Summary
Los patrones de mutación somática en las células reflejan la exposición mutagénica anterior y pueden revelar relaciones de linaje del desarrollo. Aquí se presenta una metodología para catalogar y analizar mutaciones somáticas en células madre hematopoyéticas individuales y células progenitoras.
Abstract
Las células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSpC) acumulan gradualmente mutaciones de ADN durante su vida útil, lo que puede contribuir a enfermedades asociadas a la edad como la leucemia. Caracterizar la acumulación de mutaciones puede mejorar la comprensión de la etiología de las enfermedades asociadas a la edad. Aquí se presenta un método para catalogar mutaciones somáticas en HSCCP individuales, que se basa en la secuenciación del genoma completo (WGS) de los cultivos celulares primarios clonales. Las mutaciones que están presentes en la célula original son compartidas por todas las células en el cultivo clonal, mientras que las mutaciones adquiridas in vitro después de la clasificación celular están presentes en un subconjunto de células. Por lo tanto, este método permite la detección precisa de mutaciones somáticas presentes en los genomas de los HSCCP individuales, que se acumulan durante la vida. Estos catálogos de mutaciones somáticas pueden proporcionar información valiosa sobre los procesos mutacionales activos en el tejido hematopoyético y cómo estos procesos contribuyen a la leucomogénesis. Además, mediante la evaluación de mutaciones somáticas que se comparten entre múltiples HSCCP del mismo individuo, se pueden determinar las relaciones de linaje clonal y la dinámica poblacional de las poblaciones sanguíneas. Como este enfoque se basa en la expansión in vitro de células individuales, el método se limita a las células hematopoyéticas con suficiente potencial replicativo.
Introduction
La exposición de células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSCCP) a fuentes mutagénicas endógenas o extrínsicas contribuye a la acumulación gradual de mutaciones en el ADN durante una vida útil1. La acumulación gradual de mutaciones en los HSCCP1 puede dar lugar a hematopoyesis clonal relacionada con la edad (ARCH)2,3, que es una condición no sintomática impulsada por HSCCP portadores de mutaciones de leucemia-conductor. Inicialmente, se pensó que las personas con ARCH tienen un mayor riesgo de leucemia2,3. Sin embargo, estudios recientes han demostrado una incidencia de95% de ARCH en personas mayores 4, haciendo la asociación con neoplasias malignas menos clara y planteando la cuestión de por qué algunos individuos con ARCH finalmente desarrollan o no neoplasias malignas. No obstante, las mutaciones somáticas en los SSPCCP pueden suponer graves riesgos para la salud, ya que los trastornos mielodisplásicos y la leucemia se caracterizan por la presencia de mutaciones específicas del conductor del cáncer.
Para identificar los procesos mutacionales y estudiar la clonalidad de la sangre, es necesario caracterizar la acumulación de mutaciones en los HSCCP individuales. Los procesos mutacionales dejan patrones característicos en el genoma, las llamadas firmas mutacionales, que pueden ser identificadas y cuantificadas en colecciones de mutacionesdetodo el genoma 5. Por ejemplo, la exposición a la luz UV, los agentes alquiladores y losdefectos en las vías de reparación del ADN se han asociado con una firma mutacional diferente 6,7. Además, debido a la naturaleza estocástica de las acumulaciones de mutaciones, la mayoría (si no todas) de las mutaciones adquiridas son únicas entre las células. Si las mutaciones se comparten entre varias células del mismo individuo, indica que estas células comparten un ancestro común8. Por lo tanto, mediante la evaluación de mutaciones compartidas, las relaciones de linaje se pueden determinar entre las células y un árbol de linaje del desarrollo se puede construir rama por rama. Sin embargo, catalogar mutaciones somáticas raras en células fisiológicamente normales es técnicamente difícil debido a la naturaleza policlonal de los tejidos sanos.
Aquí se presenta un método para identificar y determinar con precisión mutaciones somáticas en los genomas de los HSCCP individuales. Esto implica el aislamiento y la expansión clonal de los HSCCP in vitro. Estos cultivos clonales reflejan la composición genética de la célula original (es decir, las mutaciones en la célula original serán compartidas por todas las demás células del cultivo). Este enfoque nos permite obtener suficiente ADN para la secuenciación del genoma completo (WGS). Hemos demostrado previamente que las mutaciones acumuladas in vitro durante el cultivo clonal serán compartidas por un subconjunto de células. Esto permite el filtrado de todas las mutaciones in vitro, ya que éstasestarán presentes en una fracción más pequeña de las lecturas en comparación con las mutaciones adquiridas in vivo 9. Los métodos anteriores han obtenido suficiente ADN de una sola célula para WGS utilizando amplificación del genoma completo (WGA)10. Sin embargo, la principal desventaja de WGA es su amplificación relativamente propensa a errores y desequilibrada del genoma, que puede resultar en deserciones de alelo11. No obstante, dado que este enfoque se basa en la expansión in vitro de células individuales, se limita a las células sanguíneas con suficiente potencial replicante, lo que no es el caso de los métodos dependientes de WGA. Los esfuerzos anteriores que secuencian cultivos clonales han confiado en el uso de capas de alimentación para garantizar la amplificación clonal de HSCCP individuales12. Sin embargo, el ADN de las capas del alimentador puede potencialmente contaminar el ADN de los cultivos clonales, confundiendo la posterior llamada y filtrado de la mutación. El método presentado aquí se basa únicamente en un medio especificado para ampliar clonalmente los HSCCP únicos y, por lo tanto, evita la emisión de contaminación del ADN. Hasta ahora, hemos aplicado con éxito este método en la médula ósea humana, la sangre del cordón umbilical, la médula ósea congelada de forma visibilidad y la sangre periférica.
Protocol
Las muestras deben obtenerse de acuerdo con los protocolos de ética apropiados, y los donantes deben dar su consentimiento informado antes del procedimiento.
1. Preparación del material de muestra
NOTA: Cuando trabaje con material recién obtenido, comience con el paso 1.1. Cuando trabaje con material congelado, comience con el paso 1.2.
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Preparación de médula ósea fresca, sangre de cordón umbilical o sangre periférica
- Aísle la fracción mononuclear de la muestra utilizando la separación de gradiente de densidad siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales)y cuente las células mononucleares utilizando un hemocitómetro. Después del aislamiento de las células mononucleares, continúe con el paso 1.3.
- OPCIONAL: El número recomendado de células necesarias para ordenar una placa completa de 384 pozos de HSCCP es 1–2 x 107. Si se aíslan más células durante la centrifugación de gradiente de densidad, almacene el excedente de células en nitrógeno líquido.
- Resuspenda las celdas en 500 oL de IMDM + 10% FBS por 1 x 107 celdas, y agregue drop-by-drop un volumen igual de IMDM + 30% FBS + 20% DMSO para lograr una suspensión de 1 x 107 celdas en 1 mL de IMDM + 20% FBS + 10% DMSO.
- Transfiera inmediatamente las células mononucleares a viales criogénicos de 1 ml y las células de congelación a -80 oC en un recipiente de congelación de células de velocidad controlada durante la noche. Transfiera las células al día siguiente a un almacenamiento de nitrógeno líquido tras su posterior procesamiento.
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Preparación de células mononucleares congeladas de la médula ósea, la sangre del cordón umbilical o la sangre periférica
- Preparar 50 ml de medio de descongelación celular que contenga 45 ml del medio de águila modificada (IMDM) de Iscove y 5 ml de suero bovino fetal (FBS), y calentar en un baño de agua de 37 oC.
- Tomar el vial que contiene la muestra del almacenamiento de nitrógeno líquido, transferir la muestra al hielo seco y descongelar lo antes posible en un baño de agua de 37 oC.
- Cuando la muestra esté casi desconsadesalida, limpie el vial con 70% de etanol y transfiera su contenido a un tubo cónico de 50 ml. Enjuague el vial con 1 ml de IMDM precalentado + 10% FBS para recoger las celdas restantes, y agregue esta solución en sentido de gota (5 s por gota) a la muestra descongelada mientras arremolina suavemente el tubo.
- Agregue un adicional de 15 ml de IMDM + 10% FBS en sentido lento a la muestra mientras arremolina suavemente el tubo.
- Pellet las células por centrifugación durante 5 min a 350 x g.
- Retire todos los 3 ml menos de 3 ml del sobrenadante. Resuspenda las células en el sobrenadante restante y diluya añadiendo 20 ml de IMDM + 10% FBS gota a gota mientras agita suavemente el tubo.
- Tomar 10 s de la suspensión celular para el conteo celular. Diluir estos 10 l agregando 20 sl de solución azul trypan al 0,4% y contar las células usando un hemocitómetro. El número de células puede disminuir al descongelarse, con hasta un 50% de pérdida de células después de descongelarse. La viabilidad celular debe oscilar entre 70% y 90%.
- Si trabaja con células sanguíneas de médula ósea o de cordón umbilical, tome 5 x 106 células mononucleares para el cultivo de MSC (paso 2.1). Si trabaja con sangre periférica, tome 2–5 x 106 células para el aislamiento de células T (paso 2.2)
- Células restantes de pellets 5 min a 350 x g y resuspenden en 3 ml de búfer FACS (0,05% BSA + 1 mM EDTA en PBS).
- Transfiera 1 x 105 células a un microtubo lleno con 200 ml de tampón FACS, que servirá como un control negativo para la citometría de flujo (paso 3.8), y manténgalo en hielo.
2. Cultivo celular
NOTA: Para obtener catálogos de mutaciones adquiridas somáticamente, es necesario filtrar la variación de la línea germinal específica del donante. Cuando se inician biopsias de médula ósea o sangre de cordón umbilical, las células estromales mesenquimales (MSC) se pueden utilizar como control coincidente para filtrar la variación de la línea germinal. En este caso, siga la sección 2.1. Cuando utilice sangre periférica (movilizada) siga el paso 2.2 para aislar y utilizar células T como muestra de control coincidente para filtrar la variación de la línea germinal (Figura1). La población masiva de células T compartirá la misma relación de linaje que los HSCCP.
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Cultura MSC
- Preparar 50 ml de medio MSC que contenga 45 ml de medio DMEM/F12, 10% FBS, 500 ml de alternativa de trippsina o trippsina y 500 ml de solución de penicilina/estreptomicina.
- Placa aproximadamente 5 x 105 células mononucleares en 1,5 ml de medio MSC por pozo. Colocar las células en una incubadora humidificadaa 37oC con un 5% de CO2.
- Reemplazar el medio después de 24 h, y posteriormente reemplazar el medio cada 3 días para asegurarse de que todas las células hematopoyéticas se lavan. Continúe cultivando hasta que la confluencia sea del 100%.
- Si los MSC son confluentes, lave las células con 1 ml de PBS y cosecha los MSC agregando 200 sL de trypsin o trypsin alternativa por pozo. Incubar células durante 5 min a 37oC. Agregue 800 s de medio MSC y encadene las células hacia arriba y hacia abajo para aflojar las células de la placa del pozo.
- Transfiera los MSC al tubo de microcentrífuga y replete las células por centrifugación durante 5 min a 350 x g. Retire el sobrenadante y continúe con el aislamiento del ADN o almacene el pellet a -20 oC para un aislamiento posterior del ADN (sección 4).
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Aislamiento de células T
NOTA: Si se utiliza sangre periférica (movilizada), las células T se pueden aislar y utilizar como control de la línea germinal.- Resuspender el gránulo celular en 100 l de solución de tinción anti-CD3 (dilución 1:100 de anticuerpo anti-CD en tampón FACS).
- Lave las células agregando 1 ml de búfer FACS. Reventar las células por centrifugación durante 5 min a 350 x g y resuspender en 300 s de tampón FACS.
- Aísle al menos 5 x 105 células CD3+ utilizando un clasificador FACS en un tubo de poliestireno de 5 ml precargado con 1 ml de FBS.
- Reventar las células clasificadas utilizando centrifugación durante 5 min a 350 x g, eliminar el sobrenadante, y continuar directamente con aislamiento de ADN (sección 4) o almacenar el pellet a -20 oC para un posterior aislamiento del ADN.
3. Aislamiento, clasificación y cultura de HSPC
- Gire hacia abajo a 1–2 x 107 células mononucleares durante 5 min a 350 x g y resuspende en 50 s de tampón FACS (ver paso 2.2.1). Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga.
NOTA: Al ordenar con >2 x 107 células, aumente la mezcla de anticuerpos y los volúmenes de búfer FACS en consecuencia. - Preparar 50 l de mezcla de tinción HSC 2x de acuerdo con la receta que se ve en la Tabla1.
| Anticuerpo | volumen [L] |
| BV421-CD34 | 5 |
| Mezcla FITC-Lineage (CD3/14/19/20/56) | 5 |
| PE-CD38 | 2 |
| APC- CD90 | 0.5 |
| PerCP/Cy5.5 - CD45RA | 5 |
| PE/Cy7- CD49f | 1 |
| FITC -CD16 | 1 |
| FITC-CD11 | 5 |
| Zona de influencia FACS | 25.5 |
Tabla 1: Mezcla de clasificación HSC. Se muestra una tabla que indica las diluciones de los anticuerpos utilizados para ordenar los HSC.
- Mezclar 50 ml de solución celular con la mezcla de tinción HSC preparada e incubar las células durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) o durante 1 h sobre hielo para que los anticuerpos se adhieran.
- Lave las células añadiendo 1 ml de tampón FACS y pellet mediante centrifugación durante 5 min a 350 x g.
- Resuspenda las células en 300 ml de tampón FACS y filtre la suspensión celular a través de un tubo de poliestireno de 5 ml con tapa de celda de 35 m para eliminar los grumos celulares antes de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
- Preparar 25 ml de medio de cultivo HSPC, compuesto por 1x medio SFEM complementado con 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL- 6 y formulación de antibióticos de 100 ng/mL (ver Tabla de Materiales).
- Llene una placa de cultivo de celda de pozo de 384 pozos con 75 ml de medio de cultivo HSPC en cada pocal.
NOTA: Para evitar la evaporación del medio en los pozos exteriores, llene los pozos exteriores con 75 ml de agua estéril o PBS, y no utilice estos pozos para la clasificación celular. -
Clasificación de HSCCP individuales
- Establezca puertas para la clasificación de HSPC en función de un control sin mancha (paso 1.9) y 10.000 celdas de la muestra manchada. En la Figura 1se muestra un resultado representativo para establecer puertas. Compuerta las celdas individuales dibujando una puerta alrededor de la altura lineal FSC frente a la fracción del área FSC. Utilice la fracción de control sin mancha para dibujar la puerta para el linaje- fracción. Dibuje puertas para CD34+ celdas y caracterice aún más este subconjunto estableciendo una puerta específica para las celdas CD38- CD45RA - .
- Cargue la placa de pozo 384 en la máquina FACS y ordene las células individuales.
NOTA: Si es aplicable a la máquina FACS, active la opción para mantener los datos de ordenación de índices para habilitar el seguimiento de las celdas ordenadas.
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Culturing HSCs clasificados por separado
- Transfiera directamente la placa de pozo 384 a una incubadorahumidificada de 37 oC con un 5% de CO2.
NOTA: Para evitar la evaporación durante el cultivo, envuelva la placa de cultivo de pozo 384 (con tapa) en envoltura de polietileno transparente. - Mantenga la placa de pozo 384 en la incubadora durante 3-4 semanas hasta que aparezcan clones visibles. Las imágenes representativas de la cultura clonal se muestran en la Figura2. Según la condición del material de entrada 5%–30% de las celdas clasificadas se expandirán clonalmente.
- Transfiera directamente la placa de pozo 384 a una incubadorahumidificada de 37 oC con un 5% de CO2.
4. Cosecha de clones HSPC
- Después de 4 semanas de cultivo, determinar qué pozos tienen una confluencia de 30% o más.
- Pre-llenado (para cada crecimiento clonal) 1,5 ml de microtubos con 1 ml de 1% de BSA en PBS y etiquetar el tubo de acuerdo con el pozo correspondiente.
- Humedezca previamente una punta de pipeta con 1% de BSA en PBS para minimizar el número de células que se adhieren a la punta de la pipeta.
- Entubar/bajar el medio en el pozo ferozmente (al menos 5 veces) con una pipeta de 200 l (establecida en 75 l) y raspar la parte inferior del pozo para aflojar las células en el pozo, y recoger la suspensión celular en el microtubo etiquetado correspondiente al pozo.
- Tome 75 ol de BSA fresco 1% en PBS y repita el pipeteo en el pozo para asegurar la máxima toma de células.
NOTA: Las células cultivadas clonalmente pueden pegarse al fondo del pozo. Inspeccione los pozos utilizando un microscopio de luz invertida estándar para asegurarse de si se han recogido todas las células. - Si se han cosechado todos los pozos con >30% de confluencia, vuelva a colocar la placa de 384 pozos en la incubadora. Los cultivos clonales pueden proliferar hasta 5 semanas.
- Gire hacia abajo la suspensión de la celda durante 5 min a 350 x g. Un pequeño pellet debe ser visible.
- Retirar con cuidado todos los aproximadamente 5 l de sobrenadante. Los gránulos celulares se pueden congelar a -20 oC y almacenarse durante varios meses antes del aislamiento del ADN.
5. Aislamiento de ADN
-
Aísle el ADN de HSPC y MSC/Células T utilizando un kit de aislamiento de ADN a microescala de acuerdo con las instrucciones del fabricante con los siguientes ajustes:
- Añadir 2 l de RNase A después de la adición del tampón AL durante la sección 2. Incubar durante 2 min antes de añadir la proteinasa K.
- Incubar durante 30 min a 56oC en lugar de 10 min.
- Elule el ADN cargando la columna con 50 l de tampón TE con EDTA bajo (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA). Para una elución óptima, vuelva a cargar el eluido en la columna y vuelva a girar.
- Determinar la concentración de ADN utilizando un ADN de 2 ml por clon. El rendimiento del ADN varía típicamente entre 0.5–3 ng/L.
6. Secuenciación
- Realizar la secuenciación del ADN como se describe en Jager et al.
7. Mapeo y llamada de mutación somática
- Asigne la salida de secuenciación (archivos FASTQ) al genoma de referencia y llame mutaciones como se describe en Jager et al.
- Inspeccione los datos en busca de cambios kársticos en clones secuenciados y datos masivos utilizando una herramienta de análisis de números de copia, como Control-FreeC14. Hasta ahora, no hemos reportado ningún HSpaCs con abelancias kariotípicas.
- Genere una lista negra, que consta de un panel de muestras normales no coincidentes con fines de filtrado a partir de un conjunto propio de muestras, como se describió anteriormente13,o utilice la siguiente lista negra cargada:
- Filtre variaciones de nucleótidos individuales mediante SNVFI
- Archivo SNVFI.config predefinido, de modo que todas las rutas de acceso a las funciones auxiliares sean correctas.
- Ejecute SNVFI con el archivo .ini configurado de acuerdo con las configuraciones vistas en el archivo suplementario 1 (SNVFI.ini). Para excluir mutaciones inducidas in vitro, filtramos por un VAF de 0,39.
- Compruebe la salida de la fracción de alelo variante (VAF) de SNVFI (Figura4). Compruebe si el pico de la gráfica de densidad está cerca de 0,5, lo que indica que la muestra es clonal.
-
OPCIONAL: Para determinar la parte del genoma que se cubre durante el filtrado, determine las regiones invocables a lo largo de la línea germinal y controle mediante CallableLoci de GATK (Genome Analysis ToolKit):
java -jar GenomeAnalysisTK.jar ?
-T CallableLoci ?
-R reference.fasta ?
-I myreads.bam ?
-resumen table.txt ?
-o callable_status.bed -
OPCIONAL: Recupere las regiones invocables de la salida CallableLoci y realice intersecciones en pares entre los ejemplos y el volumen mediante la secuencia de comandos python CallableLoci_processor.py presente en https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . Los archivos de cama resultantes se pueden utilizar para filtrar aún más la salida de SNVFI e inspeccionar el perfil mutacional en la sección 9:
CallableLoci_processor.py dir_in dir_out nombre_muestra bulk_name –muestras sample1 sample2 sample3
8. Llamadas indel
- Seleccione todas las inserciones y eliminaciones (Indels) en el archivo raw_variants.vcf utilizando GATK SelectVariants:
java -Xmx12G ?
-jar GenomeAnalysisTK.jar ?
-T SelectVariants ?
-R reference_genome.fasta ?
-V raw_variants.vcf ?
-o raw_INDELs.vcf ?
-selectType INDEL - Filtrar la lista raw_INDELS.vcf mediante INDELFI
perl INDELFI.pl -i input.vcf (del paso 8.1)
-s muestra de prueba de columna ?
-c muestra de control de columna
9. Inspección de perfil esmutacional
- Utilice los archivos .vcf resultantes de la salida SNVFI del paso 7.6 (o del paso 7.9 con análisis de loci invocables opcionales) para analizar el perfil mutacional genómico, los tipos de mutación y el análisis de firmas utilizando el paquete R MutationalPatterns15:
10. Construcción de un árbol de linaje de desarrollo utilizando sustituciones de base
- Para construir un árbol de linaje de desarrollo, detecte mutaciones compartidas entre clones. Las mutaciones presentes en las primeras ramas del árbol de linaje también pueden estar presentes subclonalmente en la muestra a granel (MSCs/células T). Los linajes de ramificación posteriores se definirán mediante mutaciones compartidas únicamente por clones de HSPC.
- Para identificar las mutaciones que están presentes en un subconjunto de los clones y subclonalmente presentes en el grueso, realice los pasos siguientes.
- Para filtrar las mutaciones somáticas compartidas entre clones, ejecute el script filterSomatic.py en un terminal basado en Unix. El script se puede encontrar en https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Antes de ejecutar este script, edite el archivo filterSomatic.ini (consulte Archivo suplementario 2) para establecer las rutas y ajustar los demás parámetros.
- Ejecute filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py -i filterSomatic.ini).
- Filtre las mutaciones que están subclonalmente presentes en el grueso utilizando Determine_lowVAF_bulk. Script R en un terminal basado en Unix. El script se puede encontrar en https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Esto generará archivos .vcf independientes para SNVs compartidos y únicos:
Rscript Determine_lowVAF_bulk. R
--vcf Path/To/Filter_somatic_output.vcf
--bulk_name
--sample_name sample-name
--género [M- F]
--out_dir out_dir - Determinar todas las mutaciones compartidas entre clones que no están presentes en la muestra a granel superponiendo todas las posiciones de mutación (concatenar las columnas 1 y 2 de la salida SNVFI).
- Excluir falsos positivos obtenidos durante los pasos 10.5 y 10.6 mediante inspección manual utilizando IGV16. Las mutaciones se consideran falsas cuando no están presentes, cuando la mutación está presente en la línea germinal o cuando está presente en regiones mal mapeadas, véase la Figura7.
NOTA: Recomendamos encarecidamente volver a secuenciar todos los loci compartidos de forma independiente mediante la secuenciación dirigida o de sanger. - Utilice las mutaciones compartidas obtenidas durante los pasos 10.1 y 10.2 para construir una tabla binaria de mutaciones frente a clones secuenciados, con 0 indicando que la mutación no está presente y 1 indicando la presencia de la mutación.
- Salida de la tabla binaria de mutación como en un mapa de calor junto con un dendrograma que indica las relaciones de linaje entre las células utilizando R. El mapa de calor indica el estado de las mutaciones para cada célula. Vea la salida de esta función (Figura 6).
Clones <- read.table("Path/To/BinaryTable")
my_palette <- colorRampPalette(c("#cccccc", "#333333"))(n s 2)
col_breaks <- c(0,0.5,1)
heatmap.2(clones, distfun-function(x) dist(x,method á 'binary'),
hclustfun-function(x) hclust(x,method - average),
dendrograma - "columna", Rowv a F,
col-my_palette, breaks-col_breaks,
trace"none", density.info-"none")
Representative Results
Procedimiento experimental
El flujo de trabajo experimental se muestra en la Figura1. En función del tipo de material de entrada, se deben seguir diferentes pasos. En la Figura 2 se representa una salida citométrica de flujo de una ordenación de células sanguíneas de cordón umbilical. En primer lugar, todas las celdas monocíticas se seleccionan dibujando libremente una puerta alrededor de esta población. Luego, los singlets se aíslan seleccionando para celdas con una relación lineal FSC-H/FSC-A, ya que una relación FSC-H/FSC-A más baja incluye dobletes o grupos celulares. La muestra de control no manchado se utiliza para definir puertas de clasificación de celdas para linaje-, CD34+, CD38-, CD45RA-. Además, CD90 y CD49f se pueden utilizar para distinguir entre células progenitoras o células madre autorenovadoras17 (Figura2). La ordenación de índices permite el reseguimiento de celdas individuales y las celdas ordenadas se representan como puntos marrones. Durante el cultivo celular, los clones individuales pueden expandirse a un ritmo diferente, con algunos clones expandiéndose en 3 semanas, mientras que otros clones solo se expanden completamente hasta la quinta semana de cultivo. Vea la Figura 3A,B para el crecimiento representativo de la colonia. Se muestra una imagen representativa de un cultivo a granel MSC casi confluente a los 11 días después del revestimiento (Figura3C).
Comprobación de la calidad después de la secuenciación y el análisis de mutaciones
Se muestra una salida de ejemplo del análisis del número de copia generado por Control-FreeC14 para comprobar las alteraciones del número de copia (Figura4). La información cariotípica puede indicar qué cromosomas excluir durante una carrera SNVFI (paso 7.6). La gráfica VAF creada por SNVFI (Figura 5) es un histograma de frecuencias de alelos variantes en la muestra. Un pico en la gráfica de densidad en 0,5 indica que la muestra es clonal. Para obtener más información sobre las causas biológicas subyacentes detrás de las mutaciones, estas se pueden analizar utilizando el paquete R MutationalPatterns15. Aquí se muestra un análisis típico que produce unagráfica de 96-trinucleótido (Figura 6). Además de la cuantificación de diferentes tipos de mutaciones, la extracción de firmas también se puede realizar con esta herramienta.
Construcción de un árbol de linaje de desarrollo
Las mutaciones compartidas entre clones o presentes en un clon (y en VAF bajo) en el control de la línea germinal se validan mediante IGV. Las mutaciones se consideran verdaderas cuando están presentes en la muestra y no en niveles altos de VAF en la línea germinal (Figura7A). Las mutaciones se consideran falsas cuando no están presentes en IGV, lo que puede ocurrir en regiones mal mapeadas (Figura7B). En otros casos, los eventos detectados por SNVFI son mutaciones germinales perdidas (Figura7C). La resecuenciación independiente de mutaciones mediante la resecuenciación dirigida es muy recomendable para estas mutaciones en clones seleccionados. Después de la detección de mutaciones somáticas compartidas entre clones, se genera una matriz binaria (paso 10.8). Se construye un mapa de calor que contiene células con y sin las mutaciones compartidas A-M. Por encima de este mapa de calor se indica el árbol de linaje del desarrollo (Figura8).
Figura 1: Diagrama de flujo que representa el procedimiento experimental basado en el material de entrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estrategia de clasificación de celdas. En primer lugar, el gating se realiza en pequeñas células mononucleares. En segundo lugar, las celdas individuales se anegan por selección de la fracción lineal. Las celdas negativas de linaje están cerradas. Todas las células CD34+ CD38- CD45- están ordenadas en una sola celda. Se debe observar la fracción de las células en marrón, que son las celdas ordenadas resaltadas por la opción "clasificación de índice". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos del cultivo celular. Clones representativos de HSPC en una placa de pozo 384 a (A) 2 semanas después del chapado y (B) 4 semanas después del enchapado. (C) Cultivo MSC después de 2 semanas de reemplazo medio. Barra de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cariotipos. (A) Cultivo Clonal HSPC y (B) muestra a granel MSC. Los cariotipos se determinaron mediante un análisis de lectura a profundidad. Ambos gráficos indican una muestra karyotípicamente normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Histograma de frecuencias de alelos variantes. Histograma de frecuencias de alelos variantes de las variantes en un clon antes del último paso de filtrado de SNVFI (VAF >0.3). Un pico en VAF a 0,5 indica que la muestra es clonal. Las mutaciones subclonales con VAF bajo se excluyen durante el último paso de filtrado de SNVFI (VAF >0.3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis representativo del espectro mutacional de mutaciones somáticas en una muestra de HSPC. Se representa la contribución relativa de cada cambio de trinucleótido (del cual la base media está mutada) al espectro total. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Inspección manual de mutaciones mediante IGV16. (A) Las mutaciones se consideran verdaderas cuando están presentes en el clon y no en la muestra masiva. (B) Las mutaciones se consideran falsos positivos cuando están presentes en una región mal mapeada. (C) Las mutaciones se consideran falsos positivos cuando están presentes en un control germinal. La línea vertical indica la posición de una mutación llamada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Construcción de un árbol de linaje de desarrollo. Representado es un dendrograma que indica que los linajes de desarrollo se separan durante el desarrollo. El mapa de calor bajo el dendrograma indica la presencia de mutaciones en diferentes clones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Aquí se presenta un método para detectar mutaciones que se acumularon durante la vida en HSCCP individuales y para construir un árbol de linaje de desarrollo temprano utilizando estos datos de mutación.
Se deben cumplir varios requisitos críticos para realizar correctamente estos ensayos. En primer lugar, debe garantizarse la viabilidad de la muestra. El manejo rápido de la muestra es clave para garantizar la eficiencia del procedimiento. En segundo lugar, la pérdida de potencia del factor de crecimiento afectará negativamente la expansión clonal de los HSCCP. Para asegurar una alta potencia del factor de crecimiento, es importante evitar los ciclos de congelación y descongelación y preparar alícuotas de un solo uso. En tercer lugar, después de realizar EL WGS, la llamada de mutaciones y el filtrado, es crucial validar la clonalidad de la cultura clonal. Para confirmar la clonalidad del cultivo, el VAF de las mutaciones debe agruparse alrededor de 0,5 en una muestra karyotípicamente normal (Figura3). En las células con una carga mutacional baja, como los HSPC de sangre de cordón umbilical, es más difícil determinar la clonalidad debido a los bajos números de mutación.
Nuestro enfoque se basa en la expansión in vitro de células individuales para permitir WGS. Por lo tanto, nuestro enfoque está restringido a las celdas que tienen el potencial replicativo para expandirse clonalmente, como los HSCCP. En nuestras manos, alrededor del 5%-30% de todas las células de una sola vez son capaces de expandirse adecuadamente. La reducción de las tasas de crecimiento puede potencialmente resultar en un sesgo de selección. Como se discutió anteriormente, los métodos que utilizan WGA pueden superar este sesgo de selección, ya que esta técnica no se basa en la expansión de las celdas. Sin embargo, WGA tiene sus propias deficiencias, y la amplificación clonal sigue siendo el único método para determinar con precisión el número de mutaciones en todo el genoma sin abandonos alélicos e igual cobertura a lo largo del genoma, especialmente en muestras con bajo verdadero somático números de mutación.
Los datos generados con este enfoque se pueden utilizar para determinar las filogenias del sistema hematopoyético, ya que las mutaciones detectadas en células individuales se pueden utilizar para diseccionar linajes celulares, como se muestra en la Figura6. Normalmente, una o dos mutaciones pueden definir cada rama en un donante sano1. Desde la ramificación de los linajes al principio después de la concepción, las mutaciones que definenestas primeras ramas también estarán presentes con un VAF bajo en la muestra normal coincidente que se utilizó para filtrar las variantes germinales 1,18,19. En este caso, se prefiere el uso de células no hematopoyéticas, como los MSC, ya que se espera que se separen muy temprano durante el desarrollo del sistema hematopoyético. Como las células T son de origen hematopoyético, el uso de estas células como una muestra normal coincidente para filtrar las variantes de la línea germinal podría, por lo tanto, confundir la construcción de la ramificación más temprana del árbol de linaje del desarrollo. La presencia subclonal de mutaciones específicas de rama en ciertas poblaciones sanguíneas maduras, que se pueden medir mediante una secuenciación profunda dirigida, indicará que la progenie de esa rama puede dar lugar a ese tipo de célula saquemadura. Además, nuestro enfoque permite evaluar las consecuencias mutacionales de la exposición mutagénica in vivo y, en última instancia, cómo esto puede contribuir al desarrollo de la leucemia.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por una subvención VIDI de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO) (n.o 016.Vidi.171.023) a R. v. B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| 50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
| CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
| CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
| CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
| CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
| CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
| CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
| CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
| Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
| CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
| Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
| Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
| Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
| Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
| PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
| RNAse A | Qiagen | 19101 | |
| SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
| StemSpan SFEM, 500 mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
| TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |
References
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