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Neuroscience

वयस्क मानव मस्तिष्क से अल्पकालिक मुक्त फ्लोटिंग स्लाइस संस्कृति

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/59845
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 4, 4, 5, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Summary

वयस्क मानव मस्तिष्क से मुक्त चल टुकड़ा संस्कृतियों को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. प्रोटोकॉल झिल्ली आवेषण का उपयोग कर व्यापक रूप से इस्तेमाल किया टुकड़ा संस्कृति विधि की एक भिन्नता है. यह सरल, लागत प्रभावी है, और अल्पकालिक परख उम्र से जुड़े मस्तिष्क रोगों के पीछे neurodegeneration के तंत्र को जानने के उद्देश्य से चलाने के लिए सिफारिश की.

Abstract

Organotypic, या टुकड़ा संस्कृतियों, व्यापक रूप से इन विट्रो में कार्य कर रहे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के मॉडल पहलुओं के लिए नियोजित किया गया है. तंत्रिका विज्ञान में टुकड़ा संस्कृतियों की क्षमता के बावजूद, वयस्क तंत्रिका ऊतक का उपयोग कर ऐसी संस्कृतियों को तैयार करने के अध्ययन अभी भी दुर्लभ हैं, विशेष रूप से मानव विषयों से उन. वयस्क मानव ऊतक का उपयोग टुकड़ा संस्कृतियों तैयार करने के लिए विशेष रूप से मानव neuropathologies की समझ को बढ़ाने के लिए आकर्षक है, के रूप में वे परिपक्व मानव मस्तिष्क कृंतक से उत्पादित स्लाइस में कमी के विशिष्ट अद्वितीय गुण पकड़ (आमतौर पर नवजात) तंत्रिका ऊतक. इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मस्तिष्क ऊतक जीवित मानव दाताओं से एकत्र करने के लिए अल्पकालिक, मुक्त चल टुकड़ा संस्कृतियों तैयार करने के लिए resective मस्तिष्क सर्जरी के लिए प्रस्तुत किया. इन संस्कृतियों का उपयोग कर जैव रासायनिक और कोशिका जीव विज्ञान परख को बनाए रखने और निष्पादित करने की प्रक्रियाएं भी प्रस्तुत की जाती हैं। प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करता है कि ठेठ मानव cortical लेमिनेशन इन विट्रो में 4 दिनों के बाद स्लाइस में संरक्षित है (DIV4), मुख्य तंत्रिका कोशिका प्रकार की उम्मीद उपस्थिति के साथ. इसके अलावा, DIV4 में स्लाइस मजबूत सेल मौत से गुजरना जब एक विषाक्त उत्तेजना के साथ चुनौती दी (एच2हे2 2),सेल मौत परख में एक मंच के रूप में सेवा करने के लिए इस मॉडल की क्षमता का संकेत. इस विधि, झिल्ली आवेषण का उपयोग कर व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के लिए एक सरल और लागत प्रभावी विकल्प, मुख्य रूप से उम्र से जुड़े मस्तिष्क रोगों के पीछे neurodegeneration के तंत्र को जानने के उद्देश्य से अल्पकालिक परख चलाने के लिए सिफारिश की है. अंत में, हालांकि प्रोटोकॉल फार्माकोप्रतिरोधी अस्थायी पालि मिर्गी के शल्य चिकित्सा उपचार के लिए प्रस्तुत रोगियों से एकत्र cortical ऊतक का उपयोग करने के लिए समर्पित है, यह तर्क दिया है कि ऊतक अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से एकत्र / इसी तरह के मुक्त चल टुकड़ा संस्कृतियों का उत्पादन करने के लिए स्रोतों के रूप में माना जाता है।

Introduction

अनुसंधान में मानव नमूनों का उपयोग स्पष्ट रूप से मानव मस्तिष्क रोगों का अध्ययन करने के लिए एक बढ़िया विकल्प है, और आधुनिक तकनीकों रोगी व्युत्पन्न ऊतक का उपयोग कर मजबूत और नैतिक प्रयोग के लिए नए तरीके खोल दिया है. वयस्क मानव मस्तिष्क से तैयार organotypic / टुकड़ा संस्कृतियों की तरह तरीकों तेजी से इस तरह के optogenetics1, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी2,3,4,5, plasticity के रूप में प्रतिमानों में इस्तेमाल किया गया है 6,7,8,9, न्यूरोटॉक्सिसिटी / औषध जांच15,16,17, आनुवंशिकी और जीन संपादन12,18,19,20, अन्य के लिए एक रणनीति के रूप में , बेहतर करने के लिए एक रणनीति के रूप में वयस्कता के दौरान स्नायविक रोगों को समझना.

मानव मस्तिष्क रोगों अंतर्निहित तंत्र की समझ प्रयोगात्मक रणनीतियों है कि विषयों की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता पर निर्भर करता है. इसके विपरीत, टुकड़ा संस्कृतियों के मामले में, हालांकि मानव नमूनों के लिए उपयोग अभी भी मुश्किल है, एक भी cortical नमूना से 50 स्लाइस पैदा करने की संभावना आंशिक रूप से कई स्वयंसेवकों की भर्ती की आवश्यकता को दरकिनार प्रतिकृति की संख्या और एकत्र ऊतक21प्रति परख प्रदर्शन किया .

मस्तिष्क organotypic/ टुकड़ा संस्कृतियों के लिए कई प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, शास्त्रीय oculo ड्राफ्ट से लेकर22,23 रोलर ट्यूब24,25,26, अर्द्ध पारगम्य झिल्ली इंटरफ़ेस27,28,29,30, और मुक्त चल स्लाइस31,32. एक प्रयोगात्मक डिजाइन की विशेषताओं पर निर्भर करता है, प्रत्येक तकनीक अपने स्वयं के फायदे और नुकसान है. अल्पकालिक, मुक्त चल वयस्क मानव दिमाग से स्लाइस संस्कृतियों कुछ मामलों में Stoppini एट अल द्वारा इस्तेमाल किया विधि पर फायदेमंद है27,अगर तथ्य यह है कि हालांकि इन विट्रो में लंबी अवधि के सेल अस्तित्व आमतौर पर एक प्रमुख चिंता का विषय है जब मूल्यांकन अनेक प्रयोगों में संस्कृति में केवल अल्प समय की आवश्यकता होती है12,31,32,33,34,35. इन शर्तों के तहत, मुक्त चल संस्कृतियों का उपयोग सरल और अधिक लागत प्रभावी होने का लाभ प्रस्तुत करता है, साथ ही अधिक सही 2-3 सप्ताह से अधिक संस्कृति में रखा स्लाइस से मूल मानव ऊतक हालत जैसी.

तंत्रिका विज्ञान के लिए टुकड़ा संस्कृतियों की क्षमता के बावजूद, वयस्क तंत्रिका ऊतक का उपयोग कर ऐसी संस्कृतियों को तैयार करने के अध्ययन अभी भी दुर्लभ हैं, विशेष रूप से मानव विषयों से. यह लेख मुक्त चल टुकड़ा संस्कृतियों को तैयार करने के लिए resective मस्तिष्क सर्जरी के लिए प्रस्तुत मानव दाताओं से एकत्र मस्तिष्क ऊतक का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. इन संस्कृतियों का उपयोग कर जैव रासायनिक और सेल जीव विज्ञान परख को बनाए रखने और प्रदर्शन करने के लिए प्रक्रियाओं का विस्तृत विवरण है। इस प्रोटोकॉल वयस्कता से जुड़े neuropathologies के तंत्र पर जांच में व्यवहार्यता और न्यूरॉन समारोह का विश्लेषण करने के लिए मूल्यवान साबित किया गया है.

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Protocol

जीवित वयस्क मस्तिष्क ऊतक फार्माकोप्रतिरोधी अस्थायी लोब मिर्गी के उपचार के लिए प्रक्षिप् त तंत्रिका शल्य चिकित्सा से गुजर रहे रोगियों से प्राप्त किए गए थे (चित्र 1ए) . सभी प्रक्रियाओं को आचार समिति द्वारा क्लिनिक अस्पताल से Ribeir-O प्रीटो मेडिकल स्कूल (17578/2015) में अनुमोदित किया गया था, और रोगियों (या उनके कानूनी जिम्मेदार व्यक्ति) सहमत हुए और सूचित सहमति शर्तों पर हस्ताक्षर किए। ऊतक का संग्रह मिर्गी सर्जरी केंद्र में neurosurgery टीम द्वारा किया गया था (CIREP - Ribeiro प्रीटो मेडिकल स्कूल, साओ पाउलो, ब्राजील के विश्वविद्यालय में क्लीनिक अस्पताल).

1. सामग्री का बंध्याकरण

नोट: सभी सामग्री और समाधान का उपयोग करने से पहले बाँझ होना चाहिए.

  1. सभी शल्य चिकित्सा उपकरण और vibratome टुकड़ा करने की सामग्री (चाकू धारक, नमूना डिस्क, बफर ट्रे) 180 डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए एक सूखी बाँझ ओवन में बाँझ।
  2. यूवी या गामा विकिरण द्वारा तापमान के प्रति संवेदनशील सामग्री या उपकरण स्टरलाइज़ करें।
  3. 0.22 डिग्री मीटर के छिद्र झिल्ली के माध्यम से autoclavation या निस्पंदन द्वारा मीडिया और समाधान स्टरलाइज़ करें।

2. समाधान की तैयारी

  1. परिवहन समाधान के 15-20 एमएल तैयार करें: 50% v/v हैंक्स' संतुलित नमक समाधान (HBSS) पीएच 7.4, 50% v/v बेसल माध्यम प्रसवोत्तर और वयस्क मस्तिष्क न्यूरॉन्स के रखरखाव के लिए(सामग्री की तालिका),10 एम एम 4 के साथ पूरक (2-hydroxyethyl)-1- पाइपराजीनेथेनसल्फोनिक एसिड (हेप्स), 3 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज, और 33 ग्राम/एमएल जेंटामिसिन।
    नोट: परिवहन समाधान कम से कम 20 मिनट नमूना संग्रह करने से पहले के लिए (कार्बोजन गैस के साथ bubbling) ठंडा और oxygenated किया जाना चाहिए।
  2. टुकड़ा करने के समाधान के 300 एमएल तैयार (HBSS 10 mM HEPES और 3 mg/mL ग्लूकोज के साथ पूरक) और प्रारंभिक क्रिस्टल गठन की बात करने के लिए एक फ्रीजर में इसे ठंडा.
  3. संस्कृति माध्यम के 20 एमएल तैयार करें: प्रसवोत्तर और वयस्क मस्तिष्क न्यूरॉन्स के रखरखाव के लिए बेसल माध्यम (सामग्री की तालिका) 1% एल-ग्लूटामाइन व्युत्पन्न ( सामग्री कीतालिका), तंत्रिका संस्कृति के लिए 2% पूरक ( तालिका की तालिका ) सामग्री), 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.25 ग्राम/एमएल एम्फोटेरिकिन बी।

3. टुकड़ा करने के उपकरण की स्थापना

नोट: इस प्रोटोकॉल आदर्श शल्य कक्ष में नमूना संग्रह की रसद के कारण एक सहयोगी की सहायता से किया जाता है.

  1. नमक वर्धित बर्फ की एक बाल्टी में, कम से कम 20 मिनट पहले उपयोग करने से पहले के लिए कार्बोजेन मिश्रण bubbling (95% हे2, 5% सीओ2) के तहत टुकड़ा समाधान आराम करते हैं।
  2. 3% agarose (लगभग 2 सेमी x 2 सेमी 2 सेमी) का एक ब्लॉक तैयार करें और टुकड़ा करने के दौरान ऊतक नमूने के लिए अतिरिक्त यांत्रिक समर्थन बनाने के लिए इसे वाइब्राटोम नमूना डिस्क पर सुपरग्लू करें (चित्र 1ई)।
  3. टुकड़ा करने के लिए vibratome सेट करें: 200 डिग्री की खंड मोटाई, 100 हर्ट्ज के कंपन की आवृत्ति, और 0.5-1.0 मिमी के बीच टुकड़ा करने की गति।
  4. vibratome बफर ट्रे vibratome आधार करने के लिए लॉक और बर्फ जोड़ने के लिए यह टुकड़ा समाधान और नमूना प्राप्त करने से पहले फ्रिज में रखने के लिए, और टुकड़ा करने की प्रक्रिया के दौरान.

4. नमूना संग्रह

नोट: इस प्रोटोकॉल में, मानव neocortical ऊतक शल्य कक्ष में एकत्र किया गया था और प्रयोगशाला में ले जाया गया.

चेतावनी: मानव नमूनों से निपटने के दौरान, संस्था द्वारा स्थापित उपयुक्त सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करें।

  1. परिवहन उपकरण (चित्र 1ब्) जो इसके होते हैं: कार्बोजेन मिश्रण के साथ एक पोर्टेबल गैस सिलेंडर जो दबाव/प्रवाह वाल्व से जुड़ा होता है जो सिलिकॉन ट्यूबिंग से जुड़े गैस आउटपुट को नियंत्रित करता है जो गैस उत्पादन को परिवहन से जोड़ता है। पोत; एक परिवहन पोत, आमतौर पर गैस इनपुट के लिए छिद्रित ढक्कन के साथ एक 50 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब, परिवहन समाधान युक्त; और परिवहन के दौरान नमूना ठंडा करने के लिए बर्फ।
  2. नमूना एकत्र करके (चित्र 1ख) को तुरंत प्रयोगशाला में ले लीजिए और उस पर ले जाएं। ठंडे परिवहन समाधान में नमूना पनडुब्बी (लगातार कार्बोजन मिश्रण के साथ bubbled).

5. टुकड़ा करना

  1. एक पेट्री डिश (100 मिमी x 20 मिमी) टुकड़ा करने के समाधान युक्त करने के लिए नमूना स्थानांतरण और, ठीक शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ, ध्यान से नमूना में शेष meninges के रूप में संभव के रूप में ज्यादा हटा दें (चित्र 1डी).
  2. प्रयोगात्मक डिजाइन की विशेष विशेषताओं के साथ स्लाइस के उत्पादन के लिए सबसे अच्छा नमूना अभिविन्यास चुनें, और एक नंबर 24 स्केलपेल ब्लेड के साथ, नमूना डिस्क से चिपके आधार होने के लिए एक फ्लैट सतह ट्रिम।
  3. एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक चम्मच और नाजुक paintbrushes का उपयोग करना, पेट्री डिश और सूखी अतिरिक्त समाधान से टुकड़ा इकट्ठा फिल्टर कागज का उपयोग कर (केशिका द्वारा सूखी और कागज के साथ ऊतक टुकड़ा छूने से बचें).
  4. सुपरग्लू का उपयोग करके, टिश्यू को वाइब्रोम नमूना डिस्क से तब तक जोड़दें जब तक कि इसे डिस्क का मजबूती से पालन न किया जाए और अगारोस ब्लॉक के संपर्क में (चित्र 1ई) का पालन न किया जाए।
  5. पूरी प्रक्रिया के दौरान bubbling होना चाहिए कि टुकड़ा करने के समाधान के साथ भरा vibratome बफर ट्रे में vibratome नमूना डिस्क (ऊतक ठीक से संलग्न के साथ) प्लेस.
  6. चाकू धारक को रेजर ब्लेड के साथ जगह में लॉक करें।
  7. टुकड़ा करने के समाधान दोनों नमूना और ब्लेड को कवर करना चाहिए, केवल उसके बाद टुकड़ा करना शुरू (चित्र 1एफ) .
  8. नमूना को 200 डिग्री मी स्लाइस में काट लें।
    नोट: हालांकि कुछ vibratomes नमूनों स्वचालित रूप से कटौती, बंद अवलोकन और प्रक्रिया के दौरान गति टुकड़ा करने में मामूली समायोजन बेहतर स्लाइस के उत्पादन में मदद मिल सकती है. प्रारंभिक अनियमित स्लाइस छोड़ें.
  9. टुकड़ा करने के समाधान के साथ एक पेट्री डिश के लिए बफर ट्रे से स्लाइस स्थानांतरण और ढीला किनारों और लगभग 70% प्रांतस्था / 30% सफेद बात के अनुपात के लिए अतिरिक्त सफेद मैटर ट्रिम।

6. संस्कृति

नोट: बाँझ वातावरण के तहत एक laminar प्रवाह कैबिनेट में इस कदम को निष्पादित करें।

  1. अच्छी तरह से संस्कृति मध्यम के 600 $L जोड़ें (एक 24 अच्छी तरह से थाली में) और स्लाइस चढ़ाना से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए 36 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 के लिए इनक्यूबेट।
  2. तूलिका का उपयोग करके प्रति अच्छी तरह से एक टुकड़ा प्लेट करें (चित्र 1जी)।
  3. यदि प्लेट में अप्रयुक्त कुएं हों तो उन्हें 400 डिग्री सेल्सियस बाँझ पानी से भर दें।
  4. प्लेट को 36 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व्2पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: पहले मध्यम प्रतिस्थापन टुकड़ा के आकार के आधार पर चढ़ाना के बाद 8-16 एच के बीच में किया जाना चाहिए।
  5. 50 एनजी/एमएल मस्तिष्क व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक फैक्टर (बीडीएनएफ) के साथ पहले से तैयार संस्कृति माध्यम के 10 एमएल के पूरक।
    नोट: पहले 8-16 एच के दौरान, स्लाइस को पोषक तत्वों के अभाव और अम्लीकरण से बचने के लिए मध्यम के 600 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट किया जाता है, क्योंकि इस चरण में मध्यम खपत त्वरित होती है। अगले चरण से, प्रति अच्छी तरह से मध्यम की मात्रा को 400 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित किया जाता है।
  6. प्रत्येक कुएं से वातानुकूलित माध्यम के 333 $L निकालें और ताजा बीडीएनएफ-पूरक माध्यम के 133 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  7. नए बीडीएनएफ-पूरक माध्यम के साथ वातानुकूलित माध्यम के एक तिहाई की जगह हर 24 घंटे मध्यम प्रतिस्थापन की प्रक्रिया को दोहराएँ।

7. सुसंस्कृत स्लाइस में स्वास्थ्य, आकारिकी, और समारोह का मूल्यांकन

नोट: प्रतिनिधि परिणामों में उदाहरण के उद्देश्य के लिए सेल मौत प्रेरित करने के लिए, कुछ स्लाइस ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरक एच2ओ2के साथ एक 24 एच उपचार के लिए प्रस्तुत किए गए थे। चरण 7-1-1-2 तथा 7-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-2- 7-1-1-2-

  1. सेल व्यवहार्यता
    नोट: चुनौती दी टुकड़ा संस्कृतियों में neurotoxic/neuroprotection का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल, सरल विधि 3 है-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) परख36, जो सक्रिय कोशिकाओं के प्रतिशत के उपाय इलाज के नमूनों की तुलना में सामान्य परिस्थितियों में।
    1. स्तरीय प्रवाह कैबिनेट में, नए माध्यम के साथ माध्यम के एक तिहाई की जगह.
    2. एक 30% एच2हे2 शेयर समाधान से, इरादा अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए अच्छी तरह से प्रति एच2हे2 की एक मात्रा जोड़ें (30 m या 300 m).
      नोट: एच2हे2 चुनौती से पहले ताजा पोषक तत्वों की उचित आपूर्ति की गारंटी करने के लिए माध्यम के दैनिक परिवर्तन के बाद जोड़ा गया था।
    3. 36 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें, 5% सीओ2।
      नोट: एच2हे2 उपचार (या ब्याज के अन्य विषाक्त उत्तेजना) के बाद, निम्नलिखित चरणों एमटीटी परख द्वारा सेल व्यवहार्यता निर्धारण का वर्णन.
    4. प्लेट में प्रत्येक में 0ण्5 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए एमटीटी विलयन का 40 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    5. 36 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें, 3 एच के लिए 5% सीओ2।
    6. फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ स्लाइस धो लें और एक माइक्रोट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    7. सावधानी से pipeting द्वारा किसी भी शेष समाधान निकालें।
    8. प्रत्येक स्लाइस के द्रव्यमान का निर्धारण करने के लिए स्लाइस युक्त माइक्रोट्यूब वजन (यह प्राप्त अवशोषण रीडिंग को सामान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है)।
      नोट: यदि आवश्यक हो, नमूने बाद में प्रसंस्करण के लिए इस स्तर पर जमे हुए (-20 डिग्री सेल्सियस) किया जा सकता है।
    9. एक मोटरचालित मूसल का उपयोग करके आइसोप्रोपेनॉल/एचसीएल के 200 डिग्री एल में स्लाइस को होमोजेनाइज करें।
    10. 2600 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सेंट्रीफ्यूज।
    11. सुपरनेंट लीजिए और 540 एनएम पर अवशोषण को मापता है।
  2. केसीएल प्रेरित न्यूरोनल विध्रुवण
    नोट: mitogen सक्रिय प्रोटीन kinase के फॉस्फोरिलेशन (MAPK) झरना प्रोटीन ERK संकेत, पश्चिमी blotting द्वारा पीछा किया, KCl प्रेरित depolariz37 के लिए न्यूरॉन प्रतिक्रिया के परिमाणके लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. प्रवाह कैबिनेट में, एचबीएसएस के 300 डिग्री सेल्सियस द्वारा संस्कृति माध्यम को पहले से 36 डिग्री सेल्सियस तक प्रतिस्थापित करें।
    2. HBSS को पहले से 36 डिग्री सेल्सियस तक के ताजा HBSS के 300 डिग्री सेल्सियस के साथ बदलें।
    3. प्लेट को 36 डिग्री सेल्सियस पर, 5% सीओ2 को 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. HBSS को या तो ताजा HBSS के साथ या 80 एम एम केसीएल depolarizing समाधान के साथ बदलें (दोनों 36 डिग्री सेल्सियस पर) और 36 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबे, 15 मिनट के लिए 5% सीओ2।
    5. प्लेट से स्लाइस को माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें। इस चरण में, स्लाइस बाद में प्रसंस्करण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    6. रेडियोडिमिनरिडीरीज परख (आरआईपीए) बफर (50 एमएम ट्रास-एचसीएल; 150 एमएम नैकल; 1 एमएम एडीसी; 1% nonionic सर्फैक्टेंट; 0.1% सोडियम डोडिसिल सल्फेट; पीएच 7.5) में ऊतक अर्क तैयार करें। 16000 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज अर्क, supernatant इकट्ठा, और ब्रैडफोर्ड विधि का उपयोग कर कुल प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
    7. एक 12% सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज) पर कुल प्रोटीन के 30 डिग्री लोड।
    8. इलेक्ट्रोफोरोसिस के बाद, जेल सामग्री को नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली में स्थानांतरित करें।
    9. टीबीएस प्लस 0.1% ट्वीन में 5% गैर वसा शुष्क दूध के साथ झिल्ली को अवरुद्ध करने के बाद, माउस एंटी-पीईआरके (1:1,000) के साथ 16 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। धोने के बाद, खरगोश विरोधी ERK1/2 (1:1,000) के साथ आरटी में 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    10. 1 एच के लिए आरटी में उपयुक्त एचआरपी-कंजुगेट्ड सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट।
    11. पसंदीदा एचआरपी सब्सट्रेट के साथ पता चलता है।
  3. Morphological मूल्यांकन
    नोट: सेल अस्तित्व और कार्यात्मक मूल्यांकन के अलावा, यह ऊतक आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है। ध्यान रखें कि सुसंस्कृत टुकड़ा resectioning morphological विश्लेषण के लिए संभव के रूप में ज्यादा उच्च गुणवत्ता सामग्री के रूप में उत्पादन करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है.
    1. फिक्सिंग, cryoprotecting और स्लाइस resectioning
      1. संस्कृति माध्यम के साथ कुओं से स्लाइस को एक नई 24 अच्छी तरह से पीबीएस युक्त प्लेट में स्थानांतरित करें।
      2. पीबीएस निकालें और 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) का 1 एमएल जोड़ें। यह महत्वपूर्ण है कि स्लाइस को पीएफए जोड़ने से पहले फ्लैट रखा जाए। रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      3. पीएफए समाधान को सावधानी से निकालें और 30% सुक्रोज समाधान का 1 एमएल जोड़ें। 48 h के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      4. ठंड microtome -40 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट करें।
      5. माइक्रोटोम अवस्था पर एक सुक्रोज आधार तैयार की है जहां स्लाइस रखे जाने चाहिए (चित्र 2क) इसे पूरी तरह से फ्रीज करें और ध्यान से कुछ जमे हुए सुक्रोज को एक सपाट सतह का उत्पादन करने के लिए काट लें जिस पर टुकड़ा रखा जाएगा।
      6. एक विस्तारित प्लास्टिक की फिल्म पर प्रत्येक टुकड़ा प्लेस और ऊतक फ्लैट करने के लिए एक तूलिका का उपयोग करें।
      7. एक ही चाल में जमे हुए sucrose आधार करने के लिए बढ़ाया टुकड़ा स्थानांतरण।
        नोट: यह एक बार यह जमे हुए sucrose आधार खत्म हो गया है टुकड़ा ले जाने के लिए संभव नहीं है। इस स्थानांतरण चरण सावधानी से निष्पादित करें।
      8. उचित ठंड के लिए 5-10 मिनट के लिए टुकड़ा आराम करते हैं.
      9. टुकड़ा 30 डिग्री मीटर वर्गों में काट.
      10. पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश के लिए 30 डिग्री मीटर वर्गों स्थानांतरण।
      11. ऊतक विज्ञान प्रोटोकॉल के लिए आगे बढ़ें प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए और अधिक पर्याप्त.
        नोट: 30 डिग्री सेल्सियस आसानी से मुक्त चल इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, आगे ऊतक विज्ञान के लिए माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर घुड़सवार या -20 डिग्री सेल्सियस पर antifreeze समाधान में संग्रहीत.
    2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
      नोट: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसीमानक मानक प्रोटोकॉल प्रयोगशालाओं के बीच अलग-अलग होते हैं। यहाँ इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का एक विस्तृत संस्करण के लिए, Horta एट अल38देखें. चित्रा 2 में प्रस्तुत इम्यूनोस्टेनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी में न्यूरोनल न्यूक्लिकी (न्युन), स्वस्थ परिपक्व न्यूरॉन मार्कर, ग्लिल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी), एसोसाइटेस मार्कर, आयनित कैल्शियम बाइंडिंग एडाप्टर (इबा-1) और माइक्रोग्लिया शामिल हैं। मार्कर.
      1. समाधान अवरुद्ध करने में स्लाइस इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, पीबीएस में 2% सामान्य गधा सीरम) 40 मिनट के लिए।
      2. 4 डिग्री सेल्सियस पर हल्के आंदोलन के तहत प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर इनक्यूबेट।
      3. पीबीएस के साथ धोने के बाद, आरटी में हल्के आंदोलन के तहत biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 120 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      4. पीबीएस के साथ धोने के बाद, AVIDin-peroxidase संयुग्मी(सामग्री की तालिका)के साथ 120 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें।
      5. DAB + 0.04% निकल अमोनियम के साथ पता चलता है.
      6. जिलेटिन लेपित माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर दाग वर्गों माउंट और उन्हें हवा सूखी. इथेनॉल में निर्जलीकरण, xylene में diaphanize, बढ़ते माध्यम के साथ खत्म(सामग्री की तालिका),एक coverslip के साथ कवर, और छवि.

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Representative Results

एक महत्वपूर्ण पहलू सुसंस्कृत स्लाइस की गुणवत्ता और स्वास्थ्य का मूल्यांकन करने के लिए उपस्थिति और अपेक्षित तंत्रिका कोशिका प्रकार के विशिष्ट आकृति विज्ञान है, न्यूरॉन्स, और glial कोशिकाओं. मानव cortical लेमिनेशन की विशिष्ट वास्तुकला DIV4 में एक टुकड़ा में मनाया गया, न्यूरॉन इम्यूनोलेबलिंग द्वारा पता चला (चित्र 2डी) . इसके अतिरिक्त, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोग्लिया(चित्र 2ब् ब् )की अपेक्षित उपस्थिति भी देखी गई। इन परिणामों से पता चलता है कि ऊतक वास्तुकला काफी या तो शल्य प्रक्रिया / नमूना प्रसंस्करण द्वारा या इन विट्रो में अल्पकालिक अवधि से प्रभावित नहीं है. पिछले निष्कर्षों के अनुसार, यह दिखाया गया था कि NeuN इम्यूनोरेक्टी DIV0 और DIV432के बीच नहीं बदला गया था. इन परिणामों के आधार पर, मुक्त चल संस्कृति प्रारूप, 200 डिग्री करने के लिए टुकड़ा की कम मोटाई से जुड़े (व्यापक रूप से इस्तेमाल किया 300-400 डिग्री मीटर की तुलना में जब झिल्ली आवेषण का उपयोग किया जाता है), आंतरिक सेल परतों के लिए ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के बेहतर प्रसार के लिए योगदान दिया स्लाइस में, जो पहले सुसंस्कृत स्लाइस39,40के स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण होने का प्रदर्शन किया गया है .

स्लाइस में सेल मौत की मात्रा भी इस तरह के टुकड़ा संस्कृतियों के रूप में neuropathologies के पूर्व vivo मॉडल में एक मूल्यवान दृष्टिकोण है (Lossi एट अल द्वारा की समीक्षा की.41). पिछले एक अध्ययन में, हमने एमटीटी परख का उपयोग संस्कृति32की अवधि के साथ सेल मृत्यु स्तर निर्धारित करने के लिए किया था। व्यवहार्यता के अलावा, कि एक ही अध्ययन भी पता चला है कि सुसंस्कृत स्लाइस (DIV4 तक) KCl प्रेरित depolarization32पर न्यूरोट्रांसमीटर जारी करने की क्षमता संरक्षित. यहाँ, उन निष्कर्षों ईआरके फॉस्फोरिलेशन पर केसीएल प्रेरित depolarization के लिए न्यूरॉन प्रतिक्रिया की जांच करके विस्तार किया गया, एक केंद्रीय काइनाज ऐसी synaptic प्लास्टिक और स्मृति42,43के रूप में प्रक्रियाओं में शामिल . दिलचस्प बात यह है कि ईआरके फॉस्फोरिलेशन में स्पष्ट वृद्धि डीवी4 में केसीएल उपचारित स्लाइसों में देखी गई(चित्र 3ए, बी)।

अंत में, एक विषाक्त चुनौती के लिए DIV4 में स्लाइस की प्रतिक्रिया एक ज्ञात ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरक, एच2हे2के साथ मूल्यांकन किया गया था। तर्क यह था कि सेल मृत्यु की सीमा सुसंस्कृत स्लाइस में सेल व्यवहार्यता के स्तर के समानुपातिक होनी चाहिए। जैसा कि चित्र 3सीमें दिखाया गया है , स्लाइस को 300 एमएम एच 2 ओ22 24 एच के लिए उजागर करने से एमटीटी में कमी में एक मजबूत कमी हुई। एक साथ लिया, बड़े पैमाने पर सेल मौत DIV5 में मनाया के बाद एच2ओ2 चुनौती और KCl प्रेरित depolarization परिणाम संकेत मिलता है कि DIV4 पर स्लाइस के संरक्षित सामान्य स्वास्थ्य पर्याप्त रूप से इस तरह के ऑक्सीडेटिव के रूप में एक विषाक्त उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया तनाव.

Figure 1
चित्र 1: नमूना संग्रह, परिवहन, टुकड़ा करना, और वयस्क मनुष्यों से cortical ऊतक की culturing. प्रक्रिया फार्माको प्रतिरोधी मिर्गी(ए, बी)के उपचार के लिए अस्थायी लोबेक्टॉमी से cortical ऊतक के संग्रह के साथ सर्जिकल कमरे में शुरू होता है। (ग) ऊतक का अंश (द र् 1) को बर्फ-शीत ऑक्सीजनयुक्त परिवहन माध्यम वाली ट्यूब में तुरंत स्थानांतरित कर दिया जाता है (नीचे देखिए)। (डी)प्रयोगशाला में, मेनिंग्स ठीक नेत्र tweezers का उपयोग कर हटा रहे हैं. अतिरिक्त तरल फिल्टर कागज का उपयोग कर सूख जाता है, और टुकड़ा superglued है (ई) सफेद पदार्थ नीचे का सामना करना पड़ रहा है और pial सतह का सामना करना पड़ के साथ vibratome नमूना डिस्क के लिए. (च) एक वाणिज्यिक शेविंग रेजर का उपयोग करते हुए, नमूना को 200 डिग्री मी स्लाइस में काटा जाता है जो एक नाजुक तूलिका के साथ एकत्र किया जाता है और अतिरिक्त सफेद पदार्थ और ढीले सिरों की आगे ट्रिमिंग के लिए पेट्री डिश में वापस स्थानांतरित किया जाता है(जी) से पहले एक मुक्त चल प्रारूप में चढ़ाना और culturing। (ज) स्लाइस संस्कृतियों को कई दिनों तक व्यवहार्य रखा जाता है और विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक प्रोटोकॉलों में इसका उपयोग किया जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: वयस्क मानव मस्तिष्क से टुकड़ा संस्कृतियों में तंत्रिका कोशिकाओं के Morphological विश्लेषण. स्लाइस इन विट्रो में चौथे दिन तय किए गए थे. (ए, बी, सी) इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से पहले अनुभागिंग प्रक्रिया के प्रतिनिधि कदम। दृश्य को बेहतर बनाने के लिए ऊतक डिजिटल रूप से रंगीन था। (घ)वल्कुट परतों (रोमन अंकों) में न्यूरॉन्स का सामान्य वितरण। (इ) माइक्रोग्लिया और (च) एस्ट्रोसाइट्स को भी स्पष्ट रूप से देखा गया (द र् 1 स्लाइस प्रति सेल प्रकार लेबलिंग )। सभी स्लाइस एक दाता से ऊतक से प्राप्त किए गए थे. स्केल बार्स $ 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: वयस्क मानव मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में कार्यात्मक और सेल व्यवहार्यता परख. न्यूरोनल गतिविधि का मूल्यांकन विट्रो 5 (DIV5) में दिन में स्लाइस में केसीएल-प्रेरित depolarization और ERK फॉस्फोरिलेशन में परिणामी वृद्धि द्वारा किया गया था। (क)एक प्रतिनिधि इम्यूनोब्लॉट परिणाम एक स्लाइस से समरूपता के साथ प्राप्त किया जाता है। फॉस्फो ERK (पर्क) और कुल ERK (tERK) के लिए इसी बैंड संकेत दिया जाता है. (ख) एक ही मानव दाता से तीन स्वतंत्र स्लाइसों में पीईआरके/टीईआरके अनुपात का परिमाणीकरण। (ग) हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2व्2) विषाक्तता का मूल्यांकन DIV 5 में स्लाइस में एमटीटी परख द्वारा किया गया था। प्राप्त ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों प्रत्येक टुकड़ा के द्रव्यमान द्वारा सामान्यीकृत किया गया. संकेत सांद्रता में H2O2 के साथ स्लाइस को चुनौती दी गई थी (नहीं H2O2; 30 m H2O2; 300 m M H2O2) 24 h. MTT के साथ ऊष्मायन के बाद प्रतिनिधि स्लाइस की छवियाँ सलाखों के ऊपर दिखाए जाते हैं. परिणाम एक दाता से तीन स्वतंत्र स्लाइस से प्राप्त डेटा से औसत - मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मुक्त चल, अल्पकालिक टुकड़ा संस्कृतियों के उत्पादन के लिए यह प्रोटोकॉल वयस्क मानव neocortical स्लाइस culturing के लिए एक वैकल्पिक तरीका है. स्लाइस संस्कृतियों के लिए इस तरह के एक प्रोटोकॉल पर अध्ययन के लिए अनुकूल हो सकता है (लेकिन करने के लिए प्रतिबंधित नहीं) optogenetics1,44,45, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी2,3,4,5 , अल्पकालिक प्लास्टिक46,47, लंबी अवधि के प्लास्टिक48,49, neurotoxicity / 13, सेल थेरेपी14, दवा स्क्रीनिंग15,16,17, कैंसर50,51, आनुवंशिकी , और जीन संपादन12,18 ,19,20.

वयस्क मानव ऊतक से नमूनों का उपयोग मानव neuropathologies को समझने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, मानव मस्तिष्क कृंतक तंत्रिका ऊतक52से उत्पादित स्लाइस में कमी की विशिष्ट अद्वितीय गुणों के कारण . इसके अलावा, कृंतक दिमाग से टुकड़ा संस्कृतियों आमतौर पर नवजात, अपरिपक्व दिमाग, जो अत्यधिक प्लास्टिक कर रहे हैं और पलायन कोशिकाओं है कि मूल टुकड़ा cytoarchitecture बदल सकते हैं इन विट्रो वातावरण26के लिए अनुकूल करने के लिए हो सकता है से तैयार कर रहे हैं, 53,54,55. इस तरह के प्लास्टिक की घटनाओं circuitry में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व है कि जब लक्ष्य vivo हालत में नकल करने के लिए है से बचा जाना चाहिए, के रूप में टिंग एट अल द्वारा कहा गया है30:"हम कम से कम एक सप्ताह की संस्कृतियों पर ध्यान केंद्रित करने का विकल्प चुना है, जहां संरचनात्मक और कार्यात्मक गुण यथोचित हैं कम से कम क्षोभ के साथ बनाए रखा, सोने के मानक तीव्र टुकड़ा तैयारी का उपयोग कर प्राप्त माप के लिए संभव के रूप में तुलनीय हो". इसलिए, हालांकि अल्पकालिक culturing के लिए समर्पित एक विधि शुरू में सीमित के रूप में देखा जा सकता है, लंबी अवधि के culturing कई प्रयोगात्मक डिजाइन32,33,34 में प्रासंगिक परिणाम का उत्पादन करने की जरूरत नहीं है ,35,56,57.

प्रोटोकॉल के दो महत्वपूर्ण कदम स्लाइस की कम मोटाई (200 डिग्री मी) और बीडीएनएफ के साथ संस्कृति माध्यम की पूरकता हैं. पिछले कार्यमें 32हमने 4 DIV तक सेल व्यवहार्यता का परिरक्षण दिखाया है और स्लाइस मोटाई को 200 उउ तक कम करने के संभावित योगदान पर चर्चा की है , जबकि प्राय : 300-400 मीटर स्लाइस12,29. असल में, स्लाइस मोटाई को कम करने के लिए एक बेहतर oxygenation और पोषक तत्वों मुक्त चल स्लाइस में तेजी से योगदान कर सकते हैं, कोर hypoxia और neurodegeneration की संभावना को कम31,32,57, 58,59,60,61. इसके अलावा, यह ठंड में ऊतक रखने के लिए सिफारिश की है, शल्य कक्ष से vibratome पर टुकड़ा कदम करने के लिए oxygenated मीडिया, वयस्क मानव केंद्रीय तंत्रिका द्वारा O2 के लिए उच्च मांग पर विचार. BNDF के साथ माध्यम के पूरक पहले वयस्क मानव मस्तिष्क स्लाइस सुसंस्कृत मुक्त चल32में व्यवहार्यता में थोड़ा वृद्धि करने के लिए देखा गया है, अन्य लेखकों द्वारा neurotrophic कारकों के साथ मध्यम पूरकता के लिए सिफारिशों के साथ लाइन में 62,63.

अंत में, इस प्रोटोकॉल की तैयारी और वयस्क मानव दिमाग से अल्पकालिक, मुक्त चल टुकड़ा संस्कृतियों के साथ assays चलाने के लिए तरीकों का वर्णन करता है. यह मॉडल उम्र से जुड़े मस्तिष्क रोगों के लिए प्रासंगिक विषाक्तता/न्यूरोप्रोटेशन के तंत्र पर जांच के लिए सक्षम होना चाहिए। मानव resected ऊतक का उपयोग मस्तिष्क cytoarchitecture और स्थानीय circuitry के संरक्षण का लाभ प्रस्तुत करता है, प्राप्त निष्कर्षों के लिए translational शक्ति जोड़ने. इसके अलावा, तंत्रिका विज्ञान में न्यूरोसर्जरी से मानव व्युत्पन्न नमूनों के उपयोग को फोड़ने से पशु प्रयोग की आवश्यकता को कम करने में मदद मिल सकती है। हालांकि इस प्रोटोकॉल फार्माको प्रतिरोधी मिर्गी उपचार के लिए न्यूरोसर्जरी के लिए प्रस्तुत रोगियों से एकत्र ऊतक के उपयोग के आसपास केंद्रित है, यह सुझाव दिया है कि ऊतक अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से एकत्र / एक सरल और लागत प्रभावी तरीके से टुकड़ा संस्कृतियों का उत्पादन.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम FAPESP (अनुदान 25681-3/2017 से AS), CAPES (पोस्ट-डॉक्टरल फैलोशिप PNPD/INCT-HSM द्वारा A.F. और पूर्व-डॉक्टरल फैलोशिप N.D.M. को) और FAEPA द्वारा समर्थित है। G.M.A. FAPESP (MS 2018/06614-4) से मास्टर की फेलोशिप रखता है। एन.जी.सी. एक सीएनपीक्यू रिसर्च फैलोशिप रखती है। हम इस अध्ययन के लिए resected ऊतकों दान के लिए रोगियों और उनके परिवारों को धन्यवाद. हम निवासियों, नर्सों, तकनीशियनों, और CIREP टीम के समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं, Ribeiro प्रीटो मेडिकल स्कूल, साओ पाउलो विश्वविद्यालय, जो इस प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में मदद की पर नैदानिक अस्पताल से.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 - VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 - ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ

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तंत्रिका विज्ञान अंक 153 हिस्टोकल्चर neocortex पूर्व vivo neurodegeneration मिर्गी अल्जाइमर
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Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).

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