, deixe a solução de corte descansar a mistura carbogen borbulhando (95% O2, 5% CO2) por pelo menos 20 minutos antes do uso.
  2. Prepare um bloco de agarose de 3% (aproximadamente 2 cm x 2 cm x 2 cm) e supercola-o ao disco do espécime do vibratome a fim criar a sustentação mecânica adicional à amostra do tecido durante o corte (figura 1E).
  3. Defina o vibratome para corte: espessura da seção de 200 μm, frequência de vibração de 100 Hz e velocidade de corte entre 0,5-1,0 mm/s.
  4. Bloqueie a bandeja tampão vibratome para a base vibratome e adicione gelo para mantê-lo refrigerado antes de receber a solução de corte e a amostra, e durante todo o procedimento de corte.

4. Coleção de amostras

NOTA: Neste protocolo, o tecido neocortical humano foi coletado na sala cirúrgica e transportado ao laboratório.

CUIDADO: Ao lidar com amostras humanas, siga os protocolos de segurança adequados estabelecidos pela Instituição.

  1. Configure o aparelho de transporte(Figura 1C)que consiste em: um cilindro de gás portátil com mistura de carbogênio conectado a uma válvula de pressão/fluxo que controla a saída de gás conectada a uma tubulação de silício que conecta a produção de gás ao transporte navio; uma embarcação de transporte, geralmente um tubo cônico de centrífuga de 50 mL com tampa perfurado para entrada de gás, contendo a solução de transporte; e gelo para resfriamento de amostras durante o transporte.
  2. Coletar e transportar o espécime(Figura 1B)imediatamente para o laboratório. Submerse o espécime em solução de transporte a frio (constantemente borbulhado com mistura de carbogênio).

5. Fatiamento

  1. Transfira o espécime para uma placa de Petri (100 mm x 20 mm) contendo solução de corte e, com ferramentas cirúrgicas finas, retire cuidadosamente o máximo possível das meninges restantes naamostra (Figura 1D).
  2. Escolha a melhor orientação do espécime para produzir fatias com as características particulares do projeto experimental, e com uma lâmina do scalpel no. 24, aparar uma superfície plana para ser a base colada ao disco do espécime.
  3. Usando uma colher de plástico descartável e pinceles delicados, recolher o fragmento da placa de Petri e solução seca em excesso usando papel de filtro (seco por capilaridade e evitar tocar o fragmento de tecido com papel).
  4. Usando supercola, anexar o tecido para o disco do espécime vibratome até que seja firmemente respeitado ao disco e em contato com o bloco de agarose (Figura 1E).
  5. Coloque o disco do espécime vibratome (com tecido devidamente ligado) na bandeja tampão vibratome preenchido com solução de corte que deve estar borbulhando durante todo o processo.
  6. Tranque o suporte da faca no lugar com a lâmina de barbear firmemente fixada.
  7. A solução de corte deve cobrir o espécime e a lâmina, só então começar a cortar (Figura 1F).
  8. Corte o espécime em fatias de 200 μm.
    NOTA: Embora alguns vibratomes cortem os espécimes automaticamente, a observação próxima e os ajustes menores na velocidade de corte durante o processo podem ajudar a produzir melhores fatias. Descarte fatias irregulares iniciais.
  9. Transfira as fatias da bandeja tampão para uma placa de Petri com solução de corte e aparar bordas soltas e excesso de branco mater para uma proporção de cerca de 70% de córtex/30% de matéria branca.

6. Cultura

NOTA: Executar esta etapa em um armário de fluxo laminar ambiente estéril.

  1. Adicione 600 μL de meio de cultura por poço (em uma placa de 24 poços) e incubar por pelo menos 20 minutos a 36 °C e 5% CO2 antes de chapeamento das fatias.
  2. Placa uma fatia por poço usando um pincel (Figura 1G).
  3. Se houver poços não utilizados na placa, preenchê-los com 400 μL de água estéril.
  4. Incubar a placa a 36 °C, 5% CO2.
    NOTA: Primeira substituição média deve ser feita entre 8-16 h após o revestimento, dependendo do tamanho da fatia.
  5. Suplemento 10 mL do meio de cultura previamente preparado com fator neurotrófico derivado do cérebro ng/mL de 50 ng/mL (BDNF).
    NOTA: Durante as primeiras 8-16 h, as fatias são incubadas em 600 μL de médio para evitar a privação de nutrientes e acidificação, uma vez que o consumo médio nesta fase é acelerado. A partir do próximo passo, o volume de médio por poço é ajustado para 400 μL.
  6. Retire 333 μL do meio condicionado de cada poço e adicione 133 μL de médio fresco suplementado por BDNF.
  7. Repita o processo de substituição média a cada 24 h, substituindo um terço do meio condicionado por um meio fresco suplementado por BDNF.

7. Avaliar a saúde, a morfologia e a função em fatias cultivadas

NOTA: Para induzir a morte celular com a finalidade de ilustração nos resultados representativos, algumas fatias foram submetidas a um tratamento de 24 h com o indutor de estresse oxidativo H2O2. Os passos 7.1.2 e 7.1.3 descrevem o uso de H2O2 para induzir a morte celular.

  1. Viabilidade celular
    NOTA: Um método simples e simples para avaliar neurotóxicos/neuroproteção em culturas de fatias desafiadas é o ensaio 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) , que mede a porcentagem de células metabólicas ativas em condições normais em comparação com amostras tratadas.
    1. No armário de fluxo laminar, substitua um terço do meio por meio fresco.
    2. A partir de uma solução de ações 30% H2O2, adicione um volume de H2O2 por poço para alcançar a concentração final pretendida (30 mM ou 300 mM).
      NOTA: H2O2 foi adicionado após a mudança diária do meio para garantir o fornecimento adequado de nutrientes frescos antes do desafio.
    3. Incubar a placa para 24 h a 36 °C, 5% CO2.
      NOTA: Após o tratamento H2O2 (ou outro estímulo tóxico de interesse), os seguintes passos descrevem a determinação de viabilidade celular pelo ensaio MTT.
    4. Adicione 40 μL de solução MTT a uma concentração final de 0,5 mg/mL a cada poço na placa.
    5. Incubar a placa a 36 °C, 5% CO2 para 3 h.
    6. Lave as fatias com sisino fisiológico amorteceu fosfato (PBS) e transfira para um microtubo.
    7. Retire cuidadosamente qualquer solução restante por pipetting.
    8. Pese os microtubos contendo as fatias para determinar a massa de cada fatia (esta é a chave para normalizar as leituras de absorção obtidas).
      NOTA: Se necessário, as amostras podem ser congeladas (-20 °C) nesta fase para processamento posterior.
    9. Homogeneize as fatias em 200 μL de isopropanol/HCl usando um pilão motorizado.
    10. Centrífuga à temperatura ambiente (RT) por 2 min a 2600 x g.
    11. Colete o supernatant e medir a absorção em 540 nm.
  2. Despolarização neuronal induzida por KCl
    NOTA: A fosforilação da proteína vacinatura ativada mitogênica (MAPK) sinalizando a proteína em cascata ERK, seguida pela mancha ocidental, pode ser usada para a quantificação da resposta neuronal à despolarização induzida por KCl37 .
    1. No armário de fluxo, substitua o meio de cultura em 300 μL de HBSS previamente equilibrado para 36 °C.
    2. Substitua o HBSS por 300 μL de HBSS fresco previamente equilibrado para 36 °C.
    3. Incubar a placa a 36 °C, 5% CO2 para 15 min.
    4. Substitua o HBSS pelo HBSS fresco ou por uma solução dedepolarização kcl de 80 mM (ambas a 36 °C) e incubam a 36 °C, 5% DECO 2 por 15 min.
    5. Transfira as fatias da placa para microtubos. Nesta etapa, as fatias podem ser armazenadas a -20 °C para processamento posterior.
    6. Prepare extratos de tecido em 150 μL de ensaio radioimunoprecipitado (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% surfactante nonionic; 0,1% de sulfato dodócia de sódio; pH 7,5). Extratos de centrífuga a 4 °C por 10 min a 16000 x g, coletar supernatant, e determinar a concentração total de proteínas usando o método Bradford.
    7. Carregue 30 μg de proteína total em um sulofl dodecyl de 12% de poliacrilamida gel eletroforese (SDS-PAGE).
    8. Após a eletroforese, transfira o teor de gel para uma membrana de nitrocelulose.
    9. Depois de bloquear a membrana com 5% de leite seco não gordo em TBS mais 0,1% tween, incubar com mouse anti-pERK (1:1,000) para 16 h em 4 °C. Após a lavagem, incubar por 2 h em RT com coelho anti-ERK1/2 (1:1,000).
    10. Incubar com o anticorpo secundário sAR-conjugado apropriado em RT para 1 h.
    11. Revele com o substrato pE preferido.
  3. Avaliação morfológica
    NOTA: Além da sobrevivência celular e avaliações funcionais, é importante analisar a morfologia do tecido. Esteja ciente de que a ressecção da fatia cultivada é um passo importante para produzir o máximo de material de alta qualidade possível para a análise morfológica.
    1. Fixação, crioproteção e ressecção das fatias
      1. Transfira as fatias dos poços com meio de cultura para uma nova placa de 24 poços contendo PBS.
      2. Retire o PBS e adicione 1 mL de 4% de paraformaldeído (PFA). É importante que as fatias sejam mantidas planas antes de adicionar PFA. Incubar durante a noite em 4 °C.
      3. Retire cuidadosamente a solução PFA e adicione 1 mL de solução de sacarose de 30%. Incubar por 48 h a 4 °C.
      4. Defina o microtome congelante a -40 °C.
      5. Prepare uma base de sacarose no estágio microtome onde as fatias devem ser colocadas(Figura 2A). Deixe congelar completamente e cortar cuidadosamente parte da sacarose congelada para produzir uma superfície plana em que a fatia será colocada.
      6. Coloque cada fatia sobre uma película de plástico esticada e use um pincel para alisar o tecido.
      7. Transfira a fatia esticada para a base de sacarose congelada em um único movimento.
        NOTA: Não é possível mover a fatia uma vez que está sobre a base de sacarose congelada. Realize esta etapa de transferência com cuidado.
      8. Deixe a fatia descansar por 5-10 min para o congelamento adequado.
      9. Corte a fatia em 30 seções μm.
      10. Transfira as seções de 30 μm para uma placa de Petri contendo PBS.
      11. Siga para o protocolo de histologia mais adequado ao projeto experimental.
        NOTA: As seções de 30 μm podem ser prontamente usadas para imunohistoquímica flutuante, montadas em lâminas de microscopia para mais histologia ou armazenadas em solução anticongelante a -20 °C.
    2. Immunohistochemistry
      NOTA: Os protocolos padrão de imunohistoquímica e imunofluorescência variam entre os laboratórios. Para uma versão detalhada do protocolo utilizado aqui, consulte Horta et al.38. Os anticorpos primários utilizados para imunomanchas apresentados na Figura 2 incluem núcleos neuronais (NeuN), marcador de neurônio salutar saudável, proteína ácida fibrilária glial (GFAP), marcador astorcitos, adaptador de ligação de cálcio ionizado (Iba-1) e microglia Marcador.
      1. Incubar as fatias na solução de bloqueio (por exemplo, 2% de soro de burro normal em PBS) por 40 min.
      2. Incubar durante a noite com anticorpo primário agitação leve em 4 °C.
      3. Após a lavagem com PBS, incubar para 120 min com anticorpo secundário biotinylated agitação suave no RT.
      4. Depois de lavar com PBS, incubar em RT por 120 min com conjugado avidin-peroxidase(Tabela de Materiais).
      5. Revelar com DAB + 0,04% de níquel amônio.
      6. Monte as seções manchadas em lâminas de microscopia revestidas de gelatina e deixe-as secar o ar. Desidratar em etanol, diumcar em xileno, terminar com montagem média(Tabela de Materiais), cubra com um coverslip, e imagem.

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Representative Results

Um aspecto crítico para avaliar a qualidade e a saúde das fatias cultivadas é a presença e morfologia típica dos tipos esperados de células neurais, neurônios e células gliais. A arquitetura típica da laminação cortical humana foi observada em uma fatia em DIV4, revelada pela imunorotulagem neuronal (Figura 2D). Além disso, também foi observada a presença esperada de microglia e astroglia (Figura 2B,C). Esses resultados demonstram que a arquitetura do tecido não é significativamente afetada pelo procedimento cirúrgico/processamento da amostra ou pelo período de curto prazo in vitro. De acordo com os resultados anteriores, foi demonstrado que a imunoreatividade neun não foi alterada entre DIV0 e DIV432. Com base nesses resultados, o formato de cultura flutuante, associado à espessura reduzida da fatia para 200 μm (em comparação com os 300-400 μm amplamente utilizados quando as inserções da membrana são usadas), contribuiu para uma melhor difusão de oxigênio e nutrientes para as camadas celulares internas em fatias, que já foi demonstrado ser fundamental para a saúde das fatias cultivadas39,40.

Quantificação da morte celular em fatias também é uma abordagem valiosa em modelos ex vivo de neuropatologias, como culturas de fatia (revisada por Lossi et al.41). Em um estudo anterior, usamos o ensaio MTT para determinar os níveis de morte celular ao longo do período na cultura32. Além da viabilidade, esse mesmo estudo também mostrou que as fatias cultivadas (até DIV4) preservaram a capacidade de liberar neurotransmissores sobre a despolarização induzida por KCl32. Aqui, esses achados foram expandidos investigando a resposta neuronal à despolarização induzida por KCl sobre fosforilação ERK, uma quinase central envolvida em processos como plasticidade sináptica e memória42,43. Curiosamente, um claro aumento na fosforilação ERK foi visto em fatias tratadas com KCl no DIV4 (Figura 3A,B).

Finalmente, a resposta das fatias em DIV4 a um desafio tóxico foi avaliada com um indutor oxidative conhecido do esforço, H2O2. A lógica era que a extensão da morte celular deve ser proporcional ao nível de viabilidade celular nas fatias cultivadas. Como mostrado na Figura 3C,expondo as fatias de 300 mM H2O2 para 24 h levou a uma diminuição robusta na redução de MTT. Em conjunto, a morte celular maciça observada no DIV5 após o desafio H2O2 e os resultados de despolarização induzidos pelo KCl indicam que a saúde geral preservada das fatias no DIV4 responde adequadamente a um estímulo tóxico, como oxidativo Stress.

Figure 1
Figura 1:Coleta deamostras, transporte, corte e cultivo de tecido cortical de seres humanos adultos. O procedimento começa na sala cirúrgica com coleta de tecido cortical da lobectomia temporal para o tratamento da epilepsia farmacoresistente(A,B). C) Fragmento de tecido (n = 1) é imediatamente transferido para um tubo contendo meio de transporte oxigenado gelado (veja abaixo). (D)No laboratório, meninges são removidos usando pinças oftalmológicos finas. O excesso de líquido é seco usando papel de filtro, e o fragmento é supercolado(E)para o disco de espécime vibratome com a matéria branca voltada para baixo e superfície pial voltada para cima. (F) Usando uma navalha de barbear comercial, o espécime é cortado em 200 fatias μm que são coletadas com um pincel delicado e transferidas de volta para a placa de Petri para aparar ainda mais o excesso de matéria branca e pontas soltas (não mostradas) antes (G) revestimento e cultivo em um formato de flutuação livre. (H)Fatias culturas são mantidos viáveis por vários dias e pode ser usado em uma variedade de protocolos experimentais. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2:Análise morfológica das células neurais em culturas de fatia do cérebro humano adulto. As fatias foram fixadas no quarto dia in vitro. (A,B,C) Etapas representativas do procedimento de secção antes da imunohistoquímica. O tecido foi colorido digitalmente para melhorar a visualização. (D)Distribuição normal de neurônios em camadas corticais (algarismos romanos). (E) Microglia e (F) astrócitos também foram claramente observados (n = 1 fatia por rotulagem tipo celular). Todas as fatias foram obtidas do tecido de um único doador. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3:Ensaios funcionais e deviabilidade celular em culturas de fatias cerebrais humanas adultas. A atividade neuronal foi avaliada em fatias no dia in vitro 5 (DIV5) pela despolarização induzida por KCl e consequente aumento da fosforilação erk. (A)Um resultado representativo da imunoblota obtido com homogenees de uma fatia. São indicadas bandas correspondentes ao ERK de fosforo (Perk) e ERK total (tERK). (B) Quantificação da relação pERK/tERK em três fatias independentes de um único doador humano. (C) A toxicidade do peróxido de hidrogênio (H2O2)foi avaliada pelo ensaio mtt em fatias no DIV 5. Os valores de densidade óptica obtidos foram normalizados pela massa de cada fatia. As fatias foram desafiadas com H2O2 nas concentrações indicadas (No H2O2; 30 mM H2O2; 300 mM H2O2)para 24 h. Imagens de fatias representativas após a incubação com MTT são mostrados acima das barras. Os resultados são apresentados como erro padrão ± médio dos dados obtidos de três fatias independentes de um único doador. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Discussion

Este protocolo para a produção de culturas de fatias de curto prazo flutuantes e de curto prazo é um método alternativo para cultivar fatias neocorticas humanas adultas. Tal protocolo para culturas de fatia pode ser passível de estudos sobre (mas não restrito a) optogenética1,44,45, eletrofisiologia2,3,4,5 , plasticidade de curto prazo46,47, plasticidade de longo prazo48,49, neurotoxicidade / neuroproteção10,11,12, 13, terapia celular14,triagem de drogas15,16,17, câncer50,51, genética, e edição de genes12,18 19,20.

O uso de amostras de tecido humano adulto é particularmente importante para a compreensão de neuropatologias humanas, devido a propriedades únicas típicas do cérebro humano carente de fatias produzidas a partir de tecido nervoso roedor52. Além disso, as culturas de fatias de cérebros de roedores são comumente preparadas a partir de cérebros neonatais e imaturos, que são altamente plásticos e contêm células migratórias que podem alterar a citoarquitetura de fatia original para se adaptar ao ambiente in vitro26, 53,54,55. Tais eventos plásticos levam a mudanças nos circuitos que devem ser evitadas quando o objetivo é imitar a condição in vivo, como afirma Ting et al.30: "Optamos por nos concentrar em culturas de menos de uma semana, onde as propriedades estruturais e funcionais são razoavelmente mantido com perturbação mínima, para ser tão comparável quanto possível às medições obtidas usando preparações de fatia aguda padrão-ouro". Portanto, embora um método dedicado à culturing de curto prazo possa inicialmente ser visto como limitado, o cultivo de longo prazo não é necessário para produzir resultados relevantes em muitos projetos experimentais32,33,34 35,56,57.

Duas etapas críticas do protocolo são a espessura reduzida das fatias (200 μm) e a suplementação do meio da cultura com BDNF. Em trabalhos anteriores32,mostramos preservação da viabilidade celular até 4 DIV e discutimos a provável contribuição da redução da espessura da fatia para 200 μm em comparação com as fatias de 300-400 μm mais utilizadas12,29. Basicamente, reduzir a espessura das fatias pode contribuir para uma melhor oxigenação e captação de nutrientes em fatias flutuantes, diminuindo as chances de hipóxia do núcleo e neurodegeneração31,32,57, 58,59,60,61. Além disso, recomenda-se manter o tecido em mídia fria e oxigenada da sala cirúrgica até o passo de corte no vibratome, considerando a alta demanda por O2 pelo nervoso central humano adulto. A suplementação de médio com BNDF tem sido previamente vista para aumentar ligeiramente a viabilidade em fatias cerebrais humanas adultas cultivadas flutuantes32,de acordo com as recomendações para a suplementação média com fatores neurotróficos por outros autores 62,63.

Em conclusão, este protocolo descreve métodos para preparar e executar ensaios com culturas de fatias de curto prazo e flutuantes de cérebros humanos adultos. Este modelo deve ser passível de investigações sobre os mecanismos de toxicidade/neuroproteção relevantes para doenças cerebrais associadas à idade. O uso de tecido ressecado humano apresenta a vantagem de preservar a citoarquitetura cerebral e circuitos locais, adicionando poder translacional aos achados obtidos. Além disso, estourar o uso de amostras derivadas de seres humanos da neurocirurgia na neurociência pode ajudar a reduzir a necessidade de experimentação animal. Embora este protocolo seja centrado em torno do uso do tecido coletado dos pacientes submetidos à neurocirurgia para o tratamento farmacoresistente da epilepsia, sugere-se que o tecido coletado de outras regiões/circunstâncias do cérebro seja considerado igualmente como fontes para produção de culturas de fatias de uma forma simples e rentável.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado pela FAPESP (Grant 25681-3/2017 para AS), CAPES (Bolsa de Pós-Doutorado PNPD/INCT-HSM para A.F. e bolsa de pré-doutorado para N.D.M.) e FAEPA. A G.M.A. possui uma bolsa de mestrado da FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. é dona de uma Bolsa de Pesquisa cnpq. Agradecemos aos pacientes e suas famílias por doarem os tecidos ressecados para este estudo. Gostaríamos de reconhecer o apoio de moradores, enfermeiros, técnicos e da equipe do CIREP, do Hospital Clínico da Faculdade de Medicina Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, que ajudou em diversas etapas do processo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 - VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 - ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ

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Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).

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