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Neuroscience

Kurzfristig frei schwebende Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/59845
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 4, 4, 5, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Summary

Ein Protokoll zur Vorbereitung frei schwebender Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn wird vorgestellt. Das Protokoll ist eine Variation der weit verbreiteten Slice-Kultur-Methode mit Membraneinsätzen. Es ist einfach, kostengünstig und wird für die Durchführung von kurzfristigen Assays empfohlen, die darauf abzielen, Mechanismen der Neurodegeneration hinter altersbedingten Hirnerkrankungen zu entwirren.

Abstract

Organotypische, oder Scheibenkulturen, wurden weit verbreitet verwendet, um Aspekte des zentralen Nervensystems zu modellieren, das in vitro funktioniert. Trotz des Potenzials von Schnittkulturen in der Neurowissenschaft sind Studien, die erwachsenes Nervengewebe zur Vorbereitung solcher Kulturen verwenden, immer noch rar, insbesondere solche von menschlichen Probanden. Die Verwendung von erwachsenem menschlichem Gewebe zur Vorbereitung von Scheibenkulturen ist besonders attraktiv, um das Verständnis menschlicher Neuropathologien zu verbessern, da sie einzigartige Eigenschaften besitzen, die typisch für das reife menschliche Gehirn sind, das an Scheiben aus Nagetieren fehlt (in der Regel neonatal) Nervengewebe. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Gehirngewebe von lebenden menschlichen Spendern gesammelt verwendet, um resekttive Gehirnchirurgie zur Vorbereitung kurzfristiger, frei schwebender Scheibenkulturen. Es werden auch Verfahren zur Aufrechterhaltung und Durchführung biochemischer und zellbiologischer Assays mit diesen Kulturen vorgestellt. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die typische kortikale Kaschierung des Menschen nach 4 Tagen in vitro (DIV4) in Scheiben konserviert wird, wobei die Hauptanzahl der neuronalen Zelltypen zu erwarten ist. Darüber hinaus erleiden Scheiben bei DIV4 einen robusten Zelltod, wenn sie mit einem toxischen Reiz herausgefordert werden (H2O2), was auf das Potenzial dieses Modells hindeutet, als Plattform in Zelltod-Assays zu dienen. Diese Methode, eine einfachere und kostengünstigere Alternative zum weit verbreiteten Protokoll mit Membraneinsätzen, wird hauptsächlich für die Durchführung von kurzfristigen Assays empfohlen, die darauf abzielen, Mechanismen der Neurodegeneration hinter altersbedingten Hirnerkrankungen zu entwirren. Obwohl das Protokoll der Verwendung von kortikalem Gewebe gewidmet ist, das von Patienten gesammelt wurde, die zur chirurgischen Behandlung einer pharmakoresistenten temporalen Lappenepilepsie eingereicht wurden, wird argumentiert, dass Gewebe, das aus anderen Hirnregionen/-bedingungen gesammelt wurde, auch als Quellen betrachtet werden, um ähnliche frei schwebende Scheibenkulturen zu erzeugen.

Introduction

Die Verwendung menschlicher Proben in der Forschung ist eindeutig eine großartige Option, um menschliche Hirnpathologien zu untersuchen, und moderne Techniken haben neue Wege für robuste und ethische Experimente mit Patientengewebe eröffnet. Methoden wie organotypische/Slice-Kulturen aus erwachsenen menschlichen Gehirn wurden zunehmend in Paradigmen wie Optogenetik1, Elektrophysiologie2,3,4,5, Plastizität 6,7,8,9, Neurotoxizität/Neuroprotektion10,11,12,13, Zelltherapie14, Arzneimittelscreening15,16,17, Genetik und Genbearbeitung12,18,19,20, unter anderem als Strategie für eine bessere Neurologische Erkrankungen im Erwachsenenalter zu verstehen.

Das Verständnis der Mechanismen, die menschlichen Gehirnpathologien zugrunde liegen, hängt von experimentellen Strategien ab, die eine große Anzahl von Probanden erfordern. Umgekehrt umgeht bei Scheibenkulturen, obwohl der Zugang zu menschlichen Proben immer noch schwierig ist, die Möglichkeit, bis zu 50 Scheiben aus einer einzigen kortikalen Probe zu erzeugen, teilweise die Anforderung, mehrere Freiwillige zu rekrutieren, durch die Erhöhung der Anzahl der Repliken und durchgeführten Assays pro gesammeltem Gewebe21.

Es wurden mehrere Protokolle für Organotypische/Scheibenkulturen des Gehirns beschrieben, von den klassischen Oculo-Entwürfen22,23 bis hin zu Rollenrohr24,25,26, halbdurchlässigen Membranen Schnittstelle27,28,29,30und frei schwebende Slices31,32. Je nach den Besonderheiten eines experimentellen Designs hat jede Technik ihre eigenen Vor- und Nachteile. Kurzfristige, frei schwebende Scheibenkulturen aus erwachsenen menschlichen Gehirnen ist in einigen Fällen vorteilhaft gegenüber der von Stoppini et al.27verwendeten Methode, wenn man bedenkt, dass das langfristige Zellüberleben in vitro zwar in der Regel ein Hauptanliegen bei der Bewertung ist. eine Kulturmethode, in vielen Experimenten werden nur kurze Zeiträume in der Kultur benötigt12,31,32,33,34,35. Unter diesen Bedingungen bietet die Verwendung frei schwebender Kulturen den Vorteil, einfacher und kostengünstiger zu sein und dem ursprünglichen menschlichen Gewebezustand genauer zu ähneln als Scheiben, die in der Kultur über 2-3 Wochen aufbewahrt werden.

Trotz des Potenzials von Schnittkulturen für die Neurowissenschaften sind Studien, die erwachsenes Nervengewebe zur Vorbereitung solcher Kulturen verwenden, immer noch rar, insbesondere von menschlichen Probanden. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Verwendung von gesammeltem Hirngewebe von lebenden menschlichen Spendern, die sich einer resektierenden Gehirnchirurgie unterziehen, um frei schwebende Scheibenkulturen vorzubereiten. Die Verfahren zur Pflege und Durchführung biochemischer und zellbiologischer Assays mit diesen Kulturen sind detailliert. Dieses Protokoll hat sich als wertvoll für die Analyse der Lebensfähigkeit und neuronalen Funktion in Untersuchungen über die Mechanismen von Neuropathologien im Zusammenhang mit dem Erwachsenenalter erwiesen.

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Protocol

Lebende erwachsene Hirngewebe wurden von Patienten gewonnen, die sich einer resekttiven Neurochirurgie zur Behandlung einer pharmakoresistenten temporalen Lappenepilepsie unterziehen (Abbildung 1A). Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission des Klinikkrankenhauses der Ribeiréo Preto Medical School (17578/2015) genehmigt, und die Patienten (oder ihre verantwortliche Person) stimmten zu und unterzeichneten die Vereinbarten Zustimmungsbedingungen. Die Entnahme des Gewebes erfolgte durch das Neurochirurgie-Team am Epilepsie-Chirurgiezentrum (CIREP - Clinics Hospital an der Ribeiréo Preto Medical School, Universität Sao Paulo, Brasilien).

1. Sterilisation von Materialien

HINWEIS: Alle Materialien und Lösungen müssen vor der Verwendung sterilisiert werden.

  1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge und Vibratome-Slicing-Material (Messerhalter, Probenscheibe, Pufferschale) in einem trockenen Sterilisationsofen für 4 h bei 180 °C.
  2. Sterilisieren Sie temperaturempfindliches Material oder Geräte durch UV- oder Gammabestrahlung.
  3. Sterilisieren Sie Medien und Lösungen durch Autoklavierung oder Filtration durch 0,22 m Porenmembranen.

2. Vorbereitung von Lösungen

  1. Vorbereiten von 15-20 ml Transportlösung: 50% v/v Hanks' balanced salt solution (HBSS) pH 7.4, 50% v/v basales Medium zur Erhaltung von postnatalen und erwachsenen Hirnneuronen (Materialtabelle), ergänzt durch 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1- Piperazinthansulfonsäure (Hepes), 3 mg/ml Glukose und 33 g/ml Gentamicin.
    HINWEIS: Die Transportlösung muss vor der Probenentnahme mindestens 20 min gekühlt und mit Sauerstoff versorgt werden (sprudelnd mit Carbogengas).
  2. 300 ml Schneidlösung (HBSS ergänzt mit 10 mM HEPES und 3 mg/ml Glukose) vorbereiten und in einem Gefrierschrank bis zur anfänglichen Kristallbildung abkühlen.
  3. Bereiten Sie 20 ml Kulturmedium: Basalmedium für die Aufrechterhaltung der postnatalen und erwachsenen Gehirnneuronen (Tabelle der Materialien) ergänzt mit 1% L-Glutamin-Derivat ( Tabelle derMaterialien), 2% Ergänzung für neuronale Kultur (Tabelle der Materialien), 1% Penicillin/Streptomycin und 0,25 g/ml Amphotericin B.

3. Einrichten des Schneidegeräts

HINWEIS: Dieses Protokoll wird idealerweise mit Hilfe eines Kollegen durchgeführt, da die Probenentnahme im Operationssaal logistik.

  1. In einem Eimer mit salziertem Eis die Schneidlösung vor der Verwendung mindestens 20 min unter carbogen-Mischung sprudeln lassen (95%O2, 5%CO2).
  2. Bereiten Sie einen Block von 3% Agarose (ca. 2 cm x 2 cm x 2 cm) vor und kleben Sie ihn auf die Vibram-Probenscheibe, um eine zusätzliche mechanische Unterstützung der Gewebeprobe beim Schneiden zu schaffen (Abbildung 1E).
  3. Stellen Sie das Vibratom zum Schneiden ein: Schnittdicke von 200 m, Schwingungsfrequenz von 100 Hz und Schnittgeschwindigkeit zwischen 0,5-1,0 mm/s.
  4. Verriegeln Sie die Vibram-Pufferschale an der Vibram-Basis und fügen Sie Eis hinzu, um sie vor Dem Empfang der Schneidlösung und der Probe und während des gesamten Schneidvorgangs gekühlt zu halten.

4. Probensammlung

HINWEIS: In diesem Protokoll wurde menschliches neokortikales Gewebe im Operationssaal gesammelt und ins Labor transportiert.

VORSICHT: Befolgen Sie beim Umgang mit menschlichen Proben die von der Institution festgelegten Sicherheitsprotokolle.

  1. Richten Sie das Transportgerät ein (Abbildung 1C), das aus: einer tragbaren Gasflasche mit Carbogen-Gemisch besteht, die mit einem Druck-/Flussventil verbunden ist, das den Gasausgang steuert, der mit einem Siliziumschlauch verbunden ist, der die Gasleistung mit dem Transport verbindet Gefäß; ein Transportgefäß, in der Regel ein 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr mit perforiertem Deckel für den Gaseintrag, das die Transportlösung enthält; und Eis zur Probenkühlung während des Transports.
  2. Sammeln und transportieren Sie die Probe (Abbildung 1B) sofort ins Labor. Tauchmittel die Probe in Kalttransportlösung (ständig mit Carbogen-Mischung geblasen).

5. Schneiden

  1. Die Probe auf eine Petrischale (100 mm x 20 mm) mit Schneidlösung übertragen und mit feinen chirurgischen Werkzeugen so viel wie möglich der verbleibenden Meningen in der Probe sorgfältig entfernen (Abbildung 1D).
  2. Wählen Sie die beste Probenausrichtung für die Herstellung von Scheiben mit den besonderen Eigenschaften des experimentellen Designs, und mit einer Nr. 24 Skalpellklinge, trimmen Sie eine flache Oberfläche, um die Basis auf die Probenscheibe geklebt werden.
  3. Mit einem Einweg-Kunststofflöffel und zarten Pinsel, sammeln Sie das Fragment aus der Petrischale und trockene überschüssige Lösung mit Filterpapier (trocknen Sie durch Kapillarität und vermeiden Sie das Berühren des Gewebefragments mit Papier).
  4. Mit Superkleber das Gewebe an der Vibram-Probenscheibe befestigen, bis es fest an der Scheibe befestigt ist und mit dem Agaroseblock in Kontakt kommt (Abbildung 1E).
  5. Legen Sie die Vibram-Probenscheibe (mit ordnungsgemäß emsobelhaftem Gewebe) in die Vibrampufferschale, gefüllt mit Schneidlösung, die während des gesamten Prozesses sprudeln muss.
  6. Verriegeln Sie den Messerhalter mit fest fest an der Rasierklinge.
  7. Die Schneidlösung muss sowohl die Probe als auch die Klinge abdecken, erst dann mit dem Schneiden beginnen (Abbildung 1F).
  8. Schneiden Sie die Probe in 200 m Scheiben.
    HINWEIS: Obwohl einige Vibratome die Proben automatisch schneiden, können die genaue Beobachtung und kleinere Anpassungen der Schnittgeschwindigkeit während des Prozesses dazu beitragen, bessere Scheiben zu produzieren. Entsorgen Sie erste unregelmäßige Slices.
  9. Übertragen Sie die Scheiben aus der Pufferschale auf eine Petrischale mit Schneidlösung und trimmen Sie lose Kanten und überschüssige weiße Mater auf einen Anteil von etwa 70% Kortex/30% weißer Materie.

6. Kultur

HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in einem laminaren Strömungsschrank unter steriler Umgebung aus.

  1. Fügen Sie 600 l Kulturmedium pro Brunnen (in einer 24-Well-Platte) hinzu und brüten Sie mindestens 20 min bei 36 °C und 5%CO2 vor dem Beschichten der Scheiben.
  2. Platte eine Scheibe pro Brunnen mit einem Pinsel (Abbildung 1G).
  3. Wenn sich ungenutzte Brunnen in der Platte befinden, füllen Sie sie mit 400 l sterilem Wasser.
  4. Inkubieren Sie die Platte bei 36 °C, 5%CO2.
    HINWEIS: Der erste mittlere Austausch muss zwischen 8-16 h nach der Beschichtung durchgeführt werden, abhängig von der Größe der Scheibe.
  5. Ergänzung 10 ml des zuvor vorbereiteten Kulturmediums mit 50 ng/ml neurotrophen Faktor (BDNF).
    HINWEIS: Während der ersten 8-16 h werden die Scheiben in 600 l Medium inkubiert, um Nährstoffmangel und Versauerung zu vermeiden, da der mittlere Verbrauch in dieser Phase beschleunigt wird. Ab dem nächsten Schritt wird das Volumen des Mediums pro Bohrgut auf 400 l eingestellt.
  6. Entfernen Sie 333 l des konditionierten Mediums aus jedem Brunnen und fügen Sie 133 l frisches BDNF-ergänzungsmedium hinzu.
  7. Wiederholen Sie den Prozess des mittleren Austauschs alle 24 h, indem Sie ein Drittel des konditionierten Mediums durch frisches BDNF-ergänzungsmittelersetzen.

7. Bewertung von Gesundheit, Morphologie und Funktion in kultivierten Slices

HINWEIS: Um den Zelltod zum Zwecke der Veranschaulichung in den repräsentativen Ergebnissen zu induzieren, wurden einige Scheiben einer 24-stunden-Behandlung mit dem oxidativen StressinduktorH2O2unterzogen. Die Schritte 7.1.2 und 7.1.3 beschreiben die Verwendung von H2O2 zur Induzinithedes von Zellen.

  1. Zelllebensfähigkeit
    ANMERKUNG: Eine einfache, unkomplizierte Methode zur Bewertung des neurotoxischen/neuroprotektionsfreien In-/Darm-/Spezien-Assays 36 ist der 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium (MTT)-Assay36, der den Prozentsatz der metabolischen aktiven Zellen misst. unter normalen Bedingungen im Vergleich zu behandelten Proben.
    1. Ersetzen Sie im laminaren Strömungsschrank ein Drittel des Mediums durch frisches Medium.
    2. Von einer 30% H2O2-Lagerlösung ein Volumen von H2O2 pro Bohrung hinzufügen, um die beabsichtigte Endkonzentration (30 mM oder 300 mM) zu erreichen.
      HINWEIS: H2O2 wurde nach dem täglichen Wechsel des Mediums hinzugefügt, um die ordnungsgemäße Versorgung mit frischen Nährstoffen vor der Herausforderung zu gewährleisten.
    3. Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 36 °C, 5%CO2.
      HINWEIS: Nach der Behandlung von H2O2 (oder einem anderen toxischen Reiz von Interesse) beschreiben die folgenden Schritte die Bestimmung der Zelllebensfähigkeit durch den MTT-Assay.
    4. Fügen Sie 40 l MTT-Lösung zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zu jedem Brunnen in der Platte hinzu.
    5. Inkubieren Sie die Platte bei 36 °C, 5%CO2 für 3 h.
    6. Die Scheiben mit phosphatgepufferter Saline (PBS) waschen und in ein Mikrorohr übertragen.
    7. Entfernen Sie sorgfältig alle verbleibenden Lösungen durch Pipettieren.
    8. Wiegen Sie die Mikroröhrchen, die die Scheiben enthalten, um die Masse jeder Scheibe zu bestimmen (dies ist der Schlüssel zur Normalisierung der erhaltenen Absorptionswerte).
      HINWEIS: Bei Bedarf können Proben in dieser Phase für die spätere Verarbeitung eingefroren werden (-20 °C).
    9. Homogenisieren Sie die Scheiben in 200 l Isopropanol/HCl mit einem motorisierten Stößel.
    10. Zentrifuge bei Raumtemperatur (RT) für 2 min bei 2600 x g.
    11. Sammeln Sie den Überstand und messen Sie die Absorption bei 540 nm.
  2. KCl-induzierte neuronale Depolarisation
    HINWEIS: Die Phosphorylierung der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) signalisiert Kaskadenprotein ERK, gefolgt von Western Blotting, kann zur Quantifizierung der neuronalen Reaktion auf KCl-induzierte Depolarisation37 verwendet werden.
    1. Ersetzen Sie am Strömungsschrank das Kulturmedium durch 300 l HBSS, die zuvor auf 36 °C ausgeglichen wurden.
    2. Ersetzen Sie den HBSS durch 300 L frische HBSS, die zuvor auf 36 °C ausgeglichen wurden.
    3. Inkubieren Sie die Platte bei 36 °C, 5%CO2 für 15 min.
    4. Ersetzen Sie den HBSS entweder durch die frische HBSS oder mit 80 mM KCl Depolarisationslösung (beide bei 36 °C) und inkubieren Bei 36 °C, 5%CO2 für 15 min.
    5. Übertragen Sie die Scheiben von der Platte auf Mikroröhren. In diesem Schritt können Slices bei -20 °C für die spätere Verarbeitung gelagert werden.
    6. Bereiten Sie Gewebeextrakte in 150 L Radioimmunpräzipitations-Assay (RIPA)-Puffer (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% nichtionisches Tensid; 0,1% Natriumdodecylsulfat; pH 7,5) vor. Zentrifugenextrakte bei 4 °C für 10 min bei 16000 x g,sammeln Überstand und bestimmen die Gesamtproteinkonzentration nach der Bradford-Methode.
    7. 30 g Gesamtprotein auf eine 12% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufladen.
    8. Nach der Elektrophorese den Gelgehalt auf eine Nitrocellulosemembran übertragen.
    9. Nach Blockierung der Membran mit 5% fettfreier Trockenmilch in TBS plus 0,1% Tween, mit Maus anti-pERK (1:1,000) für 16 h bei 4 °C inkubieren. Nach dem Waschen 2 h bei RT mit Kaninchen Anti-ERK1/2 (1:1.000) inkubieren.
    10. Mit dem entsprechenden HRP-konjugierten Sekundärantikörper bei RT für 1 h inkubieren.
    11. Offenbaren Sie mit dem bevorzugten HRP-Substrat.
  3. Morphologische Bewertung
    HINWEIS: Neben dem Zellüberleben und funktionellen Auswertungen ist es wichtig, die Gewebemorphologie zu analysieren. Beachten Sie, dass die Resektion der kultivierten Scheibe ein wichtiger Schritt ist, um so viel hochwertiges Material wie möglich für die morphologische Analyse zu produzieren.
    1. Fixierung, Kryoschutz und Resektion der Scheiben
      1. Übertragen Sie die Scheiben aus den Brunnen mit Kulturmedium auf eine neue 24 Wellplatte mit PBS.
      2. Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) hinzu. Es ist wichtig, dass die Scheiben vor dem Hinzufügen von PFA flach gehalten werden. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
      3. Entfernen Sie vorsichtig die PFA-Lösung und fügen Sie 1 ml 30% Saccharoselösung hinzu. 48 h bei 4 °C inkubieren.
      4. Stellen Sie das Gefriermikrotome auf -40 °C ein.
      5. Bereiten Sie eine Saccharosebasis auf der Mikrotome-Stufe vor, auf der die Scheiben platziert werden sollen (Abbildung 2A). Lassen Sie es vollständig einfrieren und sorgfältig schneiden einige der gefrorenen Saccharose, um eine flache Oberfläche zu produzieren, auf der die Scheibe platziert wird.
      6. Legen Sie jede Scheibe über eine gestreckte Kunststofffolie und verwenden Sie einen Pinsel, um das Gewebe zu flachen.
      7. Übertragen Sie die gestreckte Scheibe in einem zugweise auf die gefrorene Saccharosebasis.
        HINWEIS: Es ist nicht möglich, die Scheibe zu bewegen, sobald sie sich über der gefrorenen Saccharosebasis befindet. Führen Sie diesen Übertragungsschritt sorgfältig aus.
      8. Lassen Sie die Scheibe für 5-10 min für das richtige Einfrieren ruhen.
      9. Schneiden Sie die Scheibe in 30 m Abschnitte.
      10. Übertragen Sie die 30-mm-Abschnitte auf eine Petrischale, die PBS enthält.
      11. Gehen Sie zum Histologieprotokoll über, das dem experimentellen Design angemessener ist.
        ANMERKUNG: Die 30-mm-Abschnitte können problemlos für die freischwebende Immunhistochemie verwendet, zur weiteren Histologie auf Mikroskopie-Dias montiert oder in Frostschutzlösung bei -20 °C gelagert werden.
    2. Immunohistochemistry
      HINWEIS: Immunhistochemie und Immunfluoreszenz-Standardprotokolle variieren zwischen den Laboren. Eine ausführliche Version des hier verwendeten Protokolls finden Sie unter Horta et al.38. Zu den primären Antikörpern, die für Immunfärbungen verwendet werden, wie in Abbildung 2 dargestellt, gehören neuronale Kerne (NeuN), gesunde reife Neuronenmarker, glial fibrilläres saures Protein (GFAP), Astorzytenmarker, ionisierter Calciumbindungsadapter (Iba-1) und Mikroglia anschreiber.
      1. Inkubieren Sie die Scheiben in blockblockierender Lösung (z. B. 2% normales Eselsserum in PBS) für 40 min.
      2. Über Nacht mit primärem Antikörper unter leichter Agitation bei 4 °C inkubieren.
      3. Nach dem Waschen mit PBS 120 min mit biotinyliertem Sekundärantikörper unter leichter Agitation bei RT inkubieren.
      4. Nach dem Waschen mit PBS bei RT für 120 min mit Avidin-Peroxidase-Konjugat(Materialtabelle )inkubieren.
      5. Mit DAB + 0,04% Nickelammonium enthüllen.
      6. Montieren Sie die gebeizten Abschnitte auf gelatinebeschichteten Mikroskopien und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Dehydrieren in Ethanol, Diaphanize in Xylol, beenden mit Montagemedium (Tabelle der Materialien), Abdeckung mit einem Deckblatt, und Bild.

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Representative Results

Ein kritischer Aspekt, um die Qualität und Gesundheit von kultivierten Scheiben zu bewerten, ist das Vorhandensein und die typische Morphologie der erwarteten neuronalen Zelltypen, Neuronen und Gliazellen. Die typische Architektur der menschlichen kinetischen Laminierung wurde in einer Scheibe bei DIV4 beobachtet, die durch neuronale Immunlabelierung(Abbildung 2D) offenbart wurde. Darüber hinaus wurde auch das erwartete Vorhandensein von Mikroglia und Astroglia (Abbildung 2B,C) beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gewebearchitektur weder durch den chirurgischen Eingriff/die Probenverarbeitung noch durch die kurzfristige In-vitro-Phase signifikant beeinflusst wird. Nach bisherigen Erkenntnissen wurde gezeigt, dass die NeuN-Immunreaktivität zwischen DIV0 und DIV432nicht verändert wurde. Basierend auf diesen Ergebnissen trug das frei schwebende Kulturformat, das mit der reduzierten Dicke der Scheibe auf 200 m (im Vergleich zu den weit verbreiteten 300-400 m bei Verwendung von Membraneinsätzen) verbunden ist, zu einer besseren Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen in innere Zellschichten bei. in Scheiben, die sich zuvor als entscheidend für die Gesundheit kultivierter Slices39,40erwiesen haben.

Quantifizierung des Zelltodes in Scheiben ist auch ein wertvoller Ansatz in ex vivo Modellen von Neuropathologien, wie Scheibenkulturen (überprüft von Lossi et al.41). In einer früheren Studie verwendeten wir den MTT-Assay, um die Zellsterblichkeit während des Zeitraums in Kultur32zu bestimmen. Neben der Lebensfähigkeit zeigte dieselbe Studie auch, dass kultivierte Scheiben (bis DIV4) die Fähigkeit zur Freisetzung von Neurotransmittern bei KCl-induzierter Depolarisation32bewahrten. Hier wurden diese Erkenntnisse durch die Untersuchung der neuronalen Reaktion auf die KCl-induzierte Depolarisation auf ERK-Phosphorylierung, einer zentralen Kinase, die an Prozessen wie synaptischer Plastizität und Gedächtnis42,43beteiligt ist, erweitert. Interessanterweise wurde bei den Mitfilz behandelten Scheiben bei DIV4 ein deutlicher Anstieg der ERK-Phosphorylierung beobachtet (Abbildung 3A,B).

Schließlich wurde die Reaktion von Scheiben bei DIV4 auf eine toxische Herausforderung mit einem bekannten oxidativen Stressinduktor, H2O2,bewertet. Der Grund war, dass das Ausmaß des Zelltodes proportional zum Niveau der Zelllebensfähigkeit in den kultivierten Scheiben sein sollte. Wie in Abbildung 3Cdargestellt, führte die Exposition der Scheiben auf 300 mM H2O2 für 24 h zu einer robusten Abnahme der MTT-Reduktion. Zusammengenommen deuten der massive Zelltod, der in DIV5 nach derH2O2-Herausforderung beobachtet wurde, und die KCl-induzierten Depolarisationsergebnisse darauf hin, dass die erhaltene allgemeine Gesundheit von Scheiben bei DIV4 angemessen auf einen toxischen Reiz wie oxidative streß.

Figure 1
Abbildung 1: Probenentnahme, Transport, Schneiden und Kultivieren von kortikalem Gewebe von erwachsenen Menschen. Das Verfahren beginnt im Operationssaal mit der Entnahme von kortikalem Gewebe aus der zeitlichen Lobektomie zur Behandlung von pharmakoresistenter Epilepsie (A,B). (C) Gewebefragment (n = 1) wird sofort in ein Rohr übertragen, das eiskaltes sauerstoffhaltiges Transportmittel enthält (siehe unten). (D) Im Labor werden Meningen mit einer feinen ophthalmologischen Pinzette entfernt. Überschüssige Flüssigkeit wird mit Filterpapier getrocknet, und das Fragment wird überklebt (E) auf die Vibram-Probenscheibe mit der weißen Materie nach unten und pialen Oberfläche nach oben. (F) Mit einem kommerziellen Rasiermesser wird die Probe in 200 m Scheiben geschnitten, die mit einem zarten Pinsel gesammelt und zur weiteren Zuschneide überschüssiger weißer Materie und loser Enden (nicht dargestellt) vor (G) zurück in die Petrischale gebracht werden. beschichtung und kultivieren in einem frei schwebenden Format. (H) Slices Kulturen werden für mehrere Tage lebensfähig gehalten und können in einer Vielzahl von experimentellen Protokollen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Morphologische Analyse von Nervenzellen in Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn. Die Scheiben wurden am vierten Tag in vitro fixiert. (A,B,C) Repräsentative Schritte des Schnittverfahrens vor der Immunhistochemie. Gewebe wurde digital gefärbt, um die Visualisierung zu verbessern. (D) Normalverteilung von Neuronen in kortikalen Schichten (römische Ziffern). (E) Mikroglia und (F) Astrozyten wurden ebenfalls deutlich beobachtet (n = 1 Scheibe pro Zelltypkennzeichnung). Alle Scheiben wurden aus Gewebe von einem einzigen Spender gewonnen. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Funktionelle und Zelllebensfähigkeit Assays in erwachsenen menschlichen Gehirn Scheibenkulturen. Die neuronale Aktivität wurde in Scheiben am Tag in vitro 5 (DIV5) durch KCl-induzierte Depolarisation und daraus resultierende Erhöhung der ERK-Phosphorylierung evaluiert. (A) Ein repräsentatives Immunoblot-Ergebnis, das mit Homogenaten aus einer Scheibe erzielt wird. Bänder, die Phospho ERK (Perk) und Gesamt ERK (tERK) entsprechen, sind indiziert. (B) Quantifizierung des pERK/tERK-Verhältnisses in drei unabhängigen Scheiben von einem einzigen menschlichen Spender. (C) Die Toxizität von Wasserstoffperoxid (H2O2) wurde durch den MTT-Assay in Scheiben bei DIV 5 bewertet. Die erhaltenen optischen Dichtewerte wurden durch die Masse jeder Scheibe normalisiert. Die Scheiben wurden mit H2O2 bei den angegebenen Konzentrationen herausgefordert (Nr. H2O2; 30 mM H2O2; 300 mM H2O2) für 24 h. Bilder von repräsentativen Scheiben nach der Inkubation mit MTT über den Balken angezeigt werden. Die Ergebnisse werden als durchschnittlicher Standardfehler aus Daten dargestellt, die aus drei unabhängigen Slices eines einzelnen Spenders gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll zur Herstellung frei schwebender, kurzfristiger Scheibenkulturen ist eine alternative Methode zur Kultivierung erwachsener menschlicher neokortikaler Scheiben. Ein solches Protokoll für Scheibenkulturen kann für Studien über (aber nicht beschränkt auf) Optogenetik1,44,45, Elektrophysiologie2,3,4,5 , Kurzzeitplastizität46,47, Langzeitplastizität48,49, Neurotoxizität/Neuroprotektion10,11,12, 13, Zelltherapie14, Arzneimittelscreening15,16,17, Krebs50,51, Genetik und Genbearbeitung12,18 ,19,20.

Die Verwendung von Proben aus erwachsenem menschlichem Gewebe ist besonders wichtig für das Verständnis menschlicher Neuropathologien, aufgrund einzigartiger Eigenschaften, die typisch für das menschliche Gehirn sind, denen es an Scheiben fehlt, die aus Nagetiernervengewebe hergestellt werden52. Darüber hinaus werden Scheibenkulturen aus Nagetierhirnen häufig aus neonatalen, unreifen Gehirnen hergestellt, die hochgradig plastisch sind und wandernde Zellen enthalten, die die ursprüngliche Slice-Zytoarchitektur verändern können, um sich an die In-vitro-Umgebung anzupassen26, 53,54,55. Solche plastischen Ereignisse führen zu Veränderungen in der Schaltung, die vermieden werden sollten, wenn das Ziel ist, den in vivo Zustand zu imitieren, wie von Ting et al.30erklärt: "Wir haben uns entschieden, uns auf Kulturen von weniger als einer Woche zu konzentrieren, wo strukturelle und funktionelle Eigenschaften vernünftig sind mit minimaler Störung aufrechterhalten werden, um so vergleichbar wie möglich mit Messungen zu sein, die mit Goldstandard-Akutscheibenpräparaten gewonnen wurden". Obwohl eine Methode, die der kurzfristigen Kultivierung gewidmet ist, zunächst als begrenzt angesehen werden kann, ist eine langfristige Kultivierung daher nicht erforderlich, um in vielen Versuchsentwürfen relevante Ergebnisse zu erzielen32,33,34 ,35,56,57.

Zwei kritische Schritte des Protokolls sind die reduzierte Dicke der Scheiben (200 m) und die Ergänzung des Kulturmediums mit BDNF. In früheren Arbeiten32haben wir die Erhaltung der Zelllebensfähigkeit bis zu 4 DIV gezeigt und den wahrscheinlichen Beitrag der Reduzierung der Scheibendicke auf 200 m im Vergleich zu den häufiger verwendeten 300-400-m-Scheiben12,29diskutiert. Grundsätzlich kann die Verringerung der Scheibendicke zu einer besseren Sauerstoffversorgung und Nährstoffaufnahme in frei schwebenden Scheiben beitragen, wodurch die Chancen für Kernhypoxie und Neurodegeneration31,32,57, 58,59,60,61. Darüber hinaus wird empfohlen, Gewebe in kalten, sauerstoffhaltigen Medien vom Operationssaal bis zum Schneideschritt am Vibratom zu halten, unter Berücksichtigung der hohen Nachfrage nach O2 durch den erwachsenen menschlichen Zentralnerv. Supplementierung des Mediums mit BNDF wurde zuvor gesehen, um leicht zu erhöhen Lebensfähigkeit in erwachsenen menschlichen Gehirn Scheiben kultiviert frei schwebend32, in Übereinstimmung mit Empfehlungen für die mittlere Supplementierung mit neurotrophen Faktoren von anderen Autoren 62,63.

Abschließend beschreibt dieses Protokoll Methoden zur Vorbereitung und Durchführung von Assays mit kurzfristigen, frei schwebenden Scheibenkulturen aus erwachsenen menschlichen Gehirnen. Dieses Modell sollte für Untersuchungen über die Mechanismen der Toxizität/Neuroprotektion, die für altersassoziierte Hirnerkrankungen relevant sind, zugänglich sein. Die Verwendung von humanem resektiertem Gewebe bietet den Vorteil der Erhaltung der Zytoarchitektur des Gehirns und der lokalen Schaltkreise und erhöht die translationale Kraft zu den erhaltenen Befunden. Darüber hinaus kann das Bersten der Verwendung von vom Menschen abgeleiteten Proben aus der Neurochirurgie in der Neurowissenschaft dazu beitragen, den Bedarf an Tierversuchen zu reduzieren. Obwohl sich dieses Protokoll um die Verwendung von Gewebe dreht, das von Patienten gesammelt wurde, die der Neurochirurgie zur pharmakoresistenten Epilepsiebehandlung unterzogen wurden, wird vorgeschlagen, dass Gewebe, das aus anderen Hirnregionen/-bedingungen gesammelt wird, auch als auf einfache und kostengünstige Weise Scheibenkulturen herzustellen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird unterstützt von FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Post-Doctoral fellowship PNPD/INCT-HSM to A.F. and Pre-Doctoral fellowship to N.D.M.) und FAEPA. G.M.A. hält ein Master-Stipendium von FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. besitzt ein CNPq Research Fellowship. Wir danken den Patienten und ihren Familien für die Vermehrung der resezierten Gewebe für diese Studie. Wir möchten die Unterstützung von Bewohnern, Krankenschwestern, Technikern und dem CIREP-Team des Klinischen Krankenhauses der Ribeiréo Preto Medical School, Universität von Sao Paulo, würdigen, die in verschiedenen Phasen des Prozesses geholfen haben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 - VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 - ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ

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Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).

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