Summary
Соматические мутационные модели в клетках отражают предыдущее мутагенное воздействие и могут выявить родословные развития. Здесь представлена методология каталогизации и анализа соматических мутаций в отдельных гематоподетических стволовых и клетках-прародителях.
Abstract
Гематопоиэтические стволовые и клетки-предродители (HSPCs) постепенно накапливают мутации ДНК в течение всей жизни, что может способствовать возрастным заболеваниям, таким как лейкемия. Характеризуетсяе накоплением мутаций может улучшить понимание этиологии возрастных заболеваний. Здесь представлен метод каталогизации соматических мутаций в отдельных HSPCs, который основан на секвенировании всего генома (WGS) клональных первичных клеточных культур. Мутации, присутствующие в исходной клетке, разделяются всеми клетками клональной культуры, в то время как мутации, приобретенные в пробирке после сортировки клеток, присутствуют в подмножестве клеток. Поэтому этот метод позволяет точно выявлять соматические мутации, присутствующие в геномах отдельных ГСпК, которые накапливаются в течение жизни. Эти каталоги соматических мутаций могут дать ценную информацию о мутационных процессах, активных в гематоподитической ткани, и о том, как эти процессы способствуют лейкемогенезу. Кроме того, путем оценки соматических мутаций, которые разделяются между несколькими HSPCs одного и того же человека, клональные родословные отношения и динамика популяции популяций крови могут быть определены. Поскольку этот подход опирается на расширение в пробирке одиночных клеток, метод ограничивается гематоподетические клетки с достаточным ремитивным потенциалом.
Introduction
Воздействие гематопоитических стволовых и клеток-прародителей (HSPCs) на эндогенные или экзинсиальные мутагенные источники способствуют постепенному накоплению мутаций в ДНК в течение жизни1. Постепенное накопление мутаций в HSPCs1 может привести к возрастным клональным гематопоесисом (ARCH)2,3, который является несимптоматическим состоянием, обусловленным HSPCs, несущим мутации лейкемии-драйвера. Первоначально считалось, что люди с ARCH имеют повышенный риск развития лейкемии2,3. Тем не менее, недавние исследования показали, заболеваемость 95% ARCH у пожилых людей4, что делает связь с злокачественными новообразованиями менее ясно и поднимая вопрос о том, почему некоторые люди с ARCH в конечном итоге делать или не развивать злокачественные новообразования. Тем не менее, соматические мутации в HSPCs может представлять серьезную опасность для здоровья, как миелодиспластические расстройства и лейкемия характеризуются наличием конкретных мутаций драйвера рака.
Для выявления мутационных процессов и изучения клональности крови необходимо охарактеризовать накопление мутаций в отдельных ГСпС. Мутационные процессы оставляют в геноме характерные закономерности, так называемые мутационные сигнатуры, которые можно выявить и количественно определить в общегеномных коллекциях мутаций5. Например, воздействие УФ-излучения, алкилирующих агентов и дефектов в пути восстановленияДНК были связаны с различными мутационными подписями 6,7. Кроме того, из-за стохастической природы мутационных накоплений, большинство (если не все) приобретенных мутаций являются уникальными между клетками. Если мутации распределяются между несколькими клетками одного и того же человека, это указывает на то, что эти клетки имеют общего предка8. Таким образом, путем оценки общих мутаций, отношения линии могут быть определены между клетками и развития линии дерева могут быть построены ветви по ветке. Однако каталогизация редких соматических мутаций в физиологически нормальных клетках технически сложна из-за поликлонального характера здоровых тканей.
Здесь представлен метод точного выявления и определения соматических мутаций в геномах отдельных ГСпС. Это включает в себя изоляцию и клональное расширение HSPCs in vitro. Эти клональные культуры отражают генетический состав исходной клетки (т.е. мутации в исходной клетке будут разделены всеми другими клетками культуры). Такой подход позволяет нам получить достаточно ДНК для секвенирования всего генома (WGS). Ранее мы показали, что мутации, накопленные в пробирке во время клональной культуры, будут разделены подмножеством клеток. Это позволяет фильтровать все мутации in vitro, так как они будут присутствовать в меньшей части считывания по сравнению с in vivo приобретенных мутаций9. Предыдущие методы получили достаточно ДНК из одной клетки для WGS с использованием всего генома усиления (WGA)10. Однако главным недостатком WGA является его относительно подверженное ошибкам и несбалансированное усиление генома, что может привести к отсевам аллелей11. Тем не менее, поскольку этот подход опирается на расширение в пробирке одиночных клеток, он ограничивается клетками крови с достаточным репликационным потенциалом, что не относится к методам, зависящим от WGA. Ранее усилия секвенирования клональных культур полагались на использование фидерных слоев для обеспечения клонального усиления одного HSPCs12. Тем не менее, ДНК из слоев подачи потенциально может загрязнять ДНК клональных культур, смешивая последующие вызовы мутации и фильтрации. Представленный здесь метод опирается исключительно на указанную среду для клональнического расширения одного HSPCs, и поэтому позволяет избежать проблемы загрязнения ДНК. До сих пор мы успешно применяли этот метод на костном мозге человека, пуповинной крови, жизнеспособно замороженном костном мозге и периферической крови.
Protocol
Образцы должны быть получены в соответствии с соответствующими протоколами этики, и доноры должны дать информированное согласие до процедуры.
1. Подготовка образцового материала
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе со свежеполученным материалом начните с шага 1.1. При работе с замороженным материалом начните с шага 1.2.
-
Подготовка свежего костного мозга, пуповинной крови или периферической крови
- Изолировать моноядерную фракцию из образца, используя разделение градиента плотности, следуя инструкциям производителей (см. ТаблицуМатериалов), и подсчитайте моноядерные клетки с помощью геоцитометра. После изоляции моноядерных клеток продолжайте шаг 1.3.
- ФАЦИАЛЦИЯ: Рекомендуемое количество клеток, необходимых для сортировки полной 384 хорошо пластины HSPCs составляет 1-2 х 107. Если больше клеток изолированы во время градиентного центрифугирования градиента плотности, храните излишки клеток в жидком азоте.
- Повторное отсеивайте ячейки в 500 л IMDM и 10% FBS на 1 х 107 ячеек, и добавить падение за падением равный объем IMDM и 30% FBS и 20% DMSO для достижения подвески 1 х 107 клеток в 1 мл IMDM и 20% FBS и 10% DMSO.
- Немедленно перенесите моноядерные клетки в криогенные флаконы 1 мл и заморозьте клетки при -80 градусов по Цельсию в контейнере для замораживания клеток с контролируемой скоростью на ночь. Передача клеток на следующий день в хранилище жидкого азота при дальнейшей обработке.
-
Подготовка замороженных моноядерных клеток из костного мозга, пуповинной крови или периферической крови
- Приготовьте 50 мл клеточной оттаивательной среды, содержащей 45 мл модифицированного орла (IMDM) и 5 мл сыворотки для крупного рогатого скота (FBS), и прогрейте в водяной бане 37 градусов по Цельсию.
- Возьмите флакон, содержащий образец из хранилища жидкого азота, перенесите образец на сухой лед и как можно быстрее оттаивайте в водяной бане 37 градусов.
- Когда образец почти разморозиться, протрите флакон с 70% этанола и перенести его содержимое в 50 мл конической трубки. Промыть флакон с 1 мл предварительно разогретого IMDM и 10% FBS, чтобы собрать оставшиеся клетки, и добавить это решение dropwise (5 с за каплю) в оттаявшей образец в то время как мягко закрученного трубки.
- Добавьте дополнительные предварительно разогретые 15 мл IMDM и 10% FBS dropwise к образцу, нежно закрученного трубки.
- Пелле клетки центрифугации в течение 5 мин при 350 х г.
- Удалите все, кроме 3 мл супернатанта. Resuspend клетки в оставшихся супернатант и разбавить, добавив 20 мл IMDM и 10% FBS падение за каплей в то время как мягко встряхивая трубку.
- Возьмите 10 зЛ суспензии клетки для подсчета клеток. Разбавить эти 10 л, добавив 20 qL 0,4% trypan синий раствор и рассчитывать клетки с помощью гемоцитометра. Число клеток может уменьшаться при оттаивании, с потерей до 50% клеток после оттаивания. Жизнеспособность клеток должна варьироваться от 70% до 90%.
- При работе с клетками костного мозга или пуповинной крови, возьмите 5 х 106 моноядерных клеток для культуры MSC (шаг 2.1). При работе с периферической кровью, возьмите 2-5 х 106 клеток для изоляции Т-клеток (шаг 2.2)
- Пеллетные оставшиеся клетки 5 мин при 350 х г и повторно в 3 мл буфера FACS (0,05% BSA и 1 мМ EDTA в PBS).
- Передача 1 х 105 клеток в микротрубку, наполненную 200 злицу буфера FACS, который будет служить негативным контролем для цитометрии потока (шаг 3.8), и держать на льду.
2. Культура клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения каталогов соматически приобретенных мутаций необходимо отфильтровать специфические для доноров вариации зародышевой линии. При запуске с биопсии костного мозга или пуповинной крови, мезенхимальные стромальные клетки (MSC) могут быть использованы в качестве соответствующей контроля для фильтрации для изменения зародышевой линии. В этом случае следуйте разделу 2.1. При использовании (мобилизованной) периферической крови следуйте шагу 2.2, чтобы изолировать и использовать Т-клетки в качестве сопоставленного контрольного образца для фильтрации зародышевой вариации (Рисунок 1). Основная популяция Т-клеток будет разделять те же отношения линии, что и HSPCs.
-
Культура MSC
- Подготовьте 50 мл среды MSC, содержащей 45 мл среднего DMEM/F12, 10% FBS, 500 л трипсина или альтернативного трипсина, и 500 л раствора пенициллина/стрептомицина.
- Плита примерно 5 х 105 моноядерных клеток в 1,5 мл среднего MSC на скважину. Поместите клетки в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
- Замените среду после 24 ч, а затем заменить средний каждые 3 дня, чтобы убедиться, что все гематопоитические клетки смываются. Продолжайте культуру до 100%.
- Если MSCs являются сливочными, мыть клетки с 1 мл PBS и урожай MSCs, добавив 200 зл. трипсина или трипсина альтернатива в скважине. Инкубировать клетки в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия. Добавьте 800 кл. среднего MSC, и pipet клетки вверх и вниз, чтобы ослабить клетки из скважины пластины.
- Передача MSCs в микроцентрифуг трубки и гранулы клетки центрифугации в течение 5 мин при 350 х г. Удалить супернатант и продолжить изоляцию ДНК или хранить гранулы при -20 градусов по Цельсию для последующей изоляции ДНК (раздел 4).
-
Изоляция Т-клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании (мобилизованной) периферической крови, Т-клетки могут быть изолированы и использованы в качестве контроля зародышей.- Приостановите действие клеточных гранул в 100 злиц анти-CD3 окрашивающий раствор (1:100 разбавления анти-CD антитела в буфере FACS).
- Вымойте ячейки, добавив 1 мл буфера FACS. Пелле клетки центрифугации в течение 5 мин при 350 х г и повторно в 300 л буфера FACS.
- Изолировать по крайней мере 5 х 105 CD3 "клеток с помощью FACS-сортировки в 5 мл полистирола трубки предварительно заполнены 1 мл FBS.
- Пеллет сортированные клетки с помощью центрифугации в течение 5 мин при 350 х г, удалить супернатант, и продолжить непосредственно с изоляцией ДНК (раздел 4) или хранить гранулы при -20 градусов по Цельсию для последующей изоляции ДНК.
3. Изоляция, сортировка и культура HSPC
- Спин вниз на 1-2 х 107 моноядерных клеток в течение 5 мин на 350 х г и повторно в 50 л буфера FACS (см. шаг 2.2.1). Перенесите клетки в микроцентрифугную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сортировке с йgt;2 х 107 клеток, увеличить смесь антител и FACS объемы буфера соответственно. - Приготовьте 50 зл 2x HSC окрашивающей смесь в соответствии с рецептом, увиденным в таблице1.
| Антитела | объем «L» |
| BV421-CD34 | 5 |
| Смесь FITC-Lineage (CD3/14/19/20/56) | 5 |
| PE-CD38 | 2 |
| APC- CD90 | 0,5 |
| PerCP/Cy5.5 - CD45RA | 5 |
| PE/Cy7- CD49f | 1 |
| FITC -CD16 | 1 |
| FITC-CD11 | 5 |
| FACS Буфер | 25,5 |
Таблица 1: Сортировка HSC смеси. Показана таблица, указывающая на разбавления антител, используемых для сортировки ГХК.
- Смешайте 50 зл клеточного раствора с готовой смесью окрашивания HSC и инкубируете клетки в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) или на 1 ч на льду для связывания антител.
- Вымойте клетки, добавив 1 мл буфера FACS и гранулы центрифуги в течение 5 мин при 350 х г.
- Resuspend клетки в 300 зЛ буфера FACS и фильтровывать подвеску клетки через 35 мкм ячейки ситечко-крышка 5 мл полистирола трубки для удаления клеточных сгустков до флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS).
- Подготовка 25 мл среды культуры HSPC, состоящая из 1x SFEM среднего дополнен 100 нг/мЛ SCF, 100 нг/мл Flt3, 50 нг/мл TPO, 10 нг/мл Ил-3, 20 нг/мл IL- 6, и 100 нг/мл антибиотика формулировки (см. Таблица материалов).
- Заполните 384 хорошо пластины культуры клеток с 75 Зл культуры среды HSPC в каждом колодце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения испарения среды во внешних скважинах, заполнить внешние скважины с 75 л стерильной воды или PBS, и не использовать эти скважины для сортировки клеток. -
Сортировка одного HSPCs
- Установите ворота для сортировки HSPC на основе неокрашенного элемента управления (шаг 1.9) и 10 000 ячеек из окрашенного образца. Репрезентативный результат для установки ворот изображен на рисунке 1. Ворота одиночные ячейки, рисуя ворота вокруг линейной FSC-высоты против FSC-области фракции. Используйте неокрашенные фракции управления, чтобы нарисовать ворота для линии- фракции. Нарисуйте ворота для клеток CD34и далее характеризуйте этот подмножество, установив определенные ворота для клеток CD38- CD45RA.
- Загрузите 384 пластины скважины на машину FACS и сортируйте одиночные ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если это применимо к FACS-машина, переключитесь на возможность сохранить данные сортировки индексов, чтобы обеспечить повторную отслеживание отсортированных ячеек.
-
Культивирование singly-sorted HSCs
- Непосредственно перенесите 384 пластины скважины в увлажненный инкубатор 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения испарения во время культуры, оберните 384 хорошо культуры пластины (с крышкой) в прозрачной полиэтиленовой пленкой. - Держите 384 хорошо пластины в инкубаторе в течение 3-4 недель, пока видимые клоны появляются. Репрезентативные изображения клональной культуры изображены на рисунке 2. В зависимости от состояния входиного материала 5%-30% отсортированных клеток будут клонально расширяться.
- Непосредственно перенесите 384 пластины скважины в увлажненный инкубатор 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.
4. Урожай hSPC клонов
- После 4 недель культивирования, определить, какие скважины имеют стоечность 30% или выше.
- Предварительно заполнить (для каждого клонального нароста) 1,5 мл микротрубок с 1 мл 1% BSA в PBS и пометить трубку в соответствии с соответствующим итогом.
- Предварительно влажный кончик пипетки с 1% BSA в PBS, чтобы свести к минимуму количество клеток, прилипающих к кончику пипетки.
- Pipet вверх / вниз среды в хорошо яростно (по крайней мере 5 раз) с 200 л пипетка (установленна на 75 Зл) и царапать дно колодца, чтобы ослабить клетки в колодце, и собирать клеточной подвески в помечены микротрубки, соответствующие хорошо.
- Возьмите 75 л свежего 1% BSA в PBS и повторить пипетки в колодце, чтобы обеспечить максимальное поглощение клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клонально культивированные клетки могут прилипать к нижней части колодца. Осмотрите скважины с помощью стандартного перевернутого светового микроскопа, чтобы убедиться, что все клетки были собраны. - Если все скважины с флюэнтивом в размере 30% были собраны, поместите 384 пластины скважины обратно в инкубатор. Клональные культуры могут размножаться до 5 недель.
- Спин вниз клеточной подвески в течение 5 мин на 350 х г. Должна быть видна небольшая гранулы.
- Тщательно удалите все, кроме 5 зл супернатанта. Клеточные гранулы могут быть заморожены при -20 градусов и храниться в течение нескольких месяцев до изоляции ДНК.
5. Изоляция ДНК
-
Изолировать HSPC и MSC / T-клеточная ДНК с помощью микро-масштабного комплекта изоляции ДНК в соответствии с инструкцией производителя со следующими корректировками:
- Добавьте 2 ЗЛ RNase A после добавления буфера AL во время раздела 2. Инкубировать в течение 2 мин перед добавлением протеиназа K.
- Инкубировать в течение 30 минут при 56 градусах по Цельсию вместо 10 мин.
- Выясните ДНК, загрузив столбец с 50 зл буфера TE с низким EDTA (10 мм Tris, 0,1 мм EDTA). Для оптимального elution, перезагрузите eluate снова на колонке и закрутите снова.
- Определите концентрацию ДНК с помощью ДНК, измеряемых 2 Зл на клон. Урожайность ДНК обычно колеблется в зависимости от 0,5-3 нг/Л.
6. Секвенирование
- Выполните секвенирование ДНК, описанное Jager et al.13
7. Картирование и соматические мутации
- Карта вывода секвенирования (файлы FAST) к эталонного генома и вызов мутаций, как описано в Jager et al.13
- Проверяйте данные на наличие аномальных кариотипических изменений в секвенированных клонах и массовых данных с помощью инструмента анализа номеров копий, такого как Control-FreeC14. До сих пор мы не сообщали о каких-либо HSPCs с кариотипическими аберрансами.
- Создайте черный список, который состоит из панели непревзойденных нормальных образцов для фильтрации целей из собственного набора образцов, как ранее описано13, или использовать следующий загруженный черный список: slt;https://data.mendeley.com/datasets/9y4yhwt5rp/3'gt.
- Фильтр одного нуклеотида вариации с помощью SNVFI злител;https://github.com/ToolsVanBox / SNVFI.gt;.gt;
- Предустановленный файл SNVFI.config, таким образом, что все пути к функциям помощника являются правильными.
- Выполнить SNVFI с файлом .ini, настроенным в соответствии с настройками, увиденными в дополнительном файле 1 (SNVFI.ini). Чтобы исключить in vitro индуцированные мутации, мы фильтруем для VAF 0,39.
- Проверьте вариант аллелева (VAF) выход SNVFI(Рисунок 4). Проверьте, является ли пик плотности участка около 0,5, указывая, что образец является клональным.
-
ФАКТИВ: Чтобы определить часть генома, которая покрыта во время фильтрации, определить вызываемые регионы вдоль зародышевой линии и контролировать с помощью CallableLoci от GATK (Genome Analysis ToolKit):
java-jar GenomeAnalysistK.jar
-T CallableLoci
-R reference.fasta
-Я myreads.bam
-Сводка таблицы.txt
-o callable-status.bed -
ФАКТИВ: Извлеките Callable области из выхода CallableLoci и выполните парные пересечения между образцами и объемом с помощью скрипта Python CallableLoci-processor.py, присутствующих на https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . Полученные файлы кровати могут быть использованы для дальнейшего фильтрации вывода SNVFI и для проверки мутационного профиля в разделе 9:
CallableLoci-processor.py dir'in dir-out sample-name bulk-name -samples1 sample22 sample3
8. Индель Вызов
- Выберите все вставки и удаления (Indels) в файле raw-variants.vcf с помощью GATK SelectVariants:
java -Xmx12G
-jar GenomeAnalysistK.jar
-T ВыборВарианты
-R ссылка genome.fasta
-V raw-variants.vcf
-o raw-INDELs.vcf
-выбратьТип ИНДЕЛЬ - Список фильтров с использованием INDELFI lt;https://github.com/ToolsVanBox/INDELFI;gt;:
perl INDELFI.pl -i input.vcf (от шага 8.1)
-s образец теста столбца
-c образец управления столбом
9. Мутациальная проверка профиля
- Используйте полученные файлы .vcf из выхода SNVFI с шага 7.6 (или с шага 7.9 с дополнительным анализом локусов) для анализа геномного мутационного профиля, типов мутаций и анализа подписи с помощью R-пакета MutationalPatterns15: lt;http:/bioconductor.org/packages/release/bioc/html.html.html.html.html.html.html.html.html.html.html.html.html.html. Для репрезентативного вывода, который может быть произведен с помощью полученного файла .vcf, такого как мутационный спектр 96-тринуклеотид, см. Рисунок 5.
10. Строительство девирационного линейного дерева с использованием базовых замен
- Чтобы построить дерево линии развития, обнаружить общие мутации между клонами. Мутации, присутствующие в первых ветвях линейного дерева, также могут быть подклонально представлены в массовом образце (MSC/T-cells). Позже ветвления линий будут определяться мутациями, разделяемыми только клонами HSPC.
- Для выявления мутаций, которые присутствуют в подмножестве клонов и подклонически присутствуют в объеме, выполните следующие шаги.
- Для фильтрации соматических мутаций, разделяемых между клонами, запустите filterSomatic.py скрипт в терминале на основе Unix. Скрипт можно найти по адресу https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Перед запуском этого скрипта отредкийте файл filterSomatic.ini (см. Дополнительный файл2), чтобы установить пути и настроить другие параметры.
- Выполнить filterSomatic.py(python3 filterSomatic.py -i filterSomatic.ini).
- Фильтр для мутаций, которые покорно присутствуют в объеме с помощью Determine-lowVAF-bulk. R-скрипт в терминале на основе Unix. Скрипт можно найти по адресу https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Это позволит генерировать отдельные файлы .vcf для общих и уникальных SNVs:
Rscript Determine-lowVAF-bulk. R
--vcf Путь/К/Фильтру-соматике-output.vcf
--бык навалом-имя
--образец-имя образца
--гендерная ФЗ
--аут-дир-аут-дир - Определите все мутации, разделяемые между клонами, которые не присутствуют в массовой выборке, перекрывая все позиции мутаций (конкатная колонка 1 и 2 выхода SNVFI).
- Исключить ложные срабатывания, полученные во время шагов 10.5 и 10.6 при ручном осмотре с использованием IGV16. Мутации считаются ложными, когда нет, когда мутация присутствует в зародышевой линии или когда присутствует в плохо отображенные регионы, см. Рисунок 7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы настоятельно рекомендуем повторно секвенировать все общие локусы независимо, используя целевое или секвенирование. - Используйте общие мутации, полученные во время шагов 10.1 и 10.2, чтобы построить двоичную таблицу мутаций по сравнению с секвенированными клонами, с 0, указывающими на отсутствие мутации, и 1, указывающим на наличие мутации.
- Выход мутации двоичной таблицы, как в тепловой карте вместе с дендрограммой с указанием отношений линии между клетками с помощью R. Тепловая карта указывает состояние мутаций для каждой клетки. Смотрите выход этой функции(рисунок 6).
Клоны злт;- read.table ("Путь/К/Двоичный")
моя палитра йlt;- colorRampPalette (c ("#cccccc", "#333333"))(n no 2)
колебрейки Злт;- c (0,0.5,1)
heatmap.2 (клоны, distfun'function (x) dist (x,method и 'binary'),
hclustfun'function (x) hclust (x,method - средний),
дендрограмма - "колонка", Роув и Ф,
col'my-palette, брейки-коло-брейки,
трассы "никто", плотности.инфо "никто")
Representative Results
Экспериментальная процедура
Экспериментальный рабочий процесс изображен на рисунке 1. В зависимости от типа входиного материала необходимо следовать различным шагам. На рисунке 2 показан цитометрический выход пуповинной клетки. Во-первых, все моноцитные клетки выбираются путем свободного рисования ворот вокруг этой популяции. Затем синглеты выделяются, выбирая для ячеек с линейным соотношением FSC-H/FSC-A, так как более низкое соотношение FSC-H/FSC-A включает дублеты или ячейки. Незапятнанный контрольный образец используется для определения ворот сортировки ячеек для линии- ,CD34,CD38-, CD45RA-. Кроме того, CD90 и CD49f могут быть использованы для различения клеток-прародителей или самообновляющихся стволовых клеток17 (рисунок 2). Сортировка индекса позволяет переотслеживать отдельные ячейки, а отсортированные ячейки изображаются как коричневые точки. Во время клеточной культуры, отдельные клоны могут расширяться в другом темпе, с некоторыми клонами расширения в течение 3 недель, в то время как другие клоны только полностью расширены до пятой недели культуры. См Рисунок 3A, B для представительной колонии нарастания. Репрезентативная картина показана почти сливочного MSC объемной культуры на 11 дней после покрытия(Рисунок 3C).
Проверка качества после секвенирования и анализа мутаций
Показан пример вывода анализа числа копий, генерируемого Control-FreeC14 для проверки изменений числа копий(рисунок 4). Кариотипическая информация может указывать, какие хромосомы исключить во время выполнения SNVFI (шаг 7.6). Сюжет VAF, созданный SNVFI(Рисунок 5) представляет собой гистограмму частот аллелей в образце. Пик плотности участка в 0,5 указывает на то, что образец является клональным. Чтобы получить более глубокое представление о основных биологических причин, лежащих в основе мутаций, они могут быть проанализированы с помощью пакета R MutationalPatterns15. Изображенный здесь типичный анализ производства 96-тринуклеотидного участка(рисунок 6). В дополнение к количественной оценке различных типов мутаций, извлечение подписи также может быть выполнено с помощью этого инструмента.
Построение девирационного линейного дерева
Мутации, общие между клонами или присутствующие в клоне (и при низком VAF) в контроле зародыша проверяются с помощью IGV. Мутации считаются верными при представлении в образце, а не на высоком уровне VAF в зародышевой линии(рисунок 7A). Мутации считаются ложными, когда не присутствуют в IGV, что может произойти в плохо отображенные регионы(рисунок 7B). В других случаях, события, обнаруженные SNVFI пропущенных мутаций зародышевой линии(рисунок 7C). Для этих мутаций в отдельных клонах настоятельно рекомендуется независимое повторное секвенирование мутаций путем целенаправленного повторного секвенирования. После обнаружения общих соматических мутаций между клонами генерируется двоичная матрица (шаг 10.8). Построена тепловая карта, содержащая клетки с общими мутациями A-M и без нее. Над этой тепловой картой указывается дерево линии развития(рисунок8).
Рисунок 1: Flowchart, изображающий экспериментальную процедуру, основанную на вхотливном материале. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Стратегия сортировки ячеек. Во-первых, gating выполняется на небольших моноядерных клетках. Во-вторых, одиночные ячейки закрыты выбором линейной фракции. Линия отрицательных ячеек закрыты. Все КЛЕТКи CD34и CD38- являются одноклеточными. Следует отметить фракцию ячеек в коричневом цвете, которые являются отсортированными ячейками, выделенными вариантом "индексная сортировка". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Результаты культуры ячейки представителя. Представитель HSPC клонов в 384 хорошо пластины на (A) 2 недели после покрытия и (B) 4 недели после покрытия. (C) MSC культуры после 2 недель средней замены. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Кариотипы. (A) Клональная культура HSPC и (B) MSC объемный образец. Кариотипы определялись глубоким анализом чтения. Оба графика указывают на кариотипично нормальный образец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Гистограмма частот аллелей варианта. Гистограмма варианта аллели частоты вариантов в клон амплоге до последнего шага фильтрации SNVFI (VAF Пик на VAF 0,5 указывает на то, что образец является клональным. Субклональные мутации с низким VAF исключаются во время последнего этапа фильтрации SNVFI (VAF;0.3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Репрезентативный анализ мутационного спектра соматических мутаций в образце HSPC. Изображен относительный вклад каждого изменения тринуклеотида (из которых средняя база мутирует) в общий спектр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Ручной осмотр мутаций с использованием IGV16. (A) Мутации считаются верными, когда присутствует в клоне, а не в массовом образце. (B) Мутации рассматриваются как ложные срабатывания при представлении в плохо отображенный регион. (C) Мутации считаются ложными срабатываниями при представлении в контроле зародышей. Вертикальная линия указывает на положение так называемой мутации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Строительство девирационного дерева линии. Изображена дендрограмма, указывающая на развитие линий, отделяющихся во время разработки. Тепловая карта под дендрограммой указывает на наличие мутаций в разных клонах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Представлен о своей работы метод выявления мутаций, накопленных при жизни в отдельных ГСПК, и построении раннего дерева линии развития с использованием этих данных мутаций.
Для успешного выполнения этих анализов необходимо выполнить ряд критических требований. Во-первых, необходимо обеспечить жизнеспособность выборки. Быстрая обработка образца является ключом к обеспечению эффективности процедуры. Во-вторых, потеря фактора роста потенции негативно скажется на клональном расширении HSPCs. Для обеспечения высокой потенции фактора роста важно избегать циклов замораживания оттепели и готовить одноразовые аликоты. В-третьих, после выполнения WGS, вызова мутации и фильтрации, очень важно проверить клональность клональной культуры. Чтобы подтвердить клональность культуры, VAF мутаций должен кластера около 0,5 в кариотипично нормальный образец (Рисунок 3). В клетках с низкой мутационной нагрузкой, таких как Пуповинная кровь HSPCs, труднее определить клональность из-за низких числа мутаций.
Наш подход опирается на расширение в пробирке одиночных клеток, чтобы обеспечить WGS. Таким образом, наш подход ограничен ячейками, которые имеют репликационный потенциал клонально расширяться, такие как HSPCs. В наших руках около 5%-30% всех односортных ячеек способны адекватно расширяться. Снижение темпов роста потенциально может привести к смещению выбора. Как обсуждалось ранее, методы с использованием WGA может преодолеть этот выбор смещения, как этот метод не опирается на расширение клеток. Тем не менее, WGA имеет свои недостатки, и клональное усиление остается единственным методом точно гостевых мутаций во всем геноме без аллельных отсева и равного охвата вдоль генома, особенно в образцах с низким истинным соматическим мутации чисел.
Данные, генерируемые с помощью этого подхода, могут быть использованы для определения филогений гематопоетической системы, так как мутации, обнаруженные в одиночных клетках, могут быть использованы для вскрытия клеточных линий, как показано на рисунке 6. Как правило, одна или две мутации могут определить каждую ветвь в здоровом доноре1. Так как линии ветви рано после зачатия, мутации, определяющие эти первые ветви также будет присутствовать с низким VAF в соответствующем нормальном образце, который был использован для фильтрации зародышевой варианты1,18,19. В этом случае, использование негематопоэтиных клеток, таких как MSCs, являются предпочтительными, поскольку они, как ожидается, отделить очень рано во время разработки от гематопойетической системы. Поскольку Т-клетки имеют гематопоиетическое происхождение, использование этих клеток в качестве нормального образца для фильтрации вариантов зародышевых линий может таким образом запутать конструкцию самого раннего ветвления дерева девятки. Подклональное присутствие отраслевых мутаций в некоторых зрелых популяциях крови, которые могут быть измерены путем целенаправленного глубокого секвенирования, будет означать, что потомство этой ветви может привести к тому, что зрелый тип клеток. Кроме того, наш подход позволяет оценить мутационные последствия мутагенного воздействия in vivo и, в конечном счете, как это может способствовать развитию лейкемии.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом VIDI Нидерландской организации научных исследований (NWO) (No 016.Vidi.171.023) на проект R. v. B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| 50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
| CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
| CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
| CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
| CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
| CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
| CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
| CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
| Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
| CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
| Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
| Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
| Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
| Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
| PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
| RNAse A | Qiagen | 19101 | |
| SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
| StemSpan SFEM, 500 mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
| TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |
References
- Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).
- Genovese, G., et al. Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence. New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes. New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).
- Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. Nature Communications. 7, 1-7 (2016).
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer. Cell Reports. 3, 246-259 (2013).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500, 415-421 (2013).
- Alexandrov, L., et al. The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer. bioRxiv. , (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. 513, 422-425 (2014).
- Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538, 260-264 (2016).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: Current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).
- Dong, X., et al. Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells. Nature Methods. 14, 491-493 (2017).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150, (2012).
- Jager, M., et al. Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures. Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).
- Boeva, V., et al. Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data. Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).
- Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes. Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. , (2011).
- Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561, 473-478 (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. , (2014).
