Summary
Les modèles de mutation somatiques dans les cellules reflètent l'exposition mutagène précédente et peuvent indiquer des relations de lignée développementale. Présenté ici est une méthodologie pour cataloguer et analyser les mutations somatiques dans les cellules hématopoïétiques individuelles de tige et d'ancêtre.
Abstract
Les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre (HSPc) accumulent graduellement des mutations d'ADN pendant une durée de vie, qui peuvent contribuer aux maladies âge-associées telles que la leucémie. Caractériser l'accumulation de mutation peut améliorer la compréhension de l'étiologie des maladies liées à l'âge. Présenté ici est une méthode pour cataloguer les mutations somatiques dans les HSPC individuels, qui est basé sur le séquençage du génome entier (WGS) des cultures cellulaires primaires clonales. Les mutations présentes dans la cellule d'origine sont partagées par toutes les cellules de la culture clonale, tandis que les mutations acquises in vitro après le tri cellulaire sont présentes dans un sous-ensemble de cellules. Par conséquent, cette méthode permet une détection précise des mutations somatiques présentes dans les génomes des HSPC individuels, qui s'accumulent au cours de la vie. Ces catalogues de mutations somatiques peuvent fournir des informations précieuses sur les processus mutationnels actifs dans le tissu hématopoïétique et comment ces processus contribuent à la leukemogénèse. En outre, en évaluant les mutations somatiques qui sont partagées entre plusieurs HSPC de la même lignée individuelle, les relations de lignée clonaque et la dynamique de population des populations sanguines peuvent être déterminées. Comme cette approche repose sur l'expansion in vitro des cellules individuelles, la méthode est limitée aux cellules hématopoïétiques avec un potentiel réplicif suffisant.
Introduction
L'exposition des cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre (HSPC) aux sources mutagenic endogènes ou extrinsèques contribue à l'accumulation progressive des mutations dans l'ADN pendant une durée de vie1. L'accumulation graduelle de mutation dans HSPcs1 peut avoir comme conséquence l'hématopoiesis clonal relatif à l'âge (ARCH)2,3, qui est une condition non-symptomatique conduite par HSPcs portant des mutations leucémie-conducteur. Initialement, on pensait que les personnes atteintes d'ARCH ont un risque accru de leucémie2,3. Cependant, des études récentes ont montré une incidence de 95% de arch chez les personnes âgées4, ce qui rend l'association avec les tumeurs malignes moins claire et soulevant la question de savoir pourquoi certaines personnes atteintes d'ARCH finissent par développer ou ne développent pas de tumeurs malignes. Néanmoins, les mutations somatiques dans les HSPC peuvent poser de graves risques pour la santé, car les troubles myélodysplasiques et la leucémie sont caractérisés par la présence de mutations spécifiques du conducteur du cancer.
Pour identifier les processus mutationnels et étudier la clonalité sanguine, l'accumulation de mutation dans les HSPC individuels doit être caractérisée. Les processus mutationnels laissent des modèles caractéristiques dans le génome, ce que l'on appelle les signatures mutationnelles, qui peuvent être identifiés et quantifiés dans des collections de mutations à l'échelle du génome5. Par exemple, l'exposition à la lumière UV, aux agents alkylants et aux défauts des voies de réparation de l'ADN ont été associées à une signature mutationnelle différente6,7. En outre, en raison de la nature stochastique des accumulations de mutation, la plupart (sinon la totalité) des mutations acquises sont uniques entre les cellules. Si des mutations sont partagées entre plusieurs cellules d'un même individu, cela indique que ces cellules partagent un ancêtre commun8. Par conséquent, en évaluant les mutations partagées, les relations de lignée peuvent être déterminées entre les cellules et un arbre de lignée développementale peut être construit branche par branche. Cependant, le catalogage des mutations somatiques rares dans les cellules physiologiquement normales est techniquement provocant en raison de la nature polyclonal des tissus sains.
Présenté ici est une méthode pour identifier et déterminer avec précision les mutations somatiques dans les génomes des HSPC individuels. Cela implique l'isolement et l'expansion clonale des HSPC in vitro. Ces cultures clonales reflètent la composition génétique de la cellule d'origine (c.-à-d. que les mutations de la cellule d'origine seront partagées par toutes les autres cellules de la culture). Cette approche nous permet d'obtenir suffisamment d'ADN pour le séquençage du génome entier (WGS). Nous avons déjà montré que les mutations accumulées in vitro pendant la culture clonale seront partagées par un sous-ensemble de cellules. Cela permet le filtrage de toutes les mutations in vitro, car celles-ci seront présentes dans une plus petite fraction de lectures par rapport aux mutations acquises in vivo9. Les méthodes précédentes ont obtenu suffisamment d'ADN à partir d'une seule cellule pour WGS en utilisant l'amplification du génome entier (WGA)10. Cependant, le principal inconvénient de la WGA est son amplification relativement sujette aux erreurs et déséquilibrée du génome, ce qui peut entraîner des abandons allèle11. Néanmoins, comme cette approche repose sur l'expansion in vitro des cellules individuelles, elle se limite aux cellules sanguines ayant un potentiel réplicif suffisant, ce qui n'est pas le cas pour les méthodes dépendantes de la WGA. Les efforts antérieurs de séquençage des cultures clonales ont compté sur l'utilisation de couches d'alimentation pour assurer l'amplification clonale des HSPC simples12. Cependant, l'ADN des couches d'alimentation peut potentiellement contaminer l'ADN des cultures clonales, confondant l'appel et le filtrage ultérieurs de mutation. La méthode présentée ici repose uniquement sur un moyen précis d'expansion ponctuelle des HSPC uniques, et évite ainsi la question de la contamination par l'ADN. Jusqu'à présent, nous avons appliqué avec succès cette méthode sur la moelle osseuse humaine, le sang de cordon, la moelle osseuse bien gelée et le sang périphérique.
Protocol
Les échantillons doivent être obtenus conformément aux protocoles d'éthique appropriés, et les donneurs doivent donner un consentement éclairé avant la procédure.
1. Préparation du matériel d'échantillon
REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec du matériel fraîchement obtenu, commencez par l'étape 1.1. Lorsque vous travaillez avec du matériel congelé, commencez par l'étape 1.2.
-
Préparation de la moelle osseuse fraîche, du sang de cordon ombilical ou du sang périphérique
- Isolez la fraction mononucléaire de l'échantillon à l'aide de la séparation du gradient de densité en suivant les instructions des fabricants (voir tableau des matériaux),et comptez les cellules mononucléaires à l'aide d'un hémocytomètre. Après l'isolement des cellules mononucléaires, continuez avec l'étape 1.3.
- OPTIONAL: Le nombre recommandé de cellules nécessaires pour trier une plaque complète de 384 puits de HSPC est de 1 x 2 x 107. Si plus de cellules sont isolées pendant la centrifugation de gradient de densité, stocker le surplus de cellules dans l'azote liquide.
- Resuspendre les cellules dans 500 'L de l'IMDM ' 10% FBS par 1 x 107 cellules, et ajouter goutte à goutte un volume égal d'IMDM - 30% FBS - 20% DMSO pour atteindre une suspension de 1 x 107 cellules dans 1 ml d'IMDM - 20% FBS - 10% DMSO.
- Transférer immédiatement les cellules mononucléaires à 1 ml de flacons cryogéniques et congeler les cellules à -80 oC dans un contenant de congélation cellulaire à taux contrôlé pendant la nuit. Transférer les cellules le lendemain dans un stockage d'azote liquide lors d'un traitement ultérieur.
-
Préparation des cellules mononucléaires congelées à partir de moelle osseuse, de sang de cordon ombilical ou de sang périphérique
- Préparer 50 ml de milieu de décongélation cellulaire contenant 45 ml de milieu de l'aigle modifié (IMDM) d'Iscove et 5 ml de sérum bovin fœtal (SF), et réchauffer dans un bain d'eau de 37 oC.
- Prenez le flacon contenant l'échantillon du stockage d'azote liquide, transférez l'échantillon dans la glace sèche et décongelez le plus rapidement possible dans un bain d'eau à 37 oC.
- Lorsque l'échantillon est presque décongelé, essuyez le flacon avec 70 % d'éthanol et transférez son contenu dans un tube conique de 50 ml. Rincer le flacon avec 1 ml d'IMDM pré-chauffé - 10% FBS pour recueillir les cellules restantes, et ajouter cette solution dans le sens goutte (5 s par goutte) à l'échantillon décongelé tout en tourbillonnant doucement le tube.
- Ajouter un supplément de 15 ml d'IMDM pré-chauffé, soit 10 % FBS dans le sens de la chute de l'échantillon tout en faisant tourbillonner doucement le tube.
- Pelleter les cellules par centrifugation pendant 5 min à 350 x g.
- Enlever tout sauf 3 mL du supernatant. Resuspendre les cellules dans le supernatant restant et diluer en ajoutant 20 ml d'IMDM - 10% FBS drop-by-drop tout en secouant doucement le tube.
- Prenez 10 l de la suspension cellulaire pour le comptage cellulaire. Diluer ces 10 L en ajoutant 20 L de solution bleue trypan de 0,4 % et compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Le nombre de cellules peut diminuer lors de la décongélation, avec jusqu'à 50% de perte cellulaire après la décongélation. La viabilité des cellules devrait se situer entre 70 % et 90 %.
- Si vous travaillez avec de la moelle osseuse ou des cellules sanguines du cordon ombilical, prenez 5 x 106 cellules mononucléaires pour la culture MSC (étape 2.1). Si vous travaillez avec du sang périphérique, prenez 2 à 5 x 106 cellules pour l'isolement des lymphocytes T (étape 2.2)
- Pelletez les cellules restantes 5 min à 350 x g et suspendez-les en 3 ml de tampon FACS (0,05 % BSA et 1 mM EDTA en PBS).
- Transférer 1 x 105 cellules dans un microtube rempli de 200 l de tampon FACS, qui servira de contrôle négatif pour la cytométrie du débit (étape 3.8), et garder sur la glace.
2. Culture cellulaire
REMARQUE: Pour obtenir des catalogues de mutations acquises de façon somatique, la variation germinale spécifique aux donneurs doit être filtrée. En commençant par des biopsies de moelle ou du sang de cordon ombilical, les cellules stromales mésenchymales (MSCs) peuvent être employées comme commande assortie pour filtrer pour la variation de germline. Dans ce cas, suivez l'article 2.1. Lors de l'utilisation (mobilisée), le sang périphérique suit l'étape 2.2 pour isoler et utiliser les lymphocytes T comme échantillon témoin apparié pour filtrer la variation de la lignée germinale (figure 1). La population de lymphocytes T en vrac partagera la même relation de lignée que les HSPC.
-
Culture MSC
- Préparer 50 ml de milieu MSC contenant 45 ml de milieu DMEM/F12, 10 % de FBS, 500 l d'alternative de trypsine ou de trypsine, et 500 l de solution de pénicilline/streptomycine.
- Plaque environ 5 x 105 cellules mononucléaires dans 1,5 ml de mSC moyen par puits. Placer les cellules dans un incubateur humidifié à37 oC avec 5 % de CO 2.
- Remplacer le milieu après 24 h, et ensuite remplacer le milieu tous les 3 jours pour s'assurer que toutes les cellules hématopoïétiques sont lavées. Continuer à la culture jusqu'à ce que la confluence est de 100%.
- Si les MSC sont confluents, lavez les cellules avec 1 ml de PBS et récoltez les MSC en ajoutant 200 L de trypsine ou de trypsine alternative par puits. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 oC. Ajouter 800 L de milieu MSC, et pipet les cellules de haut en bas pour desserrer les cellules de la plaque de puits.
- Transférer les MSC dans le tube microcentrifugeet les cellules par centrifugation pendant 5 min à 350 x g. Retirez le supernatant et continuez avec l'isolement de l'ADN ou stockez la pastille à -20 oC pour l'isolement ultérieur de l'ADN (section 4).
-
Isolement des lymphocytes T
REMARQUE: Si l'on utilise du sang périphérique (mobilisé), les lymphocytes T peuvent être isolés et utilisés comme mesure germinale.- Resuspendre la pastille cellulaire dans 100 l de solution de coloration anti-CD3 (1:100 dilution de l'anticorps anti-CD dans le tampon FACS).
- Laver les cellules en ajoutant 1 ml de tampon FACS. Pelleter les cellules par centrifugation pendant 5 min à 350 x g et resuspendre dans 300 l de tampon FACS.
- Isolez au moins 5 x 105 cellules CD3MD à l'aide d'un trieur FACS dans un tube de polystyrène de 5 ml prérempli de 1 ml de FBS.
- Pelleter les cellules triées à l'aide de centrifugation pendant 5 min à 350 x g,enlever le supernatant, et continuer directement avec l'isolement de l'ADN (section 4) ou stocker la pastille à -20 oC pour l'isolement ultérieur de l'ADN.
3. Isolement, tri et culture HSPC
- Faites tourner à 1/2 x 107 cellules mononucléaires pendant 5 min à 350 x g et suspendez-les en 50 oL de tampon FACS (voir l'étape 2.2.1). Transférer les cellules dans un tube de microcentrifuge.
REMARQUE: Lors du tri avec les cellules de l'organisme de tri avec les cellules de l'organisme de protection des anticorps et des volumes de tampons FACS en conséquence. - Préparer 50 l de mélange de coloration HSC 2x selon la recette vue dans le tableau 1.
| anticorps | volume [L] |
| BV421-CD34 (en anglais seulement) | 5 Annonces |
| Mix FITC-Lineage (CD3/14/19/20/56) | 5 Annonces |
| PE-CD38 (en) | 2 (en) |
| APC- CD90 | 0,5 |
| PerCP/Cy5.5 - CD45RA | 5 Annonces |
| PE/Cy7- CD49f | 1 Fois |
| FITC - CD16 | 1 Fois |
| FITC-CD11 | 5 Annonces |
| Tampon FACS | 25,5 annonces |
Tableau 1 : Mélange de tri HSC. Il s'agit d'un tableau indiquant les dilutions des anticorps utilisés pour trier les HSC.
- Mélanger 50 lde de solution cellulaire avec le mélange de coloration HSC préparé et incuber les cellules pendant 15 min à température ambiante (RT) ou pendant 1 h sur la glace pour que les anticorps se lient.
- Laver les cellules en ajoutant 1 ml de tampon FACS et de granulés en centrifuge pendant 5 min à 350 x g.
- Resuspendre les cellules dans 300 l de tampon FACS et filtrer la suspension cellulaire à travers un tube de polystyrène de 5 ml à capacité de 35 ml pour enlever les amas cellulaires avant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
- Préparer 25 mL de milieu de culture HSPC, composé de 1x SFEM milieu complété par 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL- 6, et 100 ng/mL formulation antibiotique (voir Tableau des matériaux).
- Remplissez une plaque de culture de cellules de puits de 75 oL de milieu de culture HSPC dans chaque puits.
REMARQUE: Pour éviter l'évaporation du milieu dans les puits extérieurs, remplissez les puits extérieurs avec 75 l'eau stérile ou PBS, et n'utilisez pas ces puits pour le tri cellulaire. -
Tri des HSPC simples
- Fixez les portes pour le tri HSPC basé sur un contrôle non taché (étape 1.9) et 10.000 cellules de l'échantillon taché. Un résultat représentatif pour l'établissement des portes est représenté dans la figure 1. Portez les cellules simples en dessinant une porte autour de la fraction linéaire fSC-hauteur vs FSC-zone. Utilisez la fraction de contrôle non tachée pour tracer la porte de la lignée- fraction. Dessinez des portes pour les cellules CD34 et caractérisez davantage ce sous-ensemble en fixant une porte spécifique pour les cellules CD38- CD45RA.
- Chargez la plaque de puits 384 sur la machine FACS et triez les cellules individuelles.
REMARQUE: S'il s'applique à la machine FACS, basculez sur l'option de conserver les données de tri d'index pour permettre le retraçage des cellules triées.
-
Cultiver des HSC triés
- Transférer directement la plaque de puits 384 dans un incubateurhumidifié de 37 oC avec 5 % de CO 2.
REMARQUE: Pour éviter l'évaporation pendant la culture, enveloppez la plaque de culture de puits 384 (avec couvercle) dans un enveloppement transparent en polyéthylène. - Gardez la plaque de puits 384 dans l'incubateur pendant 3 à 4 semaines jusqu'à l'apparition de clones visibles. Des images représentatives de la culture clonale sont représentées dans la figure 2. Sur la base de l'état du matériau d'entrée 5%-30% des cellules triées se développera de façon cloonale.
- Transférer directement la plaque de puits 384 dans un incubateurhumidifié de 37 oC avec 5 % de CO 2.
4. Récolte des clones HSPC
- Après 4 semaines de culture, déterminer quels puits ont une confluence de 30% ou plus.
- Préremplir (pour chaque excroissance cloaque) 1,5 ml de microtubes avec 1 ml de 1% de BSA en PBS et étiqueter le tube en fonction du puits correspondant.
- Prémouiller une pointe de pipette avec 1% BSA en PBS pour minimiser le nombre de cellules collant à la pointe de pipette.
- Pipet up/down the medium in the well farouchement (au moins 5 fois) avec une pipette de 200 l (fixée à 75 l) et gratter le fond du puits pour desserrer les cellules dans le puits, et recueillir la suspension cellulaire dans le microtube étiqueté correspondant au puits.
- Prenez 75 L de BSA frais de 1 % en PBS et répétez le tuyautage dans le puits pour assurer une prise maximale de cellules.
REMARQUE: Les cellules cultivées de façon clonale peuvent coller au fond du puits. Inspectez les puits à l'aide d'un microscope à lumière inversée standard pour vérifier si toutes les cellules ont été recueillies. - Si tous les puits avec une confluence de 30 % ont été récoltés, placez la plaque de puits 384 dans l'incubateur. Les cultures clonales peuvent proliférer jusqu'à 5 semaines.
- Faites tourner la suspension cellulaire pendant 5 min à 350 x g. Une petite boulette doit être visible.
- Retirez soigneusement tous, sauf environ 5 l de supernatant. Les granulés cellulaires peuvent être congelés à -20 oC et stockés pendant plusieurs mois avant l'isolement de l'ADN.
5. Isolement de l'ADN
-
Isoler l'ADN HSPC et MSC/Cellule T à l'aide d'une trousse d'isolement de l'ADN à micro-échelle selon les instructions du fabricant avec les ajustements suivants :
- Ajouter 2 ll de RNase A après ajout de tampon AL pendant la section 2. Incuber pendant 2 min avant d'ajouter la protéase K.
- Incuber pendant 30 min à 56 oC au lieu de 10 min.
- Élirez l'ADN en chargeant la colonne avec un tampon TE de 50 l avec un faible EDTA (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA). Pour une élution optimale, rechargez à nouveau l'éluate sur la colonne et tournez à nouveau.
- Déterminer la concentration d'ADN à l'aide d'un ADN mesurant 2 L par clone. Le rendement de l'ADN varie généralement entre 0,5 et 3 ng/L.
6. Séquençage
- Effectuer le séquençage de l'ADN tel que décrit par Jager et coll.13
7. Cartographie et appel de mutation somatique
- Cartographier la sortie du séquençage (fichiers FASTQ) au génome de référence et aux mutations d'appel décrites dans Jager et al.13
- Inspecter les données pour décevoir les changements karyotypic aberrants dans les données de clones et de vrac séquencés à l'aide d'un outil d'analyse des numéros de copie, comme Control-FreeC14. Jusqu'à présent, nous n'avons signalé aucun HSPC avec des aberrances karyotypic.
- Générer une liste noire, qui se compose d'un panneau d'échantillons normaux inégalés à des fins de filtrage à partir d'un propre ensemble d'échantillons, comme décrit précédemment13, ou utiliser la liste noire téléchargée suivante: 'lt;https://data.mendeley.com/datasets/9y4yhwt5rp/3'gt;.
- Filtrer les variations de nucléotide unique à l'aide de SNVFI (https://github.com/ToolsVanBox/SNVFI).
- Fichier SNVFI.config préréglé, de sorte que tous les chemins pour les fonctions d'aide sont corrects.
- Exécutez SNVFI avec fichier .ini configuré en fonction des paramètres vus dans le fichier supplémentaire 1 (SNVFI.ini). Pour exclure les mutations induites in vitro, nous filtrons pour un VAF 0,39.
- Vérifier la variante allèle fraction (VAF) sortie de SNVFI (Figure 4). Vérifiez si le pic de la parcelle de densité est proche de 0,5, ce qui indique que l'échantillon est clonal.
-
EN OPTION: Pour déterminer la partie du génome qui est couverte pendant le filtrage, déterminez les régions callables le long de germline et contrôlez à l'aide de CallableLoci de GATK (Genome Analysis ToolKit) :
java -jar GenomeAnalysisTK.jar
-T CallableLoci
-R reference.fasta
-I myreads.bam
-summary table.txt
-o callable.status.bed -
EN OPTION: Récupérez les régions Callable de la sortie CallableLoci et effectuez des intersections en deux sens entre les échantillons et le vrac à l'aide de l'écriture python CallableLoci-processor.py présente à https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . Les fichiers de lit qui en résultent peuvent être utilisés pour filtrer davantage la sortie de La SNVFI et pour inspecter le profil mutationnel à la section 9 :
CallableLoci-processor.py dir-in dir-out sample-name bulk-name -samples sample1 sample2 sample2 sample2
8. Appel Indel
- Sélectionnez toutes les insertions et suppressions (Indels) dans le fichier raw-variants.vcf à l'aide de GATK SelectVariants :
java -Xmx12G
-jar GenomeAnalysisTK.jar
-T SelectVariants
-R reference.genome.fasta
-V raw-variants.vcf
-o raw-INDELs.vcf
-sélectionnerType INDEL - Filtre raw-INDELS.vcf liste en utilisant INDELFI 'lt;https://github.com/ToolsVanBox/INDELFI-gt;:
perl INDELFI.pl -i input.vcf (à partir de l'étape 8.1)
-s échantillon d'essai de colonne
-c échantillon de contrôle de colonne
9. Inspection du profil mutationnel
- Utilisez les fichiers .vcf résultants de la sortie SNVFI à partir de l'étape 7.6 (ou de l'étape 7.9 avec l'analyse loci callable en option) pour analyser le profil mutationnel génomique, les types de mutation, et l'analyse de signature en utilisant le paquet R MutationalPatterns15: 'lt;http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/MutationalPatterns.html.html.gt;. Pour la sortie représentative qui peut être produite avec le fichier .vcf résultant comme un spectre mutationnel de 96 trinucléotides, voir Figure 5.
10. Construction d'un arbre de lignée de développement à l'aide de substitutions de base
- Pour construire un arbre de lignée développementale, détecter les mutations partagées entre les clones. Les mutations présentes dans les premières branches de l'arbre de lignée peuvent également être subclonalement présentes dans l'échantillon en vrac (MSCs/Lymphocytes T). Les lignées de ramification ultérieures seront définies par des mutations partagées par les clones HSPC seulement.
- Pour identifier les mutations présentes dans un sous-ensemble des clones et sous-clonalement présentes dans le volume, effectuez les étapes suivantes.
- Afin de filtrer les mutations somatiques partagées entre les clones, exécutez le script filterSomatic.py dans un terminal basé sur Unix. Le script peut être trouvé à https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Avant d'exécuter ce script, modifiez le fichier filterSomatic.ini (voir Fichier supplémentaire 2) pour définir les chemins et ajuster les autres paramètres.
- Exécuter filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py -i filterSomatic.ini).
- Filtre pour les mutations qui sont subclonalement présentes en vrac à l'aide de la bande de Determine-lowVAF. Script R dans un terminal Unix. Le script peut être trouvé à https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Cela générera des fichiers .vcf distincts pour les SNV partagés et uniques :
Rscript Déterminer-lowVAF-bulk. R
--vcf Path/To/Filter-somatic-output.vcf
--en vrac-nom
--échantillon-nom-nom-nom
--genre [M F]
--out-dir out-dir - Déterminer toutes les mutations partagées entre les clones qui ne sont pas présents dans l'échantillon en vrac en supervisant toutes les positions de mutation (colonnes 1 et 2 concatenate de sortie SNVFI).
- Exclure les faux positifs obtenus lors des étapes 10.5 et 10.6 par inspection manuelle à l'aide de l'IGV16. Les mutations sont considérées comme fausses lorsqu'elles ne sont pas présentes, lorsque la mutation est présente dans la lignée germinale ou lorsqu'elles sont présentes dans des régions mal cartographiées, voir Figure 7.
REMARQUE: Nous recommandons fortement de re-séquencetous les loci partagés indépendamment en utilisant le séquençage ciblé ou de cintre. - Utilisez les mutations partagées obtenues au cours des étapes 10.1 et 10.2 pour construire un tableau binaire des mutations par rapport aux clones séquencés, avec 0 indiquant que la mutation n'est pas présente et 1 indiquant la présence de la mutation.
- Sortie de la table binaire mutation comme dans une carte thermique avec un dendrogramme indiquant les relations de lignée entre les cellules utilisant R. La carte thermique indique l'état des mutations pour chaque cellule. Voir la sortie de cette fonction (Figure 6).
Clones 'lt;- read.table("Path/To/BinaryTable")
my-palette 'lt;- colorRampPalette(c("#cccccc", "#333333")(n '2)
col-breaks (0,0,5,1)
heatmap.2 (clones, distfun-fonction(x) dist(x,méthode 'binaire'),
hclustfun-fonction(x) hclust (x,méthode et moyenne),
dendrogramme - "colonne", Rowv et F,
col-my-palette, pauses-col-breaks,
trace "aucun", density.info "aucun")
Representative Results
Procédure expérimentale
Le flux de travail expérimental est représenté dans la figure 1. En fonction du type de matériel d'entrée, différentes étapes doivent être suivies. Dans la figure 2, une sortie cytométrique d'écoulement d'une sorte de globule de cordon est représentée. Tout d'abord, toutes les cellules monocytiques sont sélectionnées en dessinant librement une porte autour de cette population. Ensuite, les singlets sont isolés en sélectionnant pour les cellules avec un rapport linéaire FSC-H/FSC-A, comme un rapport FSC-H/FSC-A inférieur inclut les doublets ou les amas cellulaires. L'échantillon de contrôle non taché est utilisé pour définir les portes de tri cellulaire pour la lignée-, CD34,CD38-, CD45RA-. De plus, les CD90 et cD49f peuvent être utilisés pour distinguer les cellules progénitrices des cellules souches auto-renouvelables17 (figure 2). Le tri d'index permet le retraçage des cellules individuelles, et les cellules triées sont représentées comme des points bruns. Pendant la culture cellulaire, les clones individuels peuvent se développer à un rythme différent, avec quelques clones se développant dans les 3 semaines, tandis que d'autres clones sont seulement entièrement étendus jusqu'à la cinquième semaine de culture. Voir figure 3A,B pour la croissance des colonies représentatives. Une image représentative est montrée d'une culture en vrac presque confluente de MSC à 11 jours après placage (figure 3C).
Vérification de la qualité après le séquençage et l'analyse des mutations
Il s'agit d'un exemple de sortie de l'analyse du nombre de copies générée par Control-FreeC14 pour vérifier les modifications apportées au numéro de copie (figure 4). Les informations karyotypic peuvent indiquer quels chromosomes exclure pendant une course de SNVFI (étape 7.6). L'intrigue VAF créée par SNVFI (Figure 5) est un histogramme de fréquences d'allèle variables dans l'échantillon. Un pic dans la parcelle de densité à 0,5 indique que l'échantillon est clonal. Pour obtenir plus de perspicacité dans les causes biologiques sous-jacentes derrière les mutations, ceux-ci peuvent être analysés à l'aide du paquet R MutationalPatterns15. Illustré ici est une analyse typique produisant une parcelle de 96-trinucleotide (Figure 6). En plus de la quantification de différents types de mutation, l'extraction de signature peut également être effectuée avec cet outil.
Construction d'un arbre de lignée de développement
Les mutations partagées entre clones ou présentes dans un clone (et à faible VAF) dans le contrôle des lignées germinales sont validées à l'aide d'IGV. Les mutations sont considérées comme vraies lorsqu'elles sont présentes dans l'échantillon et non à des niveaux élevés de VAF dans la lignée germinale (figure 7A). Les mutations sont considérées comme fausses lorsqu'elles ne sont pas présentes dans l'IGV, ce qui peut se produire dans des régions mal cartographiées (figure 7B). Dans d'autres cas, les événements détectés par SNVFI sont des mutations germinales manquées (Figure 7C). Le reséquençage indépendant des mutations par re-séquençage ciblé est fortement recommandé pour ces mutations dans les clones choisis. Après détection de mutations somatiques partagées entre les clones, une matrice binaire est générée (étape 10.8). Une carte thermique est construite contenant des cellules avec et sans les mutations partagées A-M. Au-dessus de cette carte thermique, l'arbre de lignée développementale est indiqué (figure 8).
Figure 1 : Diagramme de flux représentant la procédure expérimentale basée sur le matériel d'entrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Stratégie de tri cellulaire. Tout d'abord, le gating est effectué sur de petites cellules mononucléaires. Deuxièmement, les cellules individuelles sont fermées par sélection de la fraction linéaire. Les cellules négatives de lignée sont fermées. Toutes les cellules CD34et CD38- CD45sont triées à une seule cellule. La fraction des cellules en brun doit être notée, qui sont les cellules triées mises en évidence par l'option «tri de l'index». Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Résultats représentatifs de la culture cellulaire. Clones HSPC représentatifs dans une plaque de puits 384 à (A) 2 semaines après le placage et (B) 4 semaines après le placage. (C) Culture MSC après 2 semaines de remplacement moyen. Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Karyotypes. (A) Culture Clonal HSPC et (B) Échantillon en vrac MSC. Les karyotypes ont été déterminés par analyse de la lecture-profondeur. Les deux graphiques indiquent un échantillon karyotypiquement normal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Histogramme des fréquences d'allèle de variante. Histogramme des fréquences d'allèle de variante des variantes dans un clone avant la dernière étape de filtrage de SNVFI (VAF ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Un pic à VAF 0,5 indique que l'échantillon est clonal. Les mutations sous-clonales avec le BAS VAF sont exclues pendant l'étape de filtrage de SNVFI (VAF ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Analyse représentative du spectre mutationnel des mutations somatiques dans un échantillon de HSPC. La contribution relative de chaque changement de trinucleotide (dont la base moyenne est mutée) au spectre total est représentée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Inspection manuelle des mutations à l'aide de l'IGV16. (A) Les mutations sont considérées comme vraies lorsqu'elles sont présentes dans le clone et non dans l'échantillon en vrac. (B) Les mutations sont considérées comme de faux positifs lorsqu'elles sont présentes dans une région mal cartographiée. (C) Les mutations sont considérées comme de faux positifs lorsqu'elles sont présentes dans un contrôle de germline. La ligne verticale indique la position d'une mutation appelée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Construction d'un arbre de lignée de développement. Un dendrogramme indique la séparation des lignées de développement pendant le développement. La carte thermique sous le dendrogramme indique la présence de mutations dans différents clones. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Présenté ici est une méthode pour détecter les mutations qui se sont accumulées au cours de la vie dans les HSPC individuels et de construire un arbre de lignée développementale précoce en utilisant ces données de mutation.
Plusieurs exigences critiques doivent être remplies afin d'effectuer ces essais avec succès. Premièrement, la viabilité de l'échantillon doit être assurée. Une manipulation rapide de l'échantillon est essentielle pour assurer l'efficacité de la procédure. Deuxièmement, la perte de puissance du facteur de croissance aura une incidence négative sur l'expansion clonale des HSPC. Pour assurer une puissance élevée du facteur de croissance, il est important d'éviter les cycles de gel-dégel et de préparer des aliquots à usage unique. Troisièmement, après avoir effectué WGS, appel de mutation et de filtrage, il est crucial de valider la clonalité de la culture clonale. Pour confirmer la clonalité de la culture, le VAF des mutations devrait se regrouper autour de 0,5 dans un échantillon karyotypiquement normal (Figure 3). Dans les cellules à faible charge mutationnelle, comme les HSPC de sang de cordon, il est plus difficile de déterminer la clonalité due aux faibles nombres de mutation.
Notre approche repose sur l'expansion in vitro des cellules individuelles pour permettre le WGS. Par conséquent, notre approche est limitée aux cellules qui ont le potentiel réplicif de se développer de façon clonale, comme les HSPC. Dans nos mains, environ 5%-30% de toutes les cellules à tri unique sont capables de se développer correctement. La réduction des taux de croissance peut entraîner un biais de sélection. Comme nous l'avons vu précédemment, les méthodes utilisant WGA peuvent surmonter ce biais de sélection que cette technique est ne repose pas sur l'expansion des cellules. Cependant, LA WGA a ses propres défauts, et l'amplification clonale reste la seule méthode pour déterminer avec précision le nombre de mutations dans l'ensemble du génome sans abandons alléliques et une couverture égale le long du génome, en particulier dans les échantillons avec peu de somatique vrai numéros de mutation.
Les données générées à l'aide de cette approche peuvent être utilisées pour déterminer les phylogénies du système hématopoïétique, car les mutations détectées dans les cellules individuelles peuvent être utilisées pour disséquer les lignées cellulaires, comme le montre la figure 6. Typiquement, une ou deux mutations peuvent définir chaque branche dans un donneur sain1. Puisque la branche de lignéetôt après la conception, les mutations définissant ces premières branches seront également présentes avec un bas VAF dans l'échantillon normal assorti qui a été employé pour filtrer les variantes de germline1,18,19. Dans ce cas, l'utilisation des cellules non hématopoïétiques, telles que les MSC, sont préférées car on s'attend à ce qu'elles se séparent très tôt pendant le développement du système hématopoïétique. Comme les lymphocytes T sont d'origine hématopoïétique, l'utilisation de ces cellules comme échantillon normal assorti pour filtrer les variantes germinales pourrait donc confondre la construction de la branchement la plus précoce de l'arbre de lignée développementale. La présence sous-clonale de mutations spécifiques aux branches dans certaines populations sanguines matures, qui peuvent être mesurées par un séquençage profond ciblé, indiquera que la progéniture de cette branche peut donner naissance à ce type de cellules matures. En outre, notre approche permet d'évaluer les conséquences mutationnelles de l'exposition mutagène in vivo et, en fin de compte, comment cela peut contribuer au développement de la leucémie.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par une subvention VIDI de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) (no. 016.Vidi.171.023) à R. c. B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| 50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
| CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
| CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
| CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
| CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
| CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
| CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
| CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
| Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
| CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
| Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
| Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
| Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
| Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
| PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
| RNAse A | Qiagen | 19101 | |
| SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
| StemSpan SFEM, 500 mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
| TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |
References
- Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).
- Genovese, G., et al. Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence. New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes. New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).
- Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. Nature Communications. 7, 1-7 (2016).
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer. Cell Reports. 3, 246-259 (2013).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500, 415-421 (2013).
- Alexandrov, L., et al. The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer. bioRxiv. , (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. 513, 422-425 (2014).
- Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538, 260-264 (2016).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: Current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).
- Dong, X., et al. Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells. Nature Methods. 14, 491-493 (2017).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150, (2012).
- Jager, M., et al. Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures. Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).
- Boeva, V., et al. Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data. Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).
- Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes. Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. , (2011).
- Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561, 473-478 (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. , (2014).
