Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

doi: 10.3791/59858 Published: July 29, 2019

Summary

Presentiamo un protocollo per isolare i fibroblasti adulti primari in modo semplice, veloce e affidabile, performabile dai principianti (ad esempio, gli studenti). La procedura combina la digestione del tessuto enzimatico e l'agitazione meccanica con onde ultrasoniche per ottenere fibroblasti primari. Il protocollo può essere facilmente adattato a specifiche esigenze sperimentali (ad esempio, tessuto umano).

Abstract

I fibroblasti adulti primari sono diventati uno strumento importante per studiare la fibrosi, le interazioni con fibroblasti e l'infiammazione in tutti i tessuti del corpo. Poiché i fibroblasti primari non possono dividersi a tempo indeterminato a causa della differenziazione del miofibroblasto o dell'induzione della senescenza, è necessario stabilire regolarmente nuove culture. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli da superare durante i processi di sviluppo di un protocollo di isolamento affidabile e di isolamento fibroblasto primario stesso: il grado di difficoltà del metodo (soprattutto per i principianti), il rischio di contaminazione batterica, il tempo necessario fino a quando i fibroblasti primari possono essere utilizzati per gli esperimenti, e la successiva qualità cellulare e vitalità. In questo studio, viene fornito un protocollo veloce, affidabile e facile da imparare per isolare e coltura fibroblasti adulti primari dal cuore del topo, polmone, fegato e rene che combinano la digestione enzimatica e l'agitazione ultrasonica.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I fibroblasti sono cellule piatte a forma di mandrino con molteplici processi stellati e un ampio reticolo endoplasmico ruvido1,2. Un fibroblasto medio misura 30 - 100 m e ha una durata di vita di 57 x 3 giorni1,3. La durata media del ciclo cellulare dei fibroblasti umani varia da 16 a 48 h a seconda delle condizioni di coltura4. È dimostrato che la capacità replicativa e la qualità funzionale dei fibroblasti primari coltivati sono correlatrici negativamente con l'età del donatore, suggerendo che i donatori più giovani (animali o pazienti) dovrebbero essere preferiti, se possibile,5,6 .

I fibroblasti costituiscono un tipo di cellula predominante della maggior parte dei tessuti del corpo dei mammiferi. Nonostante la loro presenza onnipresente, l'identificazione molecolare dei fibroblasti è ancora una sfida7. I fibroblasti migrano verso lo sviluppo di tessuti e organi provenienti da diverse fonti durante lo sviluppo embrionale8. Per questo motivo, c'è una pletora di proteine marcatore che possono essere trovate nei fibroblasti, mentre le proteine marcatore uniche, che sono presenti in ogni popolazione di fibroblasti ed esclusive per i fibroblasti, sono ancora mancanti. Pertanto, i modelli di espressione di diversi marcatori riconosciuti sono di solito utilizzati per identificare i fibroblasti. Tra i marcatori più riconosciuti sono vimentina, proteina superficiale del fibroblasto umano (hFSP), recettore del dominio discoidina 2 (DDR2) e actinmuscolare alfa liscio ( . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

I fibroblasti sono il principale tipo di cellule che producono matrici extracellulari (ECM). Di conseguenza, i fibroblasti mantengono un'architettura ordinata dei tessuti e forniscono supporto meccanico per le cellule vicine1. L'equilibrio tra sintesi e degradazione ECM è un processo ben regolato. I spostamenti verso la sintesi segnano l'inizio di un'eccessiva deposizione di ECM che, se non terminata, porta alla fibrosi. La fibrosi è mediata dai miofibroblasti, che provengono da fibroblasti attivati sottoposti a cambiamenti molecolari e fenotipici. Un segno distintivo di miofibroblasti è una maggiore secrezione di ECM e citochine e l'espressione di microfilamenti sMA ordinati9.

I fibroblasti primari sono stati sotto i riflettori di una recente ricerca incentrata sulla fibrosi, l'infiammazione dei tessuti e le interazioni fibroblasto-cancro-cellula10,11. Tuttavia, per studiare efficacemente le proprietà del fibroblasto in salute e malattia, è necessario isolare regolarmente i fibroblasti adulti vitali. Ci sono diversi metodi disponibili per isolare i fibroblasti12,13,14. I tre principali metodi di isolamento del fibroblasto sono la crescita dai pezzi di tessuto12, la digestione del tessuto enzimatico15e la perfusione ezimatica degli organi cavi9,13,16. Il vantaggio della crescita è un processo di isolamento delicato senza degradazione cellulare enzimatica. D'altra parte, le colture di escrescenza di solito richiedono periodi di coltura prolungati fino a quando le cellule possono essere utilizzate per gli esperimenti. La digestione enzimatica comune è veloce, ma comporta un rischio di contaminazione con altri tipi di cellule (ad esempio, cellule endoteliali) o batteri nel processo di agitazione, che è necessario per sciogliere meccanicamente il tessuto. Inoltre, questi metodi sono spesso elaborati e richiedono tempo e abilità per imparare.

Per quanto riguarda l'importanza dei fibroblasti primari nella ricerca, è ancora necessario ottimizzare gli approcci esistenti di isolamento cellulare in termini di rapidità, semplicità e affidabilità. Qui, viene fornito un nuovo metodo di isolamento eziblasto etcimo basato su ultrasuoni che fornisce cellule di alta qualità.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Il seguente protocollo segue le linee guida istituzionali per la cura degli animali della Technische Universitat Dresden, in Germania (numero di file: T 2014/4) e le linee guida per la cura degli animali accettate a livello internazionale (FELASA)17. Figura 1 visualizza il processo di isolamento delle celle.

1. Preparazione dell'impostazione, del materiale e dei supporti

  1. Preparare il mezzo di coltura cellulare, soluzione PBS, la soluzione di brogola di collagenae (ricostituire 50 mg di miscela di collagenasi liofilizzata in 12 mL di acqua ultrapura sterile) e soluzione di prova dello 0,25%.
  2. Riscaldare il mezzo, il PBS e la soluzione trypsin a 37 .
  3. Preriscaldare il bagno d'acqua ad ultrasuoni a 37 gradi centigradi.
  4. Disinfetta le pinze, una spatola in acciaio inossidabile, bisturi (2x bisturi per organo) e 2 becher di vetro con 70% di etanolo e posizionano questi materiali sotto il cofano della coltura cellulare.
  5. Riempire un becher con il 70% di etanolo e l'altro con acqua sterile o soluzione PBS. Questi becher sono tenuti a disinfettare e lavare lo strumento dopo ogni processione d'organo.
  6. Mettere sterili tubi di plastica da 15 mL contenenti PBS freddo sul ghiaccio bagnato. Il numero di tubi dipende dal numero di organi da cui si desidera isolare i fibroblasti.

2. Dissezione del topo e rimozione dell'organo

  1. Indossare due paia di guanti uno sopra l'altro, in modo che la prima coppia può essere rimosso non appena l'animale è stato sezionato.
    NOTA: Questa procedura impedisce ai batteri di diffondersi sopra gli organi.
  2. Eutanasia il topo (ad esempio, dislocazione cervicale) e appunta la carcassa con aghi ad ogni arto a un cuscinetto in polistirolo.
  3. Disinfettare la carcassa di topo utilizzando uno spray etanolo 70%. Assicurarsi che la pelliccia sia imbevuta di etanolo in modo che i capelli non turbinino.
  4. Tagliare la pelliccia proprio sopra il tratto urogenitale utilizzando pinze chirurgiche e forbici atraumatiche. Tagliare la pelle lungo la linea mediana dal punto dell'incisione iniziale al collo (3 - 4 cm) e aggiungere tagli di rilievo agli arti.
    AVVISO: Non perforare lo strato muscolare in questo passaggio per evitare la contaminazione batterica!
  5. Fissare la pelle al cuscinetto di schiuma di polistirolo per avere un accesso ottimale alla muscolatura che copre la cavità addominale.
  6. Disinfettare la muscolatura addominale due volte utilizzando 70% etanolo. Lasciare asciugare l'etanolo prima di proseguire con il passo successivo.
  7. Rimuovere il primo paio di guanti. Utilizzare un nuovo set sterile di pinze e forbici.
  8. Aprire la cavità addominale e il torace incidendo lo strato muscolare con forbici chirurgiche per rimuovere delicatamente gli organi di scelta. Pertanto, tenere delicatamente l'organo con pinze chirurgiche (non perforare l'organo, utilizzare una pressione minima) e tagliare i vasi sanguigni di alimentazione vicino al punto di ingresso presso l'organo con le forbici.
  9. Mettere gli organi nei tubi sterili contenenti PBS freddo. Chiudere i tubi ermeticamente. Posizionare i tubi sul ghiaccio bagnato fino a proseguire con il passaggio 3.1.

3. Mincing dei tessuti, digestione ed estrazione cellulare

  1. Trasferire i tubi sotto la sterile cappa cellulare.
    ATTENZIONE: Indossare un nuovo paio di guanti e disinfettare i tubi con il 70% di etanolo prima di trasferirli sotto il cofano!
  2. Estrarre l'organo dal tubo da 15 mL usando pinze sterili. Posizionare l'organo su una metà di una parabola Petri sterile di 6 cm e lavare brevemente l'organo con PBS per rimuovere il sangue in eccesso. Trasferire l'organo nella seconda metà del piatto Petri, rimuovere l'eccesso di PBS.
  3. Mitoilare il tessuto utilizzando due bisturi sterili. I frammenti di tessuto rimanenti non devono essere superiori a 1 - 2 mm.
  4. Trasferire il tessuto macinato in un nuovo tubo sterile da 15 mL utilizzando la spatola sterile e aggiungere 2 mL di 0,25% soluzione di prova. Collocare il tubo in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi per 5 min.
  5. Vorticare delicatamente il tubo (circa 1400/min) per 10 s.
  6. Interrompere la reazione alla trypsin sotto la cappa cellulare aggiungendo 4 mL di coltura cellulare contenente FCS medio (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), ad esempio.
  7. Aggiungere 250 l di soluzione di miscela di collagenasi ad ogni tubo contenente cuore o tessuto polmonare e 100 L per il rene o il fegato, rispettivamente.
  8. Collocare i tubi in un bagno d'acqua ad ultrasuoni (37 gradi centigradi) e attivare il sonicatore ad ultrasuoni per 10 minuti.
    NOTA: Il bagno d'acqua ad ultrasuoni utilizzato in questo protocollo ha una frequenza operativa di 35 kHz e una potenza massima di 320 W.
  9. Vorticare delicatamente i tubi (circa 1400/min) per 10 s.
  10. Riposizionare i tubi nel bagno d'acqua ad ultrasuoni per 10 min.
  11. Vorticare delicatamente (circa 1400/min) per 10 s.
  12. Disinfettare i tubi con il 70% di etanolo e trasferirli sotto la sterile cappa cellulare.
  13. Filtrare la soluzione con una rete da 40 m in un nuovo tubo sterile da 15 mL.
  14. Centrifugare il tubo a 500 x g per 5 min.
  15. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di mezzo fresco.
  16. Trasferire le cellule in un recipiente di coltura cellulare adatto (ad esempio, piastra di 6 pozze) e posizionare il recipiente nell'incubatrice coltura cellulare durante la notte a 37 e 5% CO2.
  17. Il giorno successivo, rimuovere il mezzo, lavare 3 volte con PBS, quindi aggiungere il mezzo fresco (il volume aggiunto dipende dal vaso di coltura cellulare di scelta, 2 mL per pozzo di una piastra di 6 pozzetti ecc.).
  18. Cambiare il supporto ogni due giorni.
    NOTA: I fibroblasti possono essere divisi dopo aver raggiunto la confluenza ottica del 90% (di solito dopo 5-7 giorni).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

È stata dimostrata la capacità di questo protocollo di isolare i fibroblasti adulti dal tessuto murino solido. Sono stati ottenuti fibroblasti vitali che potrebbero essere utilizzati per esperimenti successivi come l'immunofluorescenza colorazione o gli esperimenti di proliferazione (Figura 2D-F, Figura 5A).

I fibroblasti adulti sono cellule piatte a forma di mandrino con più processi cellulari che in genere crescono in monostrati12,18. I risultati ottenuti riflettono questi segni morfologici e indicano differenze morfologiche distinte nelle popolazioni di fibroblasti provenienti da diversi organi (Figura 2). I fibroblasti renali erano particolarmente più piccoli e crescevano a densità più elevate rispetto ai fibroblasti cardiaci, polmonari o epatici (Figura 2).

Il pannello superiore della Figura 3 illustra il processo di maturazione cellulare e proliferazione attraverso l'esempio di fibroblasti cardiaci dopo l'isolamento. Le celle hanno mostrato alti tassi di proliferazione che raggiungono la confluenza ottica di >90% dopo 6 x 1 giorni. A questo livello di confluenza i fibroblasti si fermano a proliferare18 e le cellule possono essere divise, usando 0,25% trypsin, e trasferite a fiasche di coltura cellulare più grandi per la successiva coltura o esperimenti.

In condizioni di coltura delle cellule basali, le colture fibroblaste sono costituite da fibroblasti e una percentuale minore di miofibroblasti19,20. Ci sono diversi marcatori accettati per identificare i fibroblasti. DDR2 e l'espressione della vimentina sono marcatori fibroblasti comuni e l'espressione di microfilamenti organizzati di SMA indica la differenziazione del miofibroblasto7,9. Un'immagine rappresentativa di un miofibroblasto differenziato con microfilamenti sMA distintivi e immagini di panoramica rappresentativa per l'abbondanza di filamento SMA nel cuore, rene, fegato e polmone sono presentati in Figura 4. Mentre solo il 20- 30% circa delle cellule isolate e successivamente coltivate esprimeva microfilamenti di SMA ordinati (che indicano la differenziazione del miofibroblasto), tutte le cellule (99%) sono stati positivi per la vimentina e la DDR2 (Figura3,pannello inferiore).

Figure 1
Figura 1 . Panoramica della procedura di isolamento del fibroblasto. Dopo che gli organi di interesse sono stati rimossi dal mouse, vengono macinati sotto una cappa di coltura cellulare utilizzando bisturi sterili. Successivamente, il tessuto macinato viene trasferito allo 0,25% della soluzione di prova per 5 min. Dopo la prima digestione, viene aggiunta la soluzione di miscelazione di collagenasi e i tubi vengono trasferiti in un bagno ad ultrasuoni per 20 min a 37 gradi centigradi. Dopo la filtrazione e la centrifugazione, il pellet cellulare può essere trasferito in un piatto di coltura cellulare adatto. Dopo almeno 8 h da attaccare, le colture vengono lavate tre volte con PBS per rimuovere gli eritrociti e i detriti. Infine, viene aggiunto il mezzo fresco (DMEM, 15% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin) e le cellule possono essere coltivate. Immagini di Servier smart medical art sono stati utilizzati per creare la figura (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Fibroblasti murini primari isolati da organi solidi dopo 7 giorni di coltura primaria. A) Fibroblasti cardiaci. B) Fibroblasti polmonari. C) Fibroblasti renali. D) Fibroblasti epatici. Le cellule sono state coltivate in DMEM (15% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin (PS)) a 37 gradi centigradi e 5% di CO2. L'ingrandimento 10x e lo zoom ottico della fotocamera 5,6x sono stati utilizzati per ottenere queste immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Identificazione dei fibroblasti nella coltura. A - C) Attacco e crescita dei fibroblasti cardiaci per 4 giorni. Dopo il lavaggio e il cambiamento medio i fibroblasti attaccati sviluppano la loro forma distintiva e proliferano. Le cellule sono state coltivate in DMEM (15% FCS, 1% PS). D - F) Immunofluorescenza colorazione immagini di fibroblasti primari dopo 7 giorni di coltura per i marcatori fibroblasti -SMA (D), DDR2 (E) e Vimentin (F). I nuclei erano macchiati di DAPI (blu). Gli anticorpi primari (Sigma-Aldrich) sono stati diluiti 1:200 in una soluzione BSA dell'1% (SMA: A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). Alexa-Fluor 488 è stato utilizzato come anticorpo secondario. Le barre della scala sono uguali alle lunghezze indicate sopra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Immagini immunocitochimiche rappresentative per l'abbondanza di microfilamenti SMA. A) Viene visualizzato un tipico miofibroblasto (ingrandimento: 20x). B – E) Rappresentante: immagini di panoramica della SMA per cuore (B), rene (C), fegato (D) e polmone (E) (ingrandimento: 10x). I cerchi bianchi indicano cellule rappresentative che erano considerate miofibroblasti. I nuclei erano macchiati di DAPI (blu). L'anticorpo primario è stato diluito 1:200 in 1% soluzione BSA (SMA: A5228). Alexa-Fluor 488 è stato utilizzato come anticorpo secondario. Le barre della scala sono uguali alle lunghezze indicate sopra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Tassi di proliferazione di fibroblasti murini e sviluppo di senescenza in vitro. A) Tasso di proliferazione dei fibroblasti murini determinato dopo 7 e 14 giorni di cultura. Le cellule sono state raccolte e contate con una camera Buerker nei rispettivi punti temporali. I risultati rappresentano il numero di celle in 1 mL di media. B) La senescenza è determinata dalla presenza di z-galactosidase (verde colorato). Le celle senescenti sono indicate con cerchi bianchi. La barra della scala è uguale a 50m. I risultati sono presentati come media : SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Rispetto alle linee cellulari fibroblaste immortale, i fibroblasti primari offrono diversi vantaggi. Possono essere isolati in modo conveniente in alta qualità e quantità. Inoltre, le colture primarie offrono la possibilità di studiare cellule da più individui, il che aumenta l'affidabilità dei risultati ottenuti e diminuisce la probabilità di studiare semplicemente gli artefatti della coltura cellulare. La generazione continua di nuove culture primarie previene le alterazioni genetiche che si verificano comunemente dopo il passaggio ripetutodi 21. Inoltre, la senescenza cellulare22,23 o una maggiore differenziazione del miofibroblasto si verificano più frequentemente nelle culture ad alti passaggi20. A passaggi bassi (2-3), il numero di miofibrolblasti basali era di circa il 20 - 30% (dati non mostrati) e solo il 2,89% delle cellule era considerato senescente in base all'espressione di z-galactosidase (Figura 5B). Per questo motivo, si consiglia di passare le culture fino a massimizzare 5 volte e di sostituirle in seguito. Ciò garantisce risultati affidabili e replicabili durante gli esperimenti. La crescita e la proliferazione ottimali dei fibroblasti sono state ottenute con un mezzo di coltura cellulare contenente il 15% di FCS invece del 10%. Ciò ha garantito una robusta resa del fibroblasto e una buona vitalità cellulare dopo il primo passaggio.

Questo protocollo integra le tecniche esistenti in termini di velocità e grado di difficoltà. Le tecniche di escrescenza richiedono tra 10 - 21 giorni, a seconda della specie e dei tessuti, fino a quando non possono essere raccolte quantità sufficienti di fibroblasti12,24. Langendorff-perfusion d'altra parte è veloce (<5 h), ma richiede più abilità manuale e formazione. Rispetto ai metodi di escrescenza12,24 o isolamento del fibroblasto dal supernatante di Langendorff-perfusione16, questo protocollo offre soprattutto ai principianti l'opportunità di lavorare con le cellule primarie dopo un brevissimo periodo di formazione (2 - 3 isolamenti) senza l'esigenza di elevate competenze meccaniche o sforzi tecnici. La contaminazione con cellule non-fibroblaste (ad esempio, cellule endoteliali) era trascurabile perché i fibroblasti coltivati aumentavano rapidamente altri tipi di cellule nelle colture a causa dei loro più alti tassi di proliferazione25. Inoltre, questo protocollo fornisce istruzioni chiare che aiutano a evitare la contaminazione batterica, che è uno dei principali problemi di lavoro con le cellule morine primarie. Qui sono stati identificati due passaggi critici per evitare la contaminazione. Il primo è l'espianto dell'organo. I batteri della pelliccia del roditore possono essere facilmente trasferiti agli organi se i guanti e gli strumenti chirurgici non vengono modificati dopo la rimozione della pelliccia e della pelle. Il secondo passaggio critico è il processo di isolamento stesso. Le cellule devono essere rimosse meccanicamente dalla loro nicchia di tessuto. Nel contesto di Langendorff-perfusione questo è realizzato da una corrente continua di liquido. Altre tecniche utilizzano barre di agitazione magnetica o metodi di agitazione. In particolare, la sostituzione delle barre di agitazione magnetica con onde ultrasoniche riduce il rischio di contaminazione batterica evitando il contatto fisico tra l'agitatore e il lisato di tessuto. Un ulteriore vantaggio del bagno d'acqua ad ultrasuoni è la distribuzione uniforme del calore ai tubi, fornendo così temperature di lavoro ottimali per gli enzimi.

In conclusione, questo protocollo fornisce un metodo rapido, affidabile e replicabile per isolare i fibroblasti primari che è ideale sia per i ricercatori avanzati che per i ricercatori in fase iniziale. Questo metodo è un'utile aggiunta allo spettro esistente di tecniche che possono contribuire a una migliore comprensione della funzione fibroblasta in salute e malattia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Ringraziamo la signora Romy Kempe e la signora Annett Opitz per il supporto tecnico esperto. Ringraziamo anche Bjoern Binnewerg per il supporto IT. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da a) il F'rderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsf'rderprogram f'r Frauen", Facoltà di Medicina Gustav Carus Dresden e c) Altrikroner-Forschungskolleg (EKFK) Facoltà di Medicina Carl Carl Carus Dresden. Siamo grati per i finanziamenti e il sostegno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T4049-100ML
Antibiotics Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA Gibco LS15140148  Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 51023608 HeraSafe KSP15
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 50049176 BBD 6220
Cell culture plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA depends on vessel 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany 20727400 BVC professional suction
Cell strainer (mesh) Corning, Tewksbury, USA 431750 40 µm Nylon
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 75007213 Megafuge 8R
Cordless pipetting controller Hirschmann, Eberstadt, Germany 9907200 Pipetus
Disposable pipette tips Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel Myco Medical, Cary, USA n.a. Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 41965-062 High glucose
Eppendorf tubes Eppendorf, Hamburg, Germany  depends on volume 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F2442-50ML
Collagenase blend Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5401020001 Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D8537-500ML 500 mL
Senescence detection kit Abcam, Cambridge, UK ab65351
Shaker/ Vortex IKA, Staufen im Breisgau, Germany n.a. MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Falcon 352095 BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany 312 Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic) Aesculap AG, Tuttlingen, Germany NR 82
Surgical scissors  Aesculap AG, Tuttlingen, Germany eq 1060.09
Surgical forceps Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BD577

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 376-379 (2011).
  2. Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14, (8), 484-491 (2017).
  3. Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4, (2), 159-166 (1975).
  4. Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62, (1), 1-12 (1992).
  5. Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516, (1), 71-74 (2002).
  6. Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38, (4), 1063-1074 (2016).
  7. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  8. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  9. Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. 445098 (2018).
  10. Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102, (2), 258-269 (2014).
  11. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16, (9), 582-598 (2016).
  12. Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4, (2), (2016).
  13. Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
  14. Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96, (5), 535-539 (2018).
  15. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40, (8-9), 268-277 (2004).
  16. El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80, (3), 396-406 (2008).
  17. Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51, (3), 311-321 (2012).
  18. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
  19. Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (9), 4219-4223 (1996).
  20. Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 389-399 (2011).
  21. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
  22. Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6, (12), 2853-2868 (2008).
  23. Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21, (12), 1424-1435 (2015).
  24. Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47, (2), 83-88 (2011).
  25. Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185, (2), 519-528 (1989).
Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).More

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter