Summary
Vi beskriver en metode til at visualisere GFP-mærket γδ IELs ved hjælp af intravital billeddannelse af murine tyndtarmen ved inverteret spinning disk confokal mikroskopi. Denne teknik gør det muligt at spore levende celler i slimhinden i op til 4 timer og kan bruges til at undersøge en række af intestinal immun-epitheliale interaktioner.
Abstract
Intraepitelial lymfocytter, der udtrykker γδ T celle receptor (γδ IEL) spiller en central rolle i immun overvågning af tarm epitelet. På grund af manglen på en definitiv ligand for γδ T celle receptoren, er vores forståelse af reguleringen af γδ IEL aktivering og deres funktion in vivo fortsat begrænset. Dette nødvendiggør udvikling af alternative strategier til at afhøre signalerings veje involveret i reguleringen af γδ IEL funktion og reaktionsevne af disse celler til det lokale mikromiljø. Selv om γδ IELs er almindeligt forstået at begrænse patogenets translokation, har brugen af intravital Imaging været afgørende for forståelsen af den spatiale dynamik i IEL/epithelial interaktioner ved Steady-State og som reaktion på invasive patogener. Heri præsenterer vi en protokol til visualisering af IEL-migrerende adfærd i den lille intestinal slimhinde i en GFP γδ T-celle reporter mus ved hjælp af inverteret roterende disk confokal laser mikroskopi. Selv om den maksimale billeddannelses dybde af denne tilgang er begrænset i forhold til brugen af to-photon laser-scanning mikroskopi, spinning disk refleksionskonfokalmikroskopi laser mikroskopi giver fordelen ved høj hastighed billed erhvervelse med reduceret foto blegning og solskader. Ved hjælp af 4D billedanalyse software, T-celle overvågning adfærd og deres interaktioner med tilstødende celler kan analyseres efter eksperimentel manipulation for at give yderligere indsigt i IEL aktivering og funktion i tarmslimhinden.
Introduction
Intraepitelial lymfocytter (IEL) er placeret i tarm Epitelet, og findes både langs kælderen membran og mellem tilstødende epitelceller i det laterale intercellulære rum1. Der er omtrent en IEL for hver 5-10 epitelial celler; disse IELs tjene som Sentinels at give immun overvågning af den store flade af den intestinale epitelial barriere2. IELs, der udtrykker γδ T-celle receptoren (TCR), udgør op til 60% af den totale IEL-population i den murine tyndtarmen. Undersøgelser i γδ T-celle-mangel mus demonstrere en stort set beskyttende rolle af disse celler som reaktion på tarm skade, betændelse og infektion3,4,5. På trods af den generation af Tcrd knockout Mouse6, er vores forståelse af γδ IEL biologi fortsat begrænset på grund af det faktum, at ligander anerkendt af γδ TCR endnu ikke er identificeret7. Som et resultat, manglen på værktøjer til at studere denne cellepopulation har gjort det vanskeligt at undersøge den rolle, som γδ TCR aktivering og funktion under fysiologiske og patologiske betingelser. For at udfylde dette hul, har vi udviklet levende Imaging teknikker til at visualisere γδ IEL migrerende adfærd og interaktioner med tilstødende enterocytter som et middel til at give yderligere indsigt i γδ IEL funktion og lydhørhed over for eksterne stimuli in vivo.
I løbet af de sidste ti år har intravital Imaging væsentligt udvidet vores forståelse af de molekylære hændelser, der er involveret i flere facetter af intestinal biologi, herunder epitelial celle afgivelse8, regulering af epitel barriere funktion9 ,10, myeloid celle prøvetagning af luminale indhold11,12, og Host-Microbe interaktioner11,13,14,15,16 . I forbindelse med IEL-biologi har brugen af intravital mikroskopi kastet lys over den spatiale dynamik i IEL motilitet og de faktorer, der formidler deres overvågnings adfærd13,14,15, 16. det er Udviklingen af TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) reporter mus, som etiketter γδ IELs af nukleare GFP udtryk17, afslørede, at Γδ iels er meget motile i epitelet og udviser en unik overvågning adfærd, der er lydhør over for mikrobielle infektion17,13,14. For nylig, en anden γδ T celle reporter mus blev udviklet (Tcrd-GDL) som udtrykker gfp i cytoplasma at tillade visualisering af hele cellen18. Lignende metode er blevet anvendt til at undersøge kravet om specifikke chemokine receptorer, såsom G protein-koblet receptor (GPCR)-18 og-55, på dynamikken i IEL motilitet19,20. I fravær af en celle specifik reporter blev fluorescerende konjugeret antistoffer mod CD8α anvendt til at visualisere og spore IEL motilitet in vivo19,20. Selv om to-photon Laserscanning mikroskopi er almindeligt anvendt til intravital Imaging, brugen af spinning disk refleksionskonfokalmikroskopi laser mikroskopi giver unikke fordele til at indfange høj hastighed og høj opløsning multi-kanal billeder med minimal baggrundsstøj. Denne teknologi er ideel til at belyse den spatiale dynamik i immun/epithelial interaktioner inden for det komplekse mikromiljø af tarmslimhinden. Desuden, gennem brug af forskellige transgene og/eller knockout musemodeller, disse undersøgelser kan give indsigt i den molekylære regulering af intestinal immun og/eller epitel cellefunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle undersøgelser blev gennemført i en sammenslutning af vurdering og akkreditering af laboratoriet Animal Care (AALAC)-akkrediteret facilitet i henhold til protokoller godkendt af Rutgers New Jersey Medical School sammenlignende medicin ressourcer.
1. forberedelse af mus
Bemærk: Følgende procedure, herunder animalsk forberedelse og kirurgi, vil tage 30 – 40 min. før operationen skal du tænde mikroskopet og varme den medfølgende inkubator op på mikroskopet til 37 °C.
- Udfør eksperimenter på 8 – 10 uger gamle TcrdEGFP mus på en C57BL/6 baggrund, som blev indhentet fra Bernard Malissen (INSERM, Paris, Frankrig). Ifølge IACUC-godkendt procedure, bedøve musen ved IP injektion af ketamin (120 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) baseret på vægten af dyret. Evaluer niveauet af anæstesi ved respiration sats (55 – 65 åndedrag per minut)21, tå pinch og øjen refleks.
- Når kirurgisk plan anæstesi er nået, fastgør bagbenene af musen ved hjælp af tape til en varmepude til at opretholde kropstemperaturen, som kan overvåges af rektal termometer. Hvis der er tegn på, at anæstesi er iført (f. eks. øget respirationsfrekvens, blinkende og/eller øjen muskulatur trækninger respons til øjen refleks), skal du readministrere 50 μl ketamin/xylazin ad gangen, indtil musen er helt bedøvet.
- Det nukleare farvestof forberedes ved fortynding 50 μL af Hoechst 33342 (10 mg/mL) med 315 μL 0,9% saltvand; den endelige koncentration er 37,5 mg/kg baseret på musens vægt (200 μL omtrentlig volumen). Når først musen er bedøvet, indsprøjtes Hoechst langsomt ved hjælp af en tuberkulin sprøjte gennem den retroorbitale venøse sinus.
Bemærk: Vent 1 – 2 min før du går videre til næste trin for at tillade musen til at acclimere til ændringen i cirkulerende volumen efter retro-orbital injektion. - Anbring en lille mængde smøremiddel over øjnene for at forhindre dem i at tørre ud.
2. mus kirurgi: Laparotomy at eksponere tarm slimhinde
- Lav en 2 cm lodret indsnit gennem huden og bughinden langs midterlinjen af den nedre del af maven for at eksterrialisere det område af tarmen, der skal være indpakket.
- Brug vinklede pincet til forsigtigt at trække cecum ud af bughulen og identificere det område af tyndtarmen, der skal indlagres. Vær omhyggelig med ikke at rive mesenteriske blodkar i løbet af denne proces. For at minimere potentielle skader eller blødning, undgå at snuppe eller klemme tarmen med pincet.
- Find et egnet område af tyndtarmen (2 – 3 cm) til billeddannelse, der indeholder minimal fæal indhold. Vend forsigtigt cecum og resterende tyndtarm ind i peritonealhulen, mens du forlader segmentet af renter eksternaliseret.
Bemærk: Undgå at punktere cecum eller forstyrre den mesenteriske vaskulatur under dette trin. - Placer to par pincet på hver side af den underliggende mesenterium mellem blodkarrene, og Gnid forsigtigt spidsen af pincet sammen for at skabe et hul i membranen (figur 1)22. Dette vil gøre det muligt for nålen at passere gennem mesenterien, når du lukker peritonealhulrummet under tarmen.
- Luk indsnittet, samtidig med at kredsløbet af tarmen eksteraliseres. Ved hjælp af vinklede pincetter og en buet, taper punkt nål fastgjort til en 5 cm sutur, trænge den ene side af peritoneum, gå gennem hullet i det foregående trin, og op gennem den anden side af peritonealdialyse foring. Placer en sutur i toppen, og en anden nær bunden af snittet.
Bemærk: Undgå at beskadige Vaskulaturen under dette trin. - Gentag denne proces for at lukke huden under tarm sløjfen ved at anbringe en sutur midt i indsnittet mellem de tidligere suturer i det underliggende peritoneum.
Bemærk: Det er vigtigt kun at eksterialisere det område, der skal indlagres. Dette vil reducere uvedkommende bevægelse under billedbehandling. Sørg for at undgå at binde de mesenteriske arterier. - Brug en elektrokauteri til at lave en perforerings linje langs den anti-mesenteriske grænse. Umiddelbart efter cauterisation, anvende et par dråber vand til overfladen af tarmen for at forhindre yderligere varme-induceret vævsskade. Blot med en Kimwipe for at fjerne resterende vand.
- Skær en lille horisontal spalte i den distale kant af det ætsende væv ved hjælp af Vannas saks og Fortsæt med at skære langs længden af den kauterisering linje mod den proksimale ende af det eksterialiserede vævs segment (ca. 1,5 cm i længden) for at eksponere slimhinde Overflade.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, skal du bruge pincet til forsigtigt at fjerne alt overskydende fækal indhold tilbage på den udsatte slimhinde overflade. - Dæk maven på musen med en fugtig Kimwipe for at forhindre vævet i at blive dehydreret. Transport musen til mikroskopet i et overdækket fartøj.
3. image erhvervelse af spinning disk Confocal Microscopy
- Der afpipetteres 150 μL 1 μM AlexaFluor 633 i HBSS på glas coveren i bunden af en 35 mm skål. Placer musen, så den åbne slimhinde overflade direkte kontakter coverslip.
- VIP mikroskop lederen tilbage, og Anbring musen på den coverglippede skål på billed stadiet i en foropvarmet inkubator. Alternativt, dække musen ved et varmetæppe for at opretholde kropstemperaturen.
- Start billedbehandlingssoftware. Den excitations intensitet og eksponeringstid for hver laser bør ikke overstige 10 – 15 mW eller 120 – 150 MS, henholdsvis for at undgå foto blegning og for at minimere intervallet mellem tidspunkter. Juster ramme gennemsnittet til "2", og Aktivér EM-forstærknings funktionen for at reducere baggrundsstøjen. Vælg 63x objektiv kalibrering for at sikre korrekt måling af pixelstørrelse.
Bemærk: De indstillinger, der er beskrevet ovenfor, er beregnet til at give en indledende reference, men vil variere afhængigt af de enkelte mikroskop konfigurationer. - Ved hjælp af 405 nm laser og 20x luft mål, visualisere kerner til at finde et felt af villi, der mangler mærkbar bevægelse eller drift af øjet. Undgå områder med artifaktuel bevægelse på grund af respiration, peristaltik eller hjerteslag.
- Ved hjælp af XY-scanningen skal du registrere XY-koordinaten for interessefeltet og skifte til glycerol Immersion 63X-målsætningen.
- Bekræft, at villi i det valgte felt er stabile ved at erhverve et live billede på 405 nm kanalen i op til 1 min.
- Mens du erhverver et levende billede på 405 nm kanal, justere fokus for at finde den ortogonale plan lige under den villøs tip. Erhverve Z-stakke starter fra lige under den villøs spids epitel ned i absorptive, indtil det er svært at løse kerner, omkring 15 – 20 μm, ved hjælp af et 1,5 μm trin.
Bemærk: Ved billeddannelse med tre kanaler (405, 488, 640 nm) ved hjælp af de ovenfor beskrevne eksponeringstider er det muligt at erhverve alle tre kanaler sekventielt med ca. 20 s intervaller. - Åbn softwaren i analyse tilstand, 3 – 5 min efter påbegyndelse af købet, for at bekræfte billedets stabilitet og γδ IEL motilitet. Fortsæt med at erhverve billeder for 30 – 60 min for hvert område af villi. Optag 2 – 3 felter for hver mus. Mens Imaging, overvåge musen hver 5 min.
Bemærk: Hvis anæstesi begynder at bære off, bruge pincet til forsigtigt skruff halsen af musen til at administrere 50 μL ketamin/xylazin ad gangen. Fortsæt med at overvåge anæstesi niveauer og re-administrere, når det er nødvendigt. - Det er ikke tilrådeligt at afbilde en enkelt mus i længere tid end 4 timer. Når billed erhvervelsen er færdig, ofrer musene ved cervikal dislokation efterfulgt af bilateral pneumothorax.
4.4D analyse af billeder
- Importer billedfiler direkte til 4D-gengivelses software.
- Opret individuelle flader til iels og lumen, og spor derefter overfladerne med tiden ved hjælp af parametrene beskrevet i tabel 1 som en indledende reference. For IELs, aktiver split rørende objekter ved hjælp af frø punkt diameter angivet.
- Brug den autoregressive sporings algoritme til at bestemme IEL motilitet. Selvom sporings algoritmen er relativt nøjagtig, er det bydende nødvendigt at inspicere spor for hver enkelt IEL. Hvis et spor er forkert, skal du rette det ved hjælp af funktionerne Afbryd og Tilslut under fanen Rediger spor .
- For at bestemme afstanden fra hver IEL til lumen, skal du vælge lumen overflade og udføre distance transformation funktion under Tool menu. Vælg uden for Surface, når du bliver bedt om det. Når den er beregnet, vil afstands transformationen blive vist som den fjerde kanal.
- Filtrer Intensitets min i den fjerde kanal for at vælge Γδ iels, der er inden for det laterale intercellulære rum (Lis). Denne værdi skal være tæt på 15 μm, baseret på højden af en søjleformede epitelial celle. Procentdelen af total γδ IELs inden for dette interval rapporteres som frekvensen af γδ IELs i LIS.
- For yderligere analyse, eksportere statistiske data, herunder: IEL spor hastighed, spor forskydning, spor rethed og spor længde. Alternativt kan du analysere data ved hjælp af Vantage modulet. Afhængigt af eksperimentet skal du anskaffe yderligere målinger fra de erhvervede data, herunder hviletider inden for LIS-eller IEL/epithelial-interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af intravital billeddannelse af TcrdEGFP reporter mus, har vi tidligere vist, at γδ IELs udviser en dynamisk overvågning adfærd, hvor de patruljerer epitel ved at migrere langs kælderen membran og ind i det laterale intercellulære rum (LIS) ved steady tilstand (figur 2, film 1).
Denne fremgangsmåde kan også bruges til at vurdere, hvordan hæmning af specifikke celle signalering veje og/eller receptorer påvirker γδ IEL migrerende adfærd. For eksempel er interleukin (Il)-15 et pleiotropisk cytokin, der er essentielt for γδ IEL homøostase23,24. For at afgøre om IL-15 signalering gennem IL-2Rβ receptor bidrager til kinetikken for γδ IEL motilitet ved Steady State, blev TcrdEGFP-reporter-musene i alderen 2 h efter administration af anti-IL-2Rβ antistof (TM-β1) eller isotype IgG2b-kontrol. De farvede spor angiver migrationstierne for individuelle γδ IELs i løbet af 30 min (figur 3a). Selv om hyppigheden af γδ IELs i LIS blev forøget hos mus behandlet med TM-β1 (figur 3a,B), udviste mere end 30% af disse γδ iels en tomgang (figur 3a,C). Tomgang γδ IELs blev defineret ved at pålægge øvre grænser for sporet rethed og spor forskydning længde. Denne tomgang fænotype blev bekræftet af en signifikant reduktion i både den øjeblikkelige hastighed og indespærring ratio af γδ IELs efter IL-2Rβ blokade i forhold til kontrol (figur 3D,E). Desuden har den inaktive γδ IELs længere hviletider og var oftere lokaliseret i LIS sammenlignet med motile γδ IELs (figur 3F).
Figur 1: Brug pincet til at oprette et hul i mesenterien. Anbring pincet på hver side af membranen for at skabe et hul til suturerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativt 3D-billede af γδ IELs i jejunum. En enkelt tidspunkt blev valgt fra en time-lapse video af taget af jejunal slimhinde af en TcrdEGFP reporter mus ved steady-state. γδ IELs er vist med grønt, kerner i hvidt og lumen i rødt. Skala stang = 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: hæmning af Il-2Rβ inducerer γδ IEL tomgang i det laterale intercellulære rum. Dette tal er blevet tilpasset fra "epithelial IL-15 er en kritisk regulator af γδ Intraepitelial lymfocyt motilitet i tarmslimhinden." af Hu, M. D. et al. 2018, J immunol, 201 (2), s. 747-756. 15 Copyright 2018 af American Association of immunmatologer, Inc. (a) time lapse-billeder, der viser migrerende gfp γδ iels inden for jejunal villøs epitel efter 2 timer behandling med 0,45 mg IgG2b eller TM-β1. Den motilitet af individuelle γδ IELs (grøn) i løbet af 30 min er vist med farvede spor. Kerner er vist i hvidt, og lumen er vist med rødt. Skala stænger = 20 μm. (B) hyppigheden af Γδ IELS i Lis (n = 3 mus pr. behandling, n = 6-7 videoer). C) procentdel af Γδ iels, der var inaktivt i IgG2b-eller TM-β1-behandlede mus. (D) øjeblikkelig hastighed (n = 13.299 og 9.600 tidspunkter). (E) spor indeslutnings forhold (n = 350 og 278 spor) vises. (F) afstand mellem tomgang og motile iels fra lumen. Mean + SEM er vist (+). * p < 0,05, * * p < 0,01, #p < 0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
| IEL | lumen | |
| Overflade detalje (μm) | 1,2 af | 1,5 af |
| Subtraktion i baggrunden (μm) | 1,67 af | 2 |
| Sæde diameter (μm) | 7,5 af | Nielsen |
| Filter: antal voxels | 250 af | 6.500 af |
| Tracking: Max afstand (μm) | 10 | 10 |
| Tracking: Max Gap | 2 | 2 |
Tabel 1: repræsentative indstillinger for genere ring γδ IEL og luminale "overflader" i Imaris. Disse indstillinger kan bruges som udgangspunkt ved generering og sporing af over flader på 488 nm-kanalen (IEL) og 640 nm-kanalen (lumen). Afhængigt af forsøgsbetingelserne kan det være nødvendigt at ændre disse indstillinger.
Film 1: Intravital billeddannelse af GFP γδ IEL-migrerende opførsel i muse jejunum. Time-lapse intravital mikroskopi af γδ IEL motilitet i jejunum fra en TcrdEGFP mus behandlet med 0,45 mg IgG2b. γδ IELs er vist med grønt, kerner i blåt og lumen i rødt. Skala bjælke, 20 μm. Frames blev indsamlet hver 30 s for ca 30 min. Movie er tilpasset fra Hu, M. D. et al. 201815. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udviklingen af intravitale mikroskopi teknikker har givet en hidtil uset mulighed for at observere reorganiseringen af subcellulære strukturer8,9,22, celle celle interaktioner12, 25 og celle migrerendeadfærd 13,14,15,16,26 i ellers utilgængelige væv. Der har været en generel mangel på værktøjer til at studere regulering og funktion af γδ iels in vivo18,27, og som følge heraf har brugen af intravital Imaging åbnet nye muligheder for undersøgelse vedrørende den molekylære regulering og funktionelle karakteristika for IEL-populationer13,14,15,16,20. der var tidligere formodning om, at γδ IELs var stationært i tarmslimhinden28. Men, yderligere analyse viste, at disse celler er meget dynamisk, men migrere langsommere end lymfocytter i sekundære lymfoide organer på grund af de stramme grænser af epitel rum13. Desuden har brugen af in vivo-billeddiagnostik givet yderligere indblik i den spatiale dynamik i IEL-overvågnings adfærden, herunder kryds stilken mellem IELs og epitelceller, der driver γδ IEL motilitet og funktion13, 14 ud af , 15 af , 16. analysen af denne migrations adfærd har defineret nye målinger for IEL-cellulære responser, som ikke ville være nøjagtigt kvantificerbare ved hjælp af ex vivo-eller in vitro-eksperimenter.
Gennem hele proceduren, er det vigtigt kontinuerligt at overvåge sedation niveau af musen. Kontinuerlig administration af gasanæstesi (isofluran) kan anvendes som et alternativ til ketamin/xylazin. Når laparotomi udføres, er det afgørende at holde Neuro vaskulær forsyning intakt for at give en nøjagtig vurdering af biologi. Binding off mesenteriske blodkar kan føre til hypoxi og gradvis nekrose af vævet. I modsætning hertil vil adskillelse af blodkar resultere i blødning i den udsatte slimhinde, som kan reducere fluorescens intensitet af nogle kanaler under billeddannelse. Hvis IELs udvikle en afrundet morfologi og stoppe med at bevæge sig under billed erhvervelse, kan dette skyldes en lille nedgang i kropstemperaturen af musen. Placering af Temperaturføleren tæt på mikroskopet sikrer, at temperaturen på den eksponerede slimhinde holdes på 37 °C. Det kan være nødvendigt at hæve temperaturen til 38 – 39 °C afhængig af temperatur stabiliteten i inkubations kammeret.
Når musen er blevet placeret på mikroskopet scenen, kan det være svært at identificere områder af villi, der mangler overdreven bevægelse på grund af peristaltik eller sammentrækning af tilstødende blodkar. Hvis dette sker, skal du flytte musen i skålen eller manipulere musens flanker eksternt i et forsøg på at stramt pakke villi mod coverslip. Alternativt kan billedfeltet blive mere stabilt et par minutter efter at have placeret musen på scenen. Hvis der er gradvis XY drift under købet, kan dette korrigeres ved hjælp af drift korrektion i 4D rendering software ved at vælge 4 – 5 kerner, der er til stede i forskellige steder i billedet i hele tidsforløbet og sporing af en spot for hver Kernen. Når pletterne er blevet genereret, skal du vælge korrekt drift undermenuen Rediger spor for at korrigere translationel drift. Det er vigtigt, at drift korrektion foretages forud for enhver anden analyse, da dette vil ændre koordinaterne bruges til at spore andre objekter i billedet.
Selv om to-photon Laserscanning mikroskopi giver mulighed for en bred dybde af billedbehandling, der er nyttig til at trænge dybt ind i væv29, spinning disk laser confokal mikroskopi har sine egne unikke fordele for intravital Imaging applikationer. To-photon Laserscanning mikroskopi er afhængig af fotomultiplikatorrør rør (PMT), der kan detektere kun én pixel ad gangen med en kvante effekt på 40 – 50%. I modsætning hertil bruger spinning disk confokal laser mikroskopi en elektron multiplikation (EM) CCD kamera til direkte at detektere op til en million pixels samtidig, hvilket øger kvante effektiviteten til 95%. Som et resultat, potentialet for foto blegning og foodamage er signifikant reduceret, mens den øgede erhvervelse hastighed maksimerer tidsmæssig opløsning, når billeddannelse celle migration i mere overfladiske væv. Uanset billedbehandlings modalitet er denne kirurgiske procedure ideel til at afsløre tarmslimhinden til billeddannelse på et inverteret mikroskop.
Med den stigende tilgængelighed af muse stammer, der udtrykker fluorescerende reportere, fluorescerende mærkede sonder eller lysstofrør stammer af mikroorganismer, der er blevet genereret i et væld af bølgelængder, kombinationerne til at evaluere in vivo intestinal svar i realtid er uendelige. Ikke alene kan intravital billeddannelse give ny indsigt i celle-celle og Host-Microbe interaktioner, men det kan også fremhæve dynamiske molekylære og cellulære processer i både epitelial og immunceller under homeostatiske eller patologiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grants, Busch Biomedical Grant (KLE). Vi takker Madeleine hu for hendes hjælp til at redigere manuskriptet og levere de data, der er vist i de repræsentative resultater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
