Summary
Un protocole pour préparer les cultures de tranches flottantes à partir du cerveau humain adulte est présenté. Le protocole est une variante de la méthode de culture de tranches largement utilisée à l'aide d'inserts membranaires. Il est simple, rentable et recommandé pour les essais à court terme visant à démêler les mécanismes de neurodégénérescence derrière les maladies du cerveau associées à l'âge.
Abstract
Organotypic, ou cultures de tranche, ont été largement employés pour modéliser des aspects du système nerveux central fonctionnant in vitro. Malgré le potentiel des cultures de tranches en neurosciences, les études utilisant le tissu nerveux adulte pour préparer de telles cultures sont encore rares, en particulier celles des sujets humains. L'utilisation de tissus humains adultes pour préparer les cultures de tranches est particulièrement attrayante pour améliorer la compréhension des neuropathologies humaines, car elles contiennent des propriétés uniques typiques du cerveau humain mature manquant de tranches produites à partir de rongeurs (généralement néonatales) tissu nerveux. Ce protocole décrit comment utiliser les tissus cérébraux recueillis auprès de donneurs humains vivants soumis à une chirurgie réséctive du cerveau pour préparer des cultures de tranches à court terme et flottantes. Des procédures pour maintenir et effectuer des essais biochimiques et de biologie cellulaire utilisant ces cultures sont également présentées. Les résultats représentatifs démontrent que le lamination corticale humain typique est préservé en tranches après 4 jours in vitro (DIV4), avec la présence prévue des principaux types de cellules neurales. En outre, les tranches de DIV4 subissent une mort cellulaire robuste lorsqu'elles sont confrontées à un stimulus toxique (H2O2), indiquant le potentiel de ce modèle pour servir de plate-forme dans les tests de mort cellulaire. Cette méthode, une alternative plus simple et rentable au protocole largement utilisé utilisant des inserts membranaires, est principalement recommandée pour exécuter des essais à court terme visant à démêler les mécanismes de neurodégénérescence derrière les maladies du cerveau associées à l'âge. Enfin, bien que le protocole soit consacré à l'utilisation de tissus corticaux prélevés sur des patients soumis à un traitement chirurgical de l'épilepsie pharmacorésistante du lobe temporal, on fait valoir que les tissus prélevés dans d'autres régions ou conditions cérébrales devraient également être comme sources pour produire des cultures de tranches flottantes similaires.
Introduction
L'utilisation d'échantillons humains dans la recherche est sans équivoque une excellente option pour étudier les pathologies du cerveau humain, et les techniques modernes ont ouvert de nouvelles voies pour l'expérimentation robuste et éthique en utilisant des tissus dérivés du patient. Des méthodes comme les cultures organotypic/slice préparées à partir du cerveau humain adulte ont été de plus en plus employées dans des paradigmes tels que l'optogénétique1, l'électrophysiologie2,3,4,5, plasticité 6,7,8,9, neurotoxicité/neuroprotection10,11,12,13, thérapie cellulaire14, dépistage des médicaments15,16,17, génétique et l'édition génétique12,18,19,20, entre autres, comme une stratégie pour mieux comprendre les maladies neurologiques à l'âge adulte.
La compréhension des mécanismes sous-jacents aux pathologies cérébrales humaines dépend de stratégies expérimentales qui nécessitent un grand nombre de sujets. Inversement, dans le cas des cultures de tranches, bien que l'accès aux échantillons humains soit encore difficile, la possibilité de générer jusqu'à 50 tranches à partir d'un seul échantillon cortical contourne partiellement l'exigence de recruter plusieurs volontaires en augmentant le nombre de répliques et d'essais effectués par tissu recueilli21.
Plusieurs protocoles pour les cultures organotypic/slice de cerveau ont été décrits, s'étendant des projets classiques d'oculo22,23 au tube de rouleau24,25,26, membranes semi-perméables interface27,28,29,30, et les tranches flottantes31,32. Selon les particularités d'un design expérimental, chaque technique a ses propres avantages et inconvénients. À court terme, les cultures de tranches flottantes libres du cerveau humain adulte est dans certains cas avantageuse par rapport à la méthode utilisée par Stoppini et coll.27, si l'on considère le fait que, bien que la survie cellulaire à long terme in vitro soit habituellement une préoccupation majeure lors de l'évaluation une méthode de culture, dans beaucoup d'expériences seulement de courtes périodes de temps dans la culture sont nécessaires12,31,32,33,34,35. Dans ces conditions, l'utilisation de cultures flottantes présente l'avantage d'être plus simple et plus rentable, ainsi que plus exactement ressemblant à l'état des tissus humains d'origine que les tranches maintenues en culture sur 2-3 semaines.
Malgré le potentiel des cultures de tranche à la neuroscience, les études utilisant le tissu nerveux adulte pour préparer de telles cultures sont encore rares, particulièrement des sujets humains. Cet article décrit un protocole pour employer le tissu de cerveau recueilli des donateurs humains vivants soumis à la chirurgie résective de cerveau pour préparer des cultures de tranche flottantes. Les procédures de maintien et d'exécution des tests biochimiques et de biologie cellulaire à l'aide de ces cultures sont détaillées. Ce protocole s'est avéré utile pour analyser la viabilité et la fonction neuronale dans les investigations sur les mécanismes des neuropathologies liées à l'âge adulte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Des tissus cérébraux adultes vivants ont été obtenus à partir de patients subissant une neurochirurgie réséctive pour le traitement de l'épilepsie pharmacorésistante du lobe temporal(figure 1A). Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'hôpital des cliniques de l'école de médecine De Ribeiro Preto (17578/2015), et les patients (ou leur personne responsable légale) ont accepté et signé les conditions du consentement éclairé. La collecte du tissu a été effectuée par l'équipe de neurochirurgie du Centre de chirurgie de l'épilepsie (CIREP - Cliniques Hospital à la Preto Medical School de Ribeiro, Université de Sao Paulo, Brésil).
1. Stérilisation des matériaux
REMARQUE : Tous les matériaux et solutions doivent être stérilisés avant utilisation.
- Stériliser tous les outils chirurgicaux et les matériaux de tranchage de vibratome (porte-couteau, disque de spécimen, plateau tampon) dans un four stérilisant sec pendant 4 h à 180 oC.
- Stériliser les matériaux ou l'équipement sensibles à la température par irradiation UV ou gamma.
- Stériliser les médias et les solutions par autoclavation ou filtration à travers des membranes de pores de 0,22 m.
2. Préparation de solutions
- Préparer 15-20 ml de solution de transport: 50% v/v Hanks' solution de sel équilibrée (HBSS) pH 7.4, 50% v/v milieu basal pour le maintien des neurones cérébraux post-natals et adultes (Tableau des matériaux), complété par 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1- acide piperazineethanesulfonic (Hepes), 3 mg/mL de glucose, et 33 g/mL de gentamicine.
REMARQUE : La solution de transport doit être réfrigérée et oxygénée (bubbling avec du gaz carbogen) pendant au moins 20 minutes avant la collecte de l'échantillon. - Préparer 300 ml de solution de découpage (HBSS complété de 10 mM HEPES et 3 mg/ml de glucose) et le refroidir au congélateur jusqu'à la formation initiale de cristaux.
- Préparer 20 ml de milieu de culture: milieu basal pour le maintien des neurones cérébraux postnatals et adultes (Tableau des matériaux) complété par 1% dérivé de la L-glutamine (Tableau des matériaux), 2% supplément pour la culture neuronale (Tableau de Matériaux), 1% pénicilline/streptomycine, et 0,25 g/mL d'amphotericine B.
3. Mise en place de l'appareil de tranchage
REMARQUE : Ce protocole est idéalement exécuté avec l'aide d'un collègue en raison de la logistique de la collecte d'échantillons dans la salle chirurgicale.
- Dans un seau de glace salée, laisser reposer la solution de tranchage sous le mélange de carbogen bouillonnant (95% O2, 5% CO2) pendant au moins 20 minutes avant l'utilisation.
- Préparer un bloc d'agarose de 3 % (environ 2 cm x 2 cm x 2 cm) et le supercoller sur le disque du spécimen de vibratome afin de créer un soutien mécanique supplémentaire à l'échantillon de tissu pendant le découpage (Figure 1E).
- Définir le vibratome pour trancher : épaisseur de section de 200 m, fréquence des vibrations de 100 Hz et vitesse de tranchage entre 0,5 et 1,0 mm/s.
- Verrouillez le plateau tampon vibratome à la base du vibratome et ajoutez de la glace pour la conserver au réfrigérateur avant de recevoir la solution de tranchage et l'échantillon, et tout au long de la procédure de tranchage.
4. Collecte d'échantillons
REMARQUE : Dans ce protocole, le tissu néocortical humain a été rassemblé dans la salle chirurgicale et transporté au laboratoire.
CAUTION : Lorsqu'il s'agit d'échantillons humains, suivez les protocoles de sécurité appropriés établis par l'établissement.
- Configurer l'appareil de transport (Figure 1C) qui se compose de: une bouteille de gaz portable avec mélange de carbogen connecté à une soupape de pression / flux qui contrôle la sortie de gaz connecté à un tube de silicium qui relie la sortie de gaz au transport navire; un navire de transport, habituellement un tube conique de centrifugeuse de 50 ml avec couvercle perforé pour l'entrée de gaz, contenant la solution de transport; et de la glace pour le refroidissement de l'échantillon pendant le transport.
- Recueillir et transporter le spécimen (Figure 1B) immédiatement au laboratoire. Submerse le spécimen dans la solution de transport à froid (constamment bullé avec le mélange de carbogen).
5. Découpage
- Transférer le spécimen dans un plat Petri (100 mm x 20 mm) contenant une solution de découpage et, avec de fines outils chirurgicaux, enlever soigneusement autant que possible les méninges restantes dans l'échantillon (Figure 1D).
- Choisissez la meilleure orientation de spécimen pour produire des tranches avec les caractéristiques particulières de la conception expérimentale, et avec une lame de scalpel no 24, taillez une surface plane pour être la base collée au disque de spécimen.
- À l'aide d'une cuillère en plastique jetable et de pinceaux délicats, recueillir le fragment du plat Petri et sécher la solution excédentaire à l'aide de papier filtre (sec par capillarité et éviter de toucher le fragment de tissu avec du papier).
- À l'aide de superglue, attachez le tissu au disque du spécimen de vibratome jusqu'à ce qu'il soit fermement adhéré au disque et en contact avec le bloc d'agarose (Figure 1E).
- Placez le disque de spécimen de vibratome (avec le tissu correctement attaché) dans le plateau tampon de vibratome rempli de solution de tranchement qui doit bouillonner pendant tout le processus.
- Verrouillez le porte-couteau en place avec la lame de rasoir fermement fixée.
- La solution de tranchage doit couvrir à la fois le spécimen et la lame, puis commencer à trancher (Figure 1F).
- Couper le spécimen en tranches de 200 m.
REMARQUE : Bien que certains vibratomes coupent automatiquement les spécimens, l'observation rapprochée et les ajustements mineurs de la vitesse de découpe pendant le processus peuvent aider à produire de meilleures tranches. Jeter les tranches irrégulières initiales. - Transférer les tranches du bac tampon dans un plat Petri avec une solution de découpe et couper les bords lâches et l'excès de mater blanc à une proportion d'environ 70% cortex /30% de matière blanche.
6. La culture
REMARQUE : Effectuez cette étape dans une armoire à flux laminaire sous un environnement stérile.
- Ajouter 600 l de culture moyenne par puits (dans une assiette de 24 puits) et couver pendant au moins 20 min à 36 oC et 5 % de CO2 avant de placage les tranches.
- Déposer une tranche par puits à l'aide d'un pinceau (Figure 1G).
- S'il y a des puits inutilisés dans l'assiette, remplissez-les de 400 l d'eau stérile.
- Incuber la plaque à 36 oC, 5 % de CO2.
REMARQUE : Le premier remplacement moyen doit être effectué entre 8 et 16 h après le placage selon la taille de la tranche. - Supplément 10 mL du milieu de culture précédemment préparé avec le facteur neurotrophique dérivé de cerveau de 50 ng/mL (BDNF).
REMARQUE : Au cours des 8 à 16 premiers heures, les tranches sont incubées dans 600 l l de milieu pour éviter la privation et l'acidification des nutriments, puisque la consommation moyenne dans cette phase est accélérée. À partir de l'étape suivante, le volume du puits moyen est ajusté à 400 L. - Retirez 333 L du milieu conditionné de chaque puits et ajoutez 133 l de milieu frais complété par le BDNF.
- Répétez le processus de remplacement moyen toutes les 24 h en remplaçant un tiers du milieu conditionné par un milieu frais complété par le BDNF.
7. Évaluer la santé, la morphologie et la fonction en tranches cultivées
REMARQUE: Pour induire la mort cellulaire aux fins de l'illustration dans les résultats représentatifs, certaines tranches ont été soumises à un traitement de 24 heures avec l'inducteur de stress oxydatif H2O2. Les étapes 7.1.2 et 7.1.3 décrivent l'utilisation de H2O2 pour induire la mort cellulaire.
- Viabilité cellulaire
REMARQUE : Une méthode simple et simple pour évaluer le neurotoxique/neuroprotection dans les cultures contestées de tranche est le 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) analyse 36 , qui mesure le pourcentage des cellules actives métaboliques36, qui mesure le pourcentage de cellules actives métaboliques dans des conditions normales par rapport aux échantillons traités.- Dans l'armoire à débit laminaire, remplacer un tiers du milieu par un milieu frais.
- À partir d'une solution de stock H2O2 de 30 %, ajoutez un volume de H2O2 par puits pour atteindre la concentration finale prévue (30 mM ou 300 mM).
REMARQUE: H2O2 a été ajouté après le changement quotidien du milieu pour garantir l'approvisionnement approprié en nutriments frais avant le défi. - Incuber la plaque pendant 24 h à 36 oC, 5 % de CO2.
REMARQUE : Après le traitement H2O2 (ou d'autres stimulants toxiques d'intérêt), les étapes suivantes décrivent la détermination de la viabilité cellulaire par l'assay de MTT. - Ajouter 40 OL de solution MTT à une concentration finale de 0,5 mg/ml à chaque puits dans la plaque.
- Incuber la plaque à 36 oC, 5 % de CO2 pour 3 h.
- Laver les tranches avec de la saline tamponnée en phosphate (PBS) et transférer dans un microtube.
- Retirez soigneusement toute solution restante par pipetting.
- Peser les microtubes contenant les tranches pour déterminer la masse de chaque tranche (c'est la clé pour normaliser les lectures d'absorption obtenues).
REMARQUE : Si nécessaire, les échantillons peuvent être congelés (-20 oC) à ce stade pour un traitement ultérieur. - Homogériser les tranches de 200 oL d'isopropanol/HCl à l'aide d'un pilon motorisé.
- Centrifugeuse à température ambiante (RT) pendant 2 min à 2600 x g.
- Recueillir le supernatant et mesurer l'absorption à 540 nm.
- Dépolarisation neuronale induite par KCl
REMARQUE : La phosphorylation de la kinase de protéine activée par mitogène (MAPK) signalant la protéine en cascade ERK, suivie du ballonnement occidental, peut être employée pour la quantification de la réponse neuronale à la dépolarisation KCl-induite37.- À l'armoire de débit, remplacer le milieu de culture par 300 L de HBSS précédemment réquilibé à 36 oC.
- Remplacez le HBSS par 300 L de HBSS frais préalablement récalcitrés à 36 oC.
- Incuber la plaque à 36 oC, 5 % de CO2 pendant 15 min.
- Remplacer le HBSS par le HBSS frais ou avec une solution de dépolarisation KCl de 80 mL (à 36 oC) et couver à 36 oC, 5 % de CO2 pendant 15 min.
- Transférer les tranches de la plaque dans les microtubes. À cette étape, les tranches peuvent être stockées à -20 oC pour un traitement ultérieur.
- Préparer des extraits de tissus dans 150 l'analyse radioimmunoprécipitation (RIPA) tampon (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% surfactant nonionic; 0,1% de sulfate dodécyl de sodium; pH 7,5). Extraits de centrifugeuse à 4 oC pendant 10 min à 16000 x g,recueillir supernatant, et déterminer la concentration totale de protéines en utilisant la méthode Bradford.
- Chargez 30 g de protéines totales sur une électrophoresde au polyacrylamide de sulfate de sulfate de 12 % (SDS-PAGE).
- Après l'électrophoresis, transférer la teneur en gel dans une membrane de nitrocellulose.
- Après avoir bloqué la membrane avec 5% de lait sec non gras dans le SCT plus 0,1% de tween, incuber avec la souris anti-pERK (1:1,000) pendant 16 h à 4 oC. Après le lavage, incuber pendant 2 h à RT avec lapin anti-ERK1/2 (1:1,000).
- Incuber avec l'anticorps secondaire HRP-conjugué approprié à RT pendant 1 h.
- Révélez avec le substrat HRP préféré.
- Évaluation morphologique
REMARQUE : En plus de la survie cellulaire et des évaluations fonctionnelles, il est important d'analyser la morphologie des tissus. Sachez que la résection de la tranche cultivée est une étape importante pour produire autant de matériaux de haute qualité que possible pour l'analyse morphologique.- Fixation, cryoprotection et résection des tranches
- Transférer les tranches des puits avec un milieu de culture dans une nouvelle plaque de 24 puits contenant du PBS.
- Retirez le PBS et ajoutez 1 ml de paraformaldéhyde (PFA) de 4 %. Il est important que les tranches restent à plat avant d'ajouter PFA. Incuber toute la nuit à 4 oC.
- Retirez soigneusement la solution PFA et ajoutez 1 ml de solution de saccharose à 30 %. Incuber pendant 48 h à 4 oC.
- Fixer le microtome de congélation à -40 oC.
- Préparer une base de saccharose sur le stade du microtome où les tranches doivent être placées (Figure 2A). Laisser congeler complètement et couper soigneusement une partie du saccharose congelé pour produire une surface plane sur laquelle la tranche sera placée.
- Placer chaque tranche sur un film plastique étiré et utiliser un pinceau pour aplatir le tissu.
- Transférer la tranche étirée sur la base de saccharose congelée en un seul mouvement.
REMARQUE : Il n'est pas possible de déplacer la tranche une fois qu'elle est au-dessus de la base congelée de saccharose. Effectuez cette étape de transfert avec soin. - Laisser reposer la tranche de 5 à 10 min pour bien la congélation.
- Couper la tranche en sections de 30 m.
- Transférer les sections de 30 m dans un plat Petri contenant du PBS.
- Passez au protocole d'histologie plus adéquat à la conception expérimentale.
REMARQUE : Les sections de 30 m peuvent être facilement utilisées pour l'immunohistochimie flottante, montées sur des glissières de microscopie pour une histologie plus poussée ou stockées dans une solution antigel à -20 oC.
- Immunohistochemistry
REMARQUE : Les protocoles standard d'immunohistochimie et d'immunofluorescence varient d'un laboratoire à l'autre. Pour une version détaillée du protocole utilisé ici, consultez Horta et coll.38. Les anticorps primaires utilisés pour les immunostainings présentés à la figure 2 comprennent les noyaux neuronaux (NeuN), le marqueur de neurones matures en bonne santé, la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), le marqueur des astorcytes, l'adaptateur ionisé de liaison de calcium (Iba-1) et les microglies marqueur.- Incuber les tranches dans la solution de blocage (par exemple, 2% sérum d'âne normal en PBS) pendant 40 min.
- Incuber toute la nuit avec l'anticorps primaire sous une légère agitation à 4 oC.
- Après lavage avec PBS, incuber pendant 120 min avec l'anticorps secondaire biotinylated sous l'agitation douce à RT.
- Après le lavage avec PBS, incuber à RT pendant 120 min avec avidin-peroxidase conjugué (Tableau des matériaux).
- Révélez-le avec du DAB à 0,04 % d'ammonium de nickel.
- Montez les sections tachées sur des lames de microscopie recouvertes de gélatine et laissez-les sécher à l'air. Déshydrater dans l'éthanol, diaphaniser en xylène, finir avec le milieu de montage (Table of Materials), couvrir d'un bordereau et de l'image.
- Fixation, cryoprotection et résection des tranches
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un aspect critique pour évaluer la qualité et la santé des tranches cultivées est la présence et la morphologie typique des types de cellules neurales, des neurones, et des cellules gliales prévus. L'architecture typique du lamination corticale humain a été observée dans une tranche à DIV4, révélée par l'immunolabeling neuronal (Figure 2D). De plus, on a également observé la présence prévue de microglies et d'astroglia(figure 2B,C). Ces résultats démontrent que l'architecture tissulaire n'est pas significativement affectée ni par la procédure chirurgicale / traitement de l'échantillon ou par la période à court terme in vitro. Conformément aux résultats précédents, il a été démontré que l'immunoréactivité de NeuN n'était pas altérée entre DIV0 et DIV432. Sur la base de ces résultats, le format de culture flottant, associé à l'épaisseur réduite de la tranche à 200 m (par rapport aux 300-400 m largement utilisés lorsque des inserts de membrane sont utilisés), a contribué à une meilleure diffusion de l'oxygène et des nutriments aux couches cellulaires internes en tranches, qui a déjà été démontrée pour être critique pour la santé des tranches cultivées39,40.
La quantification de la mort cellulaire en tranches est également une approche précieuse dans les modèles ex vivo de neuropathologies, telles que les cultures de tranches (revues par Lossi et al.,41). Dans une étude précédente, nous avons utilisé l'étude MTT pour déterminer les niveaux de mortalité cellulaire tout au long de la période dans la culture32. En plus de la viabilité, cette même étude a également montré que les tranches cultivées (jusqu'à DIV4) ont préservé la capacité de libérer des neurotransmetteurs lors de la dépolarisation induite par KCl32. Ici, ces résultats ont été élargis en étudiant la réponse neuronale à la dépolarisation KCl-induite sur la phosphorylation ERK, une kinase centrale impliquée dans des processus tels que la plasticité synaptique et la mémoire42,43. Fait intéressant, une nette augmentation de la phosphorylation ERK a été observée dans les tranches traitées au KCl à DIV4 (Figure 3A,B).
Enfin, la réponse des tranches à DIV4 à un défi toxique a été évaluée avec un inducteur de stress oxydatif connu, H2O2. La raison en était que l'étendue de la mort cellulaire devrait être proportionnelle au niveau de viabilité cellulaire dans les tranches cultivées. Comme le montre la figure 3C, l'exposition des tranches à 300 mM H2O2 pendant 24 h a entraîné une forte diminution de la réduction du TMT. Pris ensemble, la mort cellulaire massive observée dans DIV5 après le défi H2O2 et les résultats de dépolarisation induits par KCl indiquent que la santé générale préservée des tranches à DIV4 répond adéquatement à un stimulus toxique tel que l'oxydatif stress.
Figure 1: Collecte d'échantillons, transport, découpe et culture de tissus corticaux provenant d'humains adultes. La procédure commence à la salle chirurgicale avec la collecte du tissu cortical de la lobetomie temporelle pour le traitement de l'épilepsie pharmacorésistante (A,B). (C) Le fragment de tissu (n - 1) est immédiatement transféré dans un tube contenant un milieu de transport oxygéné à froid (voir ci-dessous). (D) En laboratoire, les méninges sont enlevées à l'aide d'une pince à épislmique fine. L'excès de liquide est séché à l'aide de papier filtre, et le fragment est superglued (E) au disque de spécimen de vibratome avec la matière blanche faisant face vers le bas et la surface de pial vers le haut. (F) À l'aide d'un rasoir à raser commercial, le spécimen est coupé en tranches de 200 m qui sont recueillies avec un pinceau délicat et transférés vers le plat Petri pour rogner davantage de l'excès de matière blanche et les extrémités lâches (non montré) avant (G) placage et la culture dans un format flottant. (H) Les cultures de tranches sont maintenues viables pendant plusieurs jours et peuvent être utilisées dans une variété de protocoles expérimentaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Analyse morphologique des cellules neurales dans les cultures de tranches du cerveau humain adulte. Les tranches ont été fixées au quatrième jour in vitro. (A,B,C) Étapes représentatives de la procédure de sectionnement avant l'immunohistochimie. Le tissu a été numériquement coloré pour améliorer la visualisation. (D) Distribution normale des neurones en couches corticales (chiffres romains). (E) Les microglies et (F) les astrocytes ont également été clairement observés (n - 1 tranche par étiquetage de type cellulaire). Toutes les tranches ont été obtenues à partir de tissus d'un seul donneur. Barres d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Tests fonctionnels et de viabilité cellulaire dans les cultures adultes de tranche de cerveau humain. L'activité neuronale a été évaluée en tranches au jour in vitro 5 (DIV5) par la dépolarisation KCl-induite et l'augmentation conséquente de la phosphorylation ERK. (A) Un résultat immunoblot représentatif obtenu avec des homogénéates d'une tranche. Les bandes correspondant au phospho ERK (Perk) et à l'ERK total (tERK) sont indiquées. (B) Quantification du ratio pERK/tERK en trois tranches indépendantes d'un seul donneur humain. (C) La toxicité du peroxyde d'hydrogène (H2O2) a été évaluée par l'assay MTT en tranches à DIV 5. Les valeurs de densité optique obtenues ont été normalisées par la masse de chaque tranche. Les tranches ont été contestées avec H2O2 aux concentrations indiquées (No H2O2;30 mM H22;300 mM H2O2) pendant 24 h. Images de tranches représentatives après l'incubation avec MTT sont montrés au-dessus des barres. Les résultats sont présentés comme une erreur standard moyenne à partir de données obtenues à partir de trois tranches indépendantes d'un seul donateur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole pour la production de cultures de tranches flottantes et à court terme est une méthode alternative pour la culture de tranches néocorticales humaines adultes. Un tel protocole pour les cultures de tranches peut être propice aux études sur (mais pas limité à) l'optogénétique1,44,45, l'électrophysiologie2,3,4,5 , plasticité à court terme46,47, plasticité à long terme48,49, neurotoxicité/neuroprotection10,11,12, 13, thérapie cellulaire14, dépistage des médicaments15,16,17, cancer50,51, génétique, et l'édition de gènes12,18 ,19,20.
L'utilisation d'échantillons de tissus humains adultes est particulièrement importante pour comprendre les neuropathologies humaines, en raison de propriétés uniques typiques du cerveau humain manquant de tranches produites à partir de tissu nerveux de rongeurs52. En outre, les cultures de tranches de cerveaux de rongeurs sont généralement préparées à partir de cerveaux néonatals immatures, qui sont très plastiques et contiennent des cellules migratrices qui peuvent changer la cytoarchitecture tranche d'origine pour s'adapter à l'environnement in vitro26, 53,54,55. De tels événements plastiques entraînent des changements dans les circuits qui devraient être évités lorsque l'objectif est d'imiter l'état in vivo, comme l'ont déclaré Ting et coll.30: « Nous avons choisi de nous concentrer sur les cultures de moins d'une semaine, où les propriétés structurelles et fonctionnelles sont raisonnablement avec un minimum de perturbation, pour être aussi comparable que possible aux mesures obtenues à l'aide de préparations de tranches aigues de qualité or ». Par conséquent, bien qu'une méthode consacrée à la culture à court terme puisse initialement être considérée comme limitée, la culture à long terme n'est pas nécessaire pour produire des résultats pertinents dans de nombreuses conceptions expérimentales32,33,34 ,35,56,57.
Deux étapes critiques du protocole sont l'épaisseur réduite des tranches (200 m) et la supplémentation du milieu de culture avec BDNF. Dans les travaux précédents32, nous avons montré la préservation de la viabilité cellulaire jusqu'à 4 DIV et discuté de la contribution probable de la réduction de l'épaisseur de la tranche à 200 m par rapport aux plus souvent utilisés 300-400 tranches de m12,29. Fondamentalement, la réduction de l'épaisseur des tranches peut contribuer à une meilleure oxygénation et l'apport de nutriments dans les tranches flottantes, diminuant les chances d'hypoxie de base et de neurodégénérescence31,32,57, 58,59,60,61. En outre, il est recommandé de garder les tissus dans le froid, les milieuis oxygénés de la salle chirurgicale à l'étape de tranchage au vibratome, compte tenu de la forte demande pour O2 par l'adulte humain nerveux central. La supplémentation du milieu avec LE BNDF a été précédemment vue pour augmenter légèrement la viabilité dans les tranches humaines adultes de cerveau cultivées librement-flottantes32,en conformité avec des recommandations pour la supplémentation moyenne avec des facteurs neurotrophiques par d'autres auteurs 62,63.
En conclusion, ce protocole décrit les méthodes de préparation et d'exécution des essais avec des cultures de tranches à court terme et flottantes à partir de cerveaux humains adultes. Ce modèle devrait être favorable aux investigations sur les mécanismes de toxicité/neuroprotection pertinents aux maladies du cerveau liées à l'âge. L'utilisation du tissu réséqué humain présente l'avantage de préserver la cytoarchitecture de cerveau et les circuits locaux, ajoutant la puissance translationnelle aux résultats obtenus. En outre, l'éclatement de l'utilisation d'échantillons d'origine humaine provenant de la neurochirurgie en neurosciences peut aider à réduire le besoin d'expérimentation animale. Bien que ce protocole soit centré sur l'utilisation de tissus prélevés sur des patients soumis à la neurochirurgie pour un traitement pharmacorésistant de l'épilepsie, il est suggéré que les tissus prélevés dans d'autres régions ou conditions du cerveau soient également considérés comme sources de produire des cultures de tranches d'une manière simple et rentable.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par FAPESP (Grant 25681-3/2017 à AS), CAPES (Bourse postdoctorale PNPD/INCT-HSM à A.F. et Bourse prédoctorale à N.D.M.) et FAEPA. G.M.A. est titulaire d'une maîtrise du FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. est titulaire d'une bourse de recherche du CNPq. Nous remercions les patients et leurs familles d'avoir fait don des tissus réséqués pour cette étude. Nous tenons à souligner le soutien des résidents, des infirmières, des techniciens et de l'équipe du CIREP, de l'hôpital clinique de l'École de médecine Ribeiro Preto, université de Sao Paulo, qui ont aidé à diverses étapes du processus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Merck | 1096341000 | |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution | Sigma Aldrich | A3449 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| Antibody anti-ERK 2 (rabbit) | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
| Antibody anti-pERK (mouse) | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Bradford 1x Dye Reagent | BioRad | 500-0205 | |
| EDTA | Sigma | T3924 | Used in RIPA buffer |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Hank's Balanced Salts | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Vetec | 194 | |
| Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) | GE | NA931-1ML | |
| NaCl | Merck | 1064041000 | Used in RIPA buffer |
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| Non-fat dry milk (Molico) | Nestlé | Used for membrane blocking | |
| PBS Buffer pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
| Penicilin/Streptomicin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Potassium Chloride | Merck | 1049361000 | |
| Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
| SDS | Sigma | L5750 | Used in RIPA buffer |
| TEMED | GE | 17-1312-01 | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
| Tris | Sigma | T-1378 | Used in RIPA buffer |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | Used in RIPA buffer |
| Ultrapure Water | Millipore | Sterile water, derived from MiliQ water purification system | |
| Equipment and Material | |||
| 24-well plates | Corning | CL S3526 | Flat Bottom with Lid |
| Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane) | GE | 29047575 | |
| Carbogen Mixture | White Martins | 95% O2, 5% CO2 | |
| CO2 incubator | New Brunswick Scientific | CO-24 | Incubation of slices 5% CO2, 36ºC |
| Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| Microtubes | Greiner | 001608 | 1,5mL microtube |
| Motorized pestle | Kimble Chase | ||
| Plastic spoon | Size of a dessert spoon | ||
| Razor Blade | Bic | Chrome Platinum, used in slicing with vibratome | |
| Scalpel Blade | Becton Dickinson (BD) | Number 24 | Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller |
| Superglue (Loctite Super Bonder) | Henkel | Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer | |
| Vibratome | Leica | 14047235612 - VT1000S | |
| Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry | |||
| Antibody anti-NeuN (mouse) | Millipore | MAB377 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
| Antibody anti-GFAP (mouse) | Merck | MAB360 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
| Antibody anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | EPR16588 - ab178846 | Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer |
| Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) | Vector | BA-9200 | |
| DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
| Entellan | Merck | 107960 | |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
| Gelatin | Synth | 00G1002.02.AE | Used for coating slides |
| Microtome | Leica | SM2010R | Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
| Slides (Star Frost) | Knittel Glaser | Gelatin coated slides | |
| Sucrose | Vetec | 60REAVET017050 | |
| Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vector | PK-4000, Kit Standard | |
| Xylene | Synth | 01X1001.01.BJ |
References
- Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
- Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
- Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
- Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
- Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
- Crain, S. M. Development of Specific Synaptic Network Functions in Organotypic Central Nervous System (CNS) Cultures: Implications for Transplantation of CNS Neural Cellsin Vivo. Methods. 16 (3), 228-238 (1998).
- He, S., Bausch, S. B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis. Neuropharmacology. 77, 379-386 (2014).
- Antonietta Ajmone-Cat, M., Mancini, M., De Simone, R., Cilli, P., Minghetti, L. Microglial polarization and plasticity: Evidence from organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 61 (10), 1698-1711 (2013).
- Noraberg, J., et al. Organotypic Hippocampal Slice Cultures for Studies of Brain Damage, Neuroprotection and Neurorepair. Current Drug Target - CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Hoppe, J. B., et al. Amyloid-β neurotoxicity in organotypic culture is attenuated by melatonin: Involvement of GSK-3β, tau and neuroinflammation. Journal of Pineal Research. 48 (3), 230-238 (2010).
- Sebollela, A., et al. Amyloid-β oligomers induce differential gene expression in adult human brain slices. Journal of Biological Chemistry. 287 (10), 7436-7445 (2012).
- Chong, C. M., et al. Discovery of a novel neuroprotectant, BHDPC, that protects against MPP+/MPTP-induced neuronal death in multiple experimental models. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1057-1066 (2015).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Experimental Neurology. 248, 429-440 (2013).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (8), 659-666 (2008).
- Minami, N., et al. Organotypic brain explant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors. Cancer Medicine. 6 (11), 2635-2645 (2017).
- Magalhães, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 1-18 (2018).
- Wang, X., et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neuroscience. 10, 1-20 (2009).
- Di Pietro, V., et al. Transcriptomics of traumatic brain injury: gene expression and molecular pathways of different grades of insult in a rat organotypic hippocampal culture model. Journal of neurotrauma. 27 (2), 349-359 (2010).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Jones, R. S. G., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2015).
- Hoffer, B., Seiger, A., Ljungberg, T., Olson, L. Electrophysiological and cytological studies of brain homografts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo. Brain Research. 79 (2), 165-184 (1974).
- Hoffer, B. J., Olson, L., Palmer, M. R. Toxic effects of lead in the developing nervous system: in oculo experimental models. Environmental Health Perspectives. 74, 169-175 (1987).
- Hogue, M. J. Human fetal brain cells in tissue cultures: Their identification and motility. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 85-107 (1947).
- Costero, I., Pomerat, C. M. Cultivation of neurons from the adult human cerebral and cerebellar cortex. American Journal of Anatomy. 89 (3), 405-467 (1951).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Stoppini, L., Buchs, A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
- Sanai, N., et al. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature. 427 (6976), 740-744 (2004).
- Eugène, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
- Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Verwer, R. W. H., Dubelaar, E. J. G., Hermens, W. T. J. M. C., Swaab, D. F. Tissue cultures from adult human postmortem subcortical brain areas. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 6 (3), 429-432 (2002).
- Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
- Bruce, A. J., Malfroy, B., Baudry, M. beta-Amyloid toxicity in organotypic hippocampal cultures: protection by EUK-8, a synthetic catalytic free radical scavenger. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2312-2316 (1996).
- Finley, M., et al. Functional validation of adult hippocampal organotypic cultures as an in vitro model of brain injury. Brain Research. 1001 (1-2), 125-132 (2004).
- Schoeler, M., et al. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury. BMC Neurology. 12, 20 (2012).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Maharana, C., Sharma, K. P., Sharma, S. K. Feedback mechanism in depolarization-induced sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in the hippocampus. Scientific Reports. 3, 1103 (2013).
- Horta, J. D. A. C., López, D. E., Alvarez-Morujo, A. J., Bittencourt, J. C. Direct and indirect connections between cochlear root neurons and facial motor neurons: Pathways underlying the acoustic pinna reflex in the albino rat. Journal of Comparative Neurology. 507 (5), 1763-1779 (2008).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Metabolic origins of spatial organization in the tumor microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2934-2939 (2017).
- McMurtrey, R. J. Analytic Models of Oxygen and Nutrient Diffusion, Metabolism Dynamics, and Architecture Optimization in Three-Dimensional Tissue Constructs with Applications and Insights in Cerebral Organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
- Lossi, L., Alasia, S., Salio, C., Merighi, A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 88 (4), 221-245 (2009).
- Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 42, 135-163 (2002).
- Sharma, S. K., Carew, T. J. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: Facilitatory effects and inhibitory constraints. Learning and Memory. 11 (4), 373-378 (2004).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-755 (2011).
- Takahashi, Y. K., et al. Neural Estimates of Imagined Outcomes in the Orbitofrontal Cortex Drive Behavior and Learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
- Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
- Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a Cooperate in the Regulation of Epileptic and Synaptic Activity in the CA1 Region of the Hippocampus. Journal of Neuroscience. 33 (46), 18319-18330 (2013).
- Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
- Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1196-1201 (2015).
- Jung, S., et al. Brain tumor invasion model system using organotypic brain-slice culture as an alternative to in vivo model. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 128 (9), 469-476 (2002).
- Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 261-270 (2007).
- Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 11 (11), 484-489 (1988).
- Walsh, K., Megyesi, J., Hammond, R. Human central nervous system tissue culture: A historical review and examination of recent advances. Neurobiology of Disease. 18 (1), 2-18 (2005).
- Gähwiler, B. H. Slice cultures of cerebellar, hippocampal and hypothalamic tissue. Experientia. 40 (3), 235-243 (1984).
- Bsibsi, M., et al. Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators. Glia. 53 (7), 688-695 (2006).
- González-Martínez, J. A., Bingaman, W. E., Toms, S. A., Najm, I. M. Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 628-635 (2008).
- Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. The FASEB Journal. 16 (1), 54-60 (2002).
- Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
- Masamoto, K., Tanishita, K. Oxygen Transport in Brain Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 131 (7), 074002 (2009).
- Hadjistassou, C., Bejan, A., Ventikos, Y. Cerebral oxygenation and optimal vascular brain organization. Journal of the Royal Society Interface. 12 (107), (2015).
- Qiu, C., Kivipelto, M., von Strauss, E. Epidemiology of Alzheimer's disease: occurrence, determinants, and strategies toward intervention. Dialogues in Clinical Neuroscience. 11 (2), 111-128 (2009).
- Stahl, K., Mylonakou, M. N., Skare, O., Amiry-Moghaddam, M., Torp, R. Cytoprotective effects of growth factors: BDNF more potent than GDNF in an organotypic culture model of Parkinson's disease. Brain Research. 1378, 105-118 (2011).
