Summary
Somatiske mutasjon mønstre i cellene reflekterer tidligere mutagent eksponering og kan avdekke utviklingsmessige avstamning relasjoner. Presentert her er en metodikk for å katalogisere og analysere somatiske mutasjoner i individuelle blodkreft stammen og stamceller.
Abstract
Blodkreft stammen og stamceller (HSPCs) gradvis akkumuleres DNA mutasjoner under en levetid, noe som kan bidra til alder-assosiert sykdommer som leukemi. Karakteriserer mutasjon akkumulering kan forbedre forståelsen av etiologi av alder-assosiert sykdommer. Presentert her er en metode for å katalogisere somatiske mutasjoner i individuelle HSPCs, som er basert på hele-Genova sekvensering (WGS) av klonal primær cellekulturer. Mutasjoner som er til stede i den opprinnelige cellen er delt av alle celler i klonal kulturen, mens mutasjoner ervervet in vitro etter celle sortering er til stede i et delsett av celler. Derfor gir denne metoden for nøyaktig påvisning av somatiske mutasjoner til stede i genomer av individuelle HSPCs, som akkumuleres i løpet av livet. Disse katalogene av somatiske mutasjoner kan gi verdifull innsikt i mutational prosesser aktive i blodkreft vev og hvordan disse prosessene bidrar til leukemogenesis. I tillegg, ved å vurdere somatiske mutasjoner som er delt mellom flere HSPCs av samme individ, kan klonal avstamning relasjoner og befolkning dynamikk av blod populasjoner bestemmes. Ettersom denne tilnærmingen er avhengig in vitro utvidelse av enkeltceller, er metoden begrenset til blodkreft celler med tilstrekkelig replicative potensial.
Introduction
Eksponering av blodkreft stilk og stamceller (HSPCs) til endogene eller ytre mutagent kilder bidrar til gradvis akkumulering av mutasjoner i DNA under en levetid1. Gradvis mutasjon akkumulering i HSPCs1 kan resultere i alder-relaterte klonal hematopoiesen (Arch)2,3, som er en ikke-symptomatisk tilstand drevet av HSPCs bærer leukemi-driver mutasjoner. I utgangspunktet var det antatt at personer med bue har en økt risiko for leukemi2,3. Men nyere studier har vist en forekomst av 95% av ARCH i eldre individer4, noe som gjør foreningen med ondartet mindre klar og heve spørsmålet om hvorfor noen individer med Arch slutt gjøre eller ikke utvikle ondartet. Likevel, somatiske mutasjoner i HSPCs kan utgjøre alvorlig helserisiko, som myelodysplastisk lidelser og leukemi er karakterisert ved tilstedeværelsen av spesifikke kreft fører mutasjoner.
Å identifisere mutational prosesser og studere blod celleklonalitet, mutasjon akkumulering i individuelle HSPCs må karakteriseres. Mutational prosesser la karakteristiske mønstre i Genova, såkalte mutational signaturer, som kan identifiseres og kvantifisert i Genova-brede samlinger av mutasjoner5. For eksempel, eksponering for UV-lys, alkylating agenter, og defekter i DNA reparasjon trasé har hver blitt assosiert med en annen mutational signatur6,7. I tillegg, på grunn av Stokastisk natur mutasjon ansamlinger, de fleste (om ikke alle) av ervervet mutasjoner er unike mellom cellene. Hvis mutasjoner deles mellom flere celler av samme individ, indikerer det at disse cellene deler en felles stamfar8. Derfor, ved å vurdere felles mutasjoner, kan slekts forhold bestemmes mellom celler og en utviklingsmessige avstamning treet kan konstrueres gren av grenen. Men katalogisering sjeldne somatiske mutasjoner i fysiologisk normale celler er teknisk utfordrende på grunn av polyklonale natur sunt vev.
Presentert her er en metode for å nøyaktig identifisere og bestemme somatiske mutasjoner i genomer av individuelle HSPCs. Dette innebærer isolering og klonal utvidelse av HSPCs in vitro. Disse klonal kulturer reflekterer genetisk makeup av den opprinnelige cellen (dvs. mutasjoner i den opprinnelige cellen vil bli delt av alle andre celler i kulturen). Denne tilnærmingen gjør det mulig for oss å oppnå tilstrekkelig DNA for hele Genova sekvensering (WGS). Vi har tidligere vist at mutasjoner akkumulert in vitro under klonal kulturen vil bli delt av et delsett av celler. Dette gjør det mulig å filtrere alle in vitro mutasjoner, da disse vil være til stede i en mindre brøkdel av leser i forhold til in vivo ervervet mutasjoner9. Tidligere metoder har fått tilstrekkelig DNA fra en enkelt celle for WGS bruke hele-Genova forsterkning (WGA)10. Imidlertid, det hovedavdeling ulempen av WGA er dens relativt feil-liggende og ubalansert forsterkning av det Genova, hvilke kanne gir seg utslag i allel utfall11. Likevel, som denne tilnærmingen er avhengig in vitro utvidelse av enkeltceller, er det begrenset til blodceller med tilstrekkelig replicative potensial, som ikke er tilfelle for WGA-avhengige metoder. Tidligere innsats sekvensering klonal kulturer har stolt på å bruke mater lag for å sikre klonal forsterkning av enkelt HSPCs12. Imidlertid kan DNA fra materen lagene potensielt forurense DNA av klonal kulturer, forvirrende den påfølgende mutasjon ringer og filtrering. Metoden som presenteres her utelukkende er avhengig av spesifisert medium til clonally utvide enkelt HSPCs, og derfor unngår utstedelse av DNA-forurensning. Inntil nå har vi med hell brukt denne metoden på menneskelig benmarg, ledningen blod, viably frossen benmarg, og perifert blod.
Protocol
Prøver må innhentes i samsvar med aktuelle etiske protokoller, og givere må gi informert samtykke før prosedyren.
1. utarbeidelse av sample materiale
Merk: Når du arbeider med ferskt materiale, Start med trinn 1,1. Når du arbeider med frosset materiale, Start med trinn 1,2.
-
Tilberedning av fersk benmarg, Lednings blod eller perifert blod
- Isoler den mononukleære fraksjonen fra prøven ved å bruke tetthet gradient separasjon ved å følge produsentens instruksjoner (se tabell over materialer), og telle mononukleære celler ved hjelp av en hemocytometer. Etter isolering av de mononukleære cellene, Fortsett med trinn 1,3.
- Valgfritt: det anbefalte antallet celler som kreves for å sortere en full 384 brønn plate av HSPCs er 1 – 2 x 107. Hvis flere celler er isolert under tetthet gradient sentrifugering, lagre overskudd av celler i flytende nitrogen.
- Resuspend celler i 500 μL av IMDM + 10% FBS per 1 x 107 celler, og legge drop-by-drop et lik volum av IMDM + 30% FBS + 20% DMSO å oppnå en suspensjon på 1 x 107 celler i 1 ml IMDM + 20% FBS + 10% DMSO.
- Umiddelbart overføre de mononukleære cellene til 1 mL kryogene hetteglass og fryse celler ved-80 ° c i en kontrollert-rate celle fryse beholder over natten. Overfør cellene neste dag til en flytende nitrogen lagring ved videre behandling.
-
Tilberedning av frosne mononukleære celler fra benmarg, Lednings blod eller perifert blod
- Forbered 50 mL av celle tine medium som inneholder 45 mL av Iscove ' s modifisert Eagle ' s medium (IMDM) og 5 mL av fosterets storfe serum (FBS), og varm i 37 ° c vannbad.
- Ta hetteglasset med prøven fra lager for flytende nitrogen, Overfør prøven til tørr is og Tin så raskt som mulig i et vannbad på 37 ° c.
- Når prøven er nesten tint, tørk hetteglasset med 70% etanol og Overfør innholdet til et 50 mL konisk rør. Skyll hetteglasset med 1 mL forvarmet IMDM + 10% FBS for å samle de resterende cellene, og Legg til denne løsningen dråpevis (5 s per dråpe) til tint prøven mens du forsiktig virvler røret.
- Tilsett en ekstra forvarmet 15 mL IMDM + 10% FBS dråpevis til prøven mens du forsiktig virvler røret.
- Pellet cellene ved sentrifugering i 5 min ved 350 x g.
- Fjern alle supernatanten, men ± 3 mL. Resuspend cellene i de resterende supernatanten og fortynne ved å legge 20 mL IMDM + 10% FBS drop-by-drop mens forsiktig rister røret.
- Ta 10 μL av celle fjæringen for celle telling. Fortynne disse 10 μL ved å legge til 20 μL av 0,4% trypan blå oppløsning og telle cellene ved hjelp av en hemocytometer. Celle tallet kan reduseres ved tine, med opptil 50% celle tap etter tine. Celle levedyktighet bør variere mellom 70% og 90%.
- Hvis du arbeider med benmarg eller navlestreng blodceller, ta opp 5 x 106 mononukleære celler for MSC kultur (trinn 2,1). Hvis du arbeider med perifert blod, ta opp 2 – 5 x 106 celler for T-celle isolering (trinn 2,2)
- Pellet resterende celler 5 min på 350 x g og resuspend i 3 ml FACS buffer (0,05% BSA + 1 mm EDTA i PBS).
- Overfør 1 x 105 celler til en microtube fylt med 200 ΜL av FACS buffer, som vil tjene som en negativ kontroll for strømnings flowcytometri (trinn 3,8), og holde på isen.
2. Cell kultur
Merk: For å få kataloger av somatically ervervet mutasjoner, donor-spesifikk germline variasjon må filtreres ut. Når du starter med benmarg biopsier eller navlestreng blod, mesenchymal stromal celler (MSCs) kan brukes som matchet kontroll for å filtrere etter germline variasjon. I dette tilfellet følger du avsnitt 2,1. Når du bruker (mobilisert) perifert blod følger du trinn 2,2 for å isolere og bruke T-celler som matchet kontroll prøve for å filtrere etter germline variasjon (figur 1). Den bulk T-celle befolkningen vil dele den samme avstamning forholdet som HSPCs.
-
MSC-kulturen
- Forbered 50 mL MSC-medium som inneholder 45 mL DMEM/F12 medium, 10% FBS, 500 μL av Trypsin eller Trypsin alternativ, og 500 μL av penicillin/Streptomycin løsning.
- Plate ca 5 x 105 mononukleære celler i 1,5 ml av MSC medium per brønn. Plasser cellene i en fuktet inkubator ved 37 ° c med 5% CO2.
- Erstatt mediet etter 24 h, og deretter erstatte medium hver 3 dager for å sikre at alle blodkreft cellene er vasket av. Fortsett til kultur til confluency er 100%.
- Hvis MSCs er confluent, vaske celler med 1 mL PBS og høste MSCs ved å legge 200 μL av Trypsin eller Trypsin alternativ per brønn. Ruge celler i 5 min ved 37 ° c. Tilsett 800 μL av MSC medium, og Pipet cellene opp og ned for å løsne cellene fra brønn platen.
- Overfør MSCs til mikrosentrifugen tube og pellet cellene ved sentrifugering i 5 min ved 350 x g. Fjern supernatanten og fortsett med DNA-isolasjon eller Oppbevar pellet ved-20 ° c for senere DNA-isolasjon (avsnitt 4).
-
T-celle isolasjon
Merk: Hvis du bruker (mobilisert) perifert blod, kan T-celler isoleres og brukes som germline kontroll.- Resuspend celle pellet i 100 μL av anti-CD3 farge løsning (1:100 fortynning av anti-CD-antistoff i FACS-buffer).
- Vask cellene ved å tilsette 1 mL FACS-buffer. Pellet cellene ved sentrifugering i 5 min ved 350 x g og resuspend i 300 ΜL av FACS buffer.
- Isolere minst 5 x 105 CD3 + celler ved hjelp av en FACS-Sorter i en 5 ml polystyren rør pre-fylt med 1 ml FBS.
- Pellet de sorterte cellene ved hjelp av sentrifugering i 5 min ved 350 x g, Fjern supernatanten, og Fortsett direkte med DNA-isolasjon (del 4) eller Oppbevar pellet ved-20 ° c for senere DNA isolasjon.
3. HSPC isolering, sortering og kultur
- Spinn ned ved 1 – 2 x 107 mononukleære-celler i 5 minutter ved 350 x g og resuspend i 50 μL av FACS-buffer (se trinn 2.2.1). Overfør cellene til et mikrosentrifugen rør.
Merk: Når du sorterer med > 2 x 107 celler, øker du antistoff MIKSEN og FACS buffer volumer tilsvarende. - Forbered 50 μL av 2x HSC farging mix i henhold til oppskriften sett i tabell 1.
| Antistoff | volum [μL] |
| BV421-CD34 | 5 |
| FITC-Lineage mix (CD3/14/19/20/56) | 5 |
| PE-CD38 | 2 |
| APC-CD90 | 0,5 for alle |
| PerCP/CY 5.5-CD45RA | 5 |
| PE/Cy7-CD49f | 1 |
| FITC -CD16 | 1 |
| FITC-CD11 | 5 |
| FACS-buffer | 25,5 for alle |
Tabell 1: HSC sortering mix. Vist er en tabell som indikerer fortynninger av antistoffer som brukes til å sortere HSCs.
- Bland 50 μL av celle løsning med forberedt HSC farging mix og ruge cellene i 15 min ved romtemperatur (RT) eller for 1 t på isen for antistoffer til å binde.
- Vask cellene ved å tilsette 1 mL FACS buffer og pellets ved sentrifugering i 5 min ved 350 x g.
- Resuspend cellene i 300 μL av FACS buffer og Filtrer cellen suspensjonen gjennom en 35 μm celle sil-avkortet 5 mL polystyren rør for å fjerne celle klumper før fluorescens-aktivert celle sortering (FACS).
- Forbered 25 mL HSPC kultur medium, bestående av 1x SFEM medium supplert med 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6, og 100 ng/mL antibiotika formulering (se tabell over materialer).
- Fyll en 384 brønn cellekultur plate med 75 μL av HSPC kultur medium i hver brønn.
Merk: For å hindre fordamping av mediet i de ytre brønnene, fyll de ytre brønnene med 75 μL av sterilt vann eller PBS, og ikke bruk disse brønnene for celle sortering. -
Sortere enkelt HSPCs
- Angi porter for HSPC-sorteringen basert på en unstained kontroll (trinn 1,9) og 10 000 celler fra den fargede prøven. Et representativt resultat for angivelse av porter er avbildet i figur 1. Gate enkeltceller ved å tegne en port rundt den lineære FSC-høyde vs. FSC-området brøkdel. Bruk unstained kontroll brøk til å tegne gate for avstamning- brøk. Tegn porter for CD34+ celler og karakteriserer dette delsettet ved å angi en bestemt port for CD38- CD45RA- Cells.
- Legg 384 brønn platen på FACS-maskinen og Sorter enkeltceller.
Merk: Hvis det gjelder FACS-Machine, kan du slå på alternativet for å holde indeks sorteringsdata for å aktivere ny sporing av de sorterte cellene.
-
Dyrking enkeltvis-sortert HSCs
- Overfør 384 brønn platen direkte til en fuktet 37 ° c inkubator med 5% CO2.
Merk: For å hindre fordampning under kultur, vikle 384 brønn kultur plate (med lokk) i gjennomsiktig polyetylen wrap. - Hold 384 brønn platen i inkubator i 3 – 4 uker til synlige kloner vises. Representative bilder av klonal kultur er avbildet i figur 2. Basert på tilstanden til input materialet 5%-30% av sorterte celler vil clonally utvides.
- Overfør 384 brønn platen direkte til en fuktet 37 ° c inkubator med 5% CO2.
4. høsting HSPC kloner
- Etter 4 ukers dyrking, Bestem hvilke brønner som har en confluency på 30% eller høyere.
- Forhånds fyll (for hver klonal utvekst) 1,5 mL mikrorør med 1 mL 1% BSA i PBS og Merk slangen i henhold til tilsvarende brønn.
- Pre-Wet en pipette spissen med 1% BSA i PBS å minimere antall celler stikker til pipette spissen.
- Pipet opp/ned mediet i brønnen voldsomt (minst 5 ganger) med en 200 μL pipette (satt til 75 μL) og skrape bunnen av brønnen for å løsne cellene i brønnen, og samle celle suspensjonen i merket microtube tilsvarende brønnen.
- Ta opp 75 μL av fersk 1% BSA i PBS og gjenta pipettering i brønnen for å sikre maksimal opptak av celler.
Merk: Clonally kulturperler celler kan holde seg til bunnen av brønnen. Inspiser brønnene ved hjelp av en standard invertert lys mikroskop for å sikre om alle celler har blitt samlet inn. - Hvis alle brønner med > 30% confluency er høstet, plasser 384 brønn platen tilbake i inkubator. Klonal kulturer kan spre seg i inntil 5 uker.
- Snurr ned celle fjæringen i 5 minutter ved 350 x g. En liten pellet bør være synlig.
- Fjern alle unntatt ca. 5 μL av supernatanten forsiktig. Celle pellets kan fryses ved-20 ° c og oppbevares i flere måneder før DNA-isolasjon.
5. DNA-isolasjon
-
Isoler HSPC og MSC/T-Cell DNA ved hjelp av en mikro-skala DNA isolasjons sett i henhold til produsentens instruksjon med følgende justeringer:
- Tilsett 2 μL av RNase A etter tilsetning av buffer AL i del 2. Ruge for 2 min før du legger proteinase K.
- Ruge i 30 min ved 56 ° c istedenfor 10 min.
- Eluere DNA ved lasting kolonnen med 50 μL av TE buffer med lav EDTA (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA). For optimal eluering, Oppdater eluatet igjen på søylen og spinn igjen.
- Bestem DNA-konsentrasjonen ved hjelp av en DNA som måler 2 μL per klone. DNA-utbyttet varierer vanligvis mellom 0,5 – 3 ng/μL.
6. sekvenser
- Utføre DNA-sekvensering som beskrevet av jager et al.13
7. kartlegging og somatiske mutasjon Calling
- Kart produksjon av sekvensering (FASTQ filer) til referanse Genova og ringe mutasjoner som beskrevet i jager et al.13
- Inspiser data for avvikende karyotypic endringer i sekvensert klone og bulk data ved hjelp av et kopierings nummer analyseverktøy, for eksempel kontroll-FreeC14. Inntil nå har vi ikke rapportert noen HSPCs med karyotypic aberrances.
- Generere en svarteliste, som består av et panel av uovertruffen normal prøver for filtrering formål fra et eget sett med prøver, som tidligere beskrevet13, eller bruke følgende opplastede svarteliste: < https://data.mendeley.com/DataSets/9y4yhwt5rp/3 >.
- Filtrer enkelt nukleotid variasjoner ved hjelp av SNVFI < https://github.com/ToolsVanBox/SNVFI >.
- Forhåndsinnstilt SNVFI. config-filen, slik at alle banene til hjelperen funksjoner er riktige.
- Løpe SNVFI med. ini arkiv konfigurert alt etter avsetningene sett inne ekstra arkiv 1 (SNVFI. ini). For å ekskludere in vitro-indusert mutasjoner filtrerer vi etter en VAF ≥ 0,39.
- Kontroller variant allel brøk (VAF)-utdata fra SNVFI (Figur 4). Sjekk om toppen av tettheten tomten er nær 0,5, indikerer prøven er klonal.
-
Valgfritt: Å avgjøre delen av det Genova hvilke er belagt i løpet av filterene, avgjøre det callable områder frem germline og administrere benytter CallableLoci fra GATK (Genova analyseverktøyet):
Java-jar GenomeAnalysisTK. jar \
-T CallableLoci \
-R referanse. FASTA \
-Jeg myreads. Bam \
-oppsummering Table. txt \
-o callable_status. Bed -
Valgfritt: Gjenerverve det callable områder fra det CallableLoci produksjon og utføre parvis skjæringspunkt imellom prøvene og det bulk benytter det Python skriften CallableLoci_processor. py gave for https://GitHub.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . Den resulterende Bed filer kan brukes til ytterligere filtrere produksjonen av SNVFI og for å inspisere mutational profil i § 9:
CallableLoci_processor. py dir_in dir_out sample_name bulk_name – prøver sample1 sample2 sample3
8. Indel Calling
- Velg alle innsettinger og slettinger (indeler) i raw_variants VCF-filen ved hjelp av GATK SelectVariants:
Java-Xmx12G \
-jar GenomeAnalysisTK. jar \
-T SelectVariants \
-R reference_genome. FASTA \
-V raw_variants. VCF \
-o raw_INDELs. VCF \
-selectType INDEL - Filtrer raw_INDELS. VCF-liste ved hjelp av INDELFI < https://github.com/ToolsVanBox/INDELFI >:
Perl INDELFI.pl-i input. VCF (fra trinn 8,1) \
-s kolonne testprøven \
-c kolonne kontroll sample
9. mutational profil inspeksjon
- Bruk de resulterende VCF-filene fra SNVFI-utdata fra trinn 7,6 (eller fra trinn 7,9 med valgfri callable Loci analyse) til å analysere genomisk mutational profil, mutasjon-typer og signatur analyse ved hjelp av R-pakken MutationalPatterns15: < http://bioconductor.org/Packages/Release/bioc/HTML/MutationalPatterns.html >. For representative utdata som kan produseres med den resulterende VCF-filen, for eksempel et 96-trinucleotide mutational spektrum, se figur 5.
10. bygging av en utviklingsmessige Lineage Tree bruke base erstatninger
- Å konstruere et utviklingsmål slektstre, oppdage delte mutasjoner mellom kloner. Mutasjoner som finnes i de første grenene av slektstreet, kan også være subclonally til stede i bulk prøven (MSCs/T-Cells). Senere forgrening linjene vil bli definert av mutasjoner som deles av HSPC kloner bare.
- For å identifisere mutasjoner som finnes i et delsett av kloner og subclonally som finnes i bulk, utfører du følgende trinn.
- For å filtrere etter somatiske mutasjoner som deles mellom kloner, kjører du filterSomatic.py-skriptet i en UNIX-basert terminal. Skriptet kan bli funnet på https://GitHub.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Før du kjører dette skriptet, redigerer du filen filterSomatic. ini (se tilleggsfil 2) for å angi banene og justere de andre parameterne.
- Løpe filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py-jeg filterSomatic. ini).
- Filtrer etter mutasjoner som er subclonally til stede i bulk ved hjelp av Determine_lowVAF_bulk. R-skript i en UNIX-basert terminal. Skriptet kan bli funnet på https://GitHub.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Dette vil generere separate VCF-filer for delte og unike SNVs:
Rscript Determine_lowVAF_bulk. R
--VCF Path/til/Filter_somatic_output. VCF
-bulk bulk_name
--sample_name sample-navn
--kjønn [M | F
--out_dir out_dir - Bestem alle mutasjoner som deles mellom kloner som ikke finnes i bulk prøven ved å overlappe alle mutasjon posisjoner (sammenkoble kolonne 1 og 2 av SNVFI output).
- Ekskluder falske positiver oppnådd i trinn 10,5 og 10,6 ved manuell inspeksjon ved hjelp av IGV16. Mutasjoner anses som falske når mutasjonen er til stede i germline eller når den finnes i dårlig kartlagt regioner, se figur 7.
Merk: Vi anbefaler å re-sekvensen alle delte Loci uavhengig bruker målrettede eller sanger sekvensering. - Bruk delte mutasjoner innhentet i trinn 10,1 og 10,2 for å bygge en binær tabell over mutasjoner versus sekvensert kloner, med 0 indikerer at mutasjonen ikke er til stede og 1 indikerer tilstedeværelsen av mutasjonen.
- Output mutasjonen binære tabellen som i en heatmap sammen med en dendrogram indikerer avstamning relasjoner mellom celler ved hjelp av R. Heatmap angir mutasjon-status for hver celle. Se resultatet av denne funksjonen (figur 6).
Kloner < lese. tabell ("bane/til/BinaryTable")
my_palette <-colorRampPalette (c ("#cccccc", "#333333")) (n = 2)
col_breaks <-c (0, 0,5, 1)
heatmap. 2 (kloner, distfun = funksjon (x) dist (x, Method = ' binær '),
hclustfun = Function (x) hclust (x, metode = gjennomsnitt),
dendrogram = "kolonne", Rowv = F,
Col = my_palette, pauser = col_breaks,
Trace = "ingen", tetthet. info = "ingen")
Representative Results
Eksperimentell prosedyre
Den eksperimentelle arbeidsflyten er avbildet i figur 1. Avhengig av type inn data materiale, må ulike trinn følges. I figur 2 a Flow analytiske output av en ledningen blod celle sortering er avbildet. Først, alle monocyttisk celler er valgt av løst tegne en port rundt denne populasjonen. Deretter blir singleter isolert ved å velge for celler med en lineær FSC-H/FSC-et forhold, som en lavere FSC-H/FSC-et forhold inkluderer doublets eller celle klumper. Unstained kontroll prøve brukes til å definere celle sorterings porter for Lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-. I tillegg kan CD90 og CD49f brukes til å skille mellom stamceller eller selv fornye stamceller17 (figur 2). Indeks sortering gjør det mulig å spore enkeltceller på nytt, og de sorterte cellene blir avbildet som brune prikker. Under celle kulturen, kan individuelle kloner utvide i et annet tempo, med noen kloner utvide innen 3 uker, mens andre kloner er bare fullt utvidet til den femte uken av kulturen. Se figur 3a, B for representative koloni utvekst. Et representativt bilde er vist av en nesten confluent MSC bulk kultur på 11 dager etter plating (figur 3c).
Kontrollere kvalitet etter sekvensering og mutasjon analyse
Vist er et eksempel på utdata fra kopi nummer analysen generert av Control-FreeC14 for å se etter kopierings nummer endringer (Figur 4). Karyotypic informasjon kan indikere hvilken kromosomer som skal ekskluderes under en SNVFI-kjøring (trinn 7,6). VAF-plottet som er opprettet av SNVFI (figur 5) er et histogram av variant allel frekvenser i utvalget. En topp i tettheten tomten på 0,5 indikerer prøven er klonal. For å få mer innsikt i de underliggende biologiske årsakene bak mutasjoner, kan disse analyseres ved hjelp av R-pakken MutationalPatterns15. Avbildet her er en typisk analyse som produserer en 96-trinucleotide plot (figur 6). I tillegg til kvantifisering av ulike typer mutasjon, kan signatur utvinning også utføres med dette verktøyet.
Konstruere et utviklingsmål slektstre
Mutasjoner som deles blant kloner eller finnes i en klone (og ved lav VAF) i germline kontroll er validert ved hjelp av IGV. Mutasjoner betraktes som sanne når de finnes i prøven og ikke ved høye VAF-nivåer i germline (figur 7a). Mutasjoner anses som falske når de ikke finnes i IGV, noe som kan skje i dårlig kartlagt regioner (figur 7b). I andre tilfeller, hendelser oppdages av SNVFI er savnet germline mutasjoner (figur 7C). Uavhengig re-sekvensering av mutasjoner ved målrettet re-sekvensering er sterkt anbefalt for disse mutasjoner i utvalgte kloner. Etter påvisning av felles somatiske mutasjoner mellom kloner, en binær matrise er generert (trinn 10,8). En heatmap er bygget som inneholder celler med og uten de delte mutasjoner A-M. Over denne heatmap vises det utviklingsmessige slektstreet (Figur 8).
Figur 1: flytskjema som viser eksperimentell prosedyre basert på inn data materiale. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: celle sorterings strategi. Først gating utføres på små mononukleære celler. For det andre er enkeltceller gated ved å velge den lineære fraksjonen. Lineage negative celler er gated. Alle CD34+ CD38- CD45- celler er enkelt celle-sortert. Brøkdelen av celler i brunt bør bemerkes, som er de sorterte cellene markert med alternativet "indeks sortering". Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representative cellekultur resultater. Representative HSPC kloner i en 384 brønn plate ved (a) 2 uker etter plating og (B) 4 uker etter plating. (C) MSC kultur etter 2 uker med medium erstatning. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Karyotypes. (A) klonal HSPC kultur og (B) MSC bulk sample. Karyotypes ble bestemt av lese dybdeanalyse. Begge diagrammene indikerer en karotypisk normal prøve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: histogram for variant allel frekvenser. Histogram av variant allel frekvenser av variantene i en klone før det siste Filtreringstrinnet i SNVFI (VAF > 0.3). En topp på VAF = 0,5 indikerer at prøven er klonal. Subclonal mutasjoner med lave VAF utelates under siste filtrerings trinn i SNVFI (VAF > 0.3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: representativ mutational spektrum analyse av somatiske mutasjoner i en HSPC-prøve. Avbildet er den relative bidrag av hver trinucleotide endring (som den midterste basen er mutert) til det totale spekteret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: manuell inspeksjon av mutasjoner med IGV16. (A) mutasjoner betraktes som sanne når de finnes i klone og ikke i bulk prøven. (B) mutasjoner anses som falske positiver når de finnes i et dårlig kartlagt område. (C) mutasjoner betraktes som falske positiver når de finnes i en germline kontroll. Den vertikale linjen indikerer posisjonen til en kalt mutasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: bygging av en utviklingsmessige avstamning treet. Avbildet er en dendrogram som indikerer utviklingsmessige linjene splitting av under utvikling. Heatmap under dendrogram indikerer tilstedeværelsen av mutasjoner i ulike kloner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Presentert her er en metode for å oppdage mutasjoner som akkumulert i løpet av livet i individuelle HSPCs og å konstruere en tidlig utviklingsmessige avstamning treet ved hjelp av disse mutasjon data.
Flere kritiske krav må oppfylles for å kunne utføre disse analysene. For det første må levedyktigheten til prøven sikres. Rask håndtering av prøven er nøkkelen til å sikre effektiviteten av prosedyren. For det andre, tap av vekstfaktor styrke vil negativt påvirke klonal utvidelse av HSPCs. For å sikre høy vekstfaktor styrke, er det viktig å unngå fryse-tine sykluser og forberede engangsbruk alikvoter. For det tredje, etter å ha utført WGS, mutasjon ringer og filtrering, er det avgjørende å validere celleklonalitet av klonal kulturen. For å bekrefte celleklonalitet av kulturen, bør VAF av mutasjoner klynge rundt 0,5 i en karotypisk normal prøve (Figur 3). I celler med en lav mutational belastning, for eksempel ledningen blod HSPCs, er det vanskeligere å fastslå celleklonalitet på grunn av lav mutasjon tall.
Vår tilnærming er avhengig av in vitro-utvidelse av enkeltceller for å muliggjøre WGS. Derfor er vår tilnærming begrenset til celler som har replicative potensial til å clonally utvides, for eksempel HSPCs. I våre hender, ca 5%-30% av alle enkelt-sorterte celler er i stand til å utvide tilstrekkelig. Reduserte utvekst rater kan potensielt resultere i et utvalg bias. Som diskutert tidligere, metoder bruker WGA kan overvinne dette utvalget bias som denne teknikken er ikke avhengig av utvidelse av celler. Imidlertid, WGA har dens egen mangler, og klonal forsterkning restene det bare metoden å akkurat avgjøre antallet av mutasjoner inne det hele Genova uten allel utfall og likeverdig presseomtalen frem det Genova, særlig inne eksemplar med lav avrette somatiske mutasjon tall.
Dataene som genereres ved hjelp av denne tilnærmingen kan brukes til å bestemme phylogenies av blodkreft system, som mutasjoner oppdaget i enkeltceller kan brukes til å analysere cellelinjene, som avbildet i figur 6. Vanligvis kan en eller to mutasjoner definere hver gren i en sunn donor1. Siden linjene gren tidlig etter unnfangelsen, mutasjoner definere disse første grenene vil også være til stede med en lav VAF i matchet normal prøve som ble brukt for filtrering av germline varianter1,18,19. I dette tilfellet, bruk av ikke-blodkreft celler, som MSCs, foretrekkes som de forventes å skille veldig tidlig under utvikling fra blodkreft system. Som T-celler er av blodkreft opprinnelse, bruk av disse cellene som matchet normal prøve å filtrere germline varianter kunne derfor forvirre byggingen av de tidligste forgrening av utviklingsmessige avstamning treet. Subclonal tilstedeværelsen av gren-spesifikke mutasjoner i visse modne blod populasjoner, som kan måles ved målrettede dype sekvensering, vil indikere at avkom av at grenen kan gi opphav til at modne celle type. I tillegg gjør vår tilnærming for å vurdere mutational konsekvensene av mutagent eksponering in vivo og til slutt hvordan dette kan bidra til leukemi utvikling.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av en VIDI bevilgning av Nederland organisasjon for Scientific Research (NWO) (no. 016. Vidi. 171.023) til R. v. B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| 50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
| CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
| CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
| CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
| CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
| CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
| CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
| CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
| Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
| CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
| Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
| Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
| Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
| Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
| PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
| RNAse A | Qiagen | 19101 | |
| SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
| StemSpan SFEM, 500 mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
| TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |
References
- Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).
- Genovese, G., et al. Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence. New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes. New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).
- Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. Nature Communications. 7, 1-7 (2016).
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer. Cell Reports. 3, 246-259 (2013).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500, 415-421 (2013).
- Alexandrov, L., et al. The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer. bioRxiv. , (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. 513, 422-425 (2014).
- Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538, 260-264 (2016).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: Current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).
- Dong, X., et al. Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells. Nature Methods. 14, 491-493 (2017).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150, (2012).
- Jager, M., et al. Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures. Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).
- Boeva, V., et al. Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data. Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).
- Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes. Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. , (2011).
- Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561, 473-478 (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. , (2014).
