Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Краткосрочные свободно плавающие культуры фрагмента от взрослого человеческого мозга

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/59845
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 4, 4, 5, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Summary

Представлен протокол по подготовке свободно плавающих срезовых культур из мозга взрослого человека. Протокол представляет собой вариацию широко используемого метода культуры срезов с использованием мембранных вставок. Это простой, экономически эффективный, и рекомендуется для запуска краткосрочных анализов, направленных на разгадать механизмы нейродегенерации за возрастных заболеваний мозга.

Abstract

Organotypic, или срез культур, были широко использованы для моделирования аспектов центральной нервной системы функционирования в пробирке. Несмотря на потенциал среза культур в неврологии, исследования с использованием взрослых нервной ткани для подготовки таких культур по-прежнему скудны, особенно из человеческих субъектов. Использование взрослых человеческих тканей для подготовки среза культур особенно привлекательна для углубления понимания человеческих нейропатологий, так как они имеют уникальные свойства, характерные для зрелого человеческого мозга, не хватает ломтиков, произведенных у грызунов (обычно неонатальных) нервной ткани. Этот протокол описывает, как использовать ткани мозга, собранные из живых человеческих доноров, представленных на резекцивную операцию на головном мозге, чтобы подготовить краткосрочные, свободно плавающие культуры среза. Также представлены процедуры поддержания и проведения биохимических и клеточных анализов биологии с использованием этих культур. Репрезентативные результаты показывают, что типичная ламинирование корковой линии человека сохраняется в ломтиках после 4 дней in vitro (DIV4), при ожидаемом присутствии основных типов нейронных клеток. Кроме того, ломтики на DIV4 проходят надежную гибель клеток, когда оспаривается с токсичным стимулом (H2O2), что свидетельствует о потенциале этой модели, чтобы служить в качестве платформы в анализсмерти смерти клеток. Этот метод, более простой и экономически эффективной альтернативой широко используемому протоколу с использованием мембранных вставок, в основном рекомендуется для проведения краткосрочных анализов, направленных на распутывание механизмов нейродегенерации за возрастными заболеваниями мозга. Наконец, хотя протокол посвящен использованию корковых тканей, собранных у пациентов, представленных на хирургическое лечение фармакорезистентной височной эпилепсии, утверждается, что ткани, собранные из других областей мозга / условий также должны быть рассматривается в качестве источников для производства аналогичных свободно плавающих срезовых культур.

Introduction

Использование человеческих образцов в исследованиях однозначно отличный вариант для изучения патологий человеческого мозга, и современные методы открыли новые пути для надежных и этических экспериментов с использованием пациента полученных тканей. Такие методы, как organotypic / срез культур, подготовленных из взрослого человеческого мозга все чаще используются в парадигмы, такие как оптогенетика1, электрофизиология2,3,4,5, пластичность 6,7,8,9, нейротоксичность / нейропротекционистство10,11,12,13,клеточная терапия14, скрининг нанаркотики 15,16,17, генетика и редактирование генов12,18,19,20, среди других, как стратегия для лучшего понимание неврологических заболеваний во взрослом возрасте.

Понимание механизмов, лежащих в основе патологий человеческого мозга, зависит от экспериментальных стратегий, которые требуют большого количества испытуемых. И наоборот, в случае срезаных культур, хотя доступ к пробам человека по-прежнему затруднен, возможность генерации до 50 ломтиков из одного коркового образца частично обходит необходимость найма нескольких добровольцев за счет увеличения количество репликатов и выполненных анализов на собранную ткань21.

Несколько протоколов для мозга organotypic / срез культур были описаны, начиная от классических проектов oculo22,23 роликовой трубки24,25,26, полупроницаемые мембраны интерфейс27,28,29,30, и свободно плавающие ломтики31,32. В зависимости от особенностей экспериментального дизайна, каждая техника имеет свои преимущества и недостатки. Краткосрочные, свободно плавающие культуры ломтиков из мозга взрослого человека в некоторых случаях выгодно по сравнению с методом, используемым Stoppini и др.27, если учесть тот факт, что, хотя долгосрочные выживания клеток в пробирке, как правило, является серьезной проблемой при оценке культурный метод, во многих экспериментах только короткие периоды времени в культуре необходимы12,31,32,33,34,35. В этих условиях использование свободненских культур представляет собой преимущество более простого и экономичного, а также более точного напоминания первоначального состояния тканей человека, чем ломтики, хранящиеся в культуре в течение 2-3 недель.

Несмотря на потенциал среза культур к неврологии, исследования с использованием взрослых нервной ткани для подготовки таких культур по-прежнему скудны, особенно от человека. В этой статье описывается протокол об использовании собранной ткани мозга от живых человеческих доноров, представленных на резекцивную операцию на головном мозге для подготовки свободно плавающих культур среза. Процедуры для поддержания и выполнения биохимических и клеточных анализов биологии с использованием этих культур подробно. Этот протокол оказался ценным для анализа жизнеспособности и нейронной функции в исследованиях механизмов нейропатологии, связанных с взрослой жизнью.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ткани мозга живых взрослых были получены от пациентов, проходящих резецкую нейрохирургию для лечения фармакорезистентной эпилепсии височной доли(рисунок 1А). Все процедуры были одобрены Комитетом по этике из клиники больницы в Рибейран Прето медицинской школы (17578/2015), и пациенты (или их юридическое лицо) согласились и подписали обоснованное согласие условия. Сбор ткани был сделан нейрохирургии команды в Центре хирургии эпилепсии (CIREP - Клиники больницы в Рибейран Прето медицинская школа, Университет Сан-Паулу, Бразилия).

1. Стерилизация материалов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы и растворы должны быть стерилизованы перед использованием.

  1. Стерилизовать все хирургические инструменты и вибратом нарезки материала (нож держатель, образец диска, буфер лоток) в сухой стерилизации духовки для 4 ч при температуре 180 градусов по Цельсию.
  2. Стерилизовать чувствительный к температуре материал или оборудование с помощью УФ или гамма-облучения.
  3. Стерилизовать средства массовой информации и растворы путем автоматической или фильтрации через 0,22 мкм пор мембраны.

2. Подготовка решений

  1. Подготовка 15-20 мл транспортного раствора: 50% v/v Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) pH 7.4, 50% v/v базальный средний для поддержания послеродовых и взрослых нейронов мозга(Таблица материалов),дополненная 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1- пиперетанеанесульфоновая кислота (гепы), 3 мг/мл глюкозы и 33 мкг/мл гентамицина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Транспортное решение должно быть охлаждено и насыщено кислородом (пузырь каббогена) в течение не менее 20 минут до сбора образцов.
  2. Приготовьте 300 мл нарезки (HBSS дополнено 10 мМ HEPES и 3 мг/мл глюкозы) и охладите его в морозильной камере до точки первоначального кристаллического образования.
  3. Подготовка 20 мл культуры среды: базальная среда для поддержания послеродовой и взрослой нейронов мозга (Таблица материалов) дополнен1% L-глютамин производной (Таблица материалов), 2% дополнение для нейронной культуры (Таблица Материалы),1% пенициллина/стрептомицина, и 0,25 мкг/мл амфотерицин B.

3. Настройка нарезки аппарата

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол идеально выполняется с помощью коллеги из-за логистики сбора проб в хирургическом кабинете.

  1. В ведре соли добавил льда, пусть нарезки раствор отдыха под карбоген смесь восходящей (95% O2, 5% CO2) по крайней мере 20 минут до использования.
  2. Подготовьте блок из 3% агарозы (примерно 2 см х 2 см х 2 см) и суперприклей его на диск образца вибратом для того, чтобы создать дополнительную механическую поддержку образца ткани во время нарезки (Рисунок 1E).
  3. Установите вибратомдля для нарезки: толщина секции 200 мкм, частота вибрации 100 Гц и скорость нарезки от 0,5 до 1,0 мм/с.
  4. Заблокируйте буферный лоток вибратомна к основанию вибратом и добавьте лед, чтобы держать его в холодильнике до получения нарезки раствора и образца, а также на протяжении всей процедуры нарезки.

4. Коллекция образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, человеческая неокортикальная ткань была собрана в хирургическом кабинете и транспортирована в лабораторию.

ПРЕДУправление: При работе с образцами человека следуйте соответствующим протоколам безопасности, установленным Учреждением.

  1. Настройка транспортного аппарата(рисунок 1C), который состоит из: портативный газовый баллон со смесью карбогена, подключенным к клапану давления/потока, который контролирует выход газа, подключенный к кремниевым трубам, который соединяет выход газа с транспортом судно; транспортное судно, обычно коническая центрифуга 50 мл с перфорированной крышкой для ввода газа, содержащая транспортный раствор; и льда для охлаждения образцов во время транспортировки.
  2. Соберите и транспортировать образец(рисунок 1B) немедленно в лабораторию. Погружайте образец в холодный транспортный раствор (постоянно пузырится карбогенной смесью).

5. Нарезка

  1. Перенесите образец в чашку Петри (100 мм х 20 мм), содержащую нарезку раствора и, с помощью тонких хирургических инструментов, тщательно удалите как можно больше оставшихся олова в образце(рисунок 1D).
  2. Выберите лучшую ориентацию образца для производства ломтиков с особыми характеристиками экспериментального дизайна, и с No 24 скальпель лезвие, обрезать плоскую поверхность, чтобы быть основанием приклеены к образцу диска.
  3. Используя одноразовую пластиковую ложку и нежные кисти, соберите фрагмент из чашки Петри и сухой лишний раствор с помощью фильтровальной бумаги (сухой капиллярностью и не прикасайтесь к фрагменту ткани бумагой).
  4. Используя суперклей, прикрепите ткань к диску образца вибратом, пока он не прочно прилип нет к диску и в контакте с блоком агарозы(рисунок 1E).
  5. Поместите диск образца вибратом (с правильно прикрепленной тканью) в буферный лоток вибратом, наполненный нарезным раствором, который должен бурлять в течение всего процесса.
  6. Заблокируйте держатель ножа на месте с лезвием бритвы твердо закреплены.
  7. Нарезка раствор должен покрывать как образец, так и лезвие, только после этого начинайте нарезку(рисунок 1F).
  8. Нарежьте образец на 200 ломтиков мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя некоторые вибратомы вырезать образцы автоматически, внимательное наблюдение и незначительные корректировки в скорости нарезки во время процесса может помочь производить лучшие ломтики. Откажитесь от первоначальных нерегулярных ломтиков.
  9. Перенесите ломтики из буферного лотка в чашку Петри с нарезкой раствора и обрезать свободные края и избыток белой матер в пропорции около 70% коры / 30% белого вещества.

6. Культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг в ламинарной шкафе потока в стерильной среде.

  1. Добавьте 600 зЛ культуры среды на хорошо (в 24 хорошо пластины) и инкубировать, по крайней мере 20 мин при 36 КС и 5% CO2 до покрытия ломтиками.
  2. Плита один ломтик в хорошо с помощью кисти(Рисунок 1G).
  3. Если в тарелке есть неиспользованные колодцы, заполните их 400 л стерильной воды.
  4. Инкубировать тарелку при 36 градусах Цельсия, 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первая средняя замена должна быть сделана в период между 8-16 ч после покрытия в зависимости от размера ломтика.
  5. Дополнение 10 мл ранее подготовленной культуры среды с 50 нг/мл мозга, полученных нейротрофический фактор (BDNF).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение первых 8-16 ч, ломтики инкубируются в 600 л среды, чтобы избежать лишения питательных веществ и подкисления, так как среднее потребление в этой фазе ускоряется. На следующем этапе объем средней скважины корректируется до 400 кЛ.
  6. Удалите 333 л условного носителя из каждой скважины и добавьте 133 л свежей bDNF-дополненной среды.
  7. Повторите процесс средней замены каждые 24 ч, заменив одну треть условного носителя на свежую bDNF-дополненную среду.

7. Оценка здоровья, морфологии и функции в культурных ломтиках

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вызвать гибель клеток с целью иллюстрации в репрезентативных результатах, некоторые ломтики были представлены на 24 ч лечения с окислительным индуктором стресса H2O2. Шаги 7.1.2 и 7.1.3 описывают использование H2O2 для индуцирования клеточной смерти.

  1. Жизнеспособность клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Простой, простой метод для оценки нейротоксических / нейрозащиты в оспаривается срез культур 3-(4,5-диметилтилтиазол-2-yl)-2,5-дифенилтетриум (МТТ) анализ36, который измеряет процент метаболических активных клеток в нормальных условиях по сравнению с обработанными образцами.
    1. В ламинарном шкафу потока замените одну треть среды на свежую среду.
    2. Из 30% H2O2 бульонного раствора добавьте объем H2O2 в скважину, чтобы достичь предполагаемой конечной концентрации (30 мМ или 300 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: H2O2 был добавлен после ежедневного изменения среды, чтобы гарантировать надлежащее снабжение свежими питательными веществами до вызова.
    3. Инкубировать тарелку на 24 ч при 36 градусах Цельсия, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После H2O2 лечения (или других токсичных стимулов интереса), следующие шаги описывают определение жизнеспособности клеток ПО MTT.
    4. Добавьте 40 зл раствора МТТ к конечной концентрации 0,5 мг/мл к каждой скважине в пластине.
    5. Инкубировать тарелку при 36 градусах Цельсия, 5% CO2 на 3 ч.
    6. Вымойте ломтики фосфат-буферированным сольником (PBS) и перенесите на микротрубку.
    7. Тщательно удалите любой оставшийся раствор путем пипетки.
    8. Взвесьте микротрубки, содержащие ломтики, чтобы определить массу каждого ломтика (это ключ к нормализации полученных показаний абсорбции).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости образцы могут быть заморожены (-20 градусов по Цельсию) на данном этапе для последующей обработки.
    9. Гомогенизировать ломтики в 200 л изопропанола/HCl с помощью моторизованного пестика.
    10. Центрифуга при комнатной температуре (RT) в течение 2 мин при 2600 х г.
    11. Соберите супернатант и измерьте абсорбцию на уровне 540 нм.
  2. KCl-индуцированной нейронной деполяризации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фосфорилирование митогена активированного белка киназы (MAPK) сигнализации каскадного белка ERK, а затем западного blotting, может быть использован для количественной оценки нейрональной реакции на KCl-индуцированной деполяризации37 .
    1. На шкафу потока замените культурную среду на 300 qL HBSS, ранее уравновешиваемый до 36 градусов по Цельсию.
    2. Замените HBSS 300 л свежих HBSS, ранее уравновешиваемых до 36 градусов по Цельсию.
    3. Инкубировать тарелку при 36 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение 15 мин.
    4. Замените HBSS либо свежим HBSS, либо деполяризационным раствором 80 мМ KCl (как при 36 градусах Цельсия), так и инкубировать при 36 градусах Цельсия, 5% CO2 на 15 мин.
    5. Перенесите ломтики из тарелки в микротрубки. На этом этапе, ломтики могут храниться при -20 градусов по Цельсию для последующей обработки.
    6. Подготовка тканей экстракты в 150 л радиоиммунопреционных анализ (RIPA) буфер (50 мм Tris-HCl; 150 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1% неионический сурфактант; 0,1% натрия dodecyl сульфат; рН 7,5). Экстракты centrifuge при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин при 16000 х г,собирают супернатант и определяют общую концентрацию белка с помощью метода Брэдфорда.
    7. Нагрузка 30 мкг общего белка на 12% натрия dodecyl сульфат полиакриламид гель электрофорес (SDS-PAGE).
    8. После электрофореза перенесите содержание геля на мембрану нитроцеллюлозы.
    9. После блокирования мембраны с 5% обезжиренного сухого молока в TBS плюс 0,1% Tween, инкубировать с мышью анти-pERK (1:1,000) для 16 ч при 4 C. После мытья, инкубировать в течение 2 ч на RT с кроликом анти-ERK1/2 (1:1,000).
    10. Инкубировать с соответствующими HRP-конъюгированных вторичных антител на RT в течение 1 ч.
    11. Показать с предпочтительным субстратом HRP.
  3. Морфологическая оценка
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к выживанию клеток и функциональным оценкам, важно проанализировать морфологию тканей. Имейте в виду, что резекция культивированный кусок является важным шагом к производству как можно больше высококачественного материала, насколько это возможно для морфологического анализа.
    1. Фиксация, криозащита и резекция ломтиков
      1. Перенесите ломтики из колодцев со средой культуры в новую 24 хорошо пластины, содержащие PBS.
      2. Удалить PBS и добавить 1 мл 4% параформальдегида (PFA). Важно, чтобы срезы оставались плоскими до добавления PFA. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
      3. Тщательно удалите раствор PFA и добавьте 1 мл 30% сахарозного раствора. Инкубировать 48 ч при 4 градусах Цельсия.
      4. Установите замораживание микротома до -40 градусов по Цельсию.
      5. Подготовьте основание сахарозы на стадии микротома, где следует разместить ломтики(рисунок 2А). Пусть он полностью заморозить и осторожно вырезать некоторые из замороженных сахарозы для получения плоской поверхности, на которой ломтик будет размещен.
      6. Поместите каждый ломтик на растянутую пластиковую пленку и используйте кисть, чтобы плоские ткани.
      7. Перенесите растянутый срез на замороженную основу сахарозы одним ходом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это не возможно переместить ломтик, как только он находится над замороженным основанием сахарозы. Выполняйте этот шаг передачи тщательно.
      8. Пусть ломтик отдохнуть в течение 5-10 минут для правильного замораживания.
      9. Нарежьте нарезку на 30 мкм секций.
      10. Перенесите 30 мкм секций в чашку Петри, содержащую PBS.
      11. Переход к гистологии протокола более адекватной экспериментальной конструкции.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 30 мкм разделы могут быть легко использованы для свободно плавающей иммуногистохимии, установлен на микроскопии слайды для дальнейшей гистологии или хранится в антифризе растворпри в -20 градусов по Цельсию.
    2. Иммуногистохимия
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция стандартные протоколы различаются между лабораториями. Для подробной версии протокола, используемого здесь, обратитесь к Horta et al.38. Первичные антитела, используемые для иммуносохранения, представленные на рисунке 2, включают нейронные ядра (NeuN), здоровый зрелый нейронный маркер, глиальный фибрилловый кислотный белок (GFAP), маркер асторцитов, ионизированный адаптер кальция (Iba-1) и микроглии Маркер.
      1. Инкубировать ломтики в блокирующем растворе (например, 2% нормальной ослиной сыворотки в PBS) в течение 40 мин.
      2. Инкубировать на ночь с первичными антителами под мягким возбуждением при 4 градусах Цельсия.
      3. После мытья pbS, инкубировать в течение 120 мин с биотинилатированных вторичных антител под мягким возбуждением на RT.
      4. После мытья с PBS, инкубировать на RT в течение 120 мин с avidin-peroxidase колдъюг (Таблица материалов).
      5. Выявить с DAB 0,04% никеля аммония.
      6. Смонтируйте окрашенные секции на слайдах с микроскопией с покрытием с желатином и дайте им высохнуть. Обезвоживание в этаноле, диафанизировать в ксилене, закончить с монтажом среды (Таблица материалов), крышка с крышкой, и изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Критическим аспектом для оценки качества и здоровья культивированных ломтиков является наличие и типичная морфология ожидаемых типов нервных клеток, нейронов и глиальных клеток. Типичная архитектура ламинирования корковой ламинирования человека наблюдалась в ломтике на DIV4, выявленном нейрональной иммуномаркировкой(рисунок 2D). Кроме того, наблюдалось ожидаемое присутствие микроглии и астроглии(рисунок 2B,C). Эти результаты показывают, что архитектура тканей не сильно зависит ни от хирургической процедуры/обработки образцов, ни от краткосрочного периода in vitro. В соответствии с предыдущими выводами, было показано, что иммунореактивность NeuN не была изменена между DIV0 и DIV432. На основе этих результатов, свободно плавающий формат культуры, связанный с уменьшенной толщиной ломтика до 200 мкм (по сравнению с широко используемыми 300-400 мкм при использовании мембранных вставок), способствовал лучшему распространению кислорода и питательных веществ во внутренние клеточные слои в ломтиках, которые ранее были продемонстрированы, чтобы иметь решающее значение для здоровья культурных ломтиков39,40.

Количественная оценка клеточной смерти в ломтиках также является ценным подходом в ex vivo моделях нейропатологий, таких как срез культур (рассмотрено Lossi et al.41). В предыдущем исследовании, мы использовали MTT ассседля для определения уровня гибели клеток в течение периода в культуре32. В дополнение к жизнеспособности, то же исследование также показало, что культурные ломтики (до DIV4) сохранили способность выпускать нейротрансмиттеров на KCl-индуцированной деполяризации32. Здесь, эти выводы были расширены путем изучения нейронов ответ на KCl-индуцированной деполяризации на ЭРК фосфорилирования, центральная киназа, участвующих в таких процессах, как синаптической пластичности и памяти42,43. Интересно, что явное увеличение ФОсфорилирования ERK было замечено в KCl-обработанных ломтиков на DIV4(Рисунок 3A,B).

Наконец, ответ ломтиков на DIV4 на токсичные проблемы была оценена с известным окислительным индуктором стресса, H2O2. Обоснование заключалось в том, что степень смерти клеток должна быть пропорциональна уровню жизнеспособности клеток в культурных срезах. Как показано на рисунке 3C, подвергая ломтики до 300 мМ H2O2 на 24 ч привело к надежному снижению MTT. Взятые вместе, массовая гибель клеток наблюдается в DIV5 после H2O2 вызов и KCl индуцированной деполяризации результаты показывают, что сохранившееся общее состояние здоровья ломтиков на DIV4 адекватно реагирует на токсичные стимулы, такие как окислительный Стресс.

Figure 1
Рисунок 1: Сбор образцов, транспортировка, нарезка и культивирование корковой ткани у взрослых людей. Процедура начинается в хирургическом кабинете со сбором корковой ткани из височной лобэктомии для лечения фармакорезистентной эпилепсии(A,B). (C)Фрагмент ткани (n No 1) немедленно передается в трубку, содержащую ледяную кислородную транспортную среду (см. ниже). (D) В лаборатории, оболятели удаляются с помощью тонкой офтальмологических пинцета. Избыток жидкости высушивается с помощью фильтровальной бумаги, и фрагмент superglued (E) к диску образца вибратом с белым веществом вниз и pial поверхности вверх. (F) Использование коммерческой бритья бритвы, образец разрезается на 200 мкм ломтиками, которые собираются с деликатной кистью и переданы обратно в чашку Петри для дальнейшей обрезки избыточного белого вещества и свободные концы (не показано) до (G) покрытие и культирование в свободно плавающем формате. (H) Фрагменты культуры сохраняются жизнеспособными в течение нескольких дней и могут быть использованы в различных экспериментальных протоколов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Морфологический анализ нервных клеток в срезах культур из мозга взрослого человека. Фрагменты были зафиксированы на четвертый день в пробирке. (A,B, C) Представительные этапы процедуры секционирования до иммуногистохимии. Ткань была окрашена в цифровой цвет для улучшения визуализации. (D) Нормальное распределение нейронов в корковых слоях (римские цифры). (E) Микроглия и (F) астроциты также были четко соблюдены (n - 1 ломтик на маркировку типа клеток). Все ломтики были получены из ткани от одного донора. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Функциональные и клеточной жизнеспособности анализы во взрослом человеческом мозге срез культур. Нейронная активность оценивалась в ломтиках в день in vitro 5 (DIV5) по индуцированной KCl деполяризации и последующего увеличения фосфорилирования ERK. (A) Представитель иммуноблот результат, полученный с гомогенатов из одного ломтика. Указаны полосы, соответствующие фосфо ERK (Perk) и общей ERK (tERK). (B) Количественная оценка соотношения pERK/tERK в трех независимых ломтиках от одного донора человека. (C) Перекись водорода (H2O2) токсичность была оценена MTT асссев в ломтиках на DIV 5. Полученные значения оптической плотности нормализовались массой каждого среза. Фрагменты были оспорены с H2O2 при указанных концентрациях (No H2O2; 30 мМ H2O2; 300 мМ H2O2) для 24 ч. Изображения представительных ломтиков после инкубации с MtT показаны над решетками. Результаты представлены как средняя погрешность стандартной погрешности из данных, полученных от трех независимых срезов от одного донора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол для производства свободно плавающих, краткосрочных срезовых культур является альтернативным методом для культивирования взрослых человеческих неокортикальных ломтиков. Такой протокол для срезовых культур может быть поддается исследованиям по (но не ограничен) оптогенетике1,44,45,электрофизиологии2,3,4,5 , кратковременной пластичности46,47, долгосрочная пластичность48,49, нейротоксичность / нейропротекционная10,11,12, 13, клеточная терапия14, скрининг наркотиков15,16,17, рак50,51, генетика, и редактирование генов12,18 ,19,20.

Использование образцов из тканей взрослого человека особенно важно для понимания человеческих нейропатологий, из-за уникальных свойств, типичных для человеческого мозга, не хватает ломтиков, полученных из нервной ткани грызунов52. Кроме того, срез культур из мозга грызунов обычно готовятся из неонатальных, незрелых мозгов, которые являются очень пластиковыми и содержат мигрирующие клетки, которые могут изменить оригинальный кусок cytoarchitecture адаптироваться к среде in vitro26, 53,54,55. Такие пластиковые события приводят к изменениям в схеме, которые следует избегать, когда цель состоит в том, чтобы имитировать состояние in vivo, как заявил Ting et al.30: "Мы решили сосредоточиться на культурах менее одной недели, где структурные и функциональные свойства разумно поддерживается с минимальными возмущениями, чтобы быть как можно более сопоставимыми с измерениями, полученными с использованием золотых стандартных острых срезовых препаратов". Таким образом, хотя метод, посвященный краткосрочной культивирования может первоначально рассматриваться как ограниченный, долгосрочный культивирование не требуется для получения соответствующих результатов во многих экспериментальных конструкций32,33,34 ,35,56,57.

Двумя критическими шагами протокола являются уменьшенная толщина ломтиков (200 мкм) и дополнение культуры среды с BDNF. В предыдущей работе32, мы показали сохранение жизнеспособности клеток до 4 DIV и обсудили вероятный вклад сокращения толщины ломтика до 200 мкм по сравнению с более часто используемыми 300-400 мкм ломтиками12,29. В основном, уменьшение толщины ломтиков может способствовать лучшей оксигенации и поглощения питательных веществ в свободно плавающих ломтиках, уменьшая шансы на гипоксию ядра и нейродегенерации31,32,57, 58,59,60,61. Кроме того, рекомендуется держать ткани в холодной, насыщенной кислородом носителей из хирургического отделения до нарезки шага на вибратом, учитывая высокий спрос на O2 со стороны взрослого человека центральной нервной. Дополнение среды с BNDF ранее было замечено, чтобы немного увеличить жизнеспособность у взрослого человеческого мозга ломтики культивируется свободно плавающих32, в соответствии с рекомендациями для средних добавок с нейротрофическими факторами другими авторами 62,63.

В заключение, этот протокол описывает методы для подготовки и запуска анализов с краткосрочными, свободно плавающими срезкультуры из взрослого человеческого мозга. Эта модель должна поддается исследованиям механизмов токсичности/нейрозащиты, имеющих отношение к возрастным заболеваниям мозга. Использование ресектированной ткани человека представляет собой преимущество сохранения цитоархитектуры мозга и местных схем, добавляя трансляционную силу полученным выводам. Кроме того, разрыв использования человеческих образцов из нейрохирургии в нейробиологии может помочь уменьшить потребность в экспериментах на животных. Хотя этот протокол сосредоточен вокруг использования тканей, собранных у пациентов, представленных в нейрохирургии для лечения фармакорезичной эпилепсии, предлагается, чтобы ткани, собранные из других областей мозга / условия также рассматриваются в качестве источников для производить срезкультуры простым и экономически эффективным способом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается ФАПЕСП (Грант 25681-3/2017 as), CAPES (Пост-докторская стипендия PNPD/INCT-HSM для А.Ф. и додокторской стипендий н.д.М.) и FAEPA. G.M.A. имеет стипендию магистра от FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. имеет научно-исследовательскую стипендию CNPq. Мы благодарим пациентов и их семьи за пожертвование резецированных тканей для этого исследования. Мы хотели бы отметить поддержку жителей, медсестер, техников и команды CIREP из клинической больницы в Медицинской школе Рибейран Прето, Университет Сан-Паулу, которые помогали на различных этапах этого процесса.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 - VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 - ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
  2. Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
  3. Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
  4. Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
  5. Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
  6. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
  7. Crain, S. M. Development of Specific Synaptic Network Functions in Organotypic Central Nervous System (CNS) Cultures: Implications for Transplantation of CNS Neural Cellsin Vivo. Methods. 16 (3), 228-238 (1998).
  8. He, S., Bausch, S. B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis. Neuropharmacology. 77, 379-386 (2014).
  9. Antonietta Ajmone-Cat, M., Mancini, M., De Simone, R., Cilli, P., Minghetti, L. Microglial polarization and plasticity: Evidence from organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 61 (10), 1698-1711 (2013).
  10. Noraberg, J., et al. Organotypic Hippocampal Slice Cultures for Studies of Brain Damage, Neuroprotection and Neurorepair. Current Drug Target - CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  11. Hoppe, J. B., et al. Amyloid-β neurotoxicity in organotypic culture is attenuated by melatonin: Involvement of GSK-3β, tau and neuroinflammation. Journal of Pineal Research. 48 (3), 230-238 (2010).
  12. Sebollela, A., et al. Amyloid-β oligomers induce differential gene expression in adult human brain slices. Journal of Biological Chemistry. 287 (10), 7436-7445 (2012).
  13. Chong, C. M., et al. Discovery of a novel neuroprotectant, BHDPC, that protects against MPP+/MPTP-induced neuronal death in multiple experimental models. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1057-1066 (2015).
  14. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Experimental Neurology. 248, 429-440 (2013).
  15. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (8), 659-666 (2008).
  16. Minami, N., et al. Organotypic brain explant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors. Cancer Medicine. 6 (11), 2635-2645 (2017).
  17. Magalhães, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 1-18 (2018).
  18. Wang, X., et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neuroscience. 10, 1-20 (2009).
  19. Di Pietro, V., et al. Transcriptomics of traumatic brain injury: gene expression and molecular pathways of different grades of insult in a rat organotypic hippocampal culture model. Journal of neurotrauma. 27 (2), 349-359 (2010).
  20. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  21. Jones, R. S. G., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2015).
  22. Hoffer, B., Seiger, A., Ljungberg, T., Olson, L. Electrophysiological and cytological studies of brain homografts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo. Brain Research. 79 (2), 165-184 (1974).
  23. Hoffer, B. J., Olson, L., Palmer, M. R. Toxic effects of lead in the developing nervous system: in oculo experimental models. Environmental Health Perspectives. 74, 169-175 (1987).
  24. Hogue, M. J. Human fetal brain cells in tissue cultures: Their identification and motility. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 85-107 (1947).
  25. Costero, I., Pomerat, C. M. Cultivation of neurons from the adult human cerebral and cerebellar cortex. American Journal of Anatomy. 89 (3), 405-467 (1951).
  26. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  27. Stoppini, L., Buchs, A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  28. Sanai, N., et al. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature. 427 (6976), 740-744 (2004).
  29. Eugène, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  30. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  31. Verwer, R. W. H., Dubelaar, E. J. G., Hermens, W. T. J. M. C., Swaab, D. F. Tissue cultures from adult human postmortem subcortical brain areas. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 6 (3), 429-432 (2002).
  32. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  33. Bruce, A. J., Malfroy, B., Baudry, M. beta-Amyloid toxicity in organotypic hippocampal cultures: protection by EUK-8, a synthetic catalytic free radical scavenger. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2312-2316 (1996).
  34. Finley, M., et al. Functional validation of adult hippocampal organotypic cultures as an in vitro model of brain injury. Brain Research. 1001 (1-2), 125-132 (2004).
  35. Schoeler, M., et al. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury. BMC Neurology. 12, 20 (2012).
  36. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  37. Maharana, C., Sharma, K. P., Sharma, S. K. Feedback mechanism in depolarization-induced sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in the hippocampus. Scientific Reports. 3, 1103 (2013).
  38. Horta, J. D. A. C., López, D. E., Alvarez-Morujo, A. J., Bittencourt, J. C. Direct and indirect connections between cochlear root neurons and facial motor neurons: Pathways underlying the acoustic pinna reflex in the albino rat. Journal of Comparative Neurology. 507 (5), 1763-1779 (2008).
  39. Carmona-Fontaine, C., et al. Metabolic origins of spatial organization in the tumor microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2934-2939 (2017).
  40. McMurtrey, R. J. Analytic Models of Oxygen and Nutrient Diffusion, Metabolism Dynamics, and Architecture Optimization in Three-Dimensional Tissue Constructs with Applications and Insights in Cerebral Organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  41. Lossi, L., Alasia, S., Salio, C., Merighi, A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 88 (4), 221-245 (2009).
  42. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 42, 135-163 (2002).
  43. Sharma, S. K., Carew, T. J. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: Facilitatory effects and inhibitory constraints. Learning and Memory. 11 (4), 373-378 (2004).
  44. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-755 (2011).
  45. Takahashi, Y. K., et al. Neural Estimates of Imagined Outcomes in the Orbitofrontal Cortex Drive Behavior and Learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  46. Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a Cooperate in the Regulation of Epileptic and Synaptic Activity in the CA1 Region of the Hippocampus. Journal of Neuroscience. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  49. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  50. Jung, S., et al. Brain tumor invasion model system using organotypic brain-slice culture as an alternative to in vivo model. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 128 (9), 469-476 (2002).
  51. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 261-270 (2007).
  52. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  53. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 11 (11), 484-489 (1988).
  54. Walsh, K., Megyesi, J., Hammond, R. Human central nervous system tissue culture: A historical review and examination of recent advances. Neurobiology of Disease. 18 (1), 2-18 (2005).
  55. Gähwiler, B. H. Slice cultures of cerebellar, hippocampal and hypothalamic tissue. Experientia. 40 (3), 235-243 (1984).
  56. Bsibsi, M., et al. Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators. Glia. 53 (7), 688-695 (2006).
  57. González-Martínez, J. A., Bingaman, W. E., Toms, S. A., Najm, I. M. Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 628-635 (2008).
  58. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. The FASEB Journal. 16 (1), 54-60 (2002).
  59. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  60. Masamoto, K., Tanishita, K. Oxygen Transport in Brain Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 131 (7), 074002 (2009).
  61. Hadjistassou, C., Bejan, A., Ventikos, Y. Cerebral oxygenation and optimal vascular brain organization. Journal of the Royal Society Interface. 12 (107), (2015).
  62. Qiu, C., Kivipelto, M., von Strauss, E. Epidemiology of Alzheimer's disease: occurrence, determinants, and strategies toward intervention. Dialogues in Clinical Neuroscience. 11 (2), 111-128 (2009).
  63. Stahl, K., Mylonakou, M. N., Skare, O., Amiry-Moghaddam, M., Torp, R. Cytoprotective effects of growth factors: BDNF more potent than GDNF in an organotypic culture model of Parkinson's disease. Brain Research. 1378, 105-118 (2011).

Tags

Неврология Выпуск 153 гистокультура неокортекс ex vivo нейродегенерация эпилепсия болезнь Альцгеймера
Краткосрочные свободно плавающие культуры фрагмента от взрослого человеческого мозга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, A., Mendes, N. D.,… More

Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter