Summary
דפוסי המוטציה הסומטיים בתאים משקפים חשיפה מוטרית קודמת ויכולים לחשוף קשרים התפתחותיים של השושלת. המוצג כאן הוא מתודולוגיה לקטלג ולנתח מוטציות סומטיות בתאי גזע ומחולל המטפאות בודדים.
Abstract
גזע המטפאות ומחולל הזרע (HSPCs) בהדרגה לצבור מוטציות DNA במהלך תוחלת חיים, אשר יכול לתרום לגיל הקשורים מחלות כגון לוקמיה. אפיון הצטברות מוטציה יכול לשפר את ההבנה של האטיולוגיה של מחלות הקשורות לגיל. הציגו כאן היא שיטה לקטלג מוטציות סומטיים ב-HSPCs הפרט, אשר מבוסס על רצף הגנום השלם (WGS) של תרביות תאים שבטיים הראשי. מוטציות הקיימות בתא המקורי משותפות על ידי כל התאים בתרבות המשובטים, בעוד מוטציות שנרכשו בחוץ לאחר מיון התא נמצאים בקבוצת משנה של תאים. לכן, שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של מוטציות סומטיים נוכח הגנום של HSPCs הפרט, אשר מצטברים במהלך החיים. הקטלוגים הללו של מוטציות סומטיים יכולים לספק תובנות יקרות לתהליכי ממוגרפיה הפעילים ברקמות המטפאות וכיצד תהליכים אלה תורמים ללוקבגנזה. בנוסף, על ידי הערכת מוטציות סומטיים המשותפים בין HSPCs מרובים של אותו אדם, יחסי השושלת השיבטיים והדינמיקה האוכלוסין של אוכלוסיות דם ניתן לקבוע. כאשר גישה זו נשענת על התרחבות מבחנה של תאים בודדים, השיטה מוגבלת לתאים המטבטיים עם פוטנציאל replicative מספיק.
Introduction
חשיפת תאים גזע המטפאות ומחולל קדמון (HSPCs) כדי אנדודוגני או מקורות מוטאריים חיצוניים תורמת להצטברות הדרגתית של מוטציות ב-DNA במהלך תוחלת חיים1. הצטברות מוטציה הדרגתית ב hspcs1 יכול לגרום לגיל שבטיים הקשור המטפיאה (ARCH)2,3, שהוא מצב שאינו סימפטומטי מונע על ידי הנושאים hspcs נושאת לוקמיה-מוטציות הנהג. בתחילה, הוא חשב כי אנשים עם קשת יש סיכון מוגבר עבור לוקמיה2,3. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שכיחות של 95% של קשת באנשים קשישים4, מה שהופך את הקשר עם ממאירות פחות ברור להעלות את השאלה למה אנשים מסוימים עם ARCH בסופו של דבר לעשות או לא לפתח ממאירות. עם זאת, מוטציות סומטיים ב HSPCs יכול להוות סיכונים בריאותיים רציניים, כמו הפרעות מיאלואידית ולוקמיה מאופיינים על ידי נוכחות של מוטציות ספציפיות של מנהלי התקן סרטן.
כדי לזהות את תהליכי הזיהוי והקלאליות של דם לימוד, הצטברות מוטציה ב-HSPCs הפרט צריך להיות מאופיין. תהליכי הדפוס משאירים דפוסים אופייניים בגנום, כביכול חתימות מודמות, שניתן לזהות ולכמת באוספי הגנום הרחב של מוטציות5. למשל, חשיפה לאור אולטרא סגול, סוכני al, ופגמים במסלולי תיקון DNA יש כל אחד נקשר עם חתימת מוסיקה שונה6,7. בנוסף, בשל האופי הסטוכסטי של צטברויות מוטציה, רוב (אם לא כולם) של המוטציות הנרכשים הם ייחודיים בין התאים. אם מוטציות משותפות בין תאים מרובים של אותו אדם, הוא מציין כי תאים אלה חולקים אבקדמון משותף. לכן, על-ידי הערכת מוטציות משותפות, ניתן לקבוע קשרי שושלת היוחסין בין תאים לבין עץ השושלת ההתפתחותי ניתן לבנות ענף בענף. עם זאת, קיטלוג מוטציות סומאליות נדירות בתאים מבחינה פיזיולוגית הוא מאתגר באופן טכני בשל הטבע polyclonal בטים של רקמות בריאות.
המוצג כאן הוא שיטה לזהות במדויק ולקבוע מוטציות סומטיים בתוך הגנום של HSPCs הפרט. זה כולל את הבידוד ואת התפשטות המשובטים של HSPCs ב מבחנה. תרבויות אלה שבטים לשקף את האיפור הגנטי של התא המקורי (כלומר, מוטציות בתא המקורי יהיה משותף על ידי כל התאים האחרים בתרבות). גישה זו מאפשרת לנו להשיג די. אן. איי עבור רצף הגנום השלם (WGS). הצגנו בעבר כי מוטציות שהצטברו בתוך מבחנה במהלך תרבות שבטיים ישותפו על ידי קבוצת משנה של תאים. זה מאפשר סינון של כל מוטציות חוץ גופית, כמו אלה יהיה נוכח חלק קטן יותר של קריאות לעומת vivo רכשה מוטציות9. שיטות קודמות השיגו די. אן. איי מתא אחד עבור WGS באמצעות הגברה שלמה של הגנום (WGA)10. עם זאת, החיסרון העיקרי של WGA הוא הגברה שגיאה יחסית מועדת ובלתי מאוזנת של הגנום, אשר יכול לגרום לאלה מתלהבים האלה11. עם זאת, כאשר גישה זו מסתמכת על התרחבות מבחנה של תאים בודדים, היא מוגבלת לתאי דם עם פוטנציאל replicative שאינו המקרה עבור שיטות התלויות ב-WGA. מאמצים קודמים ברצף תרבויות המשובטים הסתמך על שימוש בשכבות ממזין כדי להבטיח הגברה של השבטים של HSPCs12. עם זאת, ה-DNA מן השכבות ממזין יכול לזהם את ה-DNA של תרבויות המשובטים, הקמת הקורא מוטציה לאחר מכן סינון. השיטה המוצגת כאן מסתמכת אך ורק על בינוני שצוין כדי clonally להרחיב HSPCs בודד, ולכן נמנע את הנושא של זיהום DNA. עד עכשיו, יש לנו בהצלחה להחיל את השיטה הזאת על מח עצם אנושי, דם טבורי, מח עצם קפוא למדי, דם היקפי.
Protocol
יש להשיג דגימות לפי פרוטוקולי אתיקה מתאימים, ותורמים חייבים לתת הסכמה מושכלת לפני ההליך.
1. הכנת חומר לדוגמא
הערה: כשעובדים עם חומר שהושג טרי, התחילו בשלב 1.1. כשעובדים עם חומר קפוא, התחילו בשלב 1.2.
-
הכנת מח עצם טרי, דם טבורי או דם היקפי
- בודד את השבר המוננורור מהדוגמה באמצעות הפרדת מעבר הצבע על-ידי ביצוע ההוראות של היצרנים (ראה טבלת חומרים), וספור את התאים המונפוניים באמצעות הומוציטומטר. לאחר בידוד של התאים המונחדריים, להמשיך עם שלב 1.3.
- אופציונלי: המספר המומלץ של תאים הדרושים כדי למיין צלחת מלאה 384 היטב של HSPCs הוא 1 – 2 x 107. אם יותר תאים מבודדים במהלך הדרגתי צפיפות צנטריפוגה, לאחסן את העודף של תאים חנקן נוזלי.
- השעיית תאים מחדש ב-500 μL של IMDM + 10% FBS לכל 1 x 107 תאים, ולהוסיף ירידה על ידי שחרור נפח שווה של imdm + 30% fbs + 20% dmso כדי להשיג השעיה של 1 x 107 תאים ב 1 מ ל של imdm + 20% FBS + 10% dmso.
- העבר מיד את התאים המוננובית לבקבוקונים מסוג mL, והקפא את התאים ב-80 ° c במיכל מבוקר של תא הקפאה מהיר בין לילה. העבר את התאים למחרת לאחסון חנקן נוזלי על עיבוד נוסף.
-
הכנת תאים קפואים מוקפאים ממוח עצם, דם טבורי או דם היקפי
- הכינו 50 mL של תא היפכנף בינונית המכילה 45 mL של הנשר המתוקן של Iscove של מדיום (IMDM) ו 5 מ ל של סרום העוברי העובר (FBS), וחמים ב 37 ° c אמבט מים.
- קח את המבחנה המכילה את המדגם מאחסון חנקן נוזלי, להעביר את המדגם לקרח יבש, ולהפשיר מהר ככל האפשר באמבט מים 37 ° c.
- כאשר המדגם כמעט הופלה, לנגב את המבחנה עם 70% אתנול ולהעביר את התוכן שלה לשפופרת מ50 mL חרוט. לשטוף את המבחנה עם 1 מ ל של טרום מחומם IMDM + 10% FBS לאסוף את התאים הנותרים, ולהוסיף את הפתרון הזה dropwise (5 s לכל טיפה) אל המדגם המוסדר תוך התערבל בעדינות את הצינור.
- הוסף מראש נוסף מחומם 15 מ ל של IMDM + 10% FBS dropwise למדגם תוך התערבל בעדינות את הצינור.
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g.
- הסירו הכל מלבד ± 3 מ ל הסופרנטאנט. השהה מחדש את התאים ב-supernatant הנותרים ולדלל על-ידי הוספת 20 מ ל של IMDM + 10% FBS ירידה על-ידי-שחרור בעדינות לטלטל את הצינור.
- קח 10 μL של ההשעיה של התא עבור ספירת תאים. לדלל את אלה 10 μL על ידי הוספת 20 μL של 0.4% הפתרון הכחול ולספור את התאים באמצעות הומוציטומטר. מספר התא יכול לרדת על הפשרה, עם עד 50% הפסד תא לאחר הפשרה. הכדאיות של התא צריכה לנוע בין 70% ל-90%.
- אם עבודה עם מח עצם או כדוריות דם טבורי, לקחת את 5 x 106 תאים mon, ברורים עבור התרבות MSC (שלב 2.1). אם עובדים עם דם היקפי, לקחת את 2 – 5 x 106 תאים עבור בידוד תא T (שלב 2.2)
- גלולה הנותרים התאים 5 דקות ב 350 x ו השעיה מחדש 3 מ מ של facs מאגר (0.05% bsa + 1 מ"מ EDTA ב PBS).
- העברה 1 x 105 תאים מיקרוtube ממולא 200 μl של מאגר facs, אשר ישמש שליטה שלילית עבור cy, הזרימה של הזרם (שלב 3.8), ולשמור על קרח.
2. תרבית תאים
הערה: כדי להשיג קטלוגים של מוטציות שנרכשו מבחינה מלאכותית, וריאציה ספציפית של התורם germline צריך להיות מסוננים. כאשר מתחילים עם מח עצם ביופסיות או דם טבורי הטבור, התאים סטרומה mesenchymal (MSCs) יכול לשמש כפקד התאמה כדי לסנן וריאציה germline. במקרה זה, בצע את סעיף 2.1. בעת שימוש (מגוייס) דם היקפי בצע את הצעד 2.2 כדי לבודד ולהשתמש בתאי T כמו מדגם בקרת התאמה כדי לסנן עבור וריאציה germline (איור 1). אוכלוסיית T-cell בצובר תשתף את אותה יחסי השושלת כמו HSPCs.
-
החברה לתואר שלמה
- הכינו 50 mL של MSC בינוני המכיל 45 mL של DMEM דיום/F12 בינונית, 10% FBS, 500 μL של טריפסין או טריפסין חלופה, ו500 μL של פתרון פניצילין/סטרפטומיצין.
- לוחית של כ 5 x 10 תאים מונמול 1.5 ML של MSC בינוני לכל טוב. מניחים את התאים בחממה לחות ב 37 ° c עם 5% CO2.
- החלף את המדיום לאחר 24 שעות, ולאחר מכן החלף את המדיום כל 3 ימים כדי לוודא שכל התאים המטבטיים נשטפים. המשך להתרבות עד ששטף המוח הוא 100%.
- אם MSCs שוטפת, לשטוף תאים עם 1 mL של PBS והקציר MSCs על ידי הוספת 200 μL של טריפסין או טריפסין אלטרנטיבה לכל טוב. התאים הדגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c. הוסף 800 μL של מדיום בינוני, ו ללטף את התאים למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים מן צלחת הבאר.
- העברת MSCs כדי שפופרת מיקרו-צנטריפוגה ו הגלולה התאים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g. הסר את supernatant ולהמשיך עם בידוד DNA או לאחסן את הגלולה ב-20 ° צ' לבידוד DNA מאוחר יותר (סעיף 4).
-
בידוד תא T
הערה: אם השימוש (מגוייס) דם היקפי, תאי T ניתן לבודד ולהשתמש כבקרת germline.- להשעות מחדש את הגלולה התא ב-100 μL של פתרון anti-CD3 מכתים (1:100 דילול של נוגדן anti-CD במאגר FACS).
- שטוף את התאים על-ידי הוספת 1 mL של מאגר FACS. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g ו-השהה מחדש ב 300 μl של מאגר facs.
- בידוד לפחות 5 x 105 CD3 + תאים באמצעות facs-סדרן בתוך 5 מ ל קלקר בצינור מראש עם 1 מ ל של fbs.
- גלולה את התאים ממוינים באמצעות צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g, להסיר את supernatant, ולהמשיך ישירות עם בידוד dna (סעיף 4) או לאחסן את הגלולה ב-20 ° c עבור בידוד dna מאוחר יותר.
3. HSPC בידוד, מיון ותרבות
- ספין למטה ב 1 – 2 x 107 תאים מונפרור עבור 5 דקות ב 350 x g ו להשעות מחדש ב 50 μl של מאגר facs (ראה שלב 2.2.1). העבירו את התאים. לצינור מיקרוצנטריפוגה
הערה: בעת מיון עם > 2 x 107 תאים, להגדיל את ערבוב הנוגדן ואמצעי אחסון של מאגר facs בהתאם. - הכינו 50 μL של שילוב הצביעת 2x HSC בהתאם למתכון הנראה בטבלה 1.
| נוגדן | אמצעי אחסון [μL] |
| BV421-CD34 | מיכל 5 |
| FITC-תערובת השושלת (CD3/14/19/20/56) | מיכל 5 |
| PE-CD38 | 2 |
| APC-CD90 | 0.5 |
| PerCP/Cy 5.5-CD45RA | מיכל 5 |
| PE/Cy7-CD49f | 1 |
| FITC-CD16 | 1 |
| FITC-CD11 | מיכל 5 |
| מאגר FACS | 25.5 |
טבלה 1: שילוב מיון HSC. מוצג הוא טבלה המציינת את הדילול של נוגדנים המשמשים למיון HSCs.
- מערבבים 50 μL של פתרון התאים עם התערובת HSC מוכן ערבוב ו דגירה של תאים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או עבור 1 h על הקרח על הנוגדנים לאגד.
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ ל של מאגר FACS ואת הגלולה על ידי תפרידו עבור 5 דקות ב 350 x g.
- להשעות מחדש את התאים ב-300 μl של מאגר facs ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 35 יקרומטר-הכתיר 5 מ ל פוליסטירן מוקצף כדי להסיר את הגושים תאים לפני מיון תא המופעל על ידי הזריחה (facs).
- הכינו 25 מ ל של התרבות HSPC בינונית, המורכבת 1x SFEM בינונית בתוספת עם 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6, ו 100 (ראה טבלת חומרים).
- למלא 384 היטב התרבות התא עם 75 μL של מדיום התרבות HSPC בכל טוב.
הערה: כדי למנוע אידוי של המדיום בבארות החיצוניות, למלא את הבארות החיצוניות עם 75 μL של מים סטריליים או PBS, ולא להשתמש בארות אלה למיון התא. -
מיון HSPCs בודד
- הגדר שערים עבור מיון HSPC המבוסס על שליטה לא מוכתמת (שלב 1.9) ו10,000 תאים מהדוגמה המוכתמת. התוצאה המייצגת את השערים מתוארת באיור 1. שער תאים בודדים על-ידי ציור שער סביב השבר הליניארי של גובה FSC לעומת האזור FSC. השתמש בשבר שליטה בלתי מוכתם כדי לצייר שער עבור משבר היוחסין. צייר שערים עבור CD34+ תאים ולאפיין את קבוצת משנה זו על-ידי הגדרת שער מסוים עבור CD38- CD45RA- תאים.
- לטעון את הצלחת 384 היטב על מכונת FACS ולמיין תאים בודדים.
הערה: אם רלוונטי ל-FACS-machine, החלף את האפשרות ליצירת אינדקס של נתוני מיון כדי לאפשר עקיבה מחדש של התאים הממוינים.
-
מHSCs ממוין ביחידים
- ישירות להעביר את הצלחת 384 מחולל לחות 37 ° c בחממה עם 5% CO2.
הערה: כדי למנוע אידוי במהלך התרבות, לעטוף את לוחית התרבות 384 היטב (עם מכסה) לעטוף פוליאתילן שקוף. - שמור את צלחת 384 בחממה במשך 3 – 4 שבועות עד שיבוטים גלויים מופיעים. דמויות מייצגות של תרבות שבטיים מתוארות באיור 2. מבוסס על מצב של חומר הקלט 5% – 30% של תאים ממוינים clonally להתרחב.
- ישירות להעביר את הצלחת 384 מחולל לחות 37 ° c בחממה עם 5% CO2.
4. קציר המשובטים HSPC
- לאחר 4 שבועות של culturing, לקבוע אילו בארות יש שליטה של 30% או יותר.
- טרום מילוי (עבור כל שבטיים outgrowth) 1.5 mL מיקרוצינורות עם 1 מ ל של 1% BSA ב PBS ולתייג את הצינור בהתאם היטב המתאים.
- מראש להרטיב עצה עם 1% BSA ב-PBS כדי למזער את מספר התאים נדבק לקצה הפיפטה.
- Pipet למעלה/למטה בינוני בפראות (לפחות 5 פעמים) עם 200 μL הצינורות (להגדיר ב 75 μL) ו לגרד את החלק התחתון של הבאר כדי לשחרר את התאים בבאר, ולאסוף את ההשעיה התא ב microtube התווית המתאים היטב.
- קח את 75 μL של טרי 1% BSA ב-PBS וחזור ליטוף בבאר כדי להבטיח ספיגה מקסימלית של תאים.
הערה: תאים Clonally מתורבתים יכולים להיצמד לחלק התחתון של הבאר. בדוק את הבארות באמצעות מיקרוסקופ קל הפוך סטנדרטי כדי להבטיח אם כל התאים נאספו. - אם כל הבארות עם > 30% השטף כבר נקצרו, מניחים את צלחת 384 בחזרה בחממה. תרבויות שבטים יכולים להתרבות עד 5 שבועות.
- לסובב את ההשעיה התא עבור 5 דקות ב 350 x g. גלולה קטנה צריכה להיות גלויה.
- הסר בזהירות את כל אלא כ 5 μL של סופרנטאנט. כדורי תא יכול להיות קפוא ב-20 ° c ומאוחסן במשך חודשים מרובים לפני בידוד DNA.
5. דנ א בידוד
-
בודד HSPC ו-MSC/T-cell DNA באמצעות ערכת בידוד DNA מיקרו בקנה מידה על פי ההוראה של היצרן עם ההתאמות הבאות:
- הוסף 2 μL של RNase A לאחר הוספת מאגר אל במהלך סעיף 2. דגירה עבור 2 דקות לפני הוספת פרוטטינואז K.
- דגירה של 30 דקות ב 56 ° צ' במקום 10 דקות.
- Elute ה-DNA על ידי טעינת העמודה עם 50 μL של מאגר TE עם EDTA נמוכה (10 מ"מ טריס, 0.1 mM EDTA). לקבלת הימנעות אופטימלית, טען שוב את הימנעות על העמודה וסובב שוב.
- לקבוע את ריכוז ה-DNA באמצעות דנ א מדידה 2 μL לכל שיבוט. התשואה DNA בדרך כלל משתנה בין 0.5 – 3 ng/μL.
6. רצפי הרצף
- לבצע רצפי DNA כפי שמתואר על ידי Jager ואח '13
7. מיפוי ומוטציה סומטית
- מפה את הפלט של רצף (קבצי FASTQ) על הגנום התייחסות מוטציות להתקשר כמתואר Jager ואח '13
- בדוק את הנתונים עבור שינויים בעלי הסדר החריג בשכפול ובנתונים בצובר באמצעות כלי ניתוח מספר העתקה, כגון Control-FreeC14. עד עכשיו, לא היינו מדווחים.
- צור רשימת שחור, המורכבת מלוח של דוגמאות רגילות שאינן תואמות למטרות סינון מערכת דוגמאות משלו, כפי שתוארה בעבר13, או השתמש ברשימת השחורה הבאה שהעלית: < https://data.mendeley.com/datasets/9y4yhwt5rp/3 >.
- סינון וריאציות בודדות של נוקלאוטיד באמצעות SNVFI < https:/Afils.uopbof/ss/nevfi >.
- קובץ SNVFI. config מוגדר מראש, כך שכל הנתיבים לפונקציות מסייע נכונים.
- הפעל SNVFI עם קובץ. ini שהוגדר בהתאם להגדרות הנמצאות בקובץ משלים 1 (snvfi. ini). כדי לא לכלול מוטציות המושרה מחוץ לבית אנחנו מסננים עבור VAF ≥ 0.39.
- בדוק את החלק המשתנה אלל (vaf) פלט של snvfi (איור 4). בדוק אם השיא של מגרש הצפיפות הוא ליד 0.5, המציין את המדגם הוא שבטים.
-
אופציונלי: כדי לקבוע את החלק של הגנום אשר מכוסה במהלך הסינון, לקבוע את האזורים הניתנים לשימוש לאורך germline ושליטה באמצעות CallableLoci מ GATK (ערכת ניתוח הגנום):
בצנצנת הג
-T CallableLoci \
-R התייחסות.
? מה. אני קורא-בום \
-טבלת סיכום. txt \
-o callable_status מיטה -
אופציונלי: אחזר את האזורים הניתנים לקריאה מהפלט CallableLoci ולבצע צמתים של זיווגים בין הדגימות ובצובר באמצעות הקובץ הפיתון CallableLoci_processor. py הנוכחי בhttps://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . את הקבצים המיטה שנוצר ניתן להשתמש כדי לסנן עוד את הפלט של SNVFI וכלה לבדוק את פרופיל מוכן בסעיף 9:
CallableLoci_processor. py dir_in dir_out sample_name bulk_name – דגימות sample1 sample2 sample3
8. מתקשרים באמצעות indel
- בחר את כל הוספות ומחיקות (Indels) בקובץ raw_variants. vcf באמצעות משתני בחירה של GATK:
java-Xmx12G \
-צנצנת מערכת-מערכת
-T בסלציאנטים \
-R reference_genome.
-V raw_variants. vcf \
-o raw_INDELs. vcf \
-selectType INDEL - Raw_INDELS לסנן את רשימת ה-. vcf באמצעות INDELFI < https:/Afil.s/opubatb > כלים:
perl INDELFI.pl-i קלט. vcf (משלב 8.1) \
-בדיקת עמודות s לדוגמה \
-c דגימת בקרת עמודות
9. מועד בדיקת פרופיל
- השתמש בקבצי. vcf המתקבלים מפלט SNVFI משלב 7.6 (או משלב 7.9 עם ניתוח לוקוסים אופציונלי) כדי לנתח את פרופיל גנוזה, סוגי מוטציה, וניתוח חתימות באמצעות חבילת R מערכת הדפוס15: < http:/Mup.aseofilatlatsasatumfid._e html >. לפלט מייצג שניתן ליצור עם קובץ ה-. vcf המתקבל כתוצאה מהספקטרום של 96, ראה איור 5.
10. בניית עץ היוחסין ההתפתחותי באמצעות החלפות בסיס
- כדי לבנות עץ היוחסין התפתחותי, לזהות מוטציות משותפות בין שיבוטים. מוטציות להציג את הענפים הראשונים של עץ השושלת יכול להיות גם subclonally הנוכחי במדגם בצובר (MSCs/T-תאים). מאוחר יותר הסתעפות ליננים יוגדר על ידי מוטציות המשותפות על ידי שיבוטים HSPC בלבד.
- כדי לזהות מוטציות הקיימות בקבוצת משנה של שיבוטים ו subclonally הנוכחי בצובר, לבצע את השלבים הבאים.
- כדי לסנן מוטציות גופניות משותפות בין שיבוטים, הפעל את ה-filterSomatic.py script במסוף מבוסס Unix. את התסריט ניתן למצוא ב https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. לפני הפעלת קובץ script זה, ערוך את הקובץ filterSomatic file. ini (עיין בקובץ משלים 2) כדי להגדיר את הנתיבים ולכוונן את הפרמטרים האחרים.
- הפעל את filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py-i Filterסומטיק. ini).
- מסנן עבור מוטציות הsubclonally נוכח בצובר באמצעות Determine_lowVAF_bulk. R סקריפט במסוף מבוסס Unix. את התסריט ניתן למצוא ב https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. פעולה זו תיצור קבצים נפרדים. vcf עבור קבצי SNVs משותפים וייחודיים:
Rscript Determine_lowVAF_bulk. R
---vcf נתיב/אל/Filter_somatic_output. vcf
-bulk_name בתפזורת
--sample_name דגם-שם
-מין [M | F
--out_dir out_dir - לקבוע את כל המוטציות משותף בין שיבוטים אשר אינם נוכחים במדגם בצובר על ידי חופפים את כל תנוחות מוטציה (השרשור עמודה 1 ו 2 של פלט SNVFI).
- אל תכלול תוצאות חיוביות שגויות שהתקבלו במהלך השלבים 10.5 ו 10.6 על ידי בדיקה ידנית באמצעות IGV16. מוטציות נחשבות כוזבות כאשר לא נוכח, כאשר המוטציה נמצאת ב-germline או כאשר הם נמצאים באזורים ממופים גרוע, ראה איור 7.
הערה: אנו ממליצים במידה רבה לסדר מחדש את כל הרוח המשותפת באופן עצמאי תוך שימוש ברצף ממוקד או מכוון. - השתמש מוטציות משותפות שהתקבלו במהלך שלבים 10.1 ו 10.2 לבנות טבלה בינארית של מוטציות לעומת שיבוטים רצף, עם 0 המציין כי המוטציה אינה נוכחת ו 1 המציין נוכחות של המוטציה.
- מייצא את הטבלה הבינארית המוטציה כמו במפת החום יחד עם הזרע המציין קשרים שושלת היוחסין בין התאים באמצעות R. מפת החום מציינת מצב של מוטציות עבור כל תא. ראה את הפלט של פונקציה זו (איור 6).
שיבוטים <-קריאה. טבלה ("נתיב/אל/הלוח הבינלי")
my_palette <-Colorramppette (c ("cccccc", "333333")) (n = 2)
col_breaks <-c (0, 0.5, 1)
החום מפה. 2 (שיבוטים, distfun = פונקציה (x) dist (x, שיטה = ' בינארי '),
hclustfun = פונקציה (x) hclof (x, שיטה = ממוצע),
גיפוגרמה = "עמודה", Rowv = F,
col = my_palette, מעברי = col_breaks,
מעקב = "none", דחיסות. info = "ללא")
Representative Results
הליך ניסיוני
זרימת העבודה הניסיונית מתוארת באיור 1. בהתבסס על סוג חומר הקלט, יש לעקוב אחר צעדים שונים. באיור 2 הפלט של cytometric הזרימה של מיון תא דם טבורי מתוארת. ראשית, כל התאים המונלוציטיים נבחרים על ידי ציור רופף של שער סביב האוכלוסיה. לאחר מכן, מבודדים באמצעות בחירה עבור תאים בעלי היחס FSC-H/FSC ליניארי-a/fsc-היחס הנמוך ביותר כולל כdoublets או גושי תאים. דגימת השליטה הבלתי מוכתמת משמשת להגדרת שערי מיון תאים לשושלת היוחסין-, CD34+, CD38-, CD45RA-. בנוסף, CD90 ו-CD49f יכולים לשמש כדי להבדיל בין תאים מחולל קדמון או בתאי גזע מחדש17 (איור 2). מיון אינדקס מאפשר את המעקב מחדש של תאים בודדים, והתאים הממוינים מתוארים כנקודות חום. במהלך תרבות התא, שיבוטים בודדים יכולים להתרחב בקצב שונה, עם כמה שיבוטים הרחבת בתוך 3 שבועות, בעוד שיבוטים אחרים מורחבים רק עד השבוע החמישי של התרבות. ראה איור 3 א, B לגידול מושבה ייצוגית. תמונה ייצוגית מוצגת על התרבות הגורפת של MSC כמעט שוטפת ב -11 ימים לאחר ציפוי (איור 3C).
בדיקת איכות לאחר קביעת רצף וניתוח מוטציה
מוצג הוא פלט דוגמה של ניתוח מספרי ההעתקה שנוצר על-ידי Control-FreeC14 כדי לבדוק אם יש שינויים במספר העותקים (איור 4). המידע karyotypic יכול לציין אילו כרומוזומים לא לכלול במהלך הפעלה SNVFI (שלב 7.6). העלילה vaf שנוצר על ידי snvfi (איור 5) היא היסטוגרמה של תדרים אלל variant במדגם. שיא במגרש הצפיפות ב 0.5 מציין כי המדגם הוא שבטים. כדי לקבל תובנה נוספת על הגורמים הביולוגיים הבסיסיים מאחורי מוטציות, ניתן לנתח את אלה באמצעות חבילת R מערכת הדפוס15. מתוארים כאן הוא ניתוח טיפוסי הפקת מגרש 96-trinucleotide גאות (איור 6). בנוסף לכמת של סוגי מוטציה שונים, מיצוי החתימה יכול להתבצע גם עם כלי זה.
בניית עץ השושלת ההתפתחותי
מוטציות משותפות בין שיבוטים או להציג בשכפול (ו-VAF נמוכה) בפקד germline מאומתים באמצעות IGV. מוטציות נחשבות נכון כאשר נוכח במדגם ולא ברמות VAF גבוה ב-germline (איור 7A). מוטציות נחשבות false כאשר לא נמצאים ב IGV, אשר יכול לקרות באזורים ממופים גרוע (איור 7B). במקרים אחרים, אירועים שזוהו על ידי SNVFI הם החמיץ מוטציות germline (איור 7C). הרצף מחדש עצמאי של מוטציות על ידי ממוקדות רצף מחדש הוא מומלץ מאוד עבור מוטציות אלה במשובטים שנבחרו. לאחר גילוי של מוטציות סומטיים משותפות בין שיבוטים, מטריצה בינארית נוצרת (שלב 10.8). מפת חום בנויה המכילה תאים עם ובלי מוטציות משותפות A-M. מעל מפת החום הזאת מצוין עץ היוחסין ההתפתחותי (איור 8).
איור 1: תרשים זרימה המתאר הליך ניסיוני המבוסס על חומר קלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אסטרטגיית מיון התא. ראשית, השידור מבוצע. על תאים קטנים וברורים שנית, תאים בודדים מגודרת על-ידי בחירה של השבר הליניארי. תאים שליליים בשושלת היוחסין מגודרת. כל CD34+ CD38- CD45- תאים ממוינים בתא בודד. יש לציין את חלקיק התאים בחום, שהם התאים הממוינים המסומנים באפשרות "מיון אינדקס". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות תרבות התא הנציג. נציג HSPC שיבוטים ב 384 צלחת באר ב (א) 2 שבועות לאחר ציפוי ו (ב) 4 שבועות לאחר ציפוי. (ג) MSC תרבות לאחר שבועיים של מחליף בינוני. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: Karyotypes. (א) תרבות השבטיים ו-(ב) MSC דוגמה גורפת. הקריוטיפוסים נקבעו על ידי ניתוח עומק לקריאה. שני הגרפים מצביעים על. דגימה נורמלית בדרך כלל אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: היסטוגרמה של תדרי אלל של variant. היסטוגרמה של תדרים אלל של variant של המשתנים בשכפול לפני שלב הסינון האחרון של snvfi (vaf > 0.3). שיא ב-VAF = 0.5 מציין שהמדגם הוא שבטים. המוטציות התת-שבטיים עם VAF נמוכה אינן נכללות במהלך הסינון האחרון של SNVFI (VAF > 0.3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניתוח הספקטרום הייצוגי של מוטציות סומטיים במדגם HSPC. מתוארת היא התרומה היחסית של כל שינוי של כל טריאוקלאואלי (שעליו מוטציה הבסיס האמצעי) לספקטרום הכולל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: בדיקה ידנית של מוטציות באמצעות IGV16. (א) מוטציות נחשבות לאמיתיות כאשר הן נמצאות בשכפול ולא במדגם הצובר. (ב) מוטציות נחשבות כתוצאות חיוביות שקריות כשהן קיימות באזור שמופה בצורה גרועה. (ג) מוטציות נחשבות כתוצאות חיוביות שגויות כאשר הם נוכחים בפקד germline. הקו האנכי מציין את מיקומו של מוטציה שנקראה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: בניית עץ השושלת ההתפתחותי. מתוארת היא שהיא בעלת העצים המעידים על התפתחות בזמן הפיתוח. מפת החום מתחת לגודגרמה מצביעה על נוכחות של מוטציות במשובטים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
מוצג כאן היא שיטה לזהות מוטציות שהצטברו במהלך החיים HSPCs הפרט לבנות עץ השושלת התפתחותית מוקדם באמצעות נתונים אלה מוטציה.
יש להכיר מספר דרישות קריטיות כדי לבצע בהצלחה את התנאים הבאים. ראשית, יש להבטיח את הכדאיות של המדגם. טיפול מהיר של המדגם הוא המפתח כדי להבטיח את יעילות ההליך. שנית, אובדן העוצמה של גורם הגדילה ישפיע לרעה על התפשטות השבטים של HSPCs. כדי להבטיח עוצמת גידול גבוהה הצמיחה, חשוב למנוע הקפאת ההפשרה מחזורים ולהכין מחזורי שימוש יחיד. שלישית, לאחר ביצוע WGS, קורא מוטציה וסינון, זה חיוני כדי לאמת את הclonality של תרבות המשובטים. כדי לאשר את הclonality של התרבות, VAF של המוטציות צריך אשכול סביב 0.5 ב karyotypically דרך כלל מדגם רגיל (איור 3). בתאים עם עומס מיתר נמוך, כגון HSPCs דם טבורי, קשה יותר לקבוע הclonality בשל מספרים מוטציה נמוכה.
הגישה שלנו מסתמכת על התרחבות מבחנה של תאים בודדים כדי לאפשר WGS. לכן, הגישה שלנו מוגבלת לתאים בעלי הפוטנציאל הclonally להתרחב, כגון HSPCs. בידינו, כ-5%-30% מכלל התאים הממוינים בודדים מסוגלים להתרחב כראוי. שיעורי גדילה מופחתים עלולים לגרום להטיה בחירה. כפי שהוזכר קודם לכן, שיטות המשתמשות ב-WGA יכולות להתגבר על הטיית בחירה זו, כאשר טכניקה זו אינה נשענת על התרחבות התאים. עם זאת, WGA יש חסרונות משלו, והגברה שבטיים נשאר השיטה היחידה כדי לקבוע במדויק את מספר המוטציות בגנום כולו ללא allelic מתלהבים וכיסוי שווה לאורך הגנום, במיוחד בדגימות עם סומאטיק אמיתי נמוך . מספרי מוטציה
הנתונים שנוצרו באמצעות גישה זו ניתן להשתמש כדי לקבוע phylogenies של המערכת המטטית, כמו המוטציות שזוהו בתאים בודדים ניתן להשתמש כדי לנתח את התאים בזמן, כפי שמתואר באיור 6. בדרך כלל, מוטציות אחת או שתיים יכולות להגדיר כל ענף בתורם בריא1. מאז הענף ליננות מוקדם לאחר ההתעברות, מוטציות המגדירות ענפים אלה הראשון יהיה גם נוכח vaf נמוכה במדגם רגיל בהתאמה ששימש לסינון משתני germline1,18,19. במקרה זה, השימוש בתאים שאינם המטבטיים, כגון MSCs, הם מועדפים כפי שהם צפויים להפריד מוקדם מאוד במהלך הפיתוח של המערכת המטתית. כמו T-תאים הם של מוצא המטמית, השימוש בתאים אלה כמדגם נורמלי תואם לסנן משתני germline יכול אפוא לבלבל את הבנייה של הסתעפות המוקדם בעץ השושלת ההתפתחותית. נוכחות תת-שבטיים של מוטציות ספציפיות לענף באוכלוסיות דם בוגרות מסוימות, אשר ניתן למדוד על ידי רצף ממוקד עמוק, יציין כי צאצאי הענף הזה יכול להצמיח את סוג התא הבוגר. בנוסף, הגישה שלנו מאפשרת להעריך את ההשלכות המוטלות של חשיפה מוטרית בvivo ובסופו של דבר כיצד זה עשוי לתרום להתפתחות לוקמיה.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך על ידי מענק VIDI של הארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) (no 016. Vidi. 171.023) כדי R. v. B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| 50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
| CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
| CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
| CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
| CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
| CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
| CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
| CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
| Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
| CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
| Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
| Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
| Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
| Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
| PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
| RNAse A | Qiagen | 19101 | |
| SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
| StemSpan SFEM, 500 mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
| TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |
References
- Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).
- Genovese, G., et al. Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence. New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes. New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).
- Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. Nature Communications. 7, 1-7 (2016).
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer. Cell Reports. 3, 246-259 (2013).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500, 415-421 (2013).
- Alexandrov, L., et al. The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer. bioRxiv. , (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. 513, 422-425 (2014).
- Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538, 260-264 (2016).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: Current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).
- Dong, X., et al. Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells. Nature Methods. 14, 491-493 (2017).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150, (2012).
- Jager, M., et al. Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures. Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).
- Boeva, V., et al. Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data. Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).
- Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes. Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. , (2011).
- Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561, 473-478 (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. , (2014).
