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Medicine

अल्ट्रासोनिक-संवर्धित प्राथमिक वयस्क Fibroblast अलगाव

doi: 10.3791/59858 Published: July 29, 2019

Summary

हम एक आसान, तेज और विश्वसनीय तरीके से प्राथमिक वयस्क फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, शुरुआती द्वारा प्रदर्शन करने योग्य (उदा., छात्र)। प्रक्रिया प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट्स प्राप्त करने के लिए अल्ट्रासोनिक तरंगों के साथ एंजाइमी ऊतक पाचन और यांत्रिक आंदोलन को जोड़ती है। प्रोटोकॉल आसानी से विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं (उदा., मानव ऊतक) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

प्राथमिक वयस्क फाइब्रोब्लास्ट फाइब्रोसिस, फाइब्रोब्लास्ट बातचीत और शरीर के सभी ऊतकों में सूजन का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गए हैं। चूंकि प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट्स मायोफाइब्रोब्लास्ट भेदभाव या जीर्णता प्रेरण के कारण अनिश्चित काल तक विभाजित नहीं हो सकते हैं, इसलिए नई संस्कृतियों को नियमित रूप से स्थापित किया जाना चाहिए। हालांकि, एक विश्वसनीय अलगाव प्रोटोकॉल और प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट अलगाव के विकास की प्रक्रियाओं के दौरान दूर करने के लिए कई बाधाएं हैं: विधि की कठिनाई की डिग्री (विशेष रूप से शुरुआती के लिए), जीवाणु संदूषण का खतरा, प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब तक आवश्यक समय, और बाद में सेल की गुणवत्ता और व्यवहार्यता. इस अध्ययन में, एक तेजी से, विश्वसनीय और आसान करने के लिए सीखने प्रोटोकॉल को अलग करने और संस्कृति माउस दिल, फेफड़े, जिगर और गुर्दे एंजाइमी पाचन और अल्ट्रासोनिक आंदोलन के संयोजन से प्राथमिक वयस्क फाइब्रोब्लास्ट्स प्रदान की जाती है।

Introduction

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फाइब्रोब्लास्ट्स फ्लैट, कई स्टेलेट प्रक्रियाओं और एक व्यापक किसी न किसी एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम1,2के साथ धुरी के आकार की कोशिकाओं रहे हैं। एक औसत फाइब्रोब्लास्ट 30 - 100 डिग्री मी के मापता है और इसका जीवन काल 57 - 3 दिन1,3है . मानव फाइब्रोब्लास्ट्स की औसत कोशिका चक्र अवधि संस्कृति की स्थितियों4के आधार पर 16 - 48 एच से होती है . वहाँ सबूत है कि प्रतिकृति क्षमता और सुसंस्कृत प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट्स के कार्यात्मक गुणवत्ता नकारात्मक दाता उम्र के साथ संबंधित है, सुझाव है कि युवा दाताओं (पशु या रोगियों) यदि संभव हो तो पसंद किया जाना चाहिए5,6 .

फाइब्रोब्लास्ट्स सबसे स्तनधारी शरीर के ऊतकों के एक प्रमुख सेल प्रकार का गठन। उनके सर्वव्यापी उपस्थिति के बावजूद, फाइब्रोब्लास्ट्स की आणविक पहचान अभी भी एक चुनौती7है. भ्रूणीय विकास8के दौरान विभिन्न स्रोतों से ऊतकों और अंगों के विकास के लिए पलायन . इस कारण से, वहाँ मार्कर प्रोटीन की एक बहुतायत है कि फाइब्रोब्लास्ट में पाया जा सकता है जबकि अद्वितीय मार्कर प्रोटीन, जो हर फाइब्रोब्लास्ट आबादी में मौजूद हैं और फाइब्रोब्लास्ट के लिए विशेष, अभी भी याद कर रहे हैं. इस प्रकार, कई मान्यता प्राप्त मार्करों की अभिव्यक्ति पैटर्न आमतौर पर फाइब्रोब्लास्ट की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है। सबसे मान्यता प्राप्त मार्करों में vimentin, मानव फाइब्रोब्लास्ट सतह प्रोटीन (hFSP), डिस्कोडिन डोमेन रिसेप्टर 2 (DDR2) और अल्फा चिकनी मांसपेशी actin (जेडएसएमए) हैं.

फाइब्रोब्लास्ट्स प्रमुख कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) उत्पादक सेल प्रकार हैं। इस तरह, फाइब्रोब्लास्ट एक व्यवस्थित ऊतक वास्तुकला को बनाए रखने और पड़ोसी कोशिकाओं1के लिए यांत्रिक सहायता प्रदान करते हैं। ECM संश्लेषण और गिरावट के बीच संतुलन एक अच्छी तरह से विनियमित प्रक्रिया है. संश्लेषण की ओर बदलाव अत्यधिक ECM जमाव की शुरुआत को चिह्नित करता है, जो, यदि समाप्त नहीं किया जाता है, फाइब्रोसिस की ओर जाता है। फाइब्रोसिस मायोफाइब्रोब्लास्ट्स द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जो आणविक और फीनोटाइपिक परिवर्तनों के दौर से गुजर रहे सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट्स से उत्पन्न होती है। मायोफाइब्रोब्लास्ट्स की एक पहचान ईसीएम और साइटोकिन्स का अधिक स्राव है और व्यवस्थितव्यवस्था की अभिव्यक्ति 9 .

प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट फाइब्रोसिस पर ध्यान केंद्रित हाल ही में अनुसंधान की सुर्खियों में रहा है, ऊतक सूजन और फाइब्रोब्लास्ट कैंसर सेल बातचीत10,11. हालांकि, प्रभावी ढंग से स्वास्थ्य और रोग में फाइब्रोब्लास्ट गुणों का अध्ययन करने के लिए, यह एक नियमित आधार पर व्यवहार्य प्राथमिक वयस्क फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए आवश्यक है। फाइब्रोब्लास्ट्स12,13,14को अलग करने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं . फाइब्रोब्लास्ट अलगाव के तीन प्रमुख तरीके ऊतक खंड12, एंजाइमी ऊतक पाचन15, और खोखले अंगों के एंजाइमी अपफ्यूजन9,13,16से वृद्धि कर रहे हैं . वृद्धि का लाभ एंजाइमी सेल गिरावट के बिना एक कोमल अलगाव प्रक्रिया है. दूसरी ओर, outgrowth संस्कृतियों आमतौर पर लंबे समय तक संस्कृति अवधि की आवश्यकता होती है जब तक कोशिकाओं प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आम एंजाइमी पाचन तेजी से है, लेकिन अन्य सेल प्रकार (जैसे, endothelial कोशिकाओं) या आंदोलन की प्रक्रिया में बैक्टीरिया है, जो यंत्रवत् ऊतक भंग करने के लिए आवश्यक है के साथ संदूषण का खतरा भालू. इसके अलावा, इन तरीकों अक्सर विस्तृत कर रहे हैं और समय और सीखने के लिए कौशल की आवश्यकता होती है.

अनुसंधान में प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट्स के महत्व के बारे में, वहाँ अभी भी एक जल्दी, सादगी और विश्वसनीयता के मामले में मौजूदा सेल अलगाव दृष्टिकोण का अनुकूलन करने की जरूरत है. यहाँ, एक उपन्यास अल्ट्रासोनिक आधारित एंजाइमी फाइब्रोब्लास्ट अलगाव विधि उच्च गुणवत्ता कोशिकाओं को देने प्रदान की जाती है।

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Protocol

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निम्नलिखित प्रोटोकॉल Technische Universit-t ड्रेसडेन, जर्मनी (फाइल नंबर: T 2014/4) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंतरराष्ट्रीय स्तर पर स्वीकार किए जाते हैं पशु देखभाल दिशा निर्देशों (FELASA)17के संस्थागत पशु देखभाल दिशा निर्देशों के बाद . चित्र 1 कक्ष आइसोलेशन प्रक्रिया को विज़ुअलाइज़ करता है.

1. सेटअप, सामग्री और मीडिया की तैयारी

  1. सेल संस्कृति मध्यम, पीबीएस समाधान, collagenase मिश्रण शेयर समाधान तैयार (पुनर्गठन 50 बाँझ ultrapure पानी के 12 एमएल में lyophilized collagenase मिश्रण के मिलीग्राम), और 0.25% trypsin समाधान.
  2. मध्यम, पीबीएस और ट्रिप्सिन समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  3. अल्ट्रासोनिक पानी स्नान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रीहीट करें।
  4. डिसंक्रमित संदंश, एक स्टेनलेस स्टील स्पैटुला, स्कैल्पल्स (2x स्केलपेल्स प्रति अंग) और 70% इथेनॉल के साथ 2 ग्लास बीकर्स और इन सामग्रियों को सेल कल्चर हुड के नीचे रखें।
  5. 70% इथेनॉल और बाँझ पानी या पीबीएस समाधान के साथ अन्य के साथ एक बीकर भरें। इन बीकरों को प्रत्येक अंग जुलूस के बाद यंत्र को कीटाणुरहित और धोने की आवश्यकता होती है।
  6. जगह बाँझ 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब गीला बर्फ पर ठंड पीबीएस युक्त. ट्यूबों की संख्या अंगों की संख्या पर निर्भर करता है जो आप फाइब्रोब्लास्ट ्स-वे से अलग करना चाहते हैं।

2. माउस विच्छेदन और अंग हटाने

  1. दस्ताने के दो जोड़े एक दूसरे के ऊपर पहनें, तो पहली जोड़ी के रूप में जल्द ही हटाया जा सकता है के रूप में जानवर विच्छेदन किया गया है.
    नोट: यह प्रक्रिया जानवरों के फर और त्वचा से बैक्टीरिया को अंगों पर फैलने से रोकती है।
  2. माउस (उदा., ग्रीवा विस्थापन) और एक polystyrene पैड करने के लिए हर अंग को सुइयों के साथ शव पिन.
  3. 70% इथेनॉल स्प्रे का उपयोग कर माउस शव को संक्रमित करें। सुनिश्चित करें कि फर इथेनॉल में भिगो याफिर बाल घूमता नहीं होगा.
  4. शल्य चिकित्सा संदंश और atraumatic कैंची का उपयोग कर यूरोजेनिक पथ के ठीक ऊपर फर कट. प्रारंभिक चीरा के बिंदु से गर्दन (3 - 4 सेमी) तक मध्य रेखा के साथ त्वचा को काटें और अंगों में राहत कटौती जोड़ें।
    चेतावनी: जीवाणु संदूषण से बचने के लिए इस कदम पर मांसपेशियों की परत को छिद्रित न करें!
  5. पेट की गुहा को कवर पेशी के लिए इष्टतम पहुँच है करने के लिए polystyrene फोम पैड के लिए त्वचा पिन.
  6. 70% इथेनॉल का उपयोग करके दो बार पेट की पेशी को संक्रमित करें। अगले चरण पर जारी रखने से पहले इथेनॉल को सूखने दें।
  7. दस्ताने की पहली जोड़ी निकालें. संदंश और कैंची के एक नए, बाँझ सेट का प्रयोग करें।
  8. धीरे पसंद के अंगों को हटाने के लिए शल्य कैंची के साथ मांसपेशियों की परत incising द्वारा पेट गुहा और छाती खोलें। इसलिए, अंग को सर्जिकल संदों के साथ धीरे से पकड़ें (अंग को छेद न करें, कम से कम दबाव का उपयोग करें) और अंग पर प्रवेश बिंदु के पास रक्त वाहिकाओं को कैंची से काटें।
  9. अंगों को ठंडे पीबीएस युक्त बाँझ ट्यूबों में डाल दिया। ट्यूबों को कसकर बंद कर दें। कदम 3.1 के साथ जारी रखने तक गीला बर्फ पर ट्यूब रखें.

3. ऊतक खनन, पाचन और सेल निष्कर्षण

  1. बाँझ सेल संस्कृति हुड के तहत ट्यूब स्थानांतरण.
    चेतावनी: दस्ताने की एक ताजा जोड़ी पहनें और उन्हें हुड के नीचे स्थानांतरित करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ ट्यूब कीटाणुरहित!
  2. बाँझ संदंश का उपयोग कर 15 एमएल ट्यूब से अंग बाहर ले लो. अंग को एक बाँझ 6 सेमी पेट्री डिश के आधे हिस्से पर रखें और अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए अंग को पीबीएस के साथ संक्षेप में धो लें। पेट्री डिश की दूसरी छमाही में अंग स्थानांतरण, अतिरिक्त पीबीएस निकालें.
  3. दो बाँझ स्केलपेल्स का उपयोग करके ऊतक को छोटा करना. शेष ऊतक के टुकड़े 1 से बड़ा नहीं होना चाहिए - 2 मिमी.
  4. कीमा बनाया ऊतक बाँझ spatula का उपयोग कर एक नया बाँझ 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण और 0.25% trypsin समाधान के 2 एमएल जोड़ें. ट्यूब को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें।
  5. 10 s के लिए धीरे से ट्यूब भंवर (सिरका 1400/
  6. 4 एमएल एफसीएस युक्त सेल संस्कृति माध्यम (Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) जोड़कर सेल संस्कृति हुड के तहत trypsin प्रतिक्रिया बंद करो, उदा.)
  7. हृदय या फेफड़ों के ऊतकों वाले प्रत्येक ट्यूब के लिए कोलैडेज़ मिश्रण समाधान के 250 डिग्री एल जोड़ें और गुर्दे या जिगर के लिए 100 डिग्री सेल्सियस, क्रमशः।
  8. एक अल्ट्रासोनिक पानी स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में ट्यूबों प्लेस और 10 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक sonicator सक्रिय करें।
    नोट: अल्ट्रासोनिक पानी स्नान इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया 35 kHz और 320 डब्ल्यू की एक अधिकतम शक्ति की एक ऑपरेटिंग आवृत्ति है।
  9. 10 s के लिए धीरे से ट्यूब (सिरका 1400/
  10. 10 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक पानी स्नान में फिर से ट्यूब प्लेस।
  11. भंवर धीरे (सिरका 1400/
  12. 70% इथेनॉल के साथ ट्यूबों को संक्रमित और बाँझ सेल संस्कृति हुड के तहत उन्हें हस्तांतरण।
  13. एक नया बाँझ 15 एमएल ट्यूब में एक 40 डिग्री मीटर जाल के साथ समाधान फ़िल्टर.
  14. 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रीफ्यूज।
  15. सुपरनेंट निकालें और ताजा माध्यम के 1 एमएल में गोली को फिर से करें।
  16. कोशिकाओं को एक उपयुक्त सेल कल्चर पोत (उदा., 6-वेल प्लेट) में स्थानांतरित करें और पोत को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2में रखें।
  17. अगले दिन, मध्यम निकालें, पीबीएस के साथ 3 बार धो लें, फिर ताजा माध्यम जोड़ें (जोड़ी मात्रा पसंद के सेल संस्कृति पोत पर निर्भर करती है, 6-वेल प्लेट आदि के प्रति 2 एमएल)।
  18. हर दूसरे दिन माध्यम बदलें.
    नोट: Fibroblasts 90% के ऑप्टिकल संगम तक पहुँचने के बाद विभाजित किया जा सकता है (आमतौर पर 5-7 दिनों के बाद).

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Representative Results

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ठोस murine ऊतक से वयस्क फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल की क्षमता का प्रदर्शन किया गया था. व्यवहार्य फाइब्रोब्लास्ट्स प्राप्त किए गए थे जिनका उपयोग बाद के प्रयोगों जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला या प्रसार प्रयोगों के लिए किया जा सकता है (चित्र 2D-F, चित्र 5A)।

वयस्क फाइब्रोब्लास्ट्स कई सेलुलर प्रक्रियाओं के साथ फ्लैट धुरी के आकार की कोशिकाओं है कि आम तौर पर monolayers12,18में विकसित होते हैं। प्राप् त परिणाम इन आकृतिक पहचानों को प्रतिबिंबित करते हैं तथा विभिन्न अंगों से फाइब्रोब्लास्ट जनसंख्या में भिन्न-भिन्न रूपात्मक अंतर दर्शाते हैं (चित्र 2)। वृक्क फाइब्रोब्लास्ट विशेष रूप से छोटे थे और हृदय, फुफ्फुसीय या यकृत फाइब्रोब्लास्ट्स की तुलना में उच्च घनत्व पर वृद्धि हुई (चित्र 2)।

चित्रा 3 के ऊपरी पैनल अलगाव के बाद हृदय फाइब्रोब्लास्ट के उदाहरण के माध्यम से सेल परिपक्वता और प्रसार की प्रक्रिया को दर्शाया गया है। कोशिकाओं को उच्च प्रसार दर प्रदर्शित की ऑप्टिकल संगम तक पहुँचने के लिए gt;90% के बाद 6 - 1 दिन. संगम फाइब्रोब्लास्ट्स के इस स्तर पर18 को बढ़ाना बंद करो और कोशिकाओं को विभाजित किया जा सकता है, 0.25% trypsin का उपयोग कर, और बाद में संस्कृति या प्रयोगों के लिए बड़ा सेल संस्कृति फ्लास्क को स्थानांतरित.

बेसल सेल संस्कृति की स्थिति के तहत, फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों फाइब्रोब्लास्ट और myofibroblasts के एक छोटे अनुपात से मिलकर बनताहै 19,20. फाइब्रोब्लास्ट की पहचान करने के लिए कई स्वीकृत मार्कर हैं। डीडीआर2 और विमेन्टिन व्यंजक सामान्य फाइब्रोब्लास्ट मार्कर हैं और संगठित माइक्रोफिलामेंट की अभिव्यक्ति मायोफाइब्रोब्लास्ट विभेद को इंगित करती है7,9. हृदय, गुर्दे, यकृत तथा फेफड़ों में $SMA फिलामेंट बहुतायत के लिए विशिष्ट $SMA microfilaments और प्रतिनिधि अवलोकन छवियों के साथ विभेदित मायोफाइब्रोब्लास्ट की एक प्रतिनिधि छवि चित्र 4में प्रस्तुत की गई है। जबकि केवल 20 - 30% पृथक और बाद में सुसंस्कृत कोशिकाओं ने व्यवस्थित रूप से व्यवस्थित -SMA microfilaments व्यक्त किया (myofibroblast भेदभाव का संकेत), सभी कोशिकाओं ($ 99%) Vimentin और DDR2 के लिए सकारात्मक थे (चित्र 3, कम पैनल).

Figure 1
चित्र 1 . फाइब्रोब्लास्ट अलगाव प्रक्रिया का अवलोकन. के बाद ब्याज के अंगों माउस से हटा दिया गया है, वे बाँझ scalpels का उपयोग कर एक सेल संस्कृति हुड के तहत कीमा बनाया जाता है. बाद में, कीमा बनाया ऊतक 5 मिनट के लिए 0.25% trypsin समाधान करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है। पहले पाचन के बाद, collagenase मिश्रण समाधान जोड़ा जाता है और ट्यूब37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। निस्पंदन और अपकेंद्रण के बाद, सेल गोली एक उपयुक्त सेल संस्कृति पकवान में स्थानांतरित किया जा सकता है. कम से कम 8 एच संलग्न करने के बाद, संस्कृतियों एरिथ्रोसाइट्स और मलबे को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोया जाता है। अंत में, ताजा माध्यम (डीएमईएम, 15% एफसीएस, 1% पेनिसिलिन/ Servier स्मार्ट चिकित्सा कला की छवियाँ आंकड़ा (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/) बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . प्राथमिक murine फाइब्रोब्लास्ट प्राथमिक संस्कृति के 7 दिनों के बाद ठोस अंगों से अलग. क) कार्डिएक फाइब्रोब्लास्ट्स। बी) पल्मोनरी फाइब्रोब्लास्ट्स। सी) गुर्दे fibroblasts. डी) यकृत फाइब्रोब्लास्ट्स। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर DMEM (15% एफसीएस, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पीएस)) में सुसंस्कृत किया गया था। 10x आवर्धन और 5.6x ऑप्टिकल कैमरा ज़ूम इन छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट की पहचान। ए - सी) अनुलग्नक और 4 दिनों के लिए कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स के विकास। धोने और मध्यम परिवर्तन के बाद संलग्न फाइब्रोब्लास्ट्स उनके विशिष्ट आकार और proliferate विकसित. कोशिकाओं DMEM में सुसंस्कृत थे (15% FCS, 1% पुनश्च). D - F) फाइब्रोब्लास्ट मार्करों के लिए संस्कृति के 7 दिनों के बाद प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट्स की इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला छवियों [SMA (डी), DDR2 (ई) और Vimentin (एफ) के लिए। नाभिक DAPI (नीले) के साथ दाग रहे थे. प्राथमिक एंटीबॉडी (सिग्मा-Aldrich) 1% बीएसए समाधान में 1:200 पतला किया गया ($SMA: A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). Alexa-Fluor 488 माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया था. पैमाने सलाखों के ऊपर संकेत लंबाई के बराबर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . $SMA microfilament बहुतायत के लिए प्रतिनिधि इम्यूनोसाइटोकेमिकल छवियों। ए) एक ठेठ मायोफिब्रोब्लास्ट प्रदर्शित किया जाता है (मैग्नीफिकेशन: 20x). बी - ई) दिल (बी), गुर्दे (सी), जिगर (डी) और फेफड़ों (ई) (मैग्निफिकेशन: 10x) के लिए प्रतिनिधि SMA अवलोकन छवियों। सफेद वृत्त प्रतिनिधि कोशिकाओं को इंगित करते हैं जिन्हें मायोफीब्रोब्लास्ट माना जाता था। नाभिक DAPI (नीले) के साथ दाग रहे थे. प्राथमिक एंटीबॉडी 1% बीएसए समाधान में 1:200 पतला किया गया था ($SMA: A5228). Alexa-Fluor 488 माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया था. पैमाने सलाखों के ऊपर संकेत लंबाई के बराबर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 . Murine फाइब्रोब्लास्ट्स और इन विट्रो सेनेस विकास की प्रसार दर। क) संस्कृति के 7 और 14 दिनों के बाद निर्धारित murine फाइब्रोब्लास्ट्स के प्रसार की दर. कोशिकाओं काटा और संबंधित समय बिंदुओं पर एक Buerker कक्ष के साथ गिना गया. परिणाम माध्यम के 1 एमएल में कक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। बी) सेनेस का निर्धारण जेड-गैलैक्टोसिडेस (सज ने हरा) की उपस्थिति से किया जाता है। सेन्सेंट कोशिकाओं को श्वेत वृत्तों के साथ दर्शाया जाता है। स्केल बार 50 डिग्री मी के बराबर होता है। परिणाम मतलब के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं - SEM. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

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अमर फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों की तुलना में, प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट कई फायदे प्रदान करते हैं। वे उच्च गुणवत्ता और मात्रा में प्रभावी ढंग से अलग लागत किया जा सकता है. इसके अलावा, प्राथमिक संस्कृतियों कई व्यक्तियों, जो प्राप्त परिणामों की विश्वसनीयता बढ़ जाती है और केवल सेल संस्कृति कलाकृतियों का अध्ययन करने की संभावना कम हो जाती है से कोशिकाओं का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करते हैं. नई प्राथमिक संस्कृतियों की सतत पीढ़ी आनुवंशिक परिवर्तनों को रोकती है जो आमतौर पर21बार - बार गुजरने के बाद होती है . इसके अतिरिक्त, सेलुलर जीर्णता22,23 या वृद्धि हुई myofibroblast भेदभाव उच्च मार्ग20पर संस्कृतियों में अधिक बार होते हैं. कम मार्ग (2-3) में, बेसल मायोफिब्रोब्लास्ट गिनती लगभग 20 - 30% (डेटा नहीं दिखाया गया) था और केवल 2.89% कोशिकाओं को $-गैलैक्टोसिडेस अभिव्यक्ति के आधार पर संवेदनशील माना जाता था (चित्र 5बी)। इस कारण से, यह अधिकतम 5 बार करने के लिए संस्कृतियों को पारित करने के लिए और उन्हें इसके बाद की जगह की सिफारिश की है. यह पूरे प्रयोगों में विश्वसनीय और प्रतिकृति परिणामों की गारंटी देता है। इष्टतम फाइब्रोब्लास्ट विकास और प्रसार सेल संस्कृति माध्यम के साथ प्राप्त किए गए थे जिसमें 10% के बजाय 15% एफसीएस शामिल थे। यह पहले पारित होने के बाद एक मजबूत फाइब्रोब्लास्ट उपज और अच्छी सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित किया।

इस प्रोटोकॉल गति और कठिनाई की डिग्री के मामले में मौजूदा तकनीकों का पूरक है. प्रजातियों और ऊतकों के आधार पर, जब तक फाइब्रोब्लास्ट की पर्याप्त मात्रा12,24को काटा जा सकता है , तब तक कि बाहर की तकनीकों को 10से21 दिनों के बीच की आवश्यकता होती है . दूसरी ओर Langendorff-perfusion तेजी से है (और lt;5 ज) लेकिन अधिक मैनुअल कौशल और प्रशिक्षण की आवश्यकता है. वृद्धि के तरीकों की तुलना में12,24 या फाइब्रोब्लास्ट अलगाव Langendorff-perfusion16के supernatant से, इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से शुरुआती एक बहुत ही कम करने के बाद प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम करने का अवसर प्रदान करता है प्रशिक्षण अवधि (2 - 3 अलगाव) उच्च यांत्रिक कौशल या तकनीकी प्रयास की आवश्यकता के बिना। गैर-फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं (जैसे, एंडोथेलियल कोशिकाओं) के साथ संदूषण नगण्य था क्योंकि उनके उच्च प्रसार दर25के कारण संस्कृतियों में सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट तेजी से अन्य कोशिका प्रकारों को बढ़ाते हैं। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल स्पष्ट निर्देश देता है जो जीवाणु संदूषण से बचने में मदद करता है, जो प्राथमिक murine कोशिकाओं के साथ काम करने में एक प्रमुख समस्या है। यहाँ, संदूषण से बचने के लिए दो महत्वपूर्ण कदम की पहचान की गई. पहले एक अंग हटाने है. दस्ताने और शल्य चिकित्सा उपकरणों फर और त्वचा को हटाने के बाद नहीं बदल रहे हैं, तो रोडेंट फर बैक्टीरिया आसानी से अंगों को स्थानांतरित किया जा सकता है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम अलगाव प्रक्रिया ही है. कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से उनके ऊतक आला से हटा दिया जाना है. लैंगेन्डॉर्फ-परफ्यूजन के संदर्भ में यह द्रव की सतत धारा द्वारा प्राप्त किया जाता है। अन्य तकनीकों चुंबकीय सरगर्मी सलाखों या मिलाते हुए तरीकों का उपयोग करें. विशेष रूप से, अल्ट्रासोनिक तरंगों द्वारा चुंबकीय सरगर्मी सलाखों के प्रतिस्थापन स्टरस्टर और ऊतक lysate के बीच शारीरिक संपर्क से बचने के द्वारा जीवाणु संदूषण के जोखिम को कम कर देता है। अल्ट्रासोनिक पानी स्नान का एक अतिरिक्त लाभ ट्यूबों के लिए गर्मी का भी वितरण है, जिससे एंजाइमों के लिए इष्टतम काम कर रहे तापमान प्रदान करते हैं।

अंत में, इस प्रोटोकॉल दोनों उन्नत और प्रारंभिक चरण के शोधकर्ताओं के लिए आदर्श है कि प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए एक त्वरित, विश्वसनीय और प्रतिकृति विधि प्रदान करता है. इस विधि तकनीक है कि स्वास्थ्य और रोग में फाइब्रोब्लास्ट समारोह की एक बेहतर समझ के लिए योगदान कर सकते हैं की मौजूदा स्पेक्ट्रम के लिए एक उपयोगी इसके अतिरिक्त है.

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Disclosures

घोषणा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए सुश्री रोमी केम्पे और श्रीमती एनेट ओपिट्ज को धन्यवाद देते हैं। हम भी आईटी समर्थन के लिए श्री ब्योर्न Binnewerg धन्यवाद. यह काम एक से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था) F]derkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsf]rderprogramm f]r Frauen", चिकित्सा के संकाय कार्ल गुस्ताव ड्रेसडेन और सी) अन्य Kr$ner-Forschungskol (EKF) संकाय के कार्ला कारस ड्रेसडेन. हम धन और समर्थन के लिए आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T4049-100ML
Antibiotics Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA Gibco LS15140148  Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 51023608 HeraSafe KSP15
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 50049176 BBD 6220
Cell culture plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA depends on vessel 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany 20727400 BVC professional suction
Cell strainer (mesh) Corning, Tewksbury, USA 431750 40 µm Nylon
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 75007213 Megafuge 8R
Cordless pipetting controller Hirschmann, Eberstadt, Germany 9907200 Pipetus
Disposable pipette tips Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel Myco Medical, Cary, USA n.a. Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 41965-062 High glucose
Eppendorf tubes Eppendorf, Hamburg, Germany  depends on volume 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F2442-50ML
Collagenase blend Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5401020001 Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D8537-500ML 500 mL
Senescence detection kit Abcam, Cambridge, UK ab65351
Shaker/ Vortex IKA, Staufen im Breisgau, Germany n.a. MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Falcon 352095 BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany 312 Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic) Aesculap AG, Tuttlingen, Germany NR 82
Surgical scissors  Aesculap AG, Tuttlingen, Germany eq 1060.09
Surgical forceps Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BD577

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References

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अल्ट्रासोनिक-संवर्धित प्राथमिक वयस्क Fibroblast अलगाव
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Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).More

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).

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