Summary
細胞内の体性変異パターンは、以前の変異型暴露を反映し、発達系統の関係を明らかにすることができる。ここでは、個々の造血幹細胞および前駆細胞における体細胞変異をカタログ化および分析する方法論を示す。
Abstract
造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)は、寿命の間に徐々にDNA変異を蓄積し、白血病などの年齢関連疾患に寄与する可能性があります。突然変異の蓄積を特徴付けすることは、年齢関連疾患の病因の理解を向上させることができる。ここでは、クローン一次細胞培養の全ゲノムシーケンシング(WGS)に基づく個々のHSPCにおける体細胞変異をカタログ化する方法を示す方法を示す。元の細胞に存在する突然変異はクローン培養内のすべての細胞で共有されますが、細胞選別後にインビトロで獲得された変異は細胞のサブセットに存在します。したがって、この方法は、生命の間に蓄積する個々のHSPCのゲノムに存在する体細胞変異の正確な検出を可能にする。体細胞変異のこれらのカタログは、血管組織で活性な変異プロセスに関する貴重な洞察を提供し、これらのプロセスが白血病形成にどのように寄与するかを提供することができます。さらに、同じ個体の複数のHSPC間で共有される体細胞変異を評価することにより、血液集団のクローン系統関係および集団ダイナミクスを決定することができる。このアプローチは単一細胞のインビトロ膨張に依存するので、この方法は十分な複製電位を有する血化細胞に限定される。
Introduction
造血性幹および前駆細胞(HSPC)を内因性または外因性変異源に曝露することは、寿命1の間にDNA中の変異の徐々な蓄積に寄与する。HSPC1における徐々に突然変異が蓄積すると、加齢性クローン型血統症(ARCH)2,3が起こり得る。当初、ARCHを持つ個人は白血病2,3のリスクが高いと考えられていた。しかし、最近の研究では、高齢者4のARCHの95%の発生率が示されており、悪性腫瘍との関連が明らかにならず、ARCHを持つ一部の個人が最終的に悪性腫瘍を発症しないか、または発症しないのかという疑問が生じ始めている。それにもかかわらず、HSPCの体細胞変異は、骨髄異形成障害および白血病が特定の癌ドライバ変異の存在によって特徴付けられるように、深刻な健康上のリスクをもたらす可能性がある。
突然変異過程を同定し、血液クローナリティを研究するためには、個々のHSPCにおける変異蓄積を特徴付ける必要がある。突然変異過程は、ゲノム中に特徴的なパターンを残し、いわゆる変異シグネチャを残し、これは変異のゲノム全体のコレクションで同定および定量することができる5。例えば、紫外線への曝露、アルキル化剤、およびDNA修復経路における欠陥は、それぞれ異なる変異シグネチャ6、7と関連している。さらに、突然変異蓄積の確率的性質のために、獲得した突然変異のほとんど(すべてではないにしても)は細胞間で一意である。変異が同じ個体の複数の細胞間で共有されている場合、これらの細胞が共通の祖先8を共有していることを示す。したがって、共有変異を評価することにより、細胞と発達系統樹と間の系統関係を決定することができ、分岐によって分岐を構築することができる。しかし、生理的に正常な細胞におけるまれな体細胞変異のカタログ化は、健康な組織の多クローン性質のために技術的に困難である。
本例では、個々のHSPCのゲノムにおける体細胞変異を正確に同定し、決定する方法を示す。これには、インビトロでのHSPCの分離とクローン拡張が含まれます。これらのクローン培養は、元の細胞の遺伝的構成を反映する(すなわち、元の細胞の突然変異は、培養中の他のすべての細胞によって共有される)。このアプローチにより、全ゲノムシーケンシング(WGS)に十分なDNAを得ることができる。我々は以前、クローン培養中にインビトロで蓄積された突然変異が細胞のサブセットによって共有されることを示した。これは、インビトロ変異のフィルタリングを可能にし、これらは生体内で獲得された変異9と比較して読み取りの小さな割合で存在する。従来の方法では、全ゲノム増幅(WGA)10を用いたWGSに対して単一細胞から十分なDNAを得ている。しかし、WGAの主な欠点は、ゲノムの比較的誤差がちで不均衡な増幅であり、対立遺伝子のドロップアウト11を引き起こす可能性がある。それにもかかわらず、このアプローチは単一細胞のインビトロ膨張に依存するため、WGA依存的な方法では十分な複製電位を有する血液細胞に限定される。クローナルカルチャをシーケンシングする以前の取り組みは、単一のHSPC12のクローン増幅を確実にするためにフィーダー層を使用することに依存していました。しかし、フィーダー層からのDNAは、クローナル培養物のDNAを汚染する可能性があり、その後の変異の呼び出しとフィルタリングを混乱させる可能性があります。ここで提示される方法は、単一のHSPCをクローン的に拡張するために指定された媒体のみに依存しているため、DNA汚染の問題を回避します。これまで、ヒト骨髄、臍帯血、凍結した骨髄、末梢血に応用してきました。
Protocol
サンプルは、適切な倫理プロトコルに従って取得する必要があり、ドナーは、手順の前にインフォームドコンセントを与える必要があります。
1. サンプル材料の調製
注:新しく取得した材料を使用する場合は、ステップ 1.1 から開始します。冷凍材料を使用する場合は、ステップ 1.2 から開始します。
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新鮮な骨髄、臍帯血、または末梢血の準備
- メーカーの指示に従って密度勾配分離を使用して単核画分をサンプルから分離し(材料の表を参照)、ヘモサイトメーターを使用して単核細胞をカウントします。単核細胞を単離した後、ステップ1.3に進みます。
- オプション: HSPC の完全な 384 ウェル プレートをソートするために必要なセルの推奨数は、1-2 x 107です。密度勾配遠心分離中により多くの細胞が単離される場合は、液体窒素中の細胞の余剰を保存します。
- IMDMの500 μLで細胞を再懸濁し、1 x 107セル当たり10%FBSを10%、10%の7セルに対して同量のIMDM +30%FBS+20%DMSOを追加し、IMDM+20%FBS+10%DMSOの1mLで1 x 107セルの懸濁液を達成する。
- 一核細胞を1mLの低温バイアルに直ちに移し、-80°Cで細胞を凍結し、制御速度の細胞凍結容器で一晩冷凍する。さらなる処理の際に、翌日に細胞を液体窒素貯蔵に移す。
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骨髄、臍帯血、末梢血からの凍結単核細胞の調製
- イスコブの改変ワシのミディアム(IMDM)の45mLと5mLの胎児ウシ血清(FBS)を含む細胞解凍媒体の50 mLを調製し、37°Cの水浴で温めます。
- 液体窒素貯蔵からサンプルを含むバイアルを取り、サンプルをドライアイスに移し、37°Cの水浴でできるだけ早く解凍します。
- サンプルがほぼ解凍されるときは、70%のエタノールでバイアルを拭き取り、その内容物を50mL円錐形のチューブに移します。予備温められたIMDM + 10%FBSの1 mLでバイアルをすすいで残りの細胞を回収し、チューブを穏やかに旋回しながら解凍したサンプルにこの溶液を滴下(1滴あたり5秒)を加えます。
- IMDM + 10% FBSをサンプルに加えて、チューブを穏やかに旋回しながら、さらに予め温めた15 mLをサンプルに加えます。
- 350 x gで5分間遠心分離によって細胞をペレットする。
- 上清の±3 mLを除くすべてを取り除く。残りの上清中の細胞を再懸濁し、チューブを静かに振りながらIMDM+10%FBSドロップバイドロップを20mL加えて希釈します。
- 細胞計数の細胞懸濁液の10 μLを取る。0.4%トリパンブルー溶液の20 μLを加えてこれらの10 μLを希釈し、ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。細胞数は解凍時に減少し、解凍後の細胞損失は最大50%です。細胞生存率は70%から90%の範囲でなければなりません。
- 骨髄または臍帯血細胞を使用する場合は、MSC培養のために5 x 106単核細胞を取ります(ステップ2.1)。末梢血を使用する場合は、T細胞単離のために2-5 x 106細胞を取ります(ステップ2.2)
- ペレット残存細胞は350 x gで5分、FACSバッファーの3mLで再中断する(PBSでは0.05%BSA+1mM EDTA)。
- 1 x 105セルを200 μLのFACSバッファーで満たされたマイクロチューブに移し、フローサイトメトリー(ステップ3.8)の陰性制御として機能し、氷の上に保ちます。
2. 細胞培養
注:体系に取得された変異のカタログを取得するには、ドナー特異的生殖細胞変異をフィルタリングする必要があります。骨髄生検または臍帯血から始めるとき、間葉間間質間質細胞(MSC)は生殖細胞の変化をフィルターする一致した対照として使用することができる。この場合は、セクション 2.1 に従ってください。(動員された)末梢血を使用する場合、ステップ2.2に従って、生殖細胞の変動をフィルタリングするために一致した対照試料としてT細胞を単離して使用する(図1)。バルク T セルの母集団は、HSPC と同じ系統関係を共有します。
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MSC カルチャ
- DMEM/F12培地の45mL、10%FBS、トリプシンまたはトリプシン代替の500 μL、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液の500 μLを含むMSC培地の50 mLを調出します。
- プレート1ウェル当たりMSC培地の1.5mLで約5 x 105単核細胞をプレート化する。加湿インキュベーターに細胞を入れ、5%CO2で37°Cに入します。
- 24時間後に培地を交換し、その後3日ごとに培地を交換し、すべての血行細胞が洗い流されることを確認する。合流が100%になるまで培養を続けます。
- MSCがコンフルエントである場合は、1 mLのPBSで細胞を洗浄し、ウェルあたり200 μLのトリプシンまたはトリプシン代替を加えてMSCを収穫します。細胞を37°Cで5分間インキュベートします。800 μLのMSC培地を加え、細胞を上下にピプテし、ウェルプレートから細胞を緩めます。
- MSCをマイクロ遠心管に移し、遠心分離によって細胞を350 x gで5分間ペレットする。上清を取り出し、DNA単離を続けるか、後のDNA単離のために-20°Cでペレットを保存します(セクション4)。
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T細胞分離
注:末梢血を(動員)使用する場合、T細胞を単離し、生殖細胞制御として使用することができる。- 細胞ペレットを100μLの抗CD3染色液(FACSバッファー中の抗CD抗体の1:100希釈)で再ステージングする。
- FACSバッファーを1mL加えて細胞を洗浄します。350 x gで5分間遠心分離により細胞をペレットし、FACSバッファーの300μLで再中断する。
- FBSの1 mLであらかじめ充填された5 mLポリスチレンチューブでFACSソーターを使用して、少なくとも5 x 105 CD3+セルを分離します。
- ペレットは、350 x gで5分間遠心分離を使用して選別した細胞を、上清を除去し、DNA単離(セクション4)で直接継続するか、または後のDNA単離のために-20°Cでペレットを保存する。
3. HSPC の分離、並べ替え、およびカルチャ
- 1-2 x 107単核セルを 350 x gで 5 分間スピンダウンし、FACS バッファーの 50 μL で再中断します (ステップ 2.2.1 を参照)。細胞をマイクロ遠心管に移します。
注:>2 x 107細胞でソートする場合は、それに応じて抗体ミックスとFACSバッファー量を増やします。 - 表1に見られるレシピに従って、2x HSC染色ミックスの50 μLを調出す。
| 抗体 | 体積 [μL] |
| BV421-CD34 | 5 |
| FITCリネージュミックス(CD3/14/19/20/56) | 5 |
| PE-CD38 | 2 |
| APC- CD90 | 0.5年 |
| パーCP/Cy5.5 - CD45RA | 5 |
| PE/サイ7- CD49f | 1 |
| FITC -CD16 | 1 |
| FITC-CD11 | 5 |
| FACS バッファ | 25.5年 |
表 1: HSC 並べ替えミックス。HSCのソートに用いられる抗体の希釈を示す表を示す図である。
- 50 μLの細胞溶液を調製したHSC染色ミックスと混合し、細胞を室温(RT)で15分間、または抗体が結合するために氷上で1時間インキュベートします。
- 350 x gで5分間遠心分離することにより、FACSバッファーとペレットの1 mLを追加して細胞を洗浄します。
- 300 μLのFACSバッファーで細胞を再懸濁し、35 μmセルストレーナーキャップ5 mLポリスチレンチューブを通して細胞懸濁液を濾過し、蛍光活性化細胞選別(FACS)の前に細胞塊を除去します。
- 100 ng/mL SCF、100 ng/mL Flt3、50 ng/mL TPO、10 ng/mL IL-3、20 ng/mL IL-6、および100 ng/mL抗生物質製剤で構成される1x SFEM培地からなるHSPC培養培地の25 mLを調製する(材料の表を参照)。
- 各ウェルに75 μLのHSPC培養培地を含む384ウェル細胞培養プレートを充填する。
注:外の井戸の媒体の蒸発を防ぐために、無菌水またはPBSの75 μLで外側の井戸を満たし、細胞選別のためにこれらの井戸を使用しないでください。 -
単一の HPC の並べ替え
- 染色されていないコントロール(ステップ1.9)と染色されたサンプルからの10,000セルに基づいてHSPCソートのゲートを設定します。ゲートを設定するための代表的な結果を図 1に示します。線形FSC高さとFSC面積の分数の周りにゲートを描画することにより、単一のセルをゲートします。染色されていない制御分数を使用して、系統のゲートを描画します。CD34+セルのゲートを描画し、さらに CD38- CD45RA-セルの特定のゲートを設定することにより、このサブセットを特徴付けします。
- FACSマシンに384ウェルプレートをロードし、単一のセルをソートします。
注:FACS マシンに適用可能な場合は、インデックスソートデータを保持するオプションを切り替えて、ソートされたセルの再トレースを有効にします。
-
一部ソートされたHSCの培養
- 384ウェルプレートを加湿した37°Cインキュベーターに直接5%CO2で直接移します。
注:培養中の蒸発を防ぐには、透明なポリエチレンラップで384ウェル培養プレート(蓋付き)を包みます。 - 384ウェルプレートをインキュベーターに3~4週間保管し、目に見えるクローンが現れるまで保管してください。クローン文化の代表的な画像を図2に示す。入力材料の状態に基づいて、ソートされた細胞の5%~30%がクローン的に膨張する。
- 384ウェルプレートを加湿した37°Cインキュベーターに直接5%CO2で直接移します。
4. HSPCクローンの収穫
- 培養の4週間後、どのウェルが30%以上の合流を有するかを決定する。
- プレフィル(各クローンの成長)1.5 mLマイクロチューブとPBSで1%BSAの1mLを有し、対応するウェルに従ってチューブにラベルを付けます。
- ピペットチップに付着する細胞の数を最小限に抑えるために、PBSで1%のBSAでピペットチップをあらかじめ濡らします。
- 200 μLピペット(75μLに設定)で激しく(少なくとも5回)ウェル内の培地を上下にピペットし、ウェル内の細胞を緩めるためにウェルの底部をこすり、ウェルに対応する標識されたマイクロチューブに細胞懸濁液を集めます。
- PBSで新鮮な1%BSAの75 μLを取り、細胞の最大取り込みを確保するために井戸でピペッティングを繰り返します。
注:クローン培養細胞は、井戸の底に固執することができます。標準的な反転光顕微鏡を使用して井戸を検査し、すべての細胞が収集されたかどうかを確認します。 - >30%の合流性を持つすべての井戸が収穫された場合は、384ウェルプレートをインキュベーターに戻します。クローン培養は最大5週間増殖する可能性があります。
- 350 x gで5分間セルサスペンションをスピンダウンします。小さなペレットが表示される必要があります。
- 上清の約5 μLを除くすべてを慎重に取り除きます。細胞ペレットは-20°Cで凍結し、DNA分離前に数ヶ月間保存することができます。
5. DNA分離
-
以下の調整を行い、製造元の指示に従って、マイクロスケールのDNA分離キットを使用してHSPCおよびMSC/T細胞DNAを分離します。
- セクション2の間にバッファALを加えてから、RNase Aの2 μLを追加します。プロテパニンゼKを添加する前に2分間インキュベートする。
- 10分ではなく56°Cで30分間インキュベートします。
- 低EDTA(10 mMトリス、0.1 mM EDTA)で50 μLのTEバッファーでカラムをロードしてDNAを溶出します。最適な溶出を実現するために、溶出物を列に再度再ロードし、再度スピンします。
- クローン当たり2μLのDNAを用いてDNA濃度を決定します。DNA収率は通常0.5~3 ng/μLの間で変化する。
6. シーケンス
- Jager et al.13で説明した DNA シーケンシングの実行
7. マッピングと体細胞変異呼び出し
- シーケンシング(FASTQファイル)の出力を参照ゲノムにマッピングし、Jager et al.13で説明されているように変異を呼び出します。
- Control-FreeC14などのコピー番号分析ツールを使用して、順序付けされたクローンおよびバルク データの異常な角変動の変化がないデータを検査します。これまで、我々は角核性の異常を持つ任意のHSPCを報告していません。
- ブラックリストを生成し、前述の13のように、独自のサンプルセットからフィルタリング目的で比類のない通常のサンプルのパネルで構成されるか、以下のアップロードされたブラックリストを使用します。
- SNVFI
- ヘルパー関数へのすべてのパスが正しいよう、SNVFI.config ファイルをプリセットします。
- 補足ファイル 1 (SNVFI.ini) に表示される設定に従って設定された .ini ファイルで SNVFI を実行します。ビトロ誘導変異を除外するには、VAF ≥0.39をフィルタリングします。
- SNVFIのバリアント対立遺伝子画率(VAF)出力を確認してください(図4)。密度プロットのピークが0.5に近いかどうかを確認し、サンプルがクローンであることを示します。
-
オプション:フィルタリング中にカバーされるゲノムの部分を決定するには、GATK(ゲノム解析ツールキット)からCallableLociを使用して生殖細胞系および制御に沿った呼び出し可能領域を決定します。
ジャワ -ジャーゲノム分析TK.jar \
-T キャラブルロチ \
-R リファレンス.fasta \
-私は私の読書.bam \
-サマリーテーブル.txt \
-o 呼び出し可能なステータス.bed -
オプション:CallableLoci 出力から CallableType を取得し、https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processorに存在する Python スクリプト CallableLoci_processor.py を使用して、サンプルとバルクの間のペアワイズ交差を実行します。.結果のベッド ファイルを使用して、SNVFI の出力をさらにフィルタリングし、セクション 9 の突然変異プロファイルを検査できます。
CallableLoci_processor.py dir_in dir_out sample sample_name bulk_name –サンプルサンプル1 sample2 sample3
8. インデル・コーリング
- GATK SelectVariants を使用して、raw_variants.vcf ファイル内のすべての挿入と削除 (インデル) を選択します。
ジャワ -Xmx12G \
-ジャーゲノム分析TK.jar \
-T 選択バリアント \
-R 参照_ゲノム.fasta \
-V raw_variants.vcf \
-o raw_INDELs.vcf \
-選択タイプインデル - INDELFI
perl INDELFI.pl -i 入力.vcf (ステップ 8.1 から) \
-s 列テスト サンプル \
-c カラム制御サンプル
9. 変異プロファイル検査
- ステップ 7.6 からの SNVFI 出力から得られる .vcf ファイル (またはオプションの呼び出し可能遺伝子解析を使用してステップ 7.9 から) を使用して、R パッケージ変異パターン15を使用してゲノム変異プロファイル、変異型、およびシグネチャ分析を分析します。96-トリヌクレオチド突然変異スペクトルなどの結果の.vcfファイルで生成できる代表的な出力については、図5を参照してください。
10. ベース置換を用した発達系統樹の構築
- 発達系統ツリーを構築するには、クローン間の共有変異を検出します。系統ツリーの最初の分岐に存在する突然変異は、バルクサンプル(MSC/T細胞)にサブクローナ的に存在することもできる。後の分岐系統は、HSPC クローンによってのみ共有される突然変異によって定義されます。
- クローンのサブセットに存在し、バルク内にサブクローナに存在する突然変異を識別するには、次の手順を実行します。
- クローン間で共有される体細胞変異をフィルタリングするには、Unix ベースの端末でfilterSomatic.pyスクリプトを実行します。スクリプトはhttps://github.com/ToolsVanBox/filterSomaticにあります。このスクリプトを実行する前に、filterSomatic.iniファイルを編集してパスを設定し、他のパラメータを調整してください。
- filterSomatic.py実行(python3 filterSomatic.py -i フィルターSomatic.ini)
- [決定_lowVAF_bulk]を使用して、バルク内にサブクローナに存在する突然変異をフィルタリングします。Unix ベースの端末の R スクリプト。スクリプトはhttps://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_mutsにあります。これにより、共有 SNV および一意の SNV 用に別々の .vcf ファイルが生成されます。
Rscript 決定_lowVAF_bulk.R
--vcf パス/アクセス/フィルタ_somatic_output.vcf
--バルク_ネーム
--sample_name サンプル名
--性別 [M|F]
--out_dir アウト_ディール - すべての突然変異位置(SNVFI出力の列1と2)を重ねることによって、バルクサンプルに存在しないクローン間で共有されるすべての変異を決定します。
- IGV 16 を使用した手動検査により、ステップ 10.5 および10.6 の間に得られた偽陽性を除外します。突然変異が存在しない場合、変異が生殖細胞系に存在する場合、またはマッピングが不十分な領域に存在する場合は、図 7を参照してください。
注:ターゲットまたはサンガーシーケンスを使用して、すべての共有遺伝子座を個別に再シーケンスすることを強くお勧めします。 - ステップ10.1および10.2の間に得られた共有変異を使用して、突然変異と配列されたクローンのバイナリテーブルを構築し、0は変異が存在しないことを示し、1は変異の存在を示す。
- ヒートマップのように突然変異バイナリテーブルを、Rを使用してセル間の系統関係を示すデンドログラムと共に出力します。ヒートマップは、各セルの突然変異ステータスを示します。この関数の出力を参照してください (図6)。
クローン <- read.table ("パス/アクセス/バイナリテーブル")
my_palette <- colorRampPalette(c("#cccccc","#333333")(n = 2)
コルブレーク <- c(0,0.5,1)
ヒートマップ.2(クローン、distfun=function(x) dist(x,メソッド = 'バイナリ')
hclustfun=関数(x) hclust(x,メソッド = 平均)
デンドログラム = "列", Rowv = F,
col=my_パレット、ブレーク=コル_ブレーク、
トレース="なし"、密度.info="なし")
Representative Results
実験手順
実験ワークフローを図 1に示します。入力材料のタイプに基づいて、異なる手順に従う必要があります。図2では、臍帯血細胞ソートのフロー細胞測定出力が図示されている。まず、すべての単球細胞は、この集団の周りに緩やかにゲートを描画することによって選択されます。次いで、単一は、線形FSC-H/FSC-A比を持つ細胞に対して選択することによって単離され、より低いFSC-H/FSC-A比は二重または細胞束を含む。染色されていないコントロールサンプルは、系統のセル選別ゲートを定義するために使用されます-, CD34+, CD38-, CD45RA-.さらに、CD90およびCD49fは、前駆細胞または自己更新幹細胞17を区別するために使用することができる(図2)。インデックスの並べ替えにより、個々のセルの再トレースが可能になり、並べ替えられたセルは茶色のドットで表示されます。細胞培養中、個々のクローンは異なるペースで拡大し、一部のクローンは3週間以内に拡大し、他のクローンは培養の第5週まで完全に拡張されます。代表的なコロニーの成長については、図3A,Bを参照してください。代表的な写真は、めっき後11日目にほぼコンフルエントなMSCバルク培養物を示しています(図3C)。
シーケンス解析と変異解析後の品質の確認
Control-FreeC14によって生成されたコピー番号分析の出力の例を示し、コピー番号の変更をチェックします(図4)。角ティクスピック情報は、SNVFI実行中に除外する染色体を示すことができます(ステップ7.6)。SNVFI(図5)によって作成されたVAFプロットは、サンプル中のバリアント対立遺伝子周波数のヒストグラムです。密度プロットのピークが0.5の場合は、サンプルがクローンであることを示します。突然変異の背後にある根本的な生物学的原因についてより多くの洞察を得るために、これらはRパッケージ変異パターン15を使用して分析することができる。ここに描かれているのは、96-トリヌクレオチドプロットを産生する典型的な分析である(図6)。異なる変異タイプの定量化に加えて、シグネチャ抽出もこのツールで実行できます。
発達系統ツリーの構築
クローン間で共有される変異、または生殖細胞系制御のクローン(および低VAF)に存在する変異は、IGVを使用して検証されます。変異は、生殖細胞系の高いVAFレベルではなく、サンプル中に存在する場合に真と見なされます(図7A)。IGV に存在しない場合、変異は偽と見なされ、マッピングが不十分な領域で発生する可能性があります (図 7B)。他のケースでは、SNVFIによって検出された事象は生殖細胞変異を見逃している(図7C)。選択したクローンにおけるこれらの突然変異については、標的再配列決定による変異の独立した再配列化を強く推奨します。 クローン間の共有体細胞変異を検出した後、バイナリマトリックスが生成されます(ステップ10.8)。ヒートマップは、共有変異A-Mの有無にかかわらず細胞を含む構成される。このヒートマップの上に、発達系統ツリーが示されています(図8)。
図1:入力材料に基づく実験手順を示すフローチャート。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: セルの並べ替え戦略。まず、小さな単核細胞に対してゲーティングを行います。第二に、単一の細胞は、線形分の選択によってゲートされる。系統陰性細胞がゲートされる。すべての CD34+ CD38- CD45-セルは単一セルソート済みである。茶色の細胞の割合は、オプション「インデックスソート」によって強調表示されたソートされた細胞である、注意する必要があります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:代表的な細胞培養結果。代表的なHSPCクローンは、めっき後2週間後および(B)メッキ後4週間で(A)で384ウェルプレートに入れた。(C)MSC培養2週間後の培地置換。スケールバー = 100 μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:カリオタイプ。(A) クローンHSPC培養および(B)MSCバルクサンプル。核型は、読み取り深度解析によって決定された。どちらのグラフも、通常のカリオを示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:バリアント対立遺伝子周波数のヒストグラム。SNVFIの最後のフィルタリングステップ(VAF >0.3)の前のクローンにおけるバリアントのバリアント対立遺伝子頻度のヒストグラム。VAF = 0.5 のピークは、サンプルがクローンであることを示します。VAFが低いサブクローナ変異は、SNVFI(VAF>0.3)の最後のフィルタリングステップ中に除外されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:HSPC試料における体細胞変異の代表的な変異スペクトル解析図示されているのは、各トリヌクレオチド変化(中間塩基が変異している)の全スペクトルに対する相対的な寄与である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:IGV16を用いて変異を手動検査する。(A) 突然変異は、クローン内に存在し、バルクサンプルに存在しない場合は真と見なされます。(B) 不十分にマッピングされた領域に存在する場合、突然変異は偽陽性と見なされます。(C) 生殖細胞系のコントロールに存在する場合、変異は偽陽性と見なされる。垂直線は、呼び出された突然変異の位置を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:発達系統樹の構築描かれているのは、発達中に分裂した発達系統を示すデンドログラムである。デンドログラムの下のヒートマップは、異なるクローンの突然変異の存在を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
ここでは、個々のHSPCにおける生命の間に蓄積された変異を検出し、これらの変異データを用いて早期発達系統樹を構築する方法を示す。
これらのアッセイを正常に実行するには、いくつかの重要な要件を満たす必要があります。まず、試料の生存率を確保する必要があります。サンプルの速い処理はプロシージャの効率を保障するために重要である。第二に、成長因子の効力の喪失は、HSPCのクローン拡張に悪影響を及ぼす。高成長因子の効力を確保するためには、凍結解凍サイクルを避け、単一使用のアリコートを準備することが重要です。第3に、WGS、突然変異呼び出しおよびフィルタリングを行った後、クローンカルチャのクローナリティを検証することが重要である。培養物のクローン性を確認するために、変異のVAFは、通常の通常のサンプルで0.5の周りにクラスター化する必要があります(図3)。臍帯血HSPCのような低い突然変異負荷を有する細胞では、変異数が少ないためクローン性を決定することはより困難である。
我々のアプローチは、WGSを可能にするために単一細胞のインビトロ拡張に依存しています。したがって、我々のアプローチは、HSPCなど、クローン的に拡張する複製性を持つ細胞に限定されます。私たちの手の中では、すべての単一ソート細胞の約5%-30%が十分に膨張することができる。成長率が低下すると、選択バイアスが発生する可能性があります。前述したように、WGA を使用する方法は、この手法がセルの拡張に依存しないため、この選択バイアスを克服できます。しかし、WGAには独自の欠点があり、クローン増幅は、特に真の体性の低いサンプルにおいて、アレルドロップアウトやゲノムに沿った等しいカバレッジなしでゲノム全体の変異数を正確に決定する唯一の方法です。突然変異番号。
このアプローチを用いて生成されたデータは、図6に示すように、単一細胞で検出された変異が細胞系統を解剖するために使用することができるので、血行系の系統を決定するために使用することができる。通常、1つまたは2つの突然変異は、健全なドナー1の各分岐を定義することができる。系統は受胎後早く分岐するので、これらの最初の分岐を定義する変異は、生殖細胞変異体1、18、19を濾過するために使用された一致した正常サンプル中に低いVAFも存在する。この場合、MSCなどの非血行細胞の使用は、血行系からの発達の非常に早期に分離することが期待されるので好ましい。T細胞は造血起源であるため、生殖細胞変異体を濾過するために一致する正常サンプルとしてこれらの細胞を使用することは、発達系統樹の最も早い分岐の構築を混乱させる可能性がある。特定の成熟した血液集団における分岐特異的変異のサブクローナル存在は、標的深い配列決定によって測定することができ、その分岐の子孫がその成熟細胞型を生み出すことができることを示す。さらに、我々のアプローチは、生体内の変異原性暴露の突然変異的結果を評価し、最終的にこれが白血病の発症にどのように寄与するかを評価することを可能にする。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、オランダ科学研究機構(NWO)のVIDI助成金(No. 016.Vidi.171.023)からR.v.Bに支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| 50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
| CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
| CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
| CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
| CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
| CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
| CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
| CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
| Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
| CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
| Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
| Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
| Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
| Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
| PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
| RNAse A | Qiagen | 19101 | |
| SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
| StemSpan SFEM, 500 mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
| TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |
References
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