Summary
Somatiske mutation mønstre i celler afspejler tidligere mutagene eksponering og kan afsløre udviklingsmæssige Lineage relationer. Præsenteret her er en metode til at katalogisere og analysere somatiske mutationer i individuelle hæmatopoietiske stem og stamceller.
Abstract
Hæmatopoietisk stamme og stamceller (Hspc'er) akkumulerer gradvist DNA-mutationer i løbet af en levetid, hvilket kan bidrage til aldersrelaterede sygdomme som leukæmi. Karakterisering mutation ophobning kan forbedre forståelsen af etiologien af aldersrelaterede sygdomme. Præsenteret her er en metode til at katalogisere somatiske mutationer i individuelle Hspc'er, som er baseret på hel-genomsekvensering (WGS) af klonale primære cellekulturer. Mutationer, der findes i den oprindelige celle, deles af alle celler i den klonale kultur, hvorimod mutationer erhvervet in vitro efter celle sortering er til stede i en delmængde af celler. Derfor giver denne metode mulighed for nøjagtig påvisning af somatiske mutationer til stede i genomer af individuelle Hspc'er, som akkumuleres i løbet af livet. Disse kataloger over somatiske mutationer kan give værdifuld indsigt i de mutationale processer, som er aktive i det hæmatopoietiske væv, og hvordan disse processer bidrager til leukemogenesen. Ved at vurdere somatiske mutationer, der deles mellem flere Hspc'er af samme person, kan der desuden fastsættes klonal Lineage-relationer og populationsdynamik for blod populationer. Da denne fremgangsmåde bygger på in vitro-udvidelse af enkeltceller, er metoden begrænset til hæmatopoietiske celler med tilstrækkelig replikerende potentiale.
Introduction
Eksponering af hæmatopoietiske stamceller og progenitorcellerne (Hspc'er) til endogene eller ydre mutagene kilder bidrager til den gradvise ophobning af mutationer i DNA under en levetid1. Gradvis mutation akkumulering i hspcs1 kan resultere i aldersrelateret klonal hematopoiese (bue)2,3, som er en ikke-symptomatisk tilstand drevet af hspc'er transporterer leukæmi-driver mutationer. I første omgang blev det troet, at personer med bue har en øget risiko for leukæmi2,3. Men, nylige undersøgelser har vist en incidens af 95% af bue hos ældre personer4, gør foreningen med maligniteter mindre klar og rejse spørgsmålet om, hvorfor nogle personer med Arch til sidst gøre eller ikke udvikler maligniteter. Ikke desto mindre, somatiske mutationer i Hspc'er kan udgøre alvorlige sundhedsmæssige risici, som myelodysplastiske lidelser og leukæmi er karakteriseret ved tilstedeværelsen af specifikke Cancer driver mutationer.
For at identificere de mutationer processer og studere blod-clonality, mutation ophobning i individuelle Hspc'er skal karakteriseres. Mutations processer efterlader karakteristiske mønstre i genomet, såkaldte Mutations signaturer, som kan identificeres og kvantificeres i Genome-dækkende samlinger af mutationer5. For eksempel har eksponering for UV-lys, alkylerende midler og defekter i DNA-reparations veje hver især været forbundet med en anden Mutations signatur på6,7. Hertil kommer, på grund af den stokastiske karakter af mutation ophobninger, de fleste (hvis ikke alle) af de erhvervede mutationer er unikke mellem celler. Hvis mutationer deles mellem flere celler af samme person, indikerer det, at disse celler deler en fælles forfader8. Derfor, ved at vurdere fælles mutationer, kan Lineage relationer bestemmes mellem celler og en udviklingsmæssige Lineage træ kan konstrueres filial af gren. Katalogisering af sjældne somatiske mutationer i fysiologisk normale celler er imidlertid teknisk udfordrende på grund af det sunde væsens polyklonale karakter.
Præsenteret her er en metode til præcist at identificere og bestemme somatiske mutationer i genomer af individuelle Hspc'er. Dette indebærer isolation og klonal ekspansion af HSPCs in vitro. Disse klonale kulturer afspejler den genetiske makeup af den oprindelige celle (dvs., mutationer i den oprindelige celle vil blive delt af alle andre celler i kulturen). Denne fremgangsmåde giver os mulighed for at opnå tilstrækkelig DNA til hele genomsekvensering (WGS). Vi har tidligere vist, at mutationer akkumuleret in vitro under klonal kultur vil blive delt af en delmængde af celler. Dette muliggør filtrering af alle in vitro-mutationer, da disse vil være til stede i en mindre brøkdel af læsninger sammenlignet med in vivo erhvervede mutationer9. Tidligere metoder har fået tilstrækkelig DNA fra en enkelt celle til WGS ved hjælp af helgenomome amplifikation (WGA)10. Men den største ulempe ved WGA er dens relativt fejlbehæftede og ubalanceret forstærkning af genomet, hvilket kan resultere i allel dropouts11. Da denne fremgangsmåde imidlertid er baseret på in vitro-udvidelse af enkeltceller, er den begrænset til blodlegemer med et tilstrækkeligt replikerende potentiale, hvilket ikke er tilfældet for WGA-afhængige metoder. Tidligere indsats sekventering klonale kulturer har påberåbt sig ved hjælp af feeder lag for at sikre klonal forstærkning af enkelt HSPCs12. DNA fra feeder-lagene kan dog potentielt forurenes DNA i de klonale kulturer, hvilket er en blanding af de efterfølgende Mutations kald og filtrering. Den metode, der præsenteres her, er udelukkende afhængig af det specificerede medium til at udvide enkelt Hspc'er, og undgår derfor udstedelse af DNA-kontaminering. Indtil nu har vi med succes anvendt denne metode på menneskelige knoglemarv, navlestrengsblod, bæredygtigt frosset knoglemarv, og perifert blod.
Protocol
Prøverne skal indhentes i overensstemmelse med de relevante etiske protokoller, og donorerne skal give informeret samtykke forud for proceduren.
1. fremstilling af prøvemateriale
Bemærk: Når du arbejder med frisk fremstillet materiale, start med trin 1,1. Når du arbejder med frossen materiale, starter du med trin 1,2.
-
Klargøring af frisk knoglemarv, navlestrengsblod eller perifert blod
- Isoler den mononukleale fraktion fra prøven ved hjælp af tæthed gradient adskillelse ved at følge producentens anvisninger (Se tabel over materialer), og tælle mononukleale celler ved hjælp af en hemocytometer. Efter isolering af mononukleare celler fortsættes med trin 1,3.
- Valgfrit: det anbefalede antal celler, der kræves for at sortere en fuld 384 brønd plade af Hspc'er er 1 – 2 x 107. Hvis flere celler isoleres under tæthed gradient centrifugering, gemme overskydende af celler i flydende nitrogen.
- Resuspendér cellerne i 500 μL IMDM + 10% FBS pr. 1 x 107 celler, og Tilføj Drop-by-Drop en tilsvarende mængde imdm + 30% FBS + 20% DMSO for at opnå en suspension af 1 x 107 celler i 1 ml IMDM + 20% FBS + 10% DMSO.
- Overfør straks mononukleiske celler til 1 mL kryogene hætteglas og fryse celler ved-80 °C i en kontrolleret celle fryse container natten over. Overfør cellerne næste dag til et flydende kvælstof lager ved videre forarbejdning.
-
Klargøring af frosne mononukleære celler fra knoglemarv, navlestrengsblod eller perifert blod
- 50 mL celle optønings medium, der indeholder 45 mL Iscove modificerede ørne medium (IMDM) og 5 mL føtal bovint serum (FBS), og varme i 37 °C vandbad.
- Tag hætteglasset med prøven fra opbevaring af flydende kvælstof, Overfør prøven til tøris, og tø så hurtigt som muligt i et 37 °C vandbad.
- Når prøven er næsten optøet, tørres hætteglasset med 70% ethanol, og indholdet overføres til et 50 mL konisk rør. Hætteglasset skylles med 1 ml præ-opvarmet imdm + 10% FBS for at indsamle de resterende celler, og tilsæt denne opløsning dråbevis (5 s pr. dråbe) til den optøede prøve, mens du forsigtigt hvirvler røret.
- Tilsæt yderligere 15 ml imdm + 10% FBS dråbevis til prøven, mens du forsigtigt hvirvler røret.
- Pellet cellerne ved centrifugering i 5 min ved 350 x g.
- Fjern alle, men ± 3 mL af supernatanten. Cellerne resuspenderes i den resterende supernatanten og fortyndes ved tilsætning af 20 mL IMDM + 10% FBS Drop-by-Drop, mens røret forsigtigt rystes.
- Tag 10 μL af cellesuspensionen til celletælling. Disse 10 μL fortyndes ved at tilsætte 20 μL 0,4% trypan og et blå opløsning og tælle cellerne ved hjælp af et hemocytometer. Celle nummeret kan falde ved optøning, med op til 50% celle tab efter optøning. Cellelevedygtighed bør variere mellem 70% og 90%.
- Hvis du arbejder med knoglemarv eller navlestrengen blodlegemer, tage op 5 x 106 mononukleare celler til MSC kultur (trin 2,1). Hvis du arbejder med perifert blod, tage op 2 – 5 x 106 celler for T-celle isolation (trin 2,2)
- Pellet resterende celler 5 min ved 350 x g og resuspension i 3 ml FACS buffer (0,05% BSA + 1 mm EDTA i PBS).
- Overfør 1 x 105 celler til et mikrorør fyldt med 200 ΜL FACS buffer, som vil fungere som en negativ kontrol for strømnings cytometri (trin 3,8), og holde på is.
2. cellekultur
Bemærk: For at få kataloger over de somatisk erhvervede mutationer skal donor specifik variation af kimcelle filtreres ud. Når du starter med knoglemarvs biopsier eller navlestrengen blod, kan mesenchymal stromale celler (MSCS) bruges som matchede kontrol til at filtrere for kimcelle variation. I dette tilfælde, Følg afsnit 2,1. Når du bruger (mobiliseret) perifert blod Følg trin 2,2 for at isolere og bruge T-celler som matchede kontrolprøve for at filtrere for kimcelle variation (figur 1). Bulk T-celle populationen vil dele samme Lineage forhold som Hspc'er.
-
MSC kultur
- 50 mL MSC-medium, der indeholder 45 mL DMEM/F12-medium, 10% FBS, 500 μL trypsin eller trypsin-alternativet, og 500 μL penicillin/streptomycin-opløsning, forberedes.
- Pladen ca. 5 x 105 mononukleare celler i 1,5 ml MSC-medium pr. brønd. Cellerne placeres i en befuret inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
- Udskift mediet efter 24 h, og Udskift derefter medium hver 3 dag for at sikre, at alle hæmatopoietiske celler vaskes af. Fortsæt til kulturen, indtil confluency er 100%.
- Hvis MSCs er flydende, bør du vaske celler med 1 mL PBS og høste MSCs ved at tilsætte 200 μL trypsin eller trypsin-alternativet pr. brønd. Inkuber cellerne i 5 minutter ved 37 °C. Tilsæt 800 μL MSC medium, og pipet cellerne op og ned for at løsne cellerne fra brønd pladen.
- Overfør MSCs til mikrocentrifuge røret og pellet cellerne ved centrifugering i 5 min ved 350 x g. Fjern supernatanten, og Fortsæt med DNA-isolation, eller Opbevar pellet ved-20 °C for senere DNA-isolation (punkt 4).
-
T-celle isolation
Bemærk: Hvis du bruger (mobiliseret) perifert blod, kan T-celler isoleres og anvendes som kimcelle kontrol.- Celle pellet opslæmmes i 100 μL anti-CD3-farvningsopløsning (1:100 fortynding af anti-CD-antistoffer i FACS-buffer).
- Cellerne vaskes ved tilsætning af 1 mL FACS-buffer. Cellerne ved centrifugering i 5 min ved 350 x g og resuspension i 300 ΜL FACS buffer.
- Isoler mindst 5 x 105 CD3 + celler ved hjælp af en FACS-sortering i et 5 ml polystyren tube fyldt med 1 ml FBS.
- Pellet de sorteres celler ved hjælp af centrifugering i 5 min ved 350 x g, Fjern supernatanten, og Fortsæt direkte med DNA-isolation (punkt 4) eller Opbevar pellet ved-20 °c for senere DNA-isolation.
3. isolation, sortering og kultur af HSPC
- Spin ned på 1 – 2 x 107 mononukleare celler i 5 min ved 350 x g og resuspension i 50 μl FACS buffer (Se trin 2.2.1). Cellerne overføres til et mikrocentrifuge glas.
Bemærk: Ved sortering med > 2 x 107 celler, øge antistof mix og FACS buffer volumener i overensstemmelse hermed. - Forbered 50 μL af 2x HSC-farvnings blanding i henhold til opskriften i tabel 1.
| Antistof | volumen [μL] |
| BV421-CD34 | 5 |
| FITC-Lineage mix (CD3/14/19/20/56) | 5 |
| PE-CD38 | 2 |
| APC-CD90 | 0,5 |
| PerCP/CY 5.5-CD45RA | 5 |
| PE/Cy7-CD49f | 1 |
| FITC-CD16 | 1 |
| FITC-CD11 | 5 |
| FACS buffer | 25,5 |
Tabel 1: HSC-sortering. Vist er en tabel, der angiver de fortyndinger af antistoffer, som bruges til at sortere Hsc'erne.
- Bland 50 μL celle opløsning med det forberedte HSC-farvnings mix, og Inkuber cellerne i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) eller i 1 time på is, for at antistofferne bindes.
- Cellerne vaskes ved at tilsætte 1 mL FACS-buffer og pellet ved centrifugering i 5 minutter ved 350 x g.
- Cellerne opslæmmes i 300 μL af FACS-buffer, og cellesuspensionen filtreres gennem et 35 μm-celle belastet 5 mL polystyren slange til fjernelse af celle klumper før fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS).
- Der forberedes 25 mL HSPC-kulturmedium bestående af 1x SFEM-medium suppleret med 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6 og 100 ng/mL antibiotika formulering (Se tabel over materialer).
- Fyld en 384 brønd cellekultur plade med 75 μL HSPC-kulturmedium i hver brønd.
Bemærk: For at forhindre fordampning af mediet i de ydre brønde skal du fylde de ydre brønde med 75 μL sterilt vand eller PBS og ikke bruge disse brønde til celle sortering. -
Sortering af enkelte Hspc'er
- Sæt Gates til HSPC sortering baseret på en ufarvet kontrol (trin 1,9) og 10.000 celler fra den farvede prøve. Et repræsentativt resultat for indstilling af porte er afbildet i figur 1. Gate enkeltceller ved at tegne en port omkring den lineære FSC-højde vs. FSC-område fraktion. Brug uplettet kontrol fraktion til at tegne Gate for Lineage- fraktion. Tegn Gates for CD34+ celler og yderligere karakterisere denne delmængde ved at sætte en bestemt port til CD38- CD45RA- celler.
- Læg 384 brønd pladen på FACS-maskinen og sortér enkeltceller.
Bemærk: Hvis det er relevant for FACS-maskinen, skal du skifte til indstillingen for at beholde indeks sorterings data for at aktivere gensporing af de sorterede celler.
-
Dyrkning af enkeltvis-sorteret HSCs
- Overfør 384 brønd pladen direkte til en befugret 37 °C inkubator med 5% CO2.
Bemærk: For at forhindre fordampning under kulturen, wrap 384 godt kultur plade (med låg) i transparent polyethylen wrap. - Hold 384 brønd pladen i inkubator i 3 – 4 uger, indtil synlige kloner vises. Repræsentative billeder af klonal kultur er afbildet i figur 2. Baseret på tilstanden af input materialet 5% – 30% af de sorteret celler vil klonalt udvide.
- Overfør 384 brønd pladen direkte til en befugret 37 °C inkubator med 5% CO2.
4. høst af HSPC-kloner
- Efter 4 ugers dyrkning, afgøre, hvilke brønde har en konfluency på 30% eller højere.
- Pre-fill (for hver klon udvækst) 1,5 ml mikrorør med 1 ml 1% BSA i PBS og etiketten røret i henhold til den tilsvarende brønd.
- Før våd en pipettespids med 1% BSA i PBS for at minimere antallet af celler, der klæber til pipettespidsen.
- Pipet op/ned i mediet i brønden voldsomt (mindst 5 gange) med en 200 μL pipette (sat til 75 μL) og skrabe bunden af brønden for at løsne cellerne i brønden, og indsamle cellesuspensionen i det mærkede mikrorør svarende til brønden.
- Tag 75 μL frisk 1% BSA i PBS og Gentag pipettering i brønden for at sikre maksimal optagelse af celler.
Bemærk: Clonally dyrkede celler kan holde sig til bunden af godt. Inspicer brøndene ved hjælp af en standard inverteret lys mikroskop for at sikre, om alle celler er blevet indsamlet. - Hvis alle brønde med > 30% konfluency er høstet, Placer 384 brønd pladen tilbage i inkubator. Klonale kulturer kan formere sig i op til 5 uger.
- Drej cellesuspensionen ned i 5 minutter ved 350 x g. En lille pellet skal være synlig.
- Fjern forsigtigt alle, men ca. 5 μL supernatant. Celle pellets kan fryses ved-20 °C og opbevares i flere måneder før DNA isolation.
5. DNA-isolation
-
Isoler HSPC-og MSC/T-Cell-DNA ved hjælp af et mikroskala-DNA-isolations sæt i henhold til producentens instruktion med følgende justeringer:
- Der tilsættes 2 μL RNase A efter tilsætning af buffer AL under punkt 2. Inkuber i 2 min. før tilsætning af proteinase K.
- Inkuber i 30 min ved 56 °C i stedet for 10 min.
- Elute DNA ved at indlæse søjlen med 50 μL TE buffer med lav EDTA (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA). For optimal elution, Genindlæs eluatet igen på søjlen og drej igen.
- DNA-koncentrationen bestemmes ved hjælp af et DNA, der måler 2 μL pr. klon. DNA-udbyttet varierer typisk mellem 0,5 – 3 ng/μL.
6. sekvensering
- Udfør DNA-sekvensering som beskrevet af jager et al.13
7. kortlægning og somatisk mutation opkald
- Kort output af sekvensering (FASTQ filer) til reference genomet og kalde mutationer som beskrevet i jager et al.13
- Undersøg dataene for afvigende karyotypiske ændringer i sekvenserede klon-og bulk-data ved hjælp af et kopierings nummer analyseværktøj, såsom Control-FreeC14. Indtil nu har vi ikke rapporteret nogen Hspc'er med karyotypic aberrances.
- Generer en sort liste, som består af et panel af uovertruffen normale prøver til filtreringsformål fra et eget sæt af prøver, som tidligere beskrevet13, eller brug følgende uploadede blackliste: < https://data.mendeley.com/DataSets/9y4yhwt5rp/3 >.
- Filtrer enkelt nukleotidvariationer ved hjælp af SNVFI < https:/github.com/Toolsvanbox/snvfi >.
- Den forudindstillede SNVFI. config-fil, så alle stier til hjælpefunktioner er korrekte.
- Kør SNVFI med. ini-filen konfigureret i henhold til de indstillinger, som er vist i supplerende fil 1 (snvfi. ini). For at udelukke in vitro-inducerede mutationer filtrerer vi for en VAF ≥ 0,39.
- Kontrollér den variable allel fraktion (VAF)-udgang for snvfi (figur 4). Kontroller, om toppen af tætheden plot er nær 0,5, hvilket indikerer, at prøven er klonal.
-
Valgfrit: For at bestemme den del af genomet, der er dækket under filtreringen, skal du bestemme de kaldelig områder langs kimcelle og kontrol ved hjælp af callableloci fra gatk (genom Analysis Toolkit):
Java-jar GenomeAnalysisTK. jar \
-T CallableLoci \
-R reference. fasta \
-Jeg myreads. bam \
-Resumé tabel. txt \
-o callable_status. Bed -
Valgfrit: Hent de Kaldelig regioner fra CallableLoci-outputtet, og Udfør parvise kryds mellem prøverne og hovedparten ved hjælp af Python-scriptet CallableLoci_processor. py til stede på https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . De resulterende seng filer kan bruges til yderligere at filtrere output af snvfi og til at inspicere Mutations profil i afsnit 9:
CallableLoci_processor. py dir_in dir_out sample_name bulk_name – prøver sample1 sample2 sample3
8. Indel-opkald
- Vælg alle indsættelser og sletninger (indrykninger) i raw_variants. vcf-filen ved hjælp af GATK Selectvarianter:
Java-Xmx12G \
-jar GenomeAnalysisTK. jar \
-T Selectvarianter \
-R reference_genome. fasta \
-V raw_variants. vcf \
-o raw_INDELs. vcf \
-selectType INDEL - Filtrer raw_INDELS. vcf-liste ved hjælp af INDELFI < https:/github.com/Toolsvanbox/indelfi >:
Perl INDELFI.pl-i input. vcf (fra trin 8,1) \
-s kolonne test eksempel \
-c kolonne kontrolprøve
9. inspektion af mutational profil
- Brug de resulterende. vcf-filer fra snvfi-output fra trin 7,6 (eller fra trin 7,9 med valgfri loci-analyse, der kan kaldes) til at analysere genomisk Mutations-profilen, Mutations typer og signatur analyse ved hjælp af R-pakken mutationalpatterns15: < http://bioconductor.org/Packages/Release/bioc/HTML/mutationalpatterns.html >. For repræsentativt output, der kan produceres med den resulterende. vcf fil såsom en 96-trinucleotid Mutations spektrum, se figur 5.
10. opførelse af et udviklingsmæssigt Linetræ ved hjælp af base substitutioner
- Hvis du vil konstruere et udviklingsmæssigt Lineage-træ, skal du registrere delte mutationer mellem kloner. Mutationer til stede i de første grene af Lineage træet kan også subclonally til stede i bulk prøve (MSCs/T-celler). Senere forgreninger vil blive defineret af mutationer, der kun deles af HSPC-kloner.
- Udfør følgende trin for at identificere de mutationer, der findes i en delmængde af klonerne og subclonally til stede i bulk.
- For at filtrere for somatiske mutationer, der deles mellem kloner, skal du køre filterSomatic.py-scriptet i en UNIX-baseret terminal. Scriptet kan findes på https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Før du kører dette script, skal du redigere filen filterSomatic. ini (Se supplerende fil 2) for at angive stierne og justere de andre parametre.
- Kør filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py-i filterSomatic. ini).
- Filtrer efter mutationer, der er subklonalt til stede i bulk ved hjælp af Determine_lowVAF_bulk. R-script i en UNIX-baseret terminal. Scriptet kan findes på https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Dette vil generere separate. vcf-filer til delte og entydige SNVs:
Rscript Determine_lowVAF_bulk. R
--vcf sti/til/Filter_somatic_output. vcf
--bulk bulk_name
--sample_name Sample-navn
--køn [M | F
--out_dir out_dir - Bestem alle mutationer, der deles mellem kloner, som ikke findes i bulkprøven, ved at overlappe alle Mutations positioner (sammenkæde kolonne 1 og 2 i SNVFI-output).
- Udelad falske positiver opnået under trin 10,5 og 10,6 ved manuel inspektion ved hjælp af IGV16. Mutationer betragtes som falske, når de ikke er til stede, når mutationen er til stede i kimcelle, eller når den findes i dårligt kortlagte områder, se figur 7.
Bemærk: Vi anbefaler stærkt at re-sekvens alle delte loci selvstændigt ved hjælp af målrettede eller sanger sekvensering. - Brug de delte mutationer opnået under trin 10,1 og 10,2 til at opbygge en binær tabel med mutationer versus sekvenserede kloner med 0, der indikerer, at mutationen ikke er til stede, og 1 indikerer tilstedeværelsen af mutationen.
- Output mutation binære tabel som i en heatmap sammen med en dendrogram angiver Lineage relationer mellem celler ved hjælp af R. Heatmap angiver mutationer status for hver celle. Se output af denne funktion (figur 6).
Kloner <-Læs. table ("sti/til/BinaryTable")
my_palette <-colorRampPalette (c ("#cccccc", "#333333")) (n = 2)
col_breaks <-c (0, 0,5, 1)
heatmap. 2 (kloner, distfun = funktion (x) dist (x, metode = ' binær '),
hclustfun = funktion (x) hclust (x, metode = gennemsnit),
dendrogram = "kolonne", Rowv = F,
Col = my_palette, pauser = col_breaks,
Trace = "none", tæthed. info = "none")
Representative Results
Eksperimentel procedure
Den eksperimentelle arbejdsgang er afbildet i figur 1. Afhængigt af typen af inputmateriale skal der følges forskellige trin. I figur 2 afbildes en flow cytometrisk udgang af en navlestrengsblod celle. Først vælges alle monocytiske celler ved løst at tegne en port omkring denne population. Derefter isoleres undertrøjer ved at vælge for celler med et lineært FSC-h/FSC-a-forhold, da et lavere FSC-h/FSC-a-forhold omfatter form eller celle klumper. Den ufarvede kontrolprøve bruges til at definere celle sortering Gates for Lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-. Derudover kan CD90 og CD49f bruges til at skelne mellem stamceller fra progenitorcellerne eller selv fornyer celler17 (figur 2). Indeks sortering gør det muligt at genspore individuelle celler, og de sorterede celler afbildes som brune prikker. Under cellekulturen, individuelle kloner kan ekspandere i et andet tempo, med nogle kloner ekspanderende inden for 3 uger, mens andre kloner er kun fuldt udbygget indtil den femte uge af kulturen. Se figur 3a, B for repræsentativ koloni udvækst. Et repræsentativt billede er vist i en næsten flydende MSC bulk kultur på 11 dage efter plating (figur 3c).
Kontrol af kvalitet efter sekvensering og mutation analyse
Vist er et eksempel på output af kopi nummer analyse genereret af Control-FreeC14 for at kontrollere for kopier nummerændringer (figur 4). Karyotypic-oplysninger kan indikere, hvilke kromosomer der skal udelukkes under en SNVFI-løbetur (trin 7,6). Den VAF plot skabt af snvfi (figur 5) er et histogram af varianten allel frekvenser i prøven. Et højdepunkt i tæthed plot på 0,5 indikerer prøven er klonal. For at få mere indsigt i de underliggende biologiske årsager bag mutationer, kan disse analyseres ved hjælp af R-pakken MutationalPatterns15. Afbildet her er en typisk analyse, der producerer et 96-trinucleotid plot (figur 6). Ud over kvantificering af forskellige Mutations typer kan signatur ekstraktion også udføres med dette værktøj.
Opbygning af et udviklingsmæssige Lineage træ
Mutationer, der deles mellem kloner eller findes i en klon (og ved lav VAF) i kimcelle-kontrolelementet, valideres ved hjælp af igv. Mutationer anses for at være sande, når de findes i prøven og ikke ved høje VAF-niveauer i kimcelle (figur 7a). Mutationer betragtes som falske, når de ikke findes i IGV, hvilket kan ske i dårligt kortlagte regioner (figur 7b). I andre tilfælde er hændelser, der opdages af snvfi, sprunget med kimcelle-mutationer (figur 7c). Uafhængig re-Sequencing af mutationer ved målrettet re-sekventering anbefales stærkt for disse mutationer i udvalgte kloner. Efter påvisning af delte somatiske mutationer mellem kloner genereres en binær matrix (trin 10,8). En heatmap er konstrueret med celler med og uden de delte mutationer A-M. Over denne heatmap det udviklingsmæssige Lineage træ er indiceret (figur 8).
Figur 1: rutediagram, som viser eksperimentel procedure baseret på inputmateriale. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: celle sorterings strategi. For det første udføres gating på små mononukleare celler. For det andet, enkeltceller er gated ved udvælgelse af den lineære fraktion. Lineage negative celler er gated. Alle CD34+ CD38- CD45- celler er enkelt celle-sorteret. Den fraktion af celler i brun skal bemærkes, som er de sorterede celler fremhævet af indstillingen "index sortering". Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative cellekultur resultater. Repræsentative HSPC kloner i en 384 brønd plade på (a) 2 uger efter plating og (B) 4 uger efter plating. C) MSC-kulturen efter 2 ugers medium udskiftning. Scale bar = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Karyotyper. A) KLONAL HSPC-kultur og (B) MSC-bulkprøve. Karyotyperne blev bestemt af en læse Dybdeanalyse. Begge grafer indikerer en karyotypisk normal prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: histogram af variant allel frekvenser. Histogram af variant allel frekvenser af varianterne i en klon før det sidste filtreringstrin af snvfi (VAF > 0,3). Et højdepunkt ved VAF = 0,5 angiver, at eksemplet er klonal. De subklonale mutationer med lav VAF er udelukket under sidste filtreringstrin af SNVFI (VAF > 0,3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: repræsentativ analyse af de somatiske mutationer i en HSPC-prøve. Afbildet er det relative bidrag af hver trinucleotid ændring (som den midterste base er muteret) til det samlede spektrum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: manuel inspektion af mutationer ved hjælp af IGV16. A) mutationer anses for at være sande, når de findes i klonen og ikke i bulkprøven. (B) mutationer betragtes som falske positiver, når de findes i et dårligt kortlagt område. (C) mutationer betragtes som falske positiver, når de findes i en kimcelle kontrol. Den lodrette linje angiver positionen af en såkaldt mutation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: opførelse af et udviklingsmæssigt lineår træ. Afbildet er et dendrogram indikerer udviklingsmæssige nedstamningens opdeling under udvikling. Heatmap under dendrogram indikerer tilstedeværelsen af mutationer i forskellige kloner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Præsenteret her er en metode til at detektere mutationer, der akkumuleres underlivet i individuelle Hspc'er og til at konstruere en tidlig udviklingsmæssige Lineage træ ved hjælp af disse mutation data.
Flere kritiske krav skal opfyldes for at kunne udføre disse assays. For det første skal det sikres, at stikprøven er rentabel. Hurtig håndtering af prøven er nøglen til at sikre effektiviteten af proceduren. For det andet, tab af vækstfaktor styrke vil indvirke negativt på klonal ekspansion af Hspc'er. For at sikre høj vækstfaktor styrke, er det vigtigt at undgå fryse-tø cyklusser og forberede engangs-Aliquots. For det tredje, efter at have udført WGS, mutation Calling og filtrering, er det afgørende at validere den klonale kulturs clonalitet. For at bekræfte den clonalitet af kulturen, VAF af mutationer bør klynge omkring af 0,5 i en karyotypisk normal prøve (figur 3). I celler med en lav Mutations belastning, såsom navlestrengsblod hspc'er, er det vanskeligere at bestemme clonalitet på grund af de lave mutation tal.
Vores tilgang er afhængig af in vitro-udvidelse af enkeltceller for at give mulighed for WGS. Derfor er vores tilgang begrænset til celler, der har det replikerende potentiale til at ekspandere, såsom Hspc'er. I vores hænder, omkring 5%-30% af alle enkelt-sorteret celler er i stand til at ekspandere tilstrækkeligt. Reducerede udvækstsatser kan potentielt resultere i en selektions skævhed. Som diskuteret tidligere, metoder ved hjælp af WGA kan overvinde denne udvælgelse bias som denne teknik er ikke stole på udvidelsen af celler. WGA har dog sine egne mangler, og klonal forstærkning er den eneste metode til præcist at bestemme antallet af mutationer i hele genomet uden alleliske dropouts og lige dækning langs genomet, især i prøver med lav true somatiske Mutations numre.
De data, der genereres ved hjælp af denne metode, kan anvendes til at bestemme fylogenier af det hæmatopoietiske system, da mutationer detekteret i enkeltceller kan bruges til at dissekere celle lineages, som afbildet i figur 6. Typisk kan en eller to mutationer definere hver gren i en sund donor1. Da nedstamningens gren tidligt efter undfangelsen, vil mutationer definere disse første grene også være til stede med en lav VAF i den matchede normale prøve, der blev brugt til filtrering af kimcelle varianter1,18,19. I dette tilfælde er brugen af ikke-hæmatopoietiske celler, såsom MSCs, foretrækkes, da de forventes at adskille meget tidligt under udviklingen fra det hæmatopoietiske system. Da T-celler er af hæmatopoietisk oprindelse, brugen af disse celler som en matchet normal prøve til at filtrere kimcelle varianter kunne derfor forvirre opførelsen af den tidligste forgrening af den udviklingsmæssige Lineage træ. Subklonal tilstedeværelse af gren specifikke mutationer i visse modne blod populationer, som kan måles ved målrettet dyb sekvensering, vil indikere, at afkom af denne gren kan give anledning til denne modne celletype. Desuden giver vores tilgang mulighed for at vurdere de muterede konsekvenser af mutagen eksponering in vivo og i sidste ende, hvordan dette kan bidrage til leukæmi udvikling.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af en VIDI Grant af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO) (no. 016. Vidi. 171.023) til R. v. B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| 50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
| CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
| CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
| CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
| CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
| CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
| CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
| CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
| Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
| CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
| Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
| Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
| Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
| Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
| PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
| RNAse A | Qiagen | 19101 | |
| SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
| StemSpan SFEM, 500 mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
| TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |
References
- Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).
- Genovese, G., et al. Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence. New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes. New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).
- Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. Nature Communications. 7, 1-7 (2016).
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer. Cell Reports. 3, 246-259 (2013).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500, 415-421 (2013).
- Alexandrov, L., et al. The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer. bioRxiv. , (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. 513, 422-425 (2014).
- Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538, 260-264 (2016).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: Current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).
- Dong, X., et al. Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells. Nature Methods. 14, 491-493 (2017).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150, (2012).
- Jager, M., et al. Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures. Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).
- Boeva, V., et al. Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data. Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).
- Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes. Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. , (2011).
- Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561, 473-478 (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. , (2014).
