Summary
Somatiska Mutations mönster i celler återspeglar tidigare mutagen exponering och kan avslöja utvecklingsmässiga härstamning relationer. Presenteras här är en metod för att katalogisera och analysera somatiska mutationer i enskilda hematopoietiska Stem och stamceller.
Abstract
Hematopoietisk Stem och stamceller (HSPCs) ackumuleras successivt DNA-mutationer under en livslängd, vilket kan bidra till åldersrelaterade sjukdomar som leukemi. Karakteriserande mutation ackumulering kan förbättra förståelsen för etiologi av åldersrelaterade sjukdomar. Presenteras här är en metod för att katalogisera somatiska mutationer i enskilda HSPCs, som bygger på hela-Genomsekvensering (WGS) av klonala primära cellkulturer. Mutationer som förekommer i den ursprungliga cellen delas av alla celler i den klonala kulturen, medan mutationer som förvärvats in vitro efter cell sortering förekommer i en delmängd celler. Därför, denna metod möjliggör korrekt detektion av somatiska mutationer som finns i genomen av enskilda HSPCs, som ackumuleras under livet. Dessa kataloger av somatiska mutationer kan ge värdefulla insikter i mutationella processer aktiva i den hematopoietiska vävnaden och hur dessa processer bidrar till leukemogenes. Dessutom, genom att bedöma somatiska mutationer som delas mellan flera HSPCs av samma individ, klonala härstamning relationer och populationsdynamik av blod populationer kan bestämmas. Eftersom detta tillvägagångssätt bygger på in vitro-expansion av enskilda celler, metoden är begränsad till hematopoietiska celler med tillräcklig replikativ potential.
Introduction
Exponering av hematopoietisk stam och stamceller (HSPCs) till endogena eller extrinsic mutagena källor bidrar till den gradvisa ansamling av mutationer i DNA under en livslängd1. Gradvis mutation ackumulering i hspcs1 kan resultera i åldersrelaterade klonala hematopoies (Arch)2,3, vilket är ett icke-symptomatiskt tillstånd som drivs av hspcs transporterar leukemi-driver mutationer. Inledningsvis, det var tänkt att personer med Arch har en ökad risk för leukemi2,3. Emellertid, nyare studier har visat en incidens av 95% av ARCH hos äldre individer4, att göra föreningen med maligniteter mindre tydlig och ta upp frågan om varför vissa individer med Arch så småningom göra eller inte utveckla maligniteter. Icke desto mindre, somatiska mutationer i HSPCs kan innebära allvarliga hälsorisker, som myelodysplastiska störningar och leukemi kännetecknas av närvaron av specifika cancer driver mutationer.
För att identifiera Mutations processer och studera blod clonality, mutation ackumulering i enskilda hspcs måste kännetecknas. Mutations processer lämnar karakteristiska mönster i genomet, så kallade Mutations signaturer, som kan identifieras och kvantifieras i genomomfattande samlingar av mutationer5. Till exempel, exponering för UV-ljus, alkylerande agenter, och defekter i DNA reparations vägar har varje förknippats med en annan Mutations signatur6,7. Dessutom, på grund av den stokastiska karaktären av mutation ackumulationer, de flesta (om inte alla) av de förvärvade mutationer är unika mellan celler. Om mutationer delas mellan flera celler av samma individ, indikerar det att dessa celler delar en gemensam förfader8. Därför, genom att bedöma gemensamma mutationer, härstamning relationer kan bestämmas mellan celler och en utvecklingsmässig härstamning träd kan konstrueras gren för gren. Katalogisering av ovanliga somatiska mutationer i fysiologiskt normala celler är dock tekniskt utmanande på grund av den polyklonala karaktären hos friska vävnader.
Presenteras här är en metod för att korrekt identifiera och bestämma somatiska mutationer i genomen av enskilda HSPCs. Detta innebär isolering och klon expansion av HSPCs in vitro-. Dessa klonala kulturer återspeglar den genetiska makeup av den ursprungliga cellen (dvs, mutationer i den ursprungliga cellen kommer att delas av alla andra celler i kulturen). Detta tillvägagångssätt gör att vi kan få tillräckligt med DNA för hela Genomsekvensering (WGS). Vi har tidigare visat att mutationer som samlats in vitro under klon kulturen kommer att delas av en delmängd av cellerna. Detta möjliggör filtrering av alla in vitro-mutationer, eftersom dessa kommer att förekomma i en mindre del av läsningar jämfört med in vivo förvärvade mutationer9. Tidigare metoder har erhållit tillräckligt med DNA från en enda cell för WGS med hjälp av helarvs-amplifiering (WGA)10. Hur... än, den huvudsaklig nackdel av WGA är dess relativt misstag-liggande och obalanserad förstärkning om genomet, vilken kanna resultera i allel avbrott11. Icke desto mindre, eftersom detta tillvägagångssätt bygger på in vitro-expansion av enskilda celler, är det begränsat till blodkroppar med tillräcklig replikativ potential, vilket inte är fallet för WGA-beroende metoder. Tidigare försök att sekvensera klonala kulturer har förlitat sig på att använda matar skikt för att säkerställa klonala amplifiering av enstaka HSPCs12. Men DNA från matar lagren kan potentiellt förora DNA av de klonala kulturerna, confounding den efterföljande mutationen ringer och filtrering. Den metod som presenteras här enbart förlitar sig på specificerade medium för att klandra expandera enda HSPCs, och därför undviker frågan om DNA-kontaminering. Fram till nu har vi framgångsrikt tillämpat denna metod på mänsklig benmärg, navelsträngsblod, klara sig fryst benmärg, och perifert blod.
Protocol
Proverna måste erhållas i enlighet med lämpliga etiska protokoll, och givarna måste ge sitt informerade samtycke innan förfarandet.
1. beredning av prov material
Anmärkning: Börja med steg 1,1 när du arbetar med nyinhämtat material. När du arbetar med fryst material, börja med steg 1,2.
-
Beredning av färsk benmärg, navelsträngsblod eller perifert blod
- Isolera den mononukleära fraktionen från provet med hjälp av densitetsgradientseparering genom att följa tillverkarens anvisningar (se tabell över material) och räkna mononukleära celler med hjälp av en hemocytometer. Efter isolering av mononukleära celler, Fortsätt med steg 1,3.
- Valfritt: det rekommenderade antalet celler som krävs för att sortera en fullständig 384 brunn plattan av HSPCs är 1 – 2 x 107. Om fler celler isoleras under densitetsgradientcentrifugering, lagra överskottet av celler i flytande kväve.
- Omsuspendera cellerna i 500 μL av IMDM + 10% FBS per 1 x 107 celler, och tillsätt droppe-för-släpp en lika mängd imdm + 30% FBS + 20% DMSO för att uppnå en suspension av 1 x 107 celler i 1 ml IMDM + 20% FBS + 10% DMSO.
- Överför omedelbart mononukleära celler till 1 mL kryogena injektionsflaskor och frys celler vid-80 ° c i en cell frys behållare med kontrollerad hastighet över natten. Överför cellerna nästa dag till en flytande kväve lagring vid vidare bearbetning.
-
Beredning av frysta mononukleära celler från benmärg, navelsträngsblod eller perifert blod
- Förbered 50 mL av cell upptinning medium innehållande 45 mL av Iscoves modifierade Eagle ' s medium (IMDM) och 5 mL av foster bovint serum (FBS), och varmt i 37 ° c vattenbad.
- Ta injektionsflaskan med provet från flytande kväve lagring, överför provet till torris och Tina så snabbt som möjligt i en 37 ° c vattenbad.
- När provet nästan tinats, torka av injektionsflaskan med 70% etanol och överför dess innehåll till ett 50 mL koniskt rör. Skölj injektionsflaskan med 1 ml förvärmda imdm + 10% FBS för att samla de återstående cellerna, och tillsätt denna lösning droppvis (5 s per droppe) till tinade provet medan försiktigt virvlande röret.
- Tillsätt en extra förvärmda 15 ml imdm + 10% FBS droppvis till provet medan du försiktigt virvlar röret.
- Pelleten cellerna genom centrifugering för 5 min vid 350 x g.
- Ta bort alla utom ± 3 mL av supernatanten. Omsuspendera cellerna i återstående supernatanten och späd genom att tillsätta 20 mL IMDM + 10% FBS Drop-by-Drop medan du försiktigt skakar röret.
- Ta 10 μL av cellsuspensionen för cellräkning. Späd dessa 10 μL genom att tillsätta 20 μL 0,4% trypan blå lösning och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Cellnumret kan minska vid upptinning, med upp till 50% cellförlust efter tinning. Cell lönsamheten bör variera mellan 70% och 90%.
- Om du arbetar med benmärg eller navelsträngsblod celler, ta upp 5 x 106 mononukleära celler för MSC kultur (steg 2,1). Om du arbetar med perifert blod, ta upp 2 – 5 x 106 celler för T-cellsisolering (steg 2,2)
- Pellets kvarvarande celler 5 min vid 350 x g och Omsuspendera i 3 ml FACS buffert (0,05% BSA + 1 mm EDTA i PBS).
- Överför 1 x 105 celler till en mikrorör fylld med 200 μl FACS buffert, som kommer att fungera som en negativ kontroll för flödescytometri (steg 3,8), och hålla på isen.
2. cell odling
Anmärkning: För att erhålla kataloger över somatiskt förvärvade mutationer måste den givarspecifika variationen i köns cells filtreras bort. När du börjar med benmärg biopsier eller navelsträngsblod, mesenkymala stromaceller (MSCS) kan användas som matchade kontroll för att filtrera efter köns cells variation. I detta fall, följ avsnitt 2,1. När du använder (mobiliserat) perifert blod Följ steg 2,2 för att isolera och använda T-celler som matchade kontrollprov för att filtrera efter köns cells variation (figur 1). Bulk T-cellpopulationen kommer att dela samma härstamning relation som HSPCs.
-
MSC Culture
- Förbered 50 mL MSC-medium innehållande 45 mL DMEM/F12 medium, 10% FBS, 500 μL trypsin eller trypsin alternativ, och 500 μL av penicillin/streptomycin lösning.
- Tallrik ca 5 x 105 mononukleära celler i 1,5 ml MSC-medium per brunn. Placera cellerna i en fuktad inkubator vid 37 ° c med 5% CO2.
- Byt ut mediet efter 24 h, och därefter ersätta medium var 3 dagar för att säkerställa att alla hematopoietiska celler tvättas bort. Fortsätt till kulturen tills sammanlänkning är 100%.
- Om MSCs är confluent, tvätta celler med 1 mL PBS och skörda MSCs genom att tillsätta 200 μL av trypsin eller trypsin alternativ per brunn. Inkubera cellerna i 5 min vid 37 ° c. Tillsätt 800 μL MSC-medium, och Pipettera cellerna upp och ner för att lossa celler från brunnen plattan.
- Överför MSCS till mikrocentrifug Tube och pellet cellerna genom centrifugering för 5 min vid 350 x g. Avlägsna supernatanten och fortsätt med DNA-isolering eller förvara pelleten vid-20 ° c för senare DNA-isolering (avsnitt 4).
-
T-cellsisolering
Anmärkning: Om du använder (mobiliserat) perifert blod, T-celler kan isoleras och användas som köns cells kontroll.- Omsuspendera cellpelleten i 100 μL anti-CD3-Färgnings lösning (1:100 utspädning av anti-CD-antikroppar i FACS-buffert).
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 mL FACS-buffert. Pelleten cellerna genom centrifugering för 5 min vid 350 x g och Omsuspendera i 300 μl av FACS buffert.
- Isolera minst 5 x 105 CD3 + celler med en FACS-sorterare i en 5 ml polystyren tub förfylld med 1 ml FBS.
- Pelleten de sorterade cellerna med centrifugering i 5 min vid 350 x g, ta bort supernatanten och fortsätt direkt med DNA-isolering (avsnitt 4) eller förvara pelleten vid-20 ° c för senare DNA-isolering.
3. HSPC isolering, sortering och kultur
- Snurra ner vid 1 – 2 x 107 mononukleära celler i 5 min vid 350 x g och omsuspendera i 50 μl FACS-buffert (se steg 2.2.1). Överför cellerna till ett microcentrifugerör.
Anmärkning: Vid sortering med > 2 x 107 celler, öka antikropp blandningen och FACS buffert volymer därefter. - Förbered 50 μL av 2x HSC-färgblandning enligt receptet som visas i tabell 1.
| Antikropp | volym [μL] |
| BV421-CD34 | 5 |
| FITC-Lineage mix (CD3/14/19/20/56) | 5 |
| PE-CD38 | 2 |
| APC-CD90 | 0,5 |
| PerCP/CY 5.5-CD45RA | 5 |
| PE/Cy7-CD49f | 1 |
| FITC-CD16 | 1 |
| FITC-CD11 | 5 |
| FACS buffert | 25,5 |
Tabell 1: HSC sortering mix. Visas är en tabell som anger utspädningar av antikroppar som används för att sortera HSCs.
- Blanda 50 μL cell lösning med den förberedda HSC-färgblandningen och inkubera cellerna i 15 min vid rumstemperatur (RT) eller i 1 h på is för antikropparna att binda.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 mL FACS buffert och pellet genom centrifugering i 5 min vid 350 x g.
- Omsuspendera cellerna i 300 μL av FACS buffert och filtrera cellsuspensionen genom en 35 μm cell SIL-utjämnade 5 mL polystyren röret för att ta bort cell klumpar innan Fluorescence-aktiverad cell sortering (FACS).
- Förbered 25 mL HSPC odlingssubstrat, bestående av 1x SFEM medium kompletterat med 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL FLT3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6, och 100 ng/mL antibiotika formulering (se tabell över material).
- Fyll en 384 brunn cellkultur tallrik med 75 μL av HSPC odlingssubstrat i varje brunn.
Anmärkning: För att förhindra avdunstning av mediet i de yttre brunnarna, fyll de yttre brunnarna med 75 μL sterilt vatten eller PBS, och Använd inte dessa brunnar för cell sortering. -
Sortera enstaka HSPCs
- Ställ in grindar för HSPC-sortering baserad på en obefläckade kontroll (steg 1,9) och 10 000 celler från det färgade provet. Ett representativt resultat för inställning av grindar avbildas i figur 1. Grind enstaka celler genom att dra en grind runt den linjära FSC-höjd kontra FSC-området fraktion. Använd obefläckade kontroll fraktion att dra grind för härstamning- fraktion. Rita grindar för CD34+ celler och ytterligare karakterisera denna delmängd genom att ange en specifik grind för CD38- CD45RA- celler.
- Ladda 384 väl plattan på FACS maskinen och sortera enstaka celler.
Anmärkning: Om tillämpligt på FACS-maskinen, växla på alternativet för att hålla index sortering data för att möjliggöra omspårning av de sorterade cellerna.
-
Odling av enstaka sorterade HSCs
- Överför direkt 384 väl plattan till en fuktad 37 ° c inkubator med 5% CO2.
Anmärkning: För att förhindra avdunstning under kulturen, Linda 384 väl kultur plattan (med lock) i transparent polyeten wrap. - Håll 384 väl plattan i inkubatorn i 3 – 4 veckor tills synliga kloner visas. Representativa bilder av klon kulturen avbildas i figur 2. Baserat på tillståndet för det ingående materialet 5% – 30% av sorterade celler kommer att expandera i klen.
- Överför direkt 384 väl plattan till en fuktad 37 ° c inkubator med 5% CO2.
4. skörd av HSPC-kloner
- Efter 4 veckors odling, avgöra vilka brunnar har en sammanlänkning av 30% eller högre.
- Pre-Fill (för varje klon utväxt) 1,5 mL mikrotuber med 1 mL 1% BSA i PBS och Märk röret enligt motsvarande brunn.
- Förblöt pipettspetsen med 1% BSA i PBS för att minimera antalet celler som fastnar på pipettspetsen.
- Pipet upp/ner mediet i brunnen våldsamt (minst 5 gånger) med en 200 μl pipett (inställt på 75 μl) och skrapa botten av brunnen för att lossa celler i brunnen, och samla in cellsuspensionen i den märkta mikrorör motsvarar brunnen.
- Ta upp 75 μL färsk 1% BSA i PBS och upprepa pipettering i brunnen för att säkerställa maximalt upptag av celler.
Anmärkning: Clalodlade celler kan hålla sig till botten av brunnen. Inspektera brunnarna med ett vanligt inverterat ljusmikroskop för att se om alla celler har samlats in. - Om alla brunnar med > 30% confluency har skördats, placera 384 väl plattan tillbaka i inkubator. Klonala kulturer kan proliferera i upp till 5 veckor.
- Snurra ner cellsuspensionen i 5 min vid 350 x g. En liten pellet ska vara synlig.
- Ta försiktigt bort alla utom ca 5 μL supernatant. Cell pellets kan frysas vid-20 ° c och lagras i flera månader före DNA-isolering.
5. DNA-isolering
-
Isolera HSPC och MSC/T-cellsdna med en Micro-Scale DNA-isolerings sats enligt tillverkarens instruktion med följande justeringar:
- Tillsätt 2 μL av RNase A efter tillsats av buffertal under avsnitt 2. Inkubera i 2 minuter innan proteinas K läggs till.
- Inkubera i 30 min vid 56 ° c i stället för 10 min.
- Eluera DNA genom att fylla på kolonnen med 50 μL TE-buffert med låg EDTA (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA). För optimal eluering, Fyll på elueringen igen på kolonnen och snurra igen.
- Bestäm DNA-koncentrationen med hjälp av en DNA-mätning på 2 μL per klon. DNA-avkastningen varierar vanligtvis mellan 0,5 – 3 ng/μL.
6. sekvensering
- Utför DNA-sekvensering enligt beskrivningen av Jager et al.13
7. kartläggning och somatiska Mutationrop
- Mappa utdata från sekvensering (FASTQ-filer) till referensgenomet och anrops mutationerna enligt beskrivningen i Jager et al.13
- Inspektera data för avvikande karyotypic förändringar i sekvenserade klon-och bulkdata med hjälp av ett kopierings nummer analysverktyg, såsom kontroll-FreeC14. Fram till nu har vi inte rapporterat några HSPCs med karyotypic aberrances.
- Generera en svart lista som består av en panel med omatchade normalprover för filtreringsändamål från en egen uppsättning prover, som tidigare beskrivits13, eller Använd följande uppladdade svart lista: < https://data.Mendeley.com/DataSets/9y4yhwt5rp/3 >.
- Filtrera enstaka nukleotidvariationer med SNVFI < https://github.com/toolsvanbox/snvfi >.
- Förinställd SNVFI. config-fil, så att alla sökvägar till hjälpfunktioner är korrekta.
- Kör SNVFI med. ini-fil konfigurerad enligt inställningarna som visas i tilläggsfilen 1 (snvfi. ini). För att utesluta in vitro-inducerade mutationer filtrerar vi för en VAF ≥ 0,39.
- Kontrollera variant allel fraktion (VAF) av snvfi (figur 4). Kontrollera om toppen av densiteten tomten är nära 0,5, vilket indikerar provet är klonala.
-
Valfritt: För att bestämma den del av genomet som täcks under filtrering, Bestäm de callable regionerna längs köns cells och kontroll med hjälp av callableloci från gatk (genomanalys Toolkit):
java-jar GenomeAnalysisTK. jar \
-T CallableLoci \
-R reference. fasta \
-Jag myreads. BAM \
-Sammanfattning Table. txt \
-o callable_status. Bed -
Valfritt: Hämta callable regioner från den CallableLoci utdata och utföra Pairwise skärningspunkter mellan exemplen och bulk med hjälp av python-skriptet CallableLoci_processor. py närvarande på https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . De resulterande bäddfilerna kan användas för att ytterligare filtrera utdata från snvfi och inspektera Mutations Profile i avsnitt 9:
CallableLoci_processor. py dir_in dir_out sample_name bulk_name-prover sample1 sample2 sample3
8. indel Calling
- Markera alla infogningar och borttagningar (indels) i filen raw_variants. vcf med hjälp av GATK SelectVariants:
Java-Xmx12G \
-jar GenomeAnalysisTK. jar \
-T SelectVariants \
-R reference_genome. fasta \
-V raw_variants. vcf \
-o raw_INDELs. vcf \
-selectType INDEL - Filtrera raw_INDELS. vcf lista med INDELFI < https://github.com/toolsvanbox/indelfi >:
perl INDELFI.pl-i input. vcf (från steg 8,1) \
-s kolumn test exempel \
-c kolumnkontroll prov
9. inspektion av mutationell profil
- Använd de resulterande VCF-filerna från SNVFI-utdata från steg 7,6 (eller från steg 7,9 med valfri anropsbar loci-analys) för att analysera den genetiska mutationella profilen, Mutations typer och signaturanalys med hjälp av R-paketet MutationalPatterns15: < http://Bioconductor.org/packages/release/bioc/HTML/mutationalpatterns.html >. För representativa utdata som kan produceras med den resulterande VCF-filen som ett mutationspektrat med 96-trinukleotid, se figur 5.
10. uppförande av en utvecklings-härstamning träd med hjälp av bas substitutioner
- För att konstruera ett utvecklings-Lineage träd, identifiera delade mutationer mellan kloner. Mutationer som förekommer i de första grenarna av härstamning träd kan också subclalt närvarande i bulk provet (MSCs/T-celler). Senare förgreningar kommer att definieras av mutationer som endast delas av HSPC-kloner.
- Utför följande steg om du vill identifiera mutationer som finns i en delmängd av klonerna och subclalt finns i bulk.
- För att filtrera efter somatiska mutationer som delas mellan kloner, kör du skriptet filterSomatic.py i en UNIX-baserad Terminal. Skriptet finns på https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Innan du kör det här skriptet redigerar du filen Filtersomatisk. ini (se kompletterande fil 2) för att ange sökvägar och justera de andra parametrarna.
- Kör filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py-i Filtersomatiska. ini).
- Filter för mutationer som är subclalt närvarande i bulk med hjälp av Determine_lowVAF_bulk. R-skript i en UNIX-baserad Terminal. Skriptet finns på https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Detta kommer att generera separata VCF-filer för delade och unika SNVs:
Rscript Determine_lowVAF_bulk. R
--VCF sökväg/till/Filter_somatic_output. vcf
--bulk bulk_name
--sample_name Sample-namn
-kön [M | F
--out_dir out_dir - Bestäm alla mutationer som delas mellan kloner som inte finns i bulkprovet genom att överlappa alla mutationspositioner (sammanfoga kolumn 1 och 2 i SNVFI-utdata).
- Exkludera falska positiva identifieringar som erhållits under steg 10,5 och 10,6 genom manuell inspektion med IGV16. Mutationer betraktas som falskt när de inte förekommer, när mutationen förekommer i köns cells eller när den förekommer i dåligt kartlagda områden, se figur 7.
Anmärkning: Vi rekommenderar starkt att omsekvensera alla delade loci självständigt med riktade eller Sanger sekvensering. - Använd de delade mutationer som erhålls under steg 10,1 och 10,2 för att bygga en binär tabell med mutationer kontra sekvenserade kloner, med 0 som indikerar att mutationen inte finns och 1 indikerar förekomst av mutationen.
- Utdata mutation binär tabell som i en heatmap tillsammans med en dendrogram visar härstamning relationer mellan celler med R. Heatmap indikerar mutationer status för varje cell. Se resultatet av denna funktion (figur 6).
Kloner <-Read. tabell ("sökväg/till/BinaryTable")
my_palette <-colorRampPalette (c ("#cccccc", "#333333")) (n = 2)
col_breaks <-c (0, 0.5, 1)
Heatmap. 2 (kloner, distfun = funktion (x) dist (x, Method = ' binär '),
hclustfun = funktion (x) hclust (x, metod = medel),
dendrogram = "kolumn", Rowv = F,
Col = my_palette, raster = col_breaks,
trace = "none", Density. info = "ingen")
Representative Results
Experimentellt tillvägagångssätt
Experiment arbetsflödet avbildas i figur 1. Baserat på typen av inmatnings material måste olika steg följas. I figur 2 avbildas ett flödescytometriskt utflöde av en navelsträngsblod cell sort. Först, alla monocytiska celler väljs genom att löst Dra en grind runt denna population. Sedan är undertröjor isolerade genom att välja för celler med en linjär FSC-h/FSC-a-förhållande, som en lägre FSC-h/FSC-ett förhållande inkluderar dubletter eller cell klumpar. Det obefläckade kontrollprovet används för att definiera cell sorterings grindar för Lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-. Dessutom kan CD90 och CD49f användas för att skilja mellan progenitorceller eller självförnyande stamceller17 (figur 2). Index sortering gör det möjligt att återspåra enskilda celler, och de sorterade cellerna avbildas som bruna prickar. Under cellkulturen kan enskilda kloner expandera i en annan takt, med några kloner som expanderar inom 3 veckor, medan andra kloner bara är helt expanderade fram till den femte Kulturveckan. Se diagram 3a, B för representativ koloni utväxt. En representativ bild visas av en nästan konfluenta MSC bulk kultur på 11 dagar efter plätering (figur 3c).
Kontrollera kvalitet efter sekvensering och mutationsanalys
Visas är ett exempel på utdata från den kopia nummer analys som genererats av Control-FreeC14 för att kontrollera om det finns ändringar i kopierings nummer (figur 4). Karyotypic information kan indikera vilka kromosomer att utesluta under en SNVFI Run (steg 7,6). VAF-handlingen som skapats av SNVFI (figur 5) är ett histogram över variantallelefrekvenserna i provet. En topp i densitetsplot vid 0,5 indikerar att provet är klonalt. För att få mer insikt i de bakomliggande biologiska orsakerna bakom mutationer kan dessa analyseras med hjälp av R-paketet MutationalPatterns15. Avbildad här är en typisk analys som producerar en 96-trinukleotide tomt (figur 6). Förutom kvantifiering av olika Mutations typer kan även signaturextraktion utföras med det här verktyget.
Konstruera en utvecklingsmässig härstamning träd
Mutationer som delas mellan kloner eller förekommer i en klon (och vid låg VAF) i köns cells kontroll valideras med hjälp av IGV. Mutationer anses vara sanna när de förekommer i provet och inte vid höga VAF-nivåer i köns Cells (figur 7a). Mutationer anses falskt när de inte förekommer i IGV, vilket kan inträffa i dåligt kartlagda regioner (figur 7b). I andra fall, händelser som upptäckts av snvfi missas köns cells mutationer (figur 7c). Oberoende omsekvensering av mutationer genom riktad omsekvensering rekommenderas starkt för dessa mutationer i utvalda kloner. Efter detektion av delade somatiska mutationer mellan kloner genereras en binär matris (steg 10,8). En heatmap konstrueras som innehåller celler med och utan de delade mutationerna A-M. Ovanför denna heatmap indikeras det utvecklings-Lineage treen (figurera 8).
Figur 1: flödesschema som föreställer Försöksförfarande baserat på insatsmaterial. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: cell sorterings strategi. Först, gating utförs på små mononukleära celler. För det andra, enstaka celler är gated genom val av den linjära fraktionen. Härstamning negativa celler är gated. Alla CD34+ CD38- CD45- celler är Single cell-sorterade. Andelen celler i brunt bör noteras, som är de sorterade cellerna markeras med alternativet "index sortering". Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa cellkultur resultat. Representativa HSPC kloner i en 384 väl platta vid (a) 2 veckor efter plätering och (B) 4 veckor efter plätering. CMSC-kulturen efter 2 veckors medel byte. Skalstapel = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Karyotyper. A) KLONALA HSPC-kulturer ochB) MSC-bulkprov. Karyotyperna bestämdes genom en Läs djups analys. Båda diagrammen indikerar ett karyotypiskt normalt prov. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: histogram över variantallelefrekvenserna. Histogram över variantallelefrekvenserna för varianterna i en klon före det sista filtrerings steget i SNVFI (VAF > 0.3). En topp vid VAF = 0,5 indikerar att provet är klonalt. De subklonala mutationerna med låg VAF exkluderas under det sista filtrerings steget i SNVFI (VAF > 0.3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativ mutationspektrumanalys av somatiska mutationer i ett HSPC-prov. Avbildad är det relativa bidraget av varje trinukleotid förändring (som den mellersta basen är muterad) till det totala spektrumet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: manuell inspektion av mutationer som använder IGV16. A) mutationer anses vara sanna när de förekommer i klon och inte i bulkprovet. (B) mutationer betraktas som falska positiva identifieringar när de förekommer i en dåligt kartlagd region. C) mutationer betraktas som falska positiva identifieringar när de förekommer i en köns cells-kontroll. Den vertikala linjen indikerar positionen för en s.k. mutation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: uppförande av ett utvecklingsträd. Avbildad är ett dendrogram som indikerar utvecklingslinjer som delas upp under utveckling. Den termiska kartan under dendrogram indikerar närvaron av mutationer i olika kloner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Presenteras här är en metod för att upptäcka mutationer som ackumulerats under livet i enskilda HSPCs och att konstruera en tidig utveckling härstamnings träd med hjälp av dessa Mutations data.
Flera kritiska krav måste uppfyllas för att kunna utföra dessa analyser. För det första måste provets genomförbarhet säkerställas. Snabb hantering av provet är nyckeln för att säkerställa effektiviteten i förfarandet. För det andra, förlust av tillväxtfaktor styrka kommer att negativt påverka den klonala expansionen av HSPCs. För att säkerställa hög tillväxtfaktor potens, är det viktigt att undvika frysning-Tina cykler och förbereda engångsanvändning alikvoter. Tredje, efter att ha utfört WGS, mutation ringer och filtrering, är det viktigt att validera clonality av den klonala kulturen. För att bekräfta clonality av kulturen, VAF av mutationerna bör klustret runt av 0,5 i en karyotypiskt normalt prov (figur 3). I celler med en låg mutationell belastning, såsom navelsträngsblod HSPCs, är det svårare att avgöra clonality på grund av de låga Mutations siffrorna.
Vår strategi bygger på in vitro-expansion av enskilda celler att tillåta WGS. Därför är vårt tillvägagångssätt begränsat till celler som har replikativ potential att clalt expandera, till exempel HSPCs. I våra händer, ca 5%-30% av alla ensorterade celler kan expandera tillräckligt. Reducerade uttillväxthastigheter kan potentiellt resultera i en urvals avvikelse. Som diskuterats tidigare, metoder med hjälp av WGA kan övervinna detta val bias eftersom denna teknik är inte beroende av utbyggnaden av celler. Emellertid, WGA har sina egna brister, och klon förstärkning är fortfarande den enda metoden för att exakt bestämma antalet mutationer i hela genomet utan alleliska avbrott och lika täckning längs genomet, särskilt i prover med låg sann somatiska Mutations nummer.
De data som genereras med hjälp av denna metod kan användas för att bestämma fylogenier av det hematopoietiska systemet, eftersom de mutationer som upptäcks i enstaka celler kan användas för att dissekera cell linjer, som avbildas i figur 6. Typiskt, en eller två mutationer kan definiera varje gren i en hälsosam givare1. Eftersom linjer filial tidigt efter befruktningen, mutationer som definierar dessa första grenar kommer också att finnas med en låg VAF i det matchade normala provet som användes för filtrering av köns cells varianter1,18,19. I detta fall, användning av icke-hematopoietiska celler, såsom MSCs, är att föredra eftersom de förväntas separera mycket tidigt under utvecklingen från det hematopoietiska systemet. Som T-celler är av hematopoietiska ursprung, användning av dessa celler som en matchande normal prov för att filtrera köns cells varianter kunde därför blanda ihop byggandet av den tidigaste förgreningen av utvecklings-härstamning träd. Subklonala närvaron av branschspecifika mutationer i vissa mogna blod populationer, som kan mätas genom riktad djupsekvensering, kommer att indikera att avkomman från denna gren kan ge upphov till den mogna celltypen. Dessutom gör vårt tillvägagångssätt för att bedöma de mutationella konsekvenserna av mutagen exponering in vivo och i slutändan hur detta kan bidra till leukemi utveckling.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av a a VIDI bevilja av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO) (nr. 016. Vidi. 171.023) till R. v. B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| 50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
| CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
| CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
| CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
| CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
| CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
| CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
| CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
| Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
| CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
| Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
| Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
| Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
| Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
| PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
| RNAse A | Qiagen | 19101 | |
| SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
| StemSpan SFEM, 500 mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
| TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |
References
- Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).
- Genovese, G., et al. Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence. New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes. New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).
- Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. Nature Communications. 7, 1-7 (2016).
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer. Cell Reports. 3, 246-259 (2013).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500, 415-421 (2013).
- Alexandrov, L., et al. The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer. bioRxiv. , (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. 513, 422-425 (2014).
- Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538, 260-264 (2016).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: Current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).
- Dong, X., et al. Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells. Nature Methods. 14, 491-493 (2017).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150, (2012).
- Jager, M., et al. Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures. Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).
- Boeva, V., et al. Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data. Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).
- Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes. Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. , (2011).
- Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561, 473-478 (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. , (2014).
