Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kortsiktige fritt flytende Slice kulturer fra Adult Human Brain

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/59845
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 4, 4, 5, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Summary

En protokoll for å forberede fritt flytende skive kulturer fra voksen menneskelige hjerne er presentert. Protokollen er en variant av den mye brukte Slice kultur metoden ved hjelp av membran inserts. Det er enkelt, kostnadseffektivt, og anbefales for å kjøre kortsiktige analyser som tar sikte på å løse mekanismer for neurodegeneration bak alder-tilknyttede hjernesykdommer.

Abstract

Organotypic, eller Slice kulturer, har vært mye brukt til å modellere aspekter av sentralnervesystemet fungerer in vitro. Til tross for potensialet i skive kulturer i nevrovitenskap, studier ved hjelp av voksen nervøs vev for å forberede slike kulturer er fortsatt knappe, spesielt de fra menneskelige. Bruk av voksen menneskelig vev for å forberede Slice kulturer er spesielt attraktivt å forsterke forståelsen av menneskelig neuropathologies, som de holder unike egenskaper typisk for den modne menneskelige hjerne mangler i skiver produsert fra gnager (vanligvis nyfødt) nervøs vev. Denne protokollen beskriver hvordan du bruker hjernevevet samlet inn fra levende menneskelige donorer sendt til resective hjernen kirurgi for å forberede kortsiktige, fritt flytende skive kulturer. Prosedyrer for å opprettholde og utføre biokjemiske og cellebiologi analyser ved hjelp av disse kulturene er også presentert. Representative resultater viser at den typiske menneskelige kortikale laminering er bevart i skiver etter 4 dager in vitro (DIV4), med forventet tilstedeværelse av de viktigste nevrale celletyper. Videre skiver på DIV4 gjennomgår robust celle død når utfordret med en giftig stimulans (H2O2), noe som indikerer potensialet i denne modellen til å tjene som en plattform i celle død analyser. Denne metoden, et enklere og kostnadseffektivt alternativ til den mye brukte protokollen ved hjelp av membran innsatser, er hovedsakelig anbefalt for å kjøre kortsiktige analyser som tar sikte på å løse mekanismer for neurodegeneration bak alder-tilknyttede hjernesykdommer. Til slutt, selv om protokollen er viet til å bruke kortikale vev samlet inn fra pasienter som sendes til kirurgisk behandling av pharmacoresistant Temporal flik epilepsi, hevdes det at vev samlet inn fra andre hjerneregioner/forhold bør også være betraktes som kilder til å produsere lignende fritt flytende skive kulturer.

Introduction

Bruken av menneskelige prøver i forskning er utvetydig en flott mulighet til å studere menneskelige hjerne patologi, og moderne teknikker har åpnet nye måter for robust og etisk eksperimentering med pasient-avledet vev. Metoder som organotypic/Slice kulturer tilberedt fra voksne menneskelige hjerne har blitt stadig mer brukt i paradigmer som optogenetics1, elektrofysiologi2,3,4,5, plastisitet 6,7,8,9, nevrotoksisitet/neuroprotection10,11,12,13, Cell Therapy14, Drug screening15,16,17, genetikk og genredigering12,18,19,20, blant andre, som en strategi for bedre forstå nevrologiske sykdommer i voksen alder.

Forståelsen av mekanismer underliggende menneskelige hjerne patologi avhenger eksperimentelle strategier som krever et stort antall. Omvendt, i tilfelle av Slice kulturer, selv om tilgang til menneskelige prøver er fortsatt vanskelig, muligheten for å generere opptil 50 skiver fra en enkelt kortikale prøve delvis omgår kravet om å rekruttere flere frivillige ved å øke antall replikerer og utførte analyser per innsamlet vev21.

Flere protokoller for Brain organotypic/Slice kulturer har blitt beskrevet, alt fra den klassiske oculo utkast22,23 til roller tube24,25,26, halvgjennomtrengelig membraner Interface27,28,29,30, og fritt flytende skiver31,32. Avhengig av særtrekk av en eksperimentell design, har hver teknikk sine egne fordeler og ulemper. Kortsiktige, fritt flytende skiver kulturer fra voksne menneskelige hjerner er i noen tilfeller fordelaktig over metoden som brukes av Stoppini et al.27, hvis vurderer det faktum at selv om langsiktig celle overlevelse in vitro er vanligvis et stort problem når du vurderer en kultur metode, i mange eksperimenter bare korte perioder i kulturen er nødvendig12,31,32,33,34,35. Under disse forholdene, presenterer bruk av frittflytende kulturer fordelen av å være enklere og mer kostnadseffektivt, samt mer nøyaktig likner den opprinnelige menneskelige vev tilstand enn skiver holdt i kultur over 2-3 uker.

Til tross for potensialet i Slice kulturer til nevrovitenskap, studier ved hjelp av voksen nervøs vev for å forberede slike kulturer er fortsatt knappe, spesielt fra menneskelige. Denne artikkelen beskriver en protokoll for å bruke samlet hjernevev fra levende menneskelige donorer sendt til resective hjernen kirurgi for å forberede fritt flytende skive kulturer. Prosedyrer for å opprettholde og utføre biokjemiske og cellebiologi analyser ved hjelp av disse kulturene er detaljert. Denne protokollen har vist seg verdifullt for å analysere levedyktighet og neuronal funksjon i undersøkelser på mekanismer av neuropathologies knyttet til voksenlivet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Live voksen hjernevev ble innhentet fra pasienter som gjennomgår resective nevrokirurgi for behandling av pharmacoresistant Temporal flik epilepsi (figur 1A). Alle prosedyrer ble godkjent av etikk komiteen fra klinikker Hospital ved Ribeirão Preto Medical School (17578/2015), og pasienter (eller deres juridiske ansvarlig person) avtalt og signerte informerte samtykke vilkår. Innsamling av vevet ble gjort av nevrokirurgi teamet ved epilepsi Surgery Center (CIREP-klinikker Hospital ved Ribeirão Preto Medical School, Universitetet i São Paulo, Brasil).

1. sterilisering av materialer

Merk: alt materiale og alle løsninger må steriliseres før bruk.

  1. Sterilisere alle kirurgiske verktøy og vibratome skjære materiale (knivholderen, prøve disk, buffer brett) i en tørr sterilisering ovn for 4 timer ved 180 ° c.
  2. Sterilisere temperatur sensitivt materiale eller utstyr ved UV-eller gamma bestråling.
  3. Sterilisere Media og løsninger ved autoclavation eller filtrering gjennom 0,22 μm pore membraner.

2. utarbeidelse av løsninger

  1. Forbered 15-20 mL transportløsning: 50% v/v Hanks ' balansert saltløsning (HBSS) pH 7,4, 50% v/v basal medium for vedlikehold av post-Natal og voksen hjerne neurons (tabell av materialer), supplert med 10 mm 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic yre (Hepes), 3 mg/mL glukose og 33 mikrogram/mL Gentamicin.
    Merk: transport løsningen må oppbevares i kjøleskap og oksygen (bobler med carbogen gass) i minst 20 minutter før prøvetaking.
  2. Forbered 300 mL av kutting løsning (HBSS supplert med 10 mM HEPES og 3 mg/mL glukose) og kjøle det ned i en fryser til det punktet av første krystall formasjon.
  3. Forbered 20 mL av kultur medium: basal medium for vedlikehold av post-Natal og voksen hjerne neurons (tabell av materialer) supplert med 1% L-glutamin derivat (tabell av materialer), 2% supplement for neural kultur (tabell over Materialer), 1% penicillin/Streptomycin og 0,25 μg/ml amfotericin B.

3. sette opp skjære apparatet

Merk: denne protokollen er ideelt utført med hjelp av en kollega på grunn av logistikk av prøven samling i kirurgisk rom.

  1. I en bøtte med salt-lagt isen, la kutting løsningen hvile under carbogen blanding boblende (95% O2,5% co2) i minst 20 min før bruk.
  2. Forbered en blokk med 3% agarose (ca 2 cm x 2 cm x 2 cm) og superlim den til vibratome prøve disken for å skape ekstra mekanisk støtte til vevsprøven under kutting (figur 1E).
  3. Angi vibratome for kutting: snitt tykkelse på 200 μm, hyppigheten av vibrasjon av 100 Hz, og hastigheten på kutting mellom 0,5-1,0 mm/s.
  4. Lås vibratome buffer skuff til vibratome base og tilsett is for å holde den nedkjølt før du mottar kutting løsningen og prøven, og gjennom hele kutting prosedyren.

4. samling av eksempler

Merk: i denne protokollen ble humant neocortical vev samlet i operasjonsstuen og transportert til laboratoriet.

FORSIKTIG: Når du arbeider med menneskelige prøver, følger du de riktige sikkerhetsprotokollene som er fastsatt av institusjonen.

  1. Sett opp transport apparatet (figur 1C) som består av: en bærbar gass sylinder med carbogen blanding koblet til en trykk/Flux ventil som styrer gassen utgang koblet til en silisium slange som forbinder gass utgang til transport fartøyets et transportfartøy, vanligvis et 50 mL konisk sentrifugerør med perforert lokk for gass inngang, som inneholder transportløsningen; og is for prøvekjøling under transport.
  2. Samle og transporter prøven (figur 1B) umiddelbart til laboratoriet. Submerse prøven i kald transportløsning (konstant boblet med carbogen blanding).

5. kutting

  1. Overfør prøven til en Petri parabol (100 mm x 20 mm) som inneholder kutting løsning og, med fine kirurgiske verktøy, forsiktig fjerne så mye som mulig av de resterende hjernehinnene i prøven (figur 1D).
  2. Velg den beste prøve retningen for å produsere skiver med de spesielle egenskapene til den eksperimentelle designen, og med et nei. 24 skalpell blad, trim en flat overflate for å være basen limt til prøven disken.
  3. Ved hjelp av en engangsplast skjeen og delikate malekoster, samle fragment fra Petri parabolen og tørr overflødig løsning med filter papir (tørr ved kapillaritet og unngå å berøre vevet fragment med papir).
  4. Bruk superlim til å feste vevet til den vibratome prøve disken til den sitter godt fast i disken og i kontakt med agarose blokken (figur 1E).
  5. Plasser vibratome prøve disk (med vevet riktig festet) i vibratome bufferbrettet fylt med kutting løsning som må bobler under hele prosessen.
  6. Lås knivholderen på plass med barberbladet godt fast.
  7. Skjære løsningen må dekke både prøven og bladet, og deretter starte kutting (figur 1F).
  8. Skjær prøven i 200 μm skiver.
    Merk: selv om noen vibratomes kutter prøvene automatisk, kan den nære observasjonen og mindre justeringer i Skjærehastigheten under prosessen bidra til å produsere bedre skiver. Forkast første uregelmessige skiver.
  9. Overfør skiver fra bufferbrettet til en Petri parabol med kutting løsning og trim løse kanter og overflødig hvit mater til en andel på rundt 70% cortex/30% hvit materie.

6. kultur

Merk: Utfør dette trinnet i et laminær strømnings kabinett under sterilt miljø.

  1. Tilsett 600 μL av kultur medium per brønn (i en 24 brønn plate) og ruge i minst 20 min ved 36 ° c og 5% CO2 før du plating skivene.
  2. Tallerken ett stykke per brønn ved hjelp av en pensel (figur 1G).
  3. Hvis det er noen ubrukte brønner i platen, fyll dem med 400 μL av sterilt vann.
  4. Ruge platen ved 36 ° c, 5% CO2.
    Merk: første medium erstatning må gjøres mellom 8-16 h etter plating avhengig av størrelsen på stykket.
  5. Supplement 10 mL av tidligere forberedt kultur medium med 50 ng/mL hjernen avledet nevrotropisk faktor (BDNF).
    Merk: i løpet av de første 8-16-h inkubert skiver i 600 μL av medium for å unngå næringsmangel og forsuring, siden middels forbruk i denne fasen er akselerert. Fra neste trinn justeres volumet av medium per brønn til 400 μL.
  6. Fjern 333 μL av det conditioned medium fra hver brønn og tilsett 133 μL av ferskt BDNF-supplert medium.
  7. Gjenta prosessen med medium utskifting hver 24 h ved å erstatte en tredjedel av betinget medium med friskt BDNF-supplert medium.

7. evaluering av helse, morfologi og funksjon i kulturperler

Merk: for å indusere celle død i den hensikt å illustrasjon i representative resultatene, ble noen skiver sendt til en 24 h behandling med oksidativt stress induser H2O2. Trinn 7.1.2 og 7.1.3 beskriver bruk av H2O2 for å indusere celle død.

  1. Celle levedyktighet
    Merk: en enkel, grei metode for å evaluere nevrotoksiske/neuroprotection i utfordret Slice kulturer er 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) analysen36, som måler prosentandelen av metabolske aktive celler under normale forhold sammenlignet med behandlede prøver.
    1. I laminær Flow kabinett, erstatte en tredjedel av mediet med friskt medium.
    2. Fra en 30% H2o2 -løsning, tilsett et volum på H2o2 per brønn for å nå den tiltenkte endelige konsentrasjonen (30 mm eller 300 mm).
      Merk: H2O2 ble lagt til etter den daglige endringen av mediet for å garantere riktig tilførsel av ferske næringsstoffer før utfordringen.
    3. Ruge platen i 24 timer ved 36 ° c, 5% CO2.
      Merk: etter H2O2 behandling (eller andre giftige stimulans av interesse), følgende trinn beskrive celle levedyktighet bestemmelse av MTT analysen.
    4. Tilsett 40 μL av MTT-løsning til en endelig konsentrasjon på 0,5 mg/mL til hver brønn i platen.
    5. Ruge platen ved 36 ° c, 5% CO2 for 3 t.
    6. Vask skiver med fosfat-bufret saltvann (PBS) og Overfør til en microtube.
    7. Fjern forsiktig eventuell gjenværende løsning ved pipettering.
    8. Veie mikrorør som inneholder skiver for å bestemme massen av hver skive (dette er nøkkelen for normalisering av absorbansen avlesninger oppnådd).
      Merk: om nødvendig kan prøvene fryses (-20 ° c) på dette stadiet for senere behandling.
    9. Homogenisere skiver i 200, μL av isopropanol/HCl ved hjelp av en motorisert morter.
    10. Sentrifuger ved romtemperatur (RT) i 2 minutter ved 2600 x g.
    11. Samle supernatanten og måle absorbansen ved 540 NM.
  2. KCl-indusert neuronal depolarization
    Merk: fosforylering av mitogen aktivert protein kinase (MAPK) signaliserer kaskade protein ERK, etterfulgt av vestlige blotting, kan brukes for kvantifisering av neuronal respons på KCl-indusert depolarization37 .
    1. Ved strømnings kabinettet, Erstatt kultur mediet med 300 μL av HBSS tidligere equilibrated til 36 ° c.
    2. Skift ut HBSS med 300 μL av fersk HBSS tidligere equilibrated til 36 ° c.
    3. Ruge platen ved 36 ° c, 5% CO2 for 15 min.
    4. Erstatt HBSS med enten den friske HBSS eller med 80 mM KCl depolariserende løsning (både ved 36 ° c) og ruge ved 36 ° c, 5% CO2 i 15 minutter.
    5. Overfør skivene fra platen til mikrorør. På dette trinnet kan skiver lagres ved-20 ° c for senere behandling.
    6. Klargjør vevs ekstrakter i 150 μL av radioimmunoprecipitation (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% ioniske overflateaktivt middel; 0,1% natrium natriumdodecylsulfat sulfat; pH 7,5). Sentrifuger ekstrakter ved 4 ° c i 10 min ved 16000 x g, samle inn supernatanten og Bestem total proteinkonsentrasjon ved hjelp av Bradford-metoden.
    7. Legg 30 mikrogram totalt protein på en 12% natrium natriumdodecylsulfat sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-side).
    8. Etter elektroforese, overføre gel innholdet til en nitrocellulose membran.
    9. Etter blokkering av membranen med 5% ikke-fett tørr melk i TBS pluss 0,1% mellom, ruge med musen anti-pERK (1:1000) for 16 t ved 4 ° c. Etter vask, ruge for 2 timer ved RT med kanin anti-ERK1/2 (1:1000).
    10. Ruge med riktig HRP-bøyd sekundær antistoff ved RT for 1 time.
    11. Avslør med det foretrukne HRP-underlaget.
  3. Morfologiske evaluering
    Merk: i tillegg til celle overlevelse og funksjonelle evalueringer, er det viktig å analysere vev morfologi. Vær oppmerksom på at resectioning den kultivert skive er et viktig skritt for å produsere så mye av høy kvalitet materiale som mulig for morfologiske analyse.
    1. Festing, cryoprotecting og resectioning av skiver
      1. Overfør skiver fra brønnene med kultur medium til en ny 24 brønn plate som inneholder PBS.
      2. Fjern PBS og tilsett 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA). Det er viktig at skiver oppbevares flatt før du legger til PFA. Ruge over natten ved 4 ° c.
      3. Forsiktig fjerne PFA løsningen og tilsett 1 mL 30% sukrose løsning. Ruge for 48 h ved 4 ° c.
      4. Sett fryse mikrotomen til-40 ° c.
      5. Forbered en sukrose base på mikrotomen der skivene skal plasseres (figur 2a). La det fryse helt og nøye kutte noen av de frosne sukrose å produsere en flat overflate som stykket vil bli plassert.
      6. Plasser hver skive over en strukket plastfilm og bruke en pensel til å flate vevet.
      7. Overfør strukket skive til frossen sukrose base i ett enkelt trekk.
        Merk: det er ikke mulig å flytte skive når den er over den frosne sukrose basen. Utfør dette overførings trinnet nøye.
      8. La stykket hvile i 5-10 min for riktig frysing.
      9. Skjær stykket inn i 30 μm seksjoner.
      10. Overfør de 30 μm seksjoner til en Petri parabolen inneholder PBS.
      11. Fortsett til histologi protokollen mer tilstrekkelig til eksperimentell design.
        Merk: de 30 μm-seksjonene kan lett brukes til fritt flytende immunhistokjemi, montert på mikroskopi lysbilder for videre histologi eller lagret i frostvæske ved-20 ° c.
    2. Immunhistokjemi
      Merk: immunhistokjemi og immunofluorescence standardprotokoller varierer mellom laboratorier. For en detaljert versjon av protokollen som brukes her, se Horta et al.38. Primære antistoffer som brukes for immunostainings presentert i figur 2 inkluderer neuronal kjerner (NeuN), friske modne Nevron markør, gliacellene fibrillary surt PROTEIN (GFAP), astorcytes markør, ionisert kalsium binding adapter (IBA-1), og mikroglia Markør.
      1. Ruge skiver i blokkerende løsning (f. eks, 2% normalt esel serum i PBS) for 40 min.
      2. Ruge over natten med primært antistoff under mild omrøring ved 4 ° c.
      3. Etter vask med PBS, ruge for 120 min med biotinylated sekundære antistoff under mild agitasjon ved RT.
      4. Etter vask med PBS, ruge ved RT for 120 min med avidin-peroksidase bøye (tabell av materialer).
      5. Avslør med DAB + 0,04% nikkel-ammonium.
      6. Monter beiset seksjoner på gelatin belagt mikroskopi lysbilder og la dem lufttørke. Tørke i etanol, diaphanize i xylen, avslutt med monterings medium (tabell av materialer), dekk med en dekkglass, og bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et kritisk aspekt for å evaluere kvaliteten og helsen til kulturperler skiver er tilstedeværelsen og typisk morfologi av de forventede nevrale celletyper, neurons, og gliacellene celler. Den typiske arkitekturen av den menneskelige kortikale laminering ble observert i en skive på DIV4, avslørt av neuronal immunolabeling (figur 2D). I tillegg ble det også observert forventet tilstedeværelse av mikroglia og astroglia (figur 2B, C). Disse resultatene viser at vev arkitekturen ikke er signifikant påvirket enten av kirurgisk prosedyre/prøve behandling eller av kortsiktig periode in vitro. I samsvar med tidligere funn, ble det vist at NeuN immunoreactivity ikke ble endret mellom DIV0 og DIV432. Basert på disse resultatene, fritt flytende kultur format, knyttet til den reduserte tykkelsen av stykket til 200 μm (sammenlignet med den mye brukt 300-400 μm når membranen innsatser brukes), bidratt til bedre diffusjon av oksygen og næringsstoffer til indre celle lag i skiver, som tidligere har vist å være avgjørende for helsen til kultivert skiver39,40.

Kvantifisering av celle død i skiver er også en verdifull tilnærming i ex vivo-modeller av neuropathologies, slik som Slice kulturer (gjennomgått av akkurat et al.41). I en tidligere studie brukte vi MTT-analysen for å fastslå celle døds nivåer langs perioden i kultur32. I tillegg til levedyktighet, den samme studien viste også at kultivert skiver (opp til DIV4) bevart kapasitet til å løslate nevrotransmittere på KCl-indusert depolarization32. Her ble disse funnene utvidet ved å undersøke neuronal respons på KCl-indusert depolarization på erk fosforylering, en sentral kinase involvert i prosesser som Synaptic plastisitet og minne42,43. Interessant nok ble en klar økning i ERK fosforylering sett i KCl-behandlede skiver på DIV4 (Figur 3a, B).

Til slutt ble responsen av skiver på DIV4 til en giftig utfordring evaluert med en kjent oksidativt stress induser, H2O2. Begrunnelsen var at omfanget av celle død bør være proporsjonal med nivået av celle levedyktighet i den kultivert skiver. Som vist i Figur 3C, utsette skiver til 300 mm h2O2 for 24 H førte til en robust nedgang i MTT reduksjon. Til sammen, den massive celle død observert i DIV5 etter H2O2 Challenge og KCl-indusert depolarization resultater tyder på at den bevarte generelle HELSEN til skiver på DIV4 svarer tilstrekkelig til en giftig stimulans som oksidativt Stress.

Figure 1
Figur 1: sample samling, transport, kutting, og dyrking av kortikale vev fra voksne mennesker. Prosedyren starter ved kirurgisk rom med samling av kortikale vev fra timelige lobektomi for behandling av pharmacoresistant epilepsi (A, B). (C) tissue fragment (n = 1) er umiddelbart overført til et rør som inneholder iskald oksygenrikt transportmedium (se nedenfor). (D) i laboratoriet, hjernehinnene fjernes ved hjelp av fine øyen pinsett. Overflødig væske tørkes ved hjelp av filter papir, og fragmentet superglued (E) til den vibratome prøve disken med den hvite saken vendt ned og saify overflaten vendt opp. (F) ved hjelp av en kommersiell barberhøvel, er prøven skåret inn i 200 μm skiver som er samlet med en delikat pensel og overført tilbake til Petri parabolen for videre trimming av overflødig hvit materie og løse ender (ikke vist) før (G) plating og dyrking i et frittflytende format. (H) skiver kulturer holdes levedyktig i flere dager og kan brukes i en rekke eksperimentelle protokoller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: morfologiske analyse av nevrale celler i skive kulturer fra voksne menneskelige hjerne. Skiver ble fikset på den fjerde dagen in vitro. (A, B, C) Representative trinn i skjære prosedyren før immunhistokjemi. Tissue var digitalt farget å forbedre visualisering. (D) normal fordeling av neurons i kortikale lag (Roman tall). (E) mikroglia og (F) astrocytter ble også tydelig observert (n = 1 skive per celle type merking). Alle skiver ble innhentet fra vev fra en enkelt donor. Skala stolper = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: funksjonell og celle levedyktighet analyser i voksen menneskelige hjerne skive kulturer. Neuronal aktivitet ble evaluert i skiver på dag in vitro 5 (DIV5) av KCl-indusert depolarization og påfølgende økning i ERK fosforylering. (A) et representativt immunoblot resultat oppnådd med homogenater fra en skive. Bånd som tilsvarer fosfat ERK (perk) og total ERK (tERK) indikeres. (B) kvantifisering av PERK/tERK ratio i tre uavhengige skiver fra en enkelt menneskelig donor. (C) hydrogenperoksid (H2O2) toksisitet ble evaluert av MTT analysen i skiver på div 5. Optisk tetthet verdier innhentet ble normalisert av massen av hver skive. Skiver ble utfordret med H2o2 ved angitte konsentrasjoner (no H2o2; 30 mm H2O2; 300 mm H2O2) for 24 H. bilder av representative skiver etter inkubasjons med MTT vises over stolpene. Resultatene presenteres som gjennomsnittlig ± standard feil fra data innhentet fra tre uavhengige stykker fra en enkelt donor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen for å produsere fritt flytende, kortsiktige Slice kulturer er en alternativ metode for dyrking voksne menneskelige neocortical skiver. En slik protokoll for Slice kulturer kan være mottagelig for studier på (men ikke begrenset til) optogenetics1,44,45, elektrofysiologi2,3,4,5 , kortsiktige plastisitet46,47, langsiktige plastisitet48,49, nevrotoksisitet/neuroprotection10,11,12, 13, Cell Therapy14, narkotika screening15,16,17, Cancer50,51, genetikk, og genredigering12,18 ,19,20.

Bruk av prøver fra voksen menneskelig vev er spesielt viktig å forstå menneskelig neuropathologies, på grunn av unike egenskaper typisk for den menneskelige hjerne mangler i skiver produsert fra gnager nervøs vev52. Videre Slice kulturer fra gnager hjerner er vanligvis tilberedt av nyfødt, umodne hjerner, som er svært plast og inneholder migrere celler som kan endre den opprinnelige skive cytoarchitecture å tilpasse seg in vitro miljø26, 53,54,55. Slike plast hendelser fører til endringer i kretsen som bør unngås når målet er å etterligne in vivo tilstand, som angitt av ting et al.30: "vi valgte å fokusere på kulturer på mindre enn en uke, hvor strukturelle og funksjonelle egenskaper er rimelig opprettholdes med minimal forstyrrelsene, å være så sammenlignbare som mulig for målinger innhentet ved hjelp av gull-standard akutte Slice preparater ". Derfor, selv om en metode viet til kortsiktig dyrking kan i utgangspunktet bli sett på som begrenset, langsiktige dyrking er ikke nødvendig å produsere relevante resultater i mange eksperimentelle design32,33,34 ,35,56,57.

To kritiske trinn i protokollen er den reduserte tykkelsen av skiver (200 μm) og tilskudd av kultur mediet med BDNF. I tidligere arbeid32, har vi vist bevaring av celle levedyktighet opp til 4 div og diskutert den sannsynlige bidrag av reduksjon av Slice tykkelse til 200 μm i forhold til de oftere brukte 300-400 μm skiver12,29. I utgangspunktet, redusere skiver tykkelse kan bidra til en bedre oksygenering og næringsstoffer opptak i fritt flytende skiver, redusere sjansene for kjerne hypoksi og neurodegeneration31,32,57, 58,59,60,61. I tillegg er det anbefalt å holde vev i kulde, oksygenrikt Media fra operasjonsstuen til kutting trinn på vibratome, vurderer den høye etterspørselen etter O2 av den voksne menneskelige sentralnervesystemet. Tilskudd av medium med BNDF har tidligere blitt sett til litt øke levedyktighet i voksen menneskelige hjerne skiver kultivert fritt flytende32, i tråd med anbefalinger for middels tilskudd med nevrotropisk faktorer av andre forfattere 62,63.

Avslutningsvis beskriver denne protokollen metoder for å forberede og kjøre analyser med kortsiktige, fritt flytende Slice kulturer fra voksne menneskelige hjerner. Denne modellen bør være mottagelig for undersøkelser på mekanismer for toksisitet/neuroprotection relevant for alder-tilknyttede hjernesykdommer. Bruken av humant resected vev presenterer fordelen av å bevare hjernen cytoarchitecture og lokale kretser, legge translational kraft til oppnådde funn. Videre, sprengning bruken av Human-avledet eksemplar fra nevrokirurgi inne nevrovitenskap kanskje hjelpe nedskrive behovet for dyr eksperimentering. Selv om denne protokollen er sentrert rundt bruk av vev innhentet fra pasienter som sendes til nevrokirurgi for pharmacoresistant epilepsi behandling, er det antydet at vev samlet inn fra andre hjerneregioner/forhold også betraktes som kilder for produsere Slice kulturer på en enkel og kostnadseffektiv måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet av FAPESP (Grant 25681-3/2017 til AS), KAPPER (post-doktor fellesskap PNPD/INCT-HSM til A.F. og pre-doktor fellesskap til N.D.M.) og FAEPA. G.M.A. har en Master ' s fellesskap fra FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. har en CNPq Research Fellowship. Vi takker pasientene og deres familier for å donere den resected vev for denne studien. Vi vil gjerne erkjenne støtte fra beboere, sykepleiere, teknikere, og CIREP team, fra Clinical Hospital ved Ribeirão Preto Medical School, Universitetet i São Paulo, som hjalp i ulike stadier av prosessen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 - VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 - ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
  2. Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
  3. Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
  4. Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
  5. Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
  6. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
  7. Crain, S. M. Development of Specific Synaptic Network Functions in Organotypic Central Nervous System (CNS) Cultures: Implications for Transplantation of CNS Neural Cellsin Vivo. Methods. 16 (3), 228-238 (1998).
  8. He, S., Bausch, S. B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis. Neuropharmacology. 77, 379-386 (2014).
  9. Antonietta Ajmone-Cat, M., Mancini, M., De Simone, R., Cilli, P., Minghetti, L. Microglial polarization and plasticity: Evidence from organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 61 (10), 1698-1711 (2013).
  10. Noraberg, J., et al. Organotypic Hippocampal Slice Cultures for Studies of Brain Damage, Neuroprotection and Neurorepair. Current Drug Target - CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  11. Hoppe, J. B., et al. Amyloid-β neurotoxicity in organotypic culture is attenuated by melatonin: Involvement of GSK-3β, tau and neuroinflammation. Journal of Pineal Research. 48 (3), 230-238 (2010).
  12. Sebollela, A., et al. Amyloid-β oligomers induce differential gene expression in adult human brain slices. Journal of Biological Chemistry. 287 (10), 7436-7445 (2012).
  13. Chong, C. M., et al. Discovery of a novel neuroprotectant, BHDPC, that protects against MPP+/MPTP-induced neuronal death in multiple experimental models. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1057-1066 (2015).
  14. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Experimental Neurology. 248, 429-440 (2013).
  15. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (8), 659-666 (2008).
  16. Minami, N., et al. Organotypic brain explant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors. Cancer Medicine. 6 (11), 2635-2645 (2017).
  17. Magalhães, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 1-18 (2018).
  18. Wang, X., et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neuroscience. 10, 1-20 (2009).
  19. Di Pietro, V., et al. Transcriptomics of traumatic brain injury: gene expression and molecular pathways of different grades of insult in a rat organotypic hippocampal culture model. Journal of neurotrauma. 27 (2), 349-359 (2010).
  20. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  21. Jones, R. S. G., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2015).
  22. Hoffer, B., Seiger, A., Ljungberg, T., Olson, L. Electrophysiological and cytological studies of brain homografts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo. Brain Research. 79 (2), 165-184 (1974).
  23. Hoffer, B. J., Olson, L., Palmer, M. R. Toxic effects of lead in the developing nervous system: in oculo experimental models. Environmental Health Perspectives. 74, 169-175 (1987).
  24. Hogue, M. J. Human fetal brain cells in tissue cultures: Their identification and motility. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 85-107 (1947).
  25. Costero, I., Pomerat, C. M. Cultivation of neurons from the adult human cerebral and cerebellar cortex. American Journal of Anatomy. 89 (3), 405-467 (1951).
  26. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  27. Stoppini, L., Buchs, A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  28. Sanai, N., et al. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature. 427 (6976), 740-744 (2004).
  29. Eugène, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  30. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  31. Verwer, R. W. H., Dubelaar, E. J. G., Hermens, W. T. J. M. C., Swaab, D. F. Tissue cultures from adult human postmortem subcortical brain areas. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 6 (3), 429-432 (2002).
  32. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  33. Bruce, A. J., Malfroy, B., Baudry, M. beta-Amyloid toxicity in organotypic hippocampal cultures: protection by EUK-8, a synthetic catalytic free radical scavenger. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2312-2316 (1996).
  34. Finley, M., et al. Functional validation of adult hippocampal organotypic cultures as an in vitro model of brain injury. Brain Research. 1001 (1-2), 125-132 (2004).
  35. Schoeler, M., et al. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury. BMC Neurology. 12, 20 (2012).
  36. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  37. Maharana, C., Sharma, K. P., Sharma, S. K. Feedback mechanism in depolarization-induced sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in the hippocampus. Scientific Reports. 3, 1103 (2013).
  38. Horta, J. D. A. C., López, D. E., Alvarez-Morujo, A. J., Bittencourt, J. C. Direct and indirect connections between cochlear root neurons and facial motor neurons: Pathways underlying the acoustic pinna reflex in the albino rat. Journal of Comparative Neurology. 507 (5), 1763-1779 (2008).
  39. Carmona-Fontaine, C., et al. Metabolic origins of spatial organization in the tumor microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2934-2939 (2017).
  40. McMurtrey, R. J. Analytic Models of Oxygen and Nutrient Diffusion, Metabolism Dynamics, and Architecture Optimization in Three-Dimensional Tissue Constructs with Applications and Insights in Cerebral Organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  41. Lossi, L., Alasia, S., Salio, C., Merighi, A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 88 (4), 221-245 (2009).
  42. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 42, 135-163 (2002).
  43. Sharma, S. K., Carew, T. J. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: Facilitatory effects and inhibitory constraints. Learning and Memory. 11 (4), 373-378 (2004).
  44. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-755 (2011).
  45. Takahashi, Y. K., et al. Neural Estimates of Imagined Outcomes in the Orbitofrontal Cortex Drive Behavior and Learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  46. Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a Cooperate in the Regulation of Epileptic and Synaptic Activity in the CA1 Region of the Hippocampus. Journal of Neuroscience. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  49. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  50. Jung, S., et al. Brain tumor invasion model system using organotypic brain-slice culture as an alternative to in vivo model. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 128 (9), 469-476 (2002).
  51. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 261-270 (2007).
  52. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  53. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 11 (11), 484-489 (1988).
  54. Walsh, K., Megyesi, J., Hammond, R. Human central nervous system tissue culture: A historical review and examination of recent advances. Neurobiology of Disease. 18 (1), 2-18 (2005).
  55. Gähwiler, B. H. Slice cultures of cerebellar, hippocampal and hypothalamic tissue. Experientia. 40 (3), 235-243 (1984).
  56. Bsibsi, M., et al. Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators. Glia. 53 (7), 688-695 (2006).
  57. González-Martínez, J. A., Bingaman, W. E., Toms, S. A., Najm, I. M. Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 628-635 (2008).
  58. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. The FASEB Journal. 16 (1), 54-60 (2002).
  59. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  60. Masamoto, K., Tanishita, K. Oxygen Transport in Brain Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 131 (7), 074002 (2009).
  61. Hadjistassou, C., Bejan, A., Ventikos, Y. Cerebral oxygenation and optimal vascular brain organization. Journal of the Royal Society Interface. 12 (107), (2015).
  62. Qiu, C., Kivipelto, M., von Strauss, E. Epidemiology of Alzheimer's disease: occurrence, determinants, and strategies toward intervention. Dialogues in Clinical Neuroscience. 11 (2), 111-128 (2009).
  63. Stahl, K., Mylonakou, M. N., Skare, O., Amiry-Moghaddam, M., Torp, R. Cytoprotective effects of growth factors: BDNF more potent than GDNF in an organotypic culture model of Parkinson's disease. Brain Research. 1378, 105-118 (2011).

Tags

Nevrovitenskap histoculture mektig ex Vivo neurodegeneration epilepsi Alzheimers
Kortsiktige fritt flytende Slice kulturer fra Adult Human Brain
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, A., Mendes, N. D.,… More

Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter