Summary
성인 인간의 뇌에서 자유롭게 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜이 제시된다. 상기 프로토콜은 멤브레인 인서트를 이용한 널리 사용되는 슬라이스 배양 방법의 변형이다. 그것은 간단 하 고, 비용 효율적인, 그리고 단기 측정 을 실행 하기 위한 권장 연령 관련 된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명 하는 것을 목표로.
Abstract
Organotypic, 또는 슬라이스 문화, 널리 생체 외에서 작동 하는 중추 신 경계의 측면을 모델링 하기 위해 사용 되었습니다. 신경 과학에 슬라이스 문화의 잠재력에도 불구 하 고, 이러한 문화를 준비 하는 성인 신경 조직을 사용 하 여 연구는 여전히 부족, 특히 인간 과목에서 그. 슬라이스 배양을 준비하기 위해 성인 인간 조직의 사용은 설치류에서 생산 된 조각 (일반적으로 신생아)에서 생산 된 성숙한 인간의 뇌의 전형적인 독특한 특성을 보유하기 때문에 인간의 신경 병리학에 대한 이해를 향상시키는 데 특히 매력적입니다. 신경 조직. 이 프로토콜은 단기, 자유 부동 슬라이스 문화를 준비하기 위해 절제 뇌 수술에 제출 살아있는 인간 기증자에서 수집 된 뇌 조직을 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양을 사용하여 생화학및 세포 생물학 분석을 유지하고 수행하는 절차도 제시된다. 대표적인 결과는 전형적인 인간 피질 적층이 시험관내(DIV4)에서 4일 후에 슬라이스로 보존되고, 주요 신경 세포 유형의 예상 존재와 함께 입증된다. 더욱이, DIV4의 슬라이스는 독성자극(H2O2)에도전할 때 강력한 세포 사멸을 겪으며, 이는 세포 사멸 법제에서 플랫폼역할을 하는 이 모델의 잠재력을 나타낸다. 이 방법은, 막 삽입을 사용하여 널리 사용되는 프로토콜에 대한 간단하고 비용 효율적인 대안, 주로 연령과 관련된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명하기위한 단기 분석법을 실행하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 프로토콜은 약리성 측두엽 간질의 외과 적 치료에 제출 된 환자에서 수집 된 피질 조직을 사용하는 데 전념하지만, 다른 뇌 영역 / 조건에서 수집 된 조직도해야한다고 주장한다. 유사한 자유 부동 슬라이스 문화원을 생성하는 소스로 간주됩니다.
Introduction
연구에서 인간 샘플의 사용은 명백하게 인간의 뇌 병리학을 연구할 수있는 좋은 옵션이며, 현대 기술은 환자 유래 조직을 사용하여 강력하고 윤리적 인 실험을위한 새로운 방법을 열었습니다. 성인 인간의 뇌에서 준비 된 organotypic / 슬라이스 문화와 같은 방법은 광유전학1,전기 생리학2,3,4,5,가소성과 같은 패러다임에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 6,7,8,9,신경 독성 / 신경 보호10,11,12,13,세포 치료14, 약물 스크리닝15,16,17,유전학 및 유전자 편집12,18,19,20,다른 사람의 사이에서, 더 나은 전략으로 성인기 동안 신경 질환을 이해.
인간의 뇌 병리의 근본적인 메커니즘의 이해는 많은 수의 과목을 필요로하는 실험 전략에 달려 있습니다. 반대로, 슬라이스 배양의 경우, 인간 샘플에 대한 접근은 여전히 어렵지만 단일 피질 샘플에서 최대 50 개의 조각을 생성 할 가능성은 부분적으로 증가하여 여러 자원 봉사자를 모집하는 요구 사항을 우회합니다. 수집된 조직당 복제 및 수행된비수치(21).
뇌 organotypic / 슬라이스 문화에 대한 몇 가지 프로토콜은 고전 oculo 초안22,23에서 롤러 튜브24, 25,26,반 투과성 멤브레인에 이르기까지 설명되었습니다. 인터페이스27,28,29,30, 자유 부동 슬라이스31,32. 실험 설계의 특수성에 따라 각 기술에는 고유한 장점과 단점이 있습니다. 성인 인간의 뇌에서 단기, 자유 부동 슬라이스 배양은 경우에 따라 Stoppini 등27에의해 사용되는 방법에 비해 유리하다, 사실 고려하면 시험관내에서 장기 세포 생존은 일반적으로 평가 할 때 주요 관심사입니다 배양 방법은, 많은 실험에서 배양에서 짧은 기간만 이들에게12,31,32,33,34,35가필요하다. 이러한 조건하에서, 자유 부동 배양의 사용은 2-3 주 동안 배양에 보관 된 조각보다 원래의 인간 조직 상태를 보다 정확하게 닮은 더 간단하고 비용 효율적인 장점을 제시한다.
신경 과학에 슬라이스 문화의 잠재력에도 불구 하 고, 이러한 문화를 준비 하는 성인 신경 조직을 사용 하 여 연구는 여전히 부족, 특히 인간의 과목에서. 이 문서는 자유 부동 슬라이스 문화를 준비하기 위해 절제 뇌 수술에 제출 살아있는 인간 기증자에서 수집 된 뇌 조직을 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 배양을 사용하여 생화학 및 세포 생물학 분석을 유지하고 수행하는 절차는 상세히 설명되어 있다. 이 프로토콜은 성인기에 연결된 신경 병리학의 메커니즘에 대한 조사에서 생존력과 신경 기능을 분석하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다.
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Protocol
살아있는 성인 뇌 조직은 약전성 측두엽 간질치료를 위한 용단신경외과를 받은 환자로부터 수득하였다(도1A). 모든 절차는 리베이라오 프레토 의과 대학 (17578/2015)의 클리닉 병원에서 윤리위원회의 승인을 받았으며 환자 (또는 법적 책임자)는 정보에 입각한 동의 조건에 동의하고 서명했습니다. 조직의 수집은 간질 외과 센터에서 신경 외과 팀에 의해 수행되었다 (CIREP - 리베라오 프레토 의과 대학에서 클리닉 병원, 상파울루 대학, 브라질).
1. 재료의 살균
참고: 모든 재료와 용액은 사용하기 전에 멸균해야 합니다.
- 모든 수술 도구와 진동 슬라이스 재료 (나이프 홀더, 시편 디스크, 버퍼 트레이)를 180 °C에서 4 시간 동안 건식 살균 오븐에서 살균하십시오.
- UV 또는 감마 조사에 의해 온도에 민감한 물질 또는 장비를 살균하십시오.
- 0.22 μm 기공 멤브레인을 통해 오토클레이브 또는 여과하여 매개체 및 용액을 살균합니다.
2. 솔루션 준비
- 수송 용액의 15-20 mL 준비: 50% v/v Hanks의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS) pH 7.4, 50% v/v 기저 배지 산후 및 성인 뇌 뉴런 유지 보수(재료 표),10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1- 피페라진에탄설포닉산(헤페스), 3 mg/mL 포도당, 33 μg/mL 겐타미신.
참고: 운송 용액은 시료 채취 최소 20분 전에 냉장 및 산소(카보겐 가스로 버블링)해야 합니다. - 300 mL의 슬라이스 용액 (HBSS는 10 mM HEPES 및 3 mg / mL 포도당으로 보충)을 준비하고 초기 결정 형성 지점까지 냉동고에서 식힙니다.
- 배양 배지 20 mL 준비: 산후 및 성인 뇌 뉴런 유지를 위한 기초배지(재료표)1% L-글루타민 유도체(재료표),신경 배양용 2% 보충제(표 재료),1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B.
3. 슬라이스 장치 설정
참고 : 이 프로토콜은 수술실에서 샘플 수집의 물류로 인해 동료의 도움으로 이상적으로 수행됩니다.
- 소금 첨가 얼음 양동이에, 슬라이스 용액을 사용 하기 전에 적어도 20 분 동안 carbogen 혼합물 버블링 (95% O2,5% CO2)에서휴식 하자.
- 아가로즈 3% 블록을 준비하고(약 2 cm x 2 cm x 2 cm) 및 진동기 시편 디스크에 슈퍼접착제를 사용하여 슬라이스 시중 시료에 추가적인 기계적 지지체를 생성한다(도1E).
- 슬라이스를 위한 진동 설정: 단면 두께 200 μm, 진동 주파수 100Hz, 슬라이스 속도 0.5-1.0 mm/s.
- 진동 완충트레이를 진동 기저에 고정하고 얼음을 추가하여 슬라이싱 용액과 시료를 받기 전에 냉장 보관하고 슬라이싱 절차 전반에 걸쳐 보관합니다.
4. 샘플 수집
참고 :이 프로토콜에서, 인간의 신피질 조직은 수술실에서 수집되어 실험실로 이송되었습니다.
주의: 인간 샘플을 다룰 때, 기관이 수립한 적절한 안전 프로토콜을 따르십시오.
- 가스 출력을 수송에 연결하는 실리콘 튜브에 연결된 가스 출력을 제어하는 압력/플럭스 밸브에 연결된 카보겐 혼합물이 있는 휴대용 가스 실린더로 구성된 운송장치(그림 1C)를설정합니다. 용기; 수송 용기, 일반적으로 수송 용액을 포함하는 가스 입력을 위한 천공 된 뚜껑을 가진 50 mL 원점 원심 분리기 튜브; 및 운송 중 시료 냉각을 위한 얼음.
- 시편을 수집하고운반합니다(그림 1B)를즉시 실험실로 이송합니다. 차가운 수송 용액에 표본을 잠수하십시오 (지속적으로 카보겐 혼합물로 거품을 낸다).
5. 슬라이스
- 시편을 슬라이스 용액을 함유한 페트리 접시(100 mm x 20 mm)로 옮기고, 미세한 수술 도구로 시료에 남아있는 수막의 가능한 한 많이 조심스럽게 제거한다(그림1D).
- 실험 설계의 특정 특성을 가진 슬라이스를 생산하기위한 최적의 시편 방향을 선택하고, No. 24 메스 블레이드와 함께, 편평한 표면을 다듬어 시편 디스크에 접착된 베이스가 될 수 있습니다.
- 일회용 플라스틱 숟가락과 섬세한 페인트 브러시를 사용하여 페트리 접시에서 조각을 수집하고 필터 용지를 사용하여 여분의 용액을 건조하십시오 (모세 혈관에 의해 건조되고 종이로 조직 조각을 만지지 마십시오).
- 수퍼글루를 사용하여, 디스크에 단단히 부착되고 아가로즈 블록과 접촉할 때까지 조직을 진동 시편 디스크에 부착한다(그림1E).
- 전체 공정 중에 버블링해야 하는 슬라이싱 용액으로 채워진 진동 버퍼 트레이에 진동 시편 디스크(조직이 제대로 부착된)를 놓습니다.
- 면도날을 단단히 고정하여 칼 홀더를 제자리에 고정시고 고정합니다.
- 슬라이싱 용액은 시편과 블레이드를 모두 덮어야 하며, 슬라이스를 시작한다음(그림 1F)에서만슬라이스를 시작해야 합니다.
- 시편을 200 μm 슬라이스로 자른다.
참고: 일부 진동체는 시편을 자동으로 잘라내지만, 공정 중 슬라이싱 속도를 면밀히 관찰하고 약간의 조정을 하면 더 나은 슬라이스를 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 초기 불규칙한 슬라이스를 버립니다. - 버퍼 트레이에서 슬라이스를 슬라이스 용액으로 페트리 접시로 옮기고 느슨한 가장자리와 여분의 흰색 매더를 약 70 % 피질 / 30 % 백색 물질의 비율로 다듬습니다.
6. 문화
참고: 멸균 환경에서 층류 캐비닛에서 이 단계를 수행합니다.
- 웰당 배양 배지 600 μL(24웰 플레이트)을 첨가하고 슬라이스를 도금하기 전에 36°C 및 5%CO2에서 적어도 20분 동안 배양한다.
- 페인트 브러시를 사용하여 잘 당 하나의 슬라이스 를 접시(그림1G).
- 플레이트에 사용하지 않은 우물이 있으면 400 μL의 멸균수로 채우십시오.
- 플레이트를 36 °C, 5 %CO2에서배양합니다.
참고 : 슬라이스의 크기에 따라 도금 후 8-16 시간 사이에 첫 번째 중간 교체가 이루어져야합니다. - 보충 10 이전에 준비 된 배양 매체의 mL 50 ng/mL 뇌 파생 신경 영양 인자 (BDNF).
참고 : 처음 8-16 시간 동안, 슬라이스는 이 단계에서 중간 소비가 가속화되기 때문에 영양 부족과 산성화를 피하기 위해 600 μL의 배지로 배양됩니다. 다음 단계에서, 웰당 배지의 부피는 400 μL로 조정된다. - 각 우물에서 컨디셔닝된 배지의 333 μL을 제거하고 신선한 BDNF 보충 배지 133 μL을 첨가합니다.
- 24시간마다 컨디셔닝된 배지의 1/3을 신선한 BDNF 보충 매체로 교체하여 중간 교체 과정을 반복합니다.
7. 배양된 슬라이스의 건강, 형태 및 기능 평가
참고: 대표적인 결과에 예시된 목적으로 세포 사멸을 유도하기 위해, 일부 슬라이스는 산화 스트레스 유도제H2 O2를사용하여 24시간 치료에 제출되었다. 단계 7.1.2 및 7.1.3은 세포 사멸을 유도하기 위해H2O2의 사용을 설명한다.
- 세포 생존력
참고 : 도전 슬라이스 배양에서 신경 독성 / 신경 보호를 평가하는 간단하고 간단한 방법은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테틀라졸륨 (MTT) 분석법36,대사 활성 세포의 비율을 측정합니다. 처리된 샘플과 비교하여 정상 조건에서.- 층상 흐름 캐비닛에서 매질의 3 분의 1을 신선한 매체로 교체하십시오.
- 30% H2O2 스톡 솔루션에서 웰당H2O2의 부피를 추가하여 의도한 최종 농도(30 mM 또는 300 mM)에 도달합니다.
참고:H2O2는 도전 하기 전에 신선한 영양소의 적절 한 공급을 보장 하기 위해 매체의 일일 변경 후 추가 되었습니다. - 36 °C, 5 %CO2에서24 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
참고:H2O2 처리(또는 관심 있는 다른 독성 자극) 후, 다음 단계는 MTT 분석에 의한 세포 생존성 측정을 기술한다. - 40 μL의 MTT 용액을 플레이트의 각 우물에 0.5 mg/mL의 최종 농도에 추가합니다.
- 플레이트를 36°C, 5%CO2에서 3시간 동안 배양합니다.
- 인산염 완충 식염수 (PBS)로 슬라이스를 씻고 마이크로 튜브로 옮니다.
- 파이펫팅을 하여 남은 용액을 조심스럽게 제거하십시오.
- 각 슬라이스의 질량을 결정하기 위해 슬라이스를 포함하는 마이크로 튜브의 무게를 측정합니다 (이것은 얻은 흡광도 판독값을 정규화하는 열쇠입니다).
참고: 필요한 경우, 시료를 나중에 처리하기 위해 이 단계에서 냉동(-20°C)할 수 있습니다. - 전동 유봉을 사용하여 이소프로판올/HCl 200 μL의 슬라이스를 균질화합니다.
- 2600 x g에서2 분 동안 실온 (RT)에서 원심 분리기.
- 상한체를 수집하고 540 nm에서 흡광도를 측정합니다.
- KCl 유도 신경 탈분극
참고: 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK)의 인산화는 캐스케이드 단백질 ERK를 시그널링하고, 이어서 서쪽 블로팅, KCl 유도 탈분극에 대한 뉴런 반응의 정량화에 사용될 수있다 37.- 유량 캐비닛에서 배양 배지를 이전에 36°C로 평형화한 HBSS의 300 μL로 교체하십시오.
- HBSS를 이전에 36°C로 평형화한 300 μL의 신선한 HBSS로 교체하십시오.
- 플레이트를 36°C, 5%CO2에서 15분 동안 배양합니다.
- HBSS를 신선한 HBSS 또는 80 mM KCl 탈분극 용액(36°C)으로 교체하고 36°C, 5%CO2에서 15분 동안 배양합니다.
- 접시에서 마이크로튜브로 슬라이스를 옮김을 옮김. 이 단계에서, 슬라이스는 나중에 처리를 위해 -20°C에서 저장될 수 있다.
- 150 μL의 방사성 면역 침전 분석 분석 (RIPA) 완충액에서 조직 추출물을 준비하십시오 (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% 요노닉 계면 활성제; 0.1% 나트륨 도데실 황산염; pH 7.5). 원심분리기 추출물은 4°C에서 16000 x g에서10분 동안, 상급체를 수집하고, 브래드포드 방법을 사용하여 총 단백질 농도를 결정한다.
- 총 단백질 30 μg를 12% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동(SDS-PAGE)에 로드합니다.
- 전기 동동 후, 겔 함량을 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 옮김.
- TBS플러스 0.1% 트웬에 5% 무지방 건조 우유로 막을 차단한 후, 4°C에서 16시간 동안 마우스 안티-pERK(1:1,000)로 배양하였다. 세척 후, 토끼 안티 ERK1/2 (1:1,000)로 RT에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- 1 시간 동안 RT에서 적절한 HRP-컨쥬게이트 이차 항체와 배양.
- 바람직한 HRP 기판으로 공개한다.
- 형태학적 평가
참고 : 세포 생존 및 기능 적 평가 외에도 조직 형태를 분석하는 것이 중요합니다. 배양된 슬라이스를 절제하는 것은 형태학적 분석을 위해 가능한 한 많은 고품질 의 재료를 생산하는 중요한 단계라는 점에 유의하십시오.- 슬라이스 고정, 냉동 보호 및 절제
- 배양 배지가 있는 우물에서 PBS를 포함하는 새로운 24개의 웰 플레이트로 슬라이스를 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김.
- PBS를 제거하고 4% 파라포름알데히드(PFA)의 1 mL을 추가합니다. PFA를 추가하기 전에 슬라이스를 평평하게 유지하는 것이 중요합니다. 4 °C에서 밤새 배양.
- 조심스럽게 PFA 용액을 제거하고 30 % 자당 용액 1 mL을 추가하십시오. 4 °C에서 48 시간 동안 배양하십시오.
- 동결 마이크로토메를 -40°C로 설정합니다.
- 슬라이스를 배치해야 하는 마이크로토메 스테이지에 자당 베이스를 준비합니다(그림2A). 그것은 완전히 동결하고 조심스럽게 슬라이스가 배치 될 평평한 표면을 생산하기 위해 냉동 자당의 일부를 잘라 보자.
- 각 슬라이스를 늘어난 플라스틱 필름 위에 놓고 페인트 브러시를 사용하여 티슈를 평평하게 합니다.
- 단 한 번의 이동으로 늘어난 슬라이스를 얼어붙은 자당 베이스로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김.
참고: 동결된 자당 베이스 위에 있으면 슬라이스를 이동할 수 없습니다. 이 전송 단계를 신중하게 수행합니다. - 슬라이스를 5-10 분 동안 놓아 두십시오.
- 슬라이스를 30 μm 섹션으로 자른다.
- 30 μm 섹션을 PBS가 들어 있는 페트리 접시로 옮니다.
- 실험 설계에 더 적합한 신체 학 프로토콜로 진행하십시오.
참고 : 30 μm 섹션은 자유 부동 면역 조직 화학에 쉽게 사용할 수 있으며, 추가 조직학을 위해 현미경 슬라이드에 장착되거나 -20 °C의 부동액에 보관 할 수 있습니다.
- 면역화학
참고: 면역성 화학 및 면역 형광 표준 프로토콜은 실험실마다 다릅니다. 여기에 사용되는 프로토콜의 자세한 버전은 Horta 등38을참조하십시오. 그림 2에 제시된 면역 염색에 사용되는 1차 항체에는 신경핵(NeuN), 건강한 성숙한 뉴런 마커, 신경교 섬유성 단백질(GFAP), 시세포 마커, 이온화된 칼슘 결합 어댑터(Iba-1), 및 마이크로글리아가 포함됩니다. 마커.- 슬라이스를 블로킹 용액(예를 들어, PBS에서 2% 정상 당나귀 혈청)에서 40분 동안 배양합니다.
- 4 °C에서 온화한 교반의 밑에 1 차적인 항체로 밤새 배양하십시오.
- PBS로 세척한 후, RT에서 경증 교반하에 생체이식 이차 항체로 120분 동안 배양하였다.
- PBS로 세척한 후, 아비딘-퍼옥시다아제 컨쥬게이트(재료표)로RT에서 120분 동안 배양합니다.
- DAB + 0.04% 니켈 암모늄으로 공개하십시오.
- 젤라틴 코팅 된 현미경 슬라이드에 스테인드 섹션을 장착하고 공기 건조시키십시오. 에탄올로 탈수하고, 자일렌으로 디아판화하고, 마운팅매체(재료 표)로마무리하고, 커버슬립과 화상으로 덮습니다.
- 슬라이스 고정, 냉동 보호 및 절제
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Representative Results
배양된 슬라이스의 품질 및 건강을 평가하는 중요한 양상은 예상되는 신경 세포 유형, 뉴런 및 신경교 세포의 존재 및 전형적인 형태이다. 인간 피질 적층의 전형적인 구조는 DIV4에서 슬라이스에서 관찰되었고, 뉴런 면역 표지에 의해밝혀졌다(도 2D). 또한, 마이크로글리아 및 아스트로글리아의 예상존재(도 2B,C)도관찰되었다. 이러한 결과는 조직 구조가 외과 적 절차 / 샘플 처리 또는 시험관 내 단기 기간에 의해 크게 영향을받지 않는다는 것을 보여줍니다. 이전 연구 결과에 따르면, NeuN 면역 반응성은 DIV0 및 DIV432사이에서 변경되지 않은 것으로 나타났다. 이러한 결과에 기초하여, 슬라이스의 감소된 두께에 연관된 자유 부동 배양 형식(멤브레인 삽입이 사용될 때 널리 사용되는 300-400 μm에 비해), 내부 세포 층에 산소와 영양소의 더 나은 확산에 기여 이전에 배양 된 슬라이스39,40의건강에 중요한 것으로 입증 된 슬라이스에서.
슬라이스에서 세포 사멸의 정량화는 또한 슬라이스 배양과 같은 신경병증의 생체 내 모델에서 귀중한 접근법이다(Lossi et al.41). 이전 연구에서는, 우리는 배양32의기간을 따라 세포 사멸 수준을 결정하기 위하여 MTT 분석기를 이용했습니다. 생존력 이외에, 동일한 연구는 또한 배양된 슬라이스(최대 DIV4)가 KCl 유도 탈분극 시 신경 전달 물질을 방출하는 능력을 보존하는 것으로나타났다(32). 여기서, 이러한 발견은 ERK 인산화에 대한 KCl 유도 탈분극에 대한 신경 반응을 조사함으로써, 시냅스 가소성 및기억(42,43)과같은 과정에 관여하는 중앙 키나아제에 의해 확대되었다. 흥미롭게도, ERK 인산화의 명백한 증가는 DIV4에서 KCl 처리 된 슬라이스에서 보였다(그림 3A,B).
마지막으로, 독성 챌린지에 대한 DIV4에서의 슬라이스의 반응을 공지된 산화 스트레스 유도제,H2O2로평가하였다. 근거는 세포 사멸의 정도가 배양된 조각에 있는 세포 생존의 수준에 비례해야 한다는 것이었습니다. 도 3C에도시된 바와 같이, 24시간 동안 300 mMH2O2에 슬라이스를 노출하면 MTT 감소의 강력한 감소를 이끌어냈다. 종합하면,H2O2 챌린지 및 KCl 유도 탈분극 결과 후 DIV5에서 관찰된 대규모 세포 사멸은 DIV4에서 슬라이스의 보존된 일반적인 건강이 산화와 같은 독성 자극에 적절하게 반응한다는 것을 나타냅니다. 스트레스.
그림 1: 성인 인간으로부터 피질 조직의 샘플 수집, 운반, 슬라이스 및 배양. 절차는 약리성 간질(A,B)의처리를 위한 측두엽 절제술에서 피질 조직의 집합을 가진 외과 방에서 시작됩니다. (C)조직 단편(n=1)은 즉시 얼음-차가운 산소수송매체를 함유하는 튜브로 이송된다(아래 참조). (D)실험실에서 수막은 미세한 안과 핀셋을 사용하여 제거됩니다. 여분의 액체는 여과지를 사용하여 건조되고, 파편은 백색 물질이 아래를 향하고 피알 표면이 위를 향하도록 진동 시편 디스크에 과착(E)된다. (F)상업용 면도기를 사용하여 시편을 200 μm 슬라이스로 자르고 섬세한 페인트 브러시로 채취한 후 페트리 접시로 다시 옮겨져 여분의 백색 물질과 느슨한 끝을 추가로 트리밍 (도시되지 않음) 전에(G) 도금 및 자유롭게 부동 형식으로 배양. (H)슬라이스 배양은 며칠 동안 실행 가능한 유지되며 다양한 실험 프로토콜에서 사용될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 성인 인간의 뇌에서 슬라이스 배양에서 신경 세포의 형태 학적 분석. 슬라이스는 시험관 내에서 4일째에 고정되었다. (A, B, C) 면역성 화학 전에 단면화 절차의 대표적인 단계. 조직은 시각화를 개선하기 위해 디지털 색을 입혔다. (D)피질 층 (로마 숫자)에서 뉴런의 정상 분포. (e)미세글리아 및(F)성상세포도 명확하게 관찰하였다(n=세포형 라벨링당 슬라이스 1개). 모든 슬라이스는 단일 공여자로부터 조직으로부터 수득되었다. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성인 인간의 뇌 슬라이스 배양에서 기능및 세포 생존성 검문. 신경 활성은 KCl-유도 된 탈분극 및 ERK 인산화의 결과적 증가에 의해 시험관 내 5 (DIV5)에서 일 슬라이스에서 평가되었다. (a)한 조각에서 균질화로 얻은 대표적인 면역블롯 결과. 포스포 ERK(특권) 및 총 ERK(tERK)에 해당하는 대역이 표시됩니다. (B)단일 인간 기증자로부터 3개의 독립적인 슬라이스에서 pERK/tERK 비율을 정량화하였다. (C)과산화수소(H2O2)는DIV 5에서 슬라이스에서 MTT 분석에 의해 독성을 평가하였다. 얻어진 광학 밀도 값은 각 슬라이스의 질량에 의해 정규화되었다. 슬라이스는 표시된 농도에서H2O2로 도전하였다(No H2O 2;30 mM H2 O 2;300 mM H 2O2)24시간 동안 MTT로 배양 후 대표적인 슬라이스의 이미지 막대 위에 표시됩니다. 결과는 단일 공여자로부터 3개의 독립적인 조각으로부터 얻은 데이터로부터 평균 ± 표준 오차로 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
자유 부동, 단기 슬라이스 배양을 생산하기위한이 프로토콜은 성인 인간 신피질 조각을 배양하기위한 대체 방법입니다. 슬라이스 배양에 대한 이러한 프로토콜은 광유전학1,44,45,전기 생리학2,3,4,5에 대한 연구에 적합할 수 있습니다. , 단기 가소성46,47,장기 가소성48,49,신경 독성 / 신경 보호10,11,12, 13,세포 치료14,약물 스크리닝15,16,17,암50,51,유전학 및 유전자 편집12,18 ,19,20.
성인 인간 조직으로부터의 샘플의 사용은 설치류 신경조직(52)으로부터생성된 슬라이스에서 부족한 인간의 뇌의 전형적인 독특한 특성으로 인해 인간의 신경병증을 이해하는 데 특히 중요하다. 더욱이, 설치류 뇌에서 슬라이스 배양은 일반적으로 고도로 플라스틱이고 시험관 내 환경에 적응하기 위해 원래슬라이스 시토아키텍처를 변경할 수 있는 이동 세포를 포함하는 신생아, 미성숙한 뇌로부터 제조된다26, 53,54,55. 이러한 플라스틱 이벤트는 팅 등30에의해 명시된 대로 생체 내 상태를 모방하는 것이 목표일 때 피해야 할 회로의 변화로 이어진다: "우리는 구조적 및 기능적 특성이 합리적으로 1주일 미만의 배양에 집중하기로 결정했습니다. 최소한의 섭동으로 유지, 금 표준 급성 슬라이스 준비를 사용하여 얻은 측정에 가능한 한 비교할 수 있도록". 따라서, 단기 배양에 전념하는 방법은 처음에는 제한적으로 보일 수 있지만, 장기 배양은 많은 실험설계32,33,34에서 관련 결과를 생성할 필요가 없다. ,35,56,57.
프로토콜의 두 가지 중요한 단계는 슬라이스의 감소된 두께(200 μm) 및 BDNF를 가진 배양 배지의 보충이다. 이전 작품32에서,우리는 4 DIV까지 세포 생존의 보존을 보여주고 더 자주 사용되는 300-400 μm 슬라이스12,29에비해 200 μm에 슬라이스 두께의 감소의 가능성이 기여도를 논의했다. 기본적으로, 슬라이스 두께를 줄이는 것은 더 나은 산소화에 기여할 수 있고, 자유 부동 슬라이스에 영양분 섭취, 핵심 저산소증 및 신경 변성의 가능성을 감소31,32,57, 58,59,60,61. 또한, 성인 중추 신경에 의한O2에 대한 높은 수요를 고려하여 수술실에서 진동 단계에서 슬라이스 단계까지 조직을 차갑고 산소화된 매체에 보관하는 것이 좋습니다. BNDF와 매체의 보충은 이전에 약간 다른 저자에 의해 신경 영양 요인과 중간 보충에 대한 권장 사항에 따라, 자유롭게 부동32배양 성인 인간의 뇌 조각에서 생존력을 증가 볼 수있다 62,63.
결론적으로,이 프로토콜은 성인 인간의 뇌에서 단기, 자유 부동 슬라이스 문화와 분석을 준비하고 실행하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 노화와 관련된 뇌 질환과 관련된 독성 /신경 보호 메커니즘에 대한 조사를 위해 의무가 있어야합니다. 인간 절제 된 조직의 사용은 뇌 세포 아키텍처 및 국소 회로를 보존하는 이점을 제시하며 얻은 연구 결과에 번역 력을 추가합니다. 더욱이, 신경과학에 있는 신경외과에서 인간 유래 견본의 사용을 파열하는 것은 동물 실험에 대한 필요성을 감소시키는 것을 도울 수 있습니다. 이 프로토콜은 약전성 간질 치료를 위해 신경 외과에 제출 된 환자에서 수집 된 조직의 사용을 중심으로하지만, 다른 뇌 영역 / 조건에서 수집 된 조직은 또한 소스로 간주될 것을 제안합니다. 간단하고 비용 효율적인 방법으로 슬라이스 배양을 생산합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 FAPESP에 의해 지원된다 (그랜트 25681-3/2017 에 AS), CAPES (박사 후 펠로우십 PNPD / INCT-HSM A.F.와 N.D.M.에 박사 전 펠로우십) 및 FAEPA. G.M.A.는 FAPESP (MS 2018/06614-4)에서 석사 펠로우십을 보유하고 있습니다. N.G.C.는 CNPq 연구 펠로우십을 보유하고 있습니다. 우리는 이 연구 결과에 대한 절제된 조직을 기증해 준 환자와 그들의 가족에게 감사드립니다. 우리는 리베이라오 프레토 의과 대학, 상파울루 대학의 임상 병원에서 주민, 간호사, 기술자 및 CIREP 팀의 지원을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Merck | 1096341000 | |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution | Sigma Aldrich | A3449 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| Antibody anti-ERK 2 (rabbit) | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
| Antibody anti-pERK (mouse) | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Bradford 1x Dye Reagent | BioRad | 500-0205 | |
| EDTA | Sigma | T3924 | Used in RIPA buffer |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Hank's Balanced Salts | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Vetec | 194 | |
| Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) | GE | NA931-1ML | |
| NaCl | Merck | 1064041000 | Used in RIPA buffer |
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| Non-fat dry milk (Molico) | Nestlé | Used for membrane blocking | |
| PBS Buffer pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
| Penicilin/Streptomicin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Potassium Chloride | Merck | 1049361000 | |
| Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
| SDS | Sigma | L5750 | Used in RIPA buffer |
| TEMED | GE | 17-1312-01 | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
| Tris | Sigma | T-1378 | Used in RIPA buffer |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | Used in RIPA buffer |
| Ultrapure Water | Millipore | Sterile water, derived from MiliQ water purification system | |
| Equipment and Material | |||
| 24-well plates | Corning | CL S3526 | Flat Bottom with Lid |
| Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane) | GE | 29047575 | |
| Carbogen Mixture | White Martins | 95% O2, 5% CO2 | |
| CO2 incubator | New Brunswick Scientific | CO-24 | Incubation of slices 5% CO2, 36ºC |
| Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| Microtubes | Greiner | 001608 | 1,5mL microtube |
| Motorized pestle | Kimble Chase | ||
| Plastic spoon | Size of a dessert spoon | ||
| Razor Blade | Bic | Chrome Platinum, used in slicing with vibratome | |
| Scalpel Blade | Becton Dickinson (BD) | Number 24 | Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller |
| Superglue (Loctite Super Bonder) | Henkel | Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer | |
| Vibratome | Leica | 14047235612 - VT1000S | |
| Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry | |||
| Antibody anti-NeuN (mouse) | Millipore | MAB377 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
| Antibody anti-GFAP (mouse) | Merck | MAB360 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
| Antibody anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | EPR16588 - ab178846 | Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer |
| Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) | Vector | BA-9200 | |
| DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
| Entellan | Merck | 107960 | |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
| Gelatin | Synth | 00G1002.02.AE | Used for coating slides |
| Microtome | Leica | SM2010R | Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
| Slides (Star Frost) | Knittel Glaser | Gelatin coated slides | |
| Sucrose | Vetec | 60REAVET017050 | |
| Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vector | PK-4000, Kit Standard | |
| Xylene | Synth | 01X1001.01.BJ |
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