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Neuroscience

来自成人大脑的短期自由浮动切片培养

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/59845
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 4, 4, 5, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Summary

提出了一种从成人大脑中制备自由浮动切片培养物的协议。该协议是使用膜插入物广泛使用的切片培养方法的变体。它简单，经济高效，建议进行短期检测，旨在解开与年龄相关的脑疾病背后的神经退化机制。

Abstract

组织，或切片培养，已被广泛用于模拟中枢神经系统在体外功能的各个方面。尽管在神经科学中切片培养物的潜力，使用成人神经组织来制备这种培养物的研究仍然很少，尤其是那些来自人类受试者的研究。使用成人人体组织来制备切片培养物对增进人类神经病变的理解特别有吸引力，因为它们具有独特的特性，这些特性是典型的成熟人类大脑，缺乏由啮齿动物（通常是新生儿）生产的切片。神经组织。该协议描述了如何使用从活体人类捐赠者那里收集的脑组织提交到切除脑外科，以准备短期的，自由浮动的切片培养物。还介绍了使用这些培养物维护和执行生化和细胞生物学测定的程序。代表性结果表明，典型的人体皮质层压在体外4天（DIV4）后保存在切片中，预期存在主要神经细胞类型。此外，DIV4的切片在受到毒性刺激（H2O2）的挑战时会经历强细胞死亡，这表明该模型有可能成为细胞死亡检测的平台。该方法是使用膜插入物广泛使用的协议的更简单、经济有效的替代方法，主要推荐用于运行短期检测，旨在解开与年龄相关的脑疾病背后的神经退化机制。最后，虽然该协议专门用于使用从患者那里收集的皮质组织，这些患者接受药物治疗，但认为从其他大脑区域/条件收集的组织也应被视为生成类似自由浮动切片区域性的源。

Introduction

在研究中使用人类样本无疑是研究人类大脑病理学的绝佳选择，现代技术为使用患者衍生组织进行稳健和合乎道德的实验开辟了新途径。从成人人脑制备的有机体/切片培养物等方法已越来越多地用于光遗传学1、电生理学2、3、4、5、可塑性等范式中。6，7，8，9，神经毒性/神经保护10，11，12，13，细胞治疗14，药物筛选15，16，17， 遗传学和基因编辑12，18，19，20，等等， 作为一个策略，以更好的了解成年后的神经疾病。

理解人类大脑病变背后的机制取决于需要大量的实验策略。相反，在切片培养的情况下，虽然获取人类样本仍然很困难，但从单个皮质样本中生成多达 50 个切片的可能性部分地规避了通过增加每个收集的组织复制和进行测定的数量21。

几个方案的大脑器官/切片培养已经描述，从经典的oculo拔模22，23到辊管24，25，26，半渗透膜接口27，28，29，30和自由浮动切片31，32。根据实验设计的特殊性，每种技术都有其优点和缺点。从成人大脑短期的，自由浮动的切片培养在某些情况下比Stoppini等人使用的方法27有利，如果考虑到事实，虽然长期细胞在体外生存通常是一个主要的关注，在评估一种文化方法，在许多实验中只需要很短的时间在文化需要12，31，32，33，34，35。在这些条件下，使用自由浮动培养物的优点是更简单、更具成本效益，并且比在培养中保存的切片在 2-3 周内更精确地类似于原始人体组织状况。

尽管切片培养对神经科学有潜力，但利用成人神经组织来制备这种培养物的研究仍然很少，尤其是来自人类的研究。本文介绍了一种协议，使用从活体人类捐赠者那里收集的脑组织提交到切除脑外科，准备自由浮动切片培养物。使用这些培养物维护和执行生化和细胞生物学测定的程序是详细的。该协议已被证明对分析与成年期相关的神经病变机制的生存能力和神经元功能有价值。

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Protocol

活成人脑组织是从接受切除神经外科治疗药理性叶癫痫的患者身上获得的（图1A）。所有程序都由里贝里诺普雷托医学院诊所医院（17578/2015）的伦理委员会批准，患者（或其法律责任人员）同意并签署了知情同意条款。组织采集工作由巴西圣保罗大学里贝里奥普雷托医学院的神经外科小组进行。

1. 材料灭菌

注：所有材料和溶液在使用前必须消毒。

  1. 在干式消毒炉中，在干燥消毒炉中消毒所有手术工具和振动体切片材料（刀架、试样盘、缓冲盘），在 180°C 下进行 4 小时消毒。
  2. 通过紫外线或伽马辐照对温度敏感材料或设备进行消毒。
  3. 通过0.22 μm孔膜的高压灭菌或过滤，对介质和溶液进行灭菌。

2. 准备解决方案

  1. 准备15-20 mL的运输溶液：50%v/v汉克斯平衡盐溶液（HBSS）pH 7.4，50%v/v基础培养基，用于维持产后和成人脑神经元（材料表），辅以10mM 4-（2-氢氢乙二醇）-1-管子甲酸（海平），3毫克/mL葡萄糖和33微克/mL甘霉素。
    注：在采集样品之前，运输溶液必须冷藏和氧化（用卡博根气体冒泡）至少20分钟。
  2. 准备300 mL的切片溶液（HBSS 辅以10 mM HEPES和3 mg/mL葡萄糖），并将其冷却在冰柜中，使其处于初始晶体形成点。
  3. 准备20 mL培养基：维持产后和成人脑神经元的基础介质（材料表），辅以1%L-谷氨酰胺衍生物（材料表），2%补充神经培养（表）材料），1%青霉素/链霉素，和0.25微克/mL五聚他素B。

3. 设置切片装置

注：由于手术室的样品采集后勤，本协议最好在同事的协助下执行。

  1. 在一桶加盐的冰中，让切片溶液在使用前至少20分钟停留在卡博根混合物冒泡（95%O 2，5%CO2）下。
  2. 准备一块3%的甘蔗（约2厘米x2厘米x2厘米），并超级粘附到振动体标本盘，以便在切片期间为组织样本创造额外的机械支持（图1E）。
  3. 设置切片的振动体：截面厚度为 200 μm，振动频率为 100 Hz，切片速度介于 0.5-1.0 mm/s 之间。
  4. 将振动缓冲盘锁定到振动体底座上，并添加冰块，使其在接收切片溶液和样品之前以及在整个切片过程中冷藏。

4. 样本收集

注：在本协议中，人类新皮质组织被收集在手术室，并运送到实验室。

注意：在处理人体样本时，请遵循机构制定的适当安全规程。

  1. 设置运输装置（图1C），其组成：一个便携式气瓶，其中，将车波根混合物连接到一个压力/通量阀，控制连接到硅管的气体输出，将气体输出连接到运输船舶;运输容器，通常为50mL锥形离心管，带穿孔盖供气体输入，含有输送溶液;和冰，用于在运输过程中进行样品冷却。
  2. 立即收集和将试样（图1B）运送到实验室。将试样浸入冷运输溶液中（不断与肉原混合物一起冒泡）。

5. 切片

  1. 将试样转移到含有切片溶液的培养皿（100 mm x 20 mm）中，使用精细的手术工具，小心地去除样品中剩余的脑膜炎（图1D）。
  2. 选择最佳试样方向，以生产具有实验设计特殊特征的切片，使用 24 号手术刀刀片，将平面修剪为粘附在试样盘上的底座。
  3. 使用一次性塑料勺和精致的画笔，收集从培养皿和干燥多余的溶液的碎片使用滤纸（干燥毛细管，避免接触纸巾碎片与纸）。
  4. 使用超胶，将组织连接到振动体试样盘，直到其牢固地粘附在圆盘上并与胶合块接触（图1E）。
  5. 将振动体试样盘（组织正确连接）放入装有切片溶液的振动体缓冲盘中，在整个过程中必须冒泡。
  6. 将刀柄固定到位，将剃刀刀刃固定到位。
  7. 切片溶液必须同时覆盖试样和刀片，然后才开始切片（图1F）。
  8. 将试样切成 200 μm 切片。
    注：虽然有些振动器会自动切割样品，但在此过程中的近距离观察和切片速度的轻微调整可能有助于生成更好的切片。丢弃初始不规则切片。
  9. 将切片从缓冲盘转移到带有切片溶液的培养皿中，并修剪松散的边缘和多余的白色母体，使其比例约为 70% 皮层/30% 白质。

6. 文化

注：在无菌环境下的层流柜中执行此步骤。

  1. 每孔（在24孔板中）加入600μL培养基，在36°C和5%CO2下孵育至少20分钟，然后电镀切片。
  2. 使用画笔每孔板一片 （图 1G）。
  3. 如果盘子里有任何未使用的水井，请用400μL的无菌水填充。
  4. 在36°C，5%CO2孵育板。
    注：电镀后，第一次介质更换必须在8-16小时之间完成，具体取决于切片的大小。
  5. 补充10 mL的先前准备的培养基，50纳克/mL脑衍生神经营养因子（BDNF）。
    注：在前8-16小时，切片在600μL的培养中孵育，以避免营养剥夺和酸化，因为该阶段的中度消耗加速。从下一步开始，每口井的介质体积调整为 400 μL。
  6. 从每口井中取出333 μL的调节介质，并加入133μL的新鲜BDNF补充介质。
  7. 每24小时重复一次介质更换过程，用新鲜的BDNF补充介质替换三分之一的调节介质。

7. 评估培养切片中的健康、形态和功能

注：为了在代表性结果中说明诱导细胞死亡，一些切片被提交到24小时处理与氧化应激诱导剂H2O2。步骤7.1.2和7.1.3描述了使用H2O2诱导细胞死亡。

  1. 细胞活力
    注：在受挑战的切片培养物中评估神经毒性/神经保护的一种简单、直接的方法是3-（4，5-二甲基硫磷-2-yl）-2，5-二苯基四甲二甲苯（MTT）测定36，它测量代谢活性细胞的百分比与经过处理的样品相比，在正常条件下。
    1. 在层流柜中，用新鲜的介质替换三分之一的介质。
    2. 从 30% H2O2库存溶液中，每口井添加 H2O2的体积，以达到预期的最终浓度（30 mM 或 300 mM）。
      注：H2O2在介质每日更换后添加，以确保在挑战前适当供应新鲜营养物质。
    3. 在36°C下孵育板24小时，CO2孵育5%。
      注：H2O2治疗后（或其他有毒刺激的利息），以下步骤描述MTT测定的细胞活力测定。
    4. 将40μL的MTT溶液加入到板中的每口井中，最终浓度为0.5mg/mL。
    5. 在 36°C 下孵育板，5% CO2孵育 3 小时。
    6. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗切片，并转移到微管中。
    7. 通过移液小心地去除所有剩余的溶液。
    8. 称量包含切片的显微管以确定每个切片的质量（这是使获得的吸收读数规范化的关键）。
      注：如果需要，样品可以在此阶段冷冻（-20°C），以便日后处理。
    9. 在 200 μL 异丙醇/HCl 中，使用电动刺虫对切片进行均质化。
    10. 在室温 （RT） 下在 2600 x g下离心 2 分钟。
    11. 收集上清液并测量 540 nm 的吸光度。
  2. KCl 诱导神经元去极化
    注：线粒体活性蛋白激酶（MAPK）信号级联蛋白ERK的磷酸化，其次是西方印迹，可用于定量对KCl诱导的去极化37的神经元反应。
    1. 在流动柜中，将培养基用300 μL的HBSS先前平衡到36°C。
    2. 用 300 μL 的新鲜 HBSS 替换 HBSS，此前这些 HBSS 已平衡到 36°C。
    3. 在36°C下孵育板，5%CO2孵育15分钟。
    4. 用新鲜的哈佛商学院或80 mM KCl去极化溶液（均在36°C下）替换HBSS，并在36°C、5%CO2孵育15分钟。
    5. 将切片从板转移到显微管。在此步骤中，切片可以存储在 -20°C 进行后续处理。
    6. 在150μL放射性免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液中制备组织提取物（50mM Tris-HCl;150 mM NaCl;1mM EDTA;1%非离子表面活性剂;0.1%硫酸钠;pH 7.5）。离心提取物在4°C下10分钟，在16000 x g下，收集上清液，并使用布拉德福德方法确定总蛋白质浓度。
    7. 将30μg的总蛋白质加载到12%的硫酸二甲酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上。
    8. 电泳后，将凝胶含量转移到硝化纤维素膜上。
    9. 在 TBS 中用 5% 非脂肪干牛奶和 0.1% 补间堵塞膜后，用小鼠抗 pERK （1：1，000） 在 4°C 下孵育 16 小时。洗涤后，在RT用兔子抗ERK1/2（1：1，000）孵育2小时。
    10. 在RT下用适当的HRP结合二级抗体孵育1小时。
    11. 使用首选 HRP 基板进行显示。
  3. 形态评价
    注：除了细胞存活率和功能评估外，分析组织形态也很重要。请注意，切除培养切片是生产尽可能多的高质量材料进行形态分析的重要步骤。
    1. 修复、冷冻保护和切除切片
      1. 将切片从培养基的孔转移到含有 PBS 的新 24 孔板。
      2. 取出PBS并加入1 mL的4%甲醛（PFA）。在添加 PFA 之前，切片应保持平整，这一点很重要。在4°C下孵育过夜。
      3. 小心地取出 PFA 溶液，并加入 1 mL 的 30% 蔗糖溶液。在4°C下孵育48小时。
      4. 将冷冻微吨设置为-40°C。
      5. 在应放置切片的微缩阶段制备蔗糖基底（图2A）。让它完全冻结，并仔细切割一些冷冻蔗糖，以产生一个平坦的表面，切片将被放置在。
      6. 将每片片放在拉伸的塑料薄膜上，并使用画笔将组织平平。
      7. 一次移动即可将拉伸切片转移到冷冻蔗糖底座。
        注： 切片在结冰的蔗糖底座上移动后无法移动。请仔细执行此传输步骤。
      8. 让切片休息 5-10 分钟，以便进行适当的冷冻。
      9. 将切片切成 30 μm 部分。
      10. 将 30 μm 部分转移到含有 PBS 的培养皿中。
      11. 继续到更适当的实验设计中的公司学协议。
        注：30 μm 部分可易用于自由浮动免疫性化学，安装在显微镜幻灯片上，用于进一步进行成科研究，或储存在 -20°C 的防冻溶液中。
    2. 免疫性化学
      注：免疫植物化学和免疫荧光标准方案因实验室而异。有关此处使用的协议的详细版本，请参阅 Horta 等人38。图2中提出的用于免疫染色的主要抗体包括神经元核（NeuN）、健康成熟的神经元标记物、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、电化剂标记物、电化钙结合适配器（Iba-1）和微胶原体标记。
      1. 在阻断溶液中孵育切片（例如，PBS中2%的正常驴血清）40分钟。
      2. 在4°C的轻度搅拌下用原发抗体孵育过夜。
      3. 使用PBS洗涤后，在RT轻度搅拌下，用生物仿当二级抗体孵育120分钟。
      4. 用PBS洗涤后，在RT孵育120分钟，用阿维辛-过氧化物酶结合（材料表）。
      5. 与 DAB = 0.04% 镍铵显示。
      6. 将染色部分安装在明胶涂层显微镜幻灯片上，让它们风干。在乙醇中脱水，在二甲苯中分二甲苯，用安装介质（材料表）完成，盖上盖有盖板，并显示图像。

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Representative Results

评估培养切片的质量和健康的一个关键方面是预期神经细胞类型、神经元和胶质细胞的存在和典型形态。在DIV4的切片中观察到人类皮质层压的典型结构，通过神经元免疫标记（图2D）显示。此外，还观察到了微胶质和星体的预期存在（图2B，C）。这些结果表明，组织结构没有受到外科手术/样品处理或体外短期期的显著影响。根据以前的发现，表明NeuN免疫反应在DIV0和DIV432之间没有改变。根据这些结果，自由浮动培养形式，与切片厚度减小到200μm（与使用膜插入时广泛使用的300-400μm相比）有助于更好地向内细胞层扩散氧气和营养物质切片，这已被证明是至关重要的培养切片39，40的健康。

切片中细胞死亡的定量也是神经病变前体模型（如切片培养）中有价值的方法（Lossi等人41审查）。在以前的研究中，我们使用MTT测定来确定在培养期32的细胞死亡水平。除了生存能力，同一研究还表明，培养切片（高达DIV4）保留了在KCl引起的脱极化32时释放神经递质的能力。在这里，这些发现通过研究对ERK磷酸化（一种参与突触可塑性和记忆42、43）过程的中央激酶的KCl引起的去极化的神经元反应进行了扩展。有趣的是，在DIV4的KCl处理切片中，ERK磷酸化明显增加（图3A，B）。

最后，用已知的氧化应激诱导剂H2O2对DIV4的切片对毒性挑战的反应进行了评价。其原理是，细胞死亡的程度应与培养切片中的细胞活力水平成正比。如图3C所示，将切片暴露于300 mM H2O2 2 2 2，在 24 小时内可导致 MTT 减少。综合起来，在H2O2挑战和KCl诱导的脱极结果之后，在DIV5中观察到的大规模细胞死亡和KCl引起的去极化结果表明，DIV4中保存的切片的一般健康对氧化剂等毒性刺激反应充分应力。

Figure 1
图1：从成年人类的皮质组织的样本收集、传输、切片和培养。手术从手术室开始，从时间性切除术中收集皮质组织，用于治疗耐药癫痫（A，B）。（C） 组织片段 （n = 1） 立即转移到含有冰冷含氧输送介质的管中（见下文）。（D） 在实验室中，用精细的眼钳去除脑膜炎。多余的液体用滤纸干燥，碎片（E）被过度粘附到振动镜盘上，白色物质朝下，皮面朝上。（F） 使用商业剃须刀，将试样切成 200 μm 切片，用精致的画笔收集，然后移回培养皿，以进一步修剪多余的白质和松极（未显示），然后 （G）电镀和培养在自由浮动格式。（H） 切片培养物可存活数天，可用于各种实验方案。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：成人脑切片培养中神经细胞的形态分析。切片在体外第四天被固定。（A，B，C）免疫组化学前切片程序的代表性步骤。组织以数字方式着色，以提高可视化效果。（D） 皮质层中神经元的正态分布（罗马数字）。（E） 微胶和 （F） 星形细胞也被清楚地观察到 （n = 每个细胞类型标签 1 片）。所有切片均从单个捐赠者的组织获得。刻度条 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：成人脑切片培养中功能和细胞活力测定。神经活性在天体外5（DIV5）切片中被KCl诱导的去极化，并随之增加ERK磷酸化。（A） 用一块切片的同质物获得的代表性免疫布乐结果.指示对应于磷ERK（Perk）和总ERK（tERK）的波段。（B） 从单个人类捐赠者对三个独立切片中的 pERK/tERK 比率进行定量。（C） 过氧化氢（H2O 2 ） 毒性在 DIV 5 的切片中由 MTT 测定评估。所得的光学密度值按每个切片的质量归一化。在指示浓度（No2O 2;30 mMH2 O 2;300 mM H2O2） 下，用 H2O2对切片进行 24 h 的筛选。显示在条形上方。结果以平均误差和标准误差形式呈现，这些数据来自来自单个捐赠者的三个独立切片。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

此协议用于生产自由浮动的短期切片培养法是培养成年人类新皮质切片的替代方法。这种切片培养方案可用于研究（但不限于）光遗传学1，44，45，电生理学2，3，4，5，短期可塑性46，47，长期可塑性48，49，神经毒性/神经保护10，11，12， 13，细胞疗法14，药物筛选15，16，17，癌症50，51，遗传学，和基因编辑12，18 ，19，20.

使用来自成年人体组织的样本对于理解人类神经病变尤为重要，因为人类大脑缺乏从啮齿动物神经组织产生的切片中的独特特性52。此外，啮齿动物大脑的切片培养物通常来自新生儿、未成熟的大脑，这些大脑是高度可塑的，含有迁移细胞，可能会改变原来的切片细胞结构以适应体外环境26。 53，54，55.如Ting等人30所说，这种塑料事件会导致电路变化，当目标是模仿体内状况时，应该避免这种变化："我们选择关注不到一周的培养物，其中结构和功能特性是合理的。保持最小的扰动，尽可能与使用金标准急性切片制剂获得的测量值相媲美"。因此，虽然一种专门用于短期栽培的方法最初可能被视为有限，但不需要长期培养才能在许多实验设计中产生相关结果 32、33、34 ，35，56，57.

该协议的两个关键步骤是减少切片厚度（200 μm）和用BDNF补充培养基。在以前的工作32中，我们已经展示了保持细胞活力高达4 DIV，并讨论了减少切片厚度到200μm的可能贡献相比，更常用的300-400μm切片12，29。基本上，减少切片厚度可能有助于在自由浮动切片中更好地氧合和营养吸收，减少核心缺氧和神经退化的机会 31，32，57，58，59，60，61.此外，考虑到成人中枢神经对O2的高需求，建议将组织保存在从手术室到振动体切片处的冷、含氧介质中。用BNDF补充介质之前已经看到，在成人人脑切片培养自由浮动32的生存能力略有增加，符合其他作者关于用神经营养因子补充中位的建议62，63.

最后，本协议描述了从成人大脑中制备和运行短期自由浮动切片培养物的测定方法。该模型应适用于研究与年龄相关的脑疾病相关的毒性/神经保护机制。使用人类切除的组织具有保护脑细胞结构和当地电路的优点，为获得的发现增加了转化能力。此外，在神经科学中大量使用神经外科的人类样本可能有助于减少动物实验的需要。虽然此协议的核心是使用从患者那里收集的组织进行抗药性癫痫治疗，但建议从其他大脑区域/条件收集的组织也被视为以简单且经济高效的方式生产切片培养物。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到FAPESP（25681-3/2017年授予AS）、CAPES（博士后研究金PNPD/INCT-HSM到A.F.和博士前奖学金到N.D.M.）和FAEPA的支持。G.M.A. 持有 FAPESP （MS 2018/06614-4） 的硕士奖学金。N.G.C. 持有 CNPq 研究奖学金。我们感谢患者及其家属为这项研究捐赠被切除的纸巾。我们要感谢圣保罗大学里贝里奥普雷托医学院临床医院的居民、护士、技术人员和CIREP团队的支持，他们帮助参与了这一进程的各个阶段。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 - VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 - ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ

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神经科学， 问题 153， 组织培养， 新皮质， 前体， 神经退化， 癫痫， 阿尔茨海默氏症
来自成人大脑的短期自由浮动切片培养
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Fernandes, A., Mendes, N. D.,… More

Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).

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