Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

doi: 10.3791/59858 Published: July 29, 2019

Summary

Birincil erişkin fibroblastları, yeni başlayanlar tarafından (örn. öğrenciler) kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmak için bir protokol sunuyoruz. Prosedür primer fibroblastlar elde etmek için enzimatik doku sindirim ve ultrasonik dalgalar ile mekanik ajitasyon birleştirir. Protokol, belirli deneysel gereksinimlere (örn. insan dokusu) kolayca adapte edilebilir.

Abstract

Primer erişkin fibroblastlar tüm vücut dokularında fibrozis, fibroblast etkileşimleri ve inflamasyonu incelemek için önemli bir araç haline gelmiştir. Primer fibroblastlar myofibroblast farklılaşma veya senesans indüksiyon nedeniyle sonsuza kadar bölünemez beri, yeni kültürler düzenli olarak kurulmalıdır. Ancak, güvenilir bir yalıtım Protokolü ve primer fibroblast yalıtım kendisi geliştirme süreçleri sırasında üstesinden gelmek için birkaç engel vardır: zorluk yöntemin derecesi (özellikle yeni başlayanlar için), bakteriyel kontaminasyon riski, Primer fibroblastlar deneyler için kullanılabilir ve sonraki hücre kalitesi ve viability kadar gerekli zaman. Bu çalışmada, hızlı, güvenilir ve öğrenme kolay bir protokol izole etmek ve kültür birincil yetişkin fibroblastlar fare kalp, akciğer, karaciğer ve böbrek enzimatik sindirim ve ultrasonik ajitasyon birleştiren sağlanır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fibroblastlar, birden fazla stellat süreçleri ve geniş bir kaba endoplazmik retikulum ile düz, iğ şeklinde hücreler1,2. Ortalama bir fibroblast 30-100 μm ölçer ve 57 ± 3 gün1,3yaşam süresi vardır. İnsan fibroblastlarının ortalama hücre döngüsü süresi, kültür koşullarına göre 16-48 h arasında değişmektedir4. Kültürlü primer fibroblastların çoğaltılabilir kapasitesinin ve fonksiyonel kalitesinin, donör çağıyla olumsuz şekilde ilişkilendirileceğinden, Genç bağışçıların (hayvanların veya hastaların) mümkünse5,6 .

Fibroblastlar en memeli vücut dokularının baskın bir hücre türünü oluşturmaktadır. Her zaman bulundukları varlığa rağmen, fibroblastların moleküler tanımlaması hala bir zorluk7. Fibroblastlar, embriyonik gelişim sırasında farklı kaynaklardan gelen doku ve organlara göç etmek8. Bu nedenle, fibroblastlar içinde bulunan, her fibroblast nüfusunda bulunan ve fibroblastların özel olan benzersiz Marker proteinlerinin hala eksik olduğu bir bolluk Marker proteini vardır. Böylece, birçok tanınan işaretçileri ifade desenleri genellikle fibroblastlar tanımlamak için kullanılır. En tanınmış belirteçleri arasında vimentin, insan fibroblast yüzey proteini (hFSP), discoidin Domain reseptör 2 (DDR2) ve Alfa pürüzsüz Kas aksini (αSMA).

Fibroblastlar, büyük hücre içi matris (ECM) üreten hücreli tiptir. Böylece, fibroblastlar düzenli bir doku mimarisi korumak ve komşu hücreler için mekanik destek sağlamak1. ECM sentezi ile bozulma arasındaki denge iyi düzenlenmiş bir süreçtir. Sentez yönüne doğru vardiyalar, sonlandırılmadıkça fibrozis yol açan aşırı ECM birikmesi başlangıcına işaret ederler. Fibrozis, moleküler ve fenotektal değişikliklerden kaynaklanan aktif fibroblastlar kaynaklı myofibroblastlar tarafından aracılılar. Miyofibroblastların bir damgasını ECM ve sitokinlerin salgılanması ve düzenli olarak düzenlenmiş αSMA mikrofilemlerin ifadesi9.

Primer fibroblastlar, fibrozis, doku iltihabı ve fibroblast-kanser-hücre etkileşimlerine odaklanan son araştırmaların Spotlight olduğunu10,11. Ancak, sağlık ve hastalık fibroblast özellikleri etkili bir şekilde çalışmak için, düzenli olarak uygun primer erişkin fibroblastlar izole etmek gereklidir. Fibroblastlar12,13,14yalıtmak için çeşitli yöntemler mevcuttur. Fibroblast izolasyonunun üç ana yöntemi, doku parçaları12, enzimatik doku sindirimi15ve boş organların enzimatik perfüzyon9,13,16büyüme vardır. Büyüme avantajı enzimatik hücre bozulması olmadan nazik bir yalıtım sürecidir. Öte yandan, büyüme kültürler genellikle hücreler deneyler için kullanılabilir kadar uzun süreli kültür dönemleri gerektirir. Yaygın enzimatik sindirim hızlı ama diğer hücre türleri ile kontaminasyon riski taşımaktadır (örneğin, endotel hücreleri) veya bakteri ajitasyon sürecinde, hangi mekanik doku çözülür için gerekli olan. Ayrıca, bu yöntemler genellikle ayrıntılı ve öğrenmek için zaman ve beceri gerektirir.

Araştırmalarda primer fibroblastların önemi ile ilgili olarak, mevcut hücre yalıtım yaklaşımlarını hızlı, basitlik ve güvenilirlik açısından optimize etmek için hala bir ihtiyaç vardır. Burada, yüksek kaliteli hücreler sunan bir yeni ultrasonik bazlı enzimatik fibroblast yalıtım yöntemi sağlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aşağıdaki protokol Technische Universität Dresden, Almanya (dosya numarası: T 2014/4) yanı sıra uluslararası kabul görmüş hayvan bakım kuralları (FELASA)17kurumsal hayvan bakım yönergeleri takip eder. Şekil 1 hücre yalıtım sürecini görselleştirir.

1. Kurulum, malzeme ve medyayı hazırlama

  1. Hazırlamak hücre kültürü orta, PBS çözüm, kolajenaz karışım stok çözüm (Re, 50 mg likofilized kolajenaz karışımı 12 ml steril ultra saf su), ve 0,25% tripsin çözeltisi.
  2. Orta, PBS ve tripsin solüsyonu 37 °C ' ye kadar ısıtın.
  3. Ultrasonik su banyosunu 37 °C ' ye ısıtın.
  4. Forseps dezenfekte, paslanmaz çelik spatula, neşter (organ başına 2x neşter) ve 70% etanol ile 2 cam bevisler ve hücre kültürü kaputu altında bu malzemeleri yerleştirin.
  5. % 70 etanol ve diğer steril su veya PBS çözeltisi ile bir kabı doldurun. Bu arıcılar her organ alayı sonrasında cihazı dezenfekte etmek ve yıkamak zorundadır.
  6. Islak buzda soğuk PBS içeren steril 15 mL Plastik tüpler yerleştirin. Boru sayısı, fibroblastları izole etmek istediğiniz organların sayısına bağlıdır.

2. fare diseksiyonu ve organ kaldırma

  1. İki çift eldiven bir diğeri üzerinde giymek, bu yüzden ilk çifti en kısa sürede hayvan dissected edilmiş olarak kaldırılabilir.
    Not: Bu prosedür, hayvanın kürk ve cilt organları üzerinde yayılması bakteri önler.
  2. Fare (örneğin, servikal dislocation) ötenize ve bir polistiren pad her ekstremite iğneler ile karkas pin.
  3. 70% etanol sprey kullanarak fare karkas dezenfekte. Saç kadar girdap olmaz böylece kürk etanol ıslatılmış olduğundan emin olun.
  4. Cerrahi forseps ve atraumatik makas kullanarak ürogenital sistemin hemen üstündeki kürk kes. İlk kesi noktasından boyun (3-4 cm) noktasından orta çizginin yanında cildi kesip ekstremitelerde kabartma kesimleri ekleyin.
    DIKKAT: bakteriyel kontaminasyonu önlemek için bu adımda kas tabakasını delmeyin!
  5. Karın boşluğu kapsayan kas için optimum erişim için Polistiren köpük Pad cilt pin.
  6. % 70 etanol kullanarak karın kasısını iki kez dezenfekte edin. Bir sonraki adıma geçmeden önce etanol kuru edelim.
  7. İlk eldiven çifti çıkarın. Yeni, steril bir forseps ve makas seti kullanın.
  8. Karın boşluğunu ve toraks, kas katmanını cerrahi makas ile yakarak seçim organlarını nazikçe kaldırmak için açın. Bu nedenle, cerrahi forseps ile yavaşça organ tutun (organ delmek değil, minimal basınç kullanın) ve makas ile organ giriş noktası yakın tedarik kan damarlarını kesti.
  9. Organları soğuk PBS içeren steril tüplere koyun. Tüpleri sıkıca kapatın. Adım 3,1 ile devam edene kadar tüpler ıslak buz üzerine yerleştirin.

3. doku mincing, sindirim ve hücre ekstraksiyon

  1. Tüpleri steril hücre kültürü kaputu altında aktarın.
    DIKKAT: yeni bir çift eldiven giyin ve onları kaput altına aktarmadan önce% 70 etanol ile tüpleri dezenfekte edin!
  2. Steril forseps kullanarak 15 mL tüpten organ alın. Organ steril 6 cm Petri çanak bir yarısında üzerine yerleştirin ve aşırı kan kaldırmak için PBS ile organ kısa bir süre yıkayın. Organ Petri tabak ikinci yarısında transfer, aşırı PBS kaldırmak.
  3. İki steril neşter kullanarak doku Mince. Kalan doku parçacıkları 1-2 mm 'den büyük olmamalıdır.
  4. Steril spatula kullanarak yeni bir steril 15 mL tüp içine kıyılmış doku aktarmak ve% 0,25 tripsin solüsyonu 2 mL ekleyin. Tüp, 37 °C ' de 5 dakika boyunca bir hücre kültürü kuluçvörü haline yerleştirin.
  5. Tüpü yavaşça (1400/dk.) 10 s için Vortex.
  6. 4 mL FCS içeren hücre kültürü ortamı (Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (DMEM), örneğin) ekleyerek hücre kültürü kaputu altında tripsin reaksiyonu durdurun.
  7. Sırasıyla böbrek veya karaciğer için kalp veya akciğer dokusu ve 100 μL içeren her tüp için 250 μL kolajenaz karışım çözeltisi ekleyin.
  8. Bir ultrasonik su banyosu (37 °C) içine tüpler yerleştirin ve 10 dakika ultrasonik sonicator etkinleştirin.
    Not: Bu protokolde kullanılan ultrasonik su banyosu 35 kHz ve 320 W maksimal gücü bir çalışma sıklığı vardır.
  9. Tüpleri hafifçe (1400/dk) 10 s için Vortex.
  10. Tüpleri tekrar ultrasonik su banyosuna 10 dakika boyunca yerleştirin.
  11. 10 s için yavaşça Vortex (1400/dk).
  12. % 70 etanol ile tüpleri dezenfekte edin ve steril hücre kültürü kaputu altında aktarın.
  13. Solüsyonu bir 40 μm Mesh ile yeni bir steril 15 mL tüpüne filtreleyin.
  14. Tüp Santrifüjü 500 x g 5 dk.
  15. Süpernatant kaldırmak ve taze orta 1 ml Pelet pelletini.
  16. Hücreleri uygun bir hücre kültürü gemisine (örn. 6-kuyu plakası) aktarın ve gemiyi, 37 °C ve% 5 CO2' de bir gecede hücre kültürü kuluçyanına yerleştirin.
  17. Ertesi gün, orta çıkarın, PBS ile 3 kez yıkayın, sonra taze orta ekleyin (eklenen hacim seçim hücre kültürü gemisi bağlıdır, 2 mL iyi başına 6-kuyu plaka vb.).
  18. Her gün ortamı değiştirin.
    Not: fibroblastlar% 90 optik konfluence ulaştıktan sonra bölünebilir (genellikle 5-7 gün sonra).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokolün yetişkin fibroblastları katı duvar dokusundan yalıtmak için yeteneği gösterildi. İmmünofluoresesans boyama veya proliferasyon deneyleri (Şekil 2D-F, Şekil 5A) gibi sonraki deneyler için kullanılabilecek fibroblastlar elde edildi.

Erişkin fibroblastlar genellikle monolayers12,18büyümek birden fazla hücresel süreçleri ile düz iğ şekilli hücrelerdir. Elde edilen sonuçlar bu morfolojik işaretleri yansıtır ve farklı organlardan fibroblast nüfuslarında farklı morfolojik farklılıklar gösterir (Şekil 2). Böbrek fibroblastları özellikle daha küçüktür ve kardiyak, pulmoner veya hepatik fibroblastlar daha yüksek yoğunluklarda büyüdü (Şekil 2).

Şekil 3 ' ün üst paneli, izolasyondan sonra kardiyak fibroblastlar örneği ile hücre olgunlaşma ve proliferasyon sürecini tasvir ediyor. Hücreler, 6 ± 1 gün sonra >% 90 optik konfluence ulaşan yüksek proliferasyon hızları gösteriliyor. Bu düzeyde konfluence fibroblastlar18 çoğalırlar durdurmak ve hücreler bölünmüş olabilir, kullanarak 0,25% tripsin, ve sonraki kültür veya deneyler için daha büyük hücre kültürü şişeler transfer.

Bazal Hücre kültürü koşullarında, fibroblast kültürlerinden fibroblastlar ve myofibroblasastların daha küçük bir oranı oluşur19,20. Fibroblastları tanımlamak için birkaç kabul edilen işaretler vardır. DDR2 ve vimentin ifadesi ortak fibroblast belirteçleri ve organize αsma mikrofilamin ifadesidir myofibroblast farklılaşma7,9gösterir. Şekil 4' te, farklı αsma mikrofilametleri ve α SMA filament bolluk için temsili genel bakış görüntüleri ile farklılaşmış bir myofibroblast temsili bir görüntü, böbrek, karaciğer ve akciğer sunulmaktadır. İzole edilmiş ve daha sonra kültürlü hücrelerin sadece yaklaşık% 20-30 ise düzenli olarak düzenlenmiş αSMA mikrofilamin (myofibroblast farklılaşma gösteren), tüm hücreler (≈ 99%) ifade vimentin ve DDR2 (Şekil 3, alt panel) için pozitif idi.

Figure 1
Şekil 1 . Fibroblast yalıtım prosedürine genel bakış. İlgi organları fare kaldırıldı sonra, onlar steril neşter kullanarak bir hücre kültürü kaput altında kıyılmış. Daha sonra, kıyılmış doku 5 dakika boyunca% 0,25 tripsin solüsyona aktarılır. İlk sindirim sonra, kolajenaz karışım çözeltisi eklenir ve tüpler ultrasonik banyo için 20 dakika 37 °c ' de aktarılır. Filtrasyon ve santrifüjleme sonrasında, hücre peletleri uygun bir hücre kültürü yemine aktarılabilir. En az 8 h eklemek için sonra, kültürler eritrositler ve enkaz kaldırmak için PBS ile üç kez yıkanır. Son olarak, taze Orta (DMEM,% 15 FCS, 1% penisilin/streptomisin) eklenir ve hücreler kültürlü olabilir. Servier akıllı tıbbi sanat görüntüleri şekil (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/) oluşturmak için kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 . Birincil kültürün 7 gün sonra katı organlardan izole primer murine fibroblastlar. A) kardiyak fibroblastlar. B) pulmoner fibroblastlar. C) böbrek fibroblastları. D) hepatik fibroblastlar. Hücreler DMEM 'de (% 15 FCS,% 1 penisilin/streptomisin (PS)) 37 °C ve% 5 CO2' de Kültürlenmiş. Bu görüntüleri elde etmek için 10X büyütme ve 5.6 x optik kamera yakınlaştırma kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Kültürde fibroblastların tanımlanması. A-C) ek ve kardiyak fibroblastlar 4 gün boyunca büyüme. Yıkandıktan ve orta değiştikten sonra bağlı fibroblastlar onların ayırt edici şeklini geliştirir ve proliferate. Hücreler DMEM 'de Kültürlenmiş (% 15 FCS,% 1 PS). D-F) Fibroblast belirteçleri (D), DDR2 (E) ve vimentin (F) için 7 günlük kültürün ardından primer fibroblastların immünofluorescence boyama görüntüleri. Çekirdekler DAPı (mavi) ile lekelendiler. Primer antikorlar (Sigma-Aldrich) 1:200% 1 BSA çözeltisi içinde seyreltildi (αSMA: A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). Alexa-Fluor 488 ikincil antikor olarak kullanıldı. Ölçek çubukları yukarıda belirtilen uzunlukları eşittir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . ΑSMA microfilament bolluk için temsilci immünosittokimyasal görüntüler. A) tipik bir myofibroblast görüntülenir (büyütme: 20X). B – E) Kalp (B), böbrek (C), karaciğer (D) ve akciğer (E) (büyütme: 10X) için temsilci αSMA genel bakış görüntüleri. Beyaz daireler, myofibroblastlar olarak kabul edilen temsili hücreleri gösterir. Çekirdekler DAPı (mavi) ile lekelendiler. Primer antikor% 1 BSA çözeltisi içinde 1:200 seyreltildi (αSMA: A5228). Alexa-Fluor 488 ikincil antikor olarak kullanıldı. Ölçek çubukları yukarıda belirtilen uzunlukları eşittir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Murin fibroblastları ve in vitro senesans gelişimi proliferasyon oranları. A) 7 ve 14 günlük kültürden sonra belirlenen murin fibroblastları proliferasyon oranı. Hücreler hasat edilmiş ve ilgili zaman noktalarında bir Buerker odası ile sayılır. Sonuçlar 1 mL Orta hücre sayısını temsil eder. B) senescence β-galaktosidaz (lekeli yeşil) varlığı ile belirlenir. Senesans hücreler beyaz çevrelerle gösterilir. Ölçek çubuğu 50 μm eşittir. sonuçlar ortalama ± SEM olarak sunulur. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mortalize fibroblast hücre hatları ile karşılaştırıldığında, primer fibroblastlar çeşitli avantajlar sunar. Yüksek kalitede ve miktarda verimli bir şekilde maliyet yalıtılabilir. Ayrıca, primer kültürler, elde edilen sonuçların güvenilirliğini artıran ve sadece hücre kültürü eserlerinin incelenmesi olasılığını azaltan birden fazla kişiden hücre Etüdü olanağı sunar. Yeni primer kültürlerin sürekli üretimi, tekrarlanan geçişte21' den sonra sıklıkla meydana gelen genetik değişimleri önler. Ayrıca, hücresel yaşlanma22,23 veya artmış myofibroblast farklılaşma daha sık kültürlerde yüksek pasajlar20oluşur. Düşük geçitlere (2-3), bazal myofibroblast sayımı yaklaşık% 20-30 (veriler gösterilmez) ve hücrelerin sadece% 2,89 ' si β-galaktosidaz ifadesine dayalı olarak kabul edildi (Şekil 5B). Bu nedenle, kültürlerin en fazla 5 kez geçmeli ve bunların yerini almak için tavsiye edilir. Bu, deneyler boyunca güvenilir ve yinelenebilir sonuçlar sağlar. % 10 yerine% 15 FCS içeren hücre kültürü ortamı ile optimum fibroblast büyümesi ve proliferasyonu elde edildi. Bu ilk geçit sonrası sağlam bir fibroblast verim ve iyi bir hücre canlılığı sağladı.

Bu protokol, hız ve zorluk derecesi açısından mevcut teknikleri tamamlar. Büyüme teknikleri, tür ve dokuya bağlı olarak, yeterli miktarlarda fibroblastlar hasat edilebilir kadar 10-21 gün arasında gerektirir12,24. Langendorff-perfüzyon öte yandan hızlı (< 5 h) ama daha manuel beceri ve eğitim gerektirir. Akıbet yöntemleri ile karşılaştırıldığında12,24 veya langendorff-perfüzyon16süpernatant fibroblast yalıtım, bu protokol özellikle yeni başlayanlar çok kısa bir süre sonra birincil hücreler ile çalışma fırsatı sunuyor yüksek mekanik beceri veya teknik çaba gereksinimi olmadan eğitim süresi (2-3 İzolasyonlar). Fibroblast olmayan hücrelerle kontaminasyon (örn., endotel hücreler), kültürlü fibroblastlar daha yüksek proliferasyonu oranları nedeniyle kültürlerdeki diğer hücre türlerini hızla büyütmesi nedeniyle ihmal edilemedi25. Ayrıca, bu protokol, birincil duvar hücreleri ile çalışan önemli bir sorundur bakteriyel kontaminasyonu önlemek için yardımcı açık talimatlar verir. Burada, kontaminasyondan kaçınmak için iki kritik adım tespit edildi. İlki organ çıkarılması. Eldiven ve cerrahi aletler kürk ve cilt çıkarmadan sonra değiştirilmez Eğer kemirgen kürk bakteriler kolayca organlara transfer edilebilir. İkinci kritik adım yalıtım işleminin kendisi. Hücreler doku niş mekanik olarak kaldırılması gerekir. Langendorff bağlamında-perfüzyon bu sıvı sürekli akım tarafından gerçekleştirilir. Diğer teknikler manyetik karıştırma çubukları veya sallayarak yöntemleri kullanın. Özellikle, ultrasonik dalgalar tarafından manyetik karıştırma çubukları değiştirilmesi karıştırıcı ve doku lysate arasındaki fiziksel temas kaçınarak bakteriyel kontaminasyon riskini azaltır. Ultrasonik su banyosu ek bir avantajı, böylece enzimler için optimum çalışma sıcaklıkları sağlayarak, tüplere sıcaklık bile dağılımıdır.

Sonuç olarak, bu protokol hem gelişmiş hem de erken evre araştırmacılar için ideal olan primer fibroblastları yalıtmak için hızlı, güvenilir ve yinelenebilir bir yöntem sağlar. Bu yöntem, sağlık ve hastalık fibroblast fonksiyonunun daha iyi anlaşılması için katkıda bulunabilir teknikleri mevcut spektrum için yararlı bir ektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Beyan etmek için ilgi çakışması yoktur.

Acknowledgments

Biz uzman teknik destek için Bayan Romy Kempe ve Bayan Annett Opitz teşekkür ederiz. Biz de destek için Bay Bjoern Binnewerg teşekkür ederiz. Bu iş bir) tarafından destekleniyordu a) Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", Tıp Fakültesi Carl Gustav Carus Dresden ve c) başka Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Tıp Fakültesi Carl Gustav Carus Dresden. Biz fon ve destek için minnettarız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T4049-100ML
Antibiotics Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA Gibco LS15140148  Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 51023608 HeraSafe KSP15
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 50049176 BBD 6220
Cell culture plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA depends on vessel 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany 20727400 BVC professional suction
Cell strainer (mesh) Corning, Tewksbury, USA 431750 40 µm Nylon
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 75007213 Megafuge 8R
Cordless pipetting controller Hirschmann, Eberstadt, Germany 9907200 Pipetus
Disposable pipette tips Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel Myco Medical, Cary, USA n.a. Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 41965-062 High glucose
Eppendorf tubes Eppendorf, Hamburg, Germany  depends on volume 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F2442-50ML
Collagenase blend Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5401020001 Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D8537-500ML 500 mL
Senescence detection kit Abcam, Cambridge, UK ab65351
Shaker/ Vortex IKA, Staufen im Breisgau, Germany n.a. MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Falcon 352095 BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany 312 Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic) Aesculap AG, Tuttlingen, Germany NR 82
Surgical scissors  Aesculap AG, Tuttlingen, Germany eq 1060.09
Surgical forceps Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BD577

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 376-379 (2011).
  2. Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14, (8), 484-491 (2017).
  3. Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4, (2), 159-166 (1975).
  4. Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62, (1), 1-12 (1992).
  5. Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516, (1), 71-74 (2002).
  6. Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38, (4), 1063-1074 (2016).
  7. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  8. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  9. Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. 445098 (2018).
  10. Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102, (2), 258-269 (2014).
  11. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16, (9), 582-598 (2016).
  12. Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4, (2), (2016).
  13. Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
  14. Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96, (5), 535-539 (2018).
  15. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40, (8-9), 268-277 (2004).
  16. El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80, (3), 396-406 (2008).
  17. Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51, (3), 311-321 (2012).
  18. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
  19. Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (9), 4219-4223 (1996).
  20. Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 389-399 (2011).
  21. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
  22. Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6, (12), 2853-2868 (2008).
  23. Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21, (12), 1424-1435 (2015).
  24. Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47, (2), 83-88 (2011).
  25. Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185, (2), 519-528 (1989).
Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).More

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter