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Neuroscience

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Published: October 16, 2019 doi: 10.3791/59859
Automatic Translation
1, 2
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

Summary

Bei einigen genmanipulierten Tieren kann die Verwendung eines einzigen Protokolls nicht in zerebellar Purkinje-Zellen ltd induzieren, und es kann eine Diskrepanz zwischen LTD und motorischem Lernen geben. Mehrere Protokolle sind notwendig, um die LTD-Induktion bei genmanipulierten Tieren zu bewerten. Standardprotokolle werden angezeigt.

Abstract

Synaptische Plastizität bietet einen Mechanismus zum Lernen und Gedächtnis. Für das kleinhirnmotorische Lernen gilt die Langzeitdepression (LTD) synaptischer Übertragungen von Parallelfasern (PF) zu Purkinje-Zellen (PC) als Grundlage für motorisches Lernen, und Mängel sowohl des LTD- als auch des motorischen Lernens werden in verschiedenen genmanipulierten Tieren. Gemeinsame motorische Lernsets, wie die Anpassung des optokinetischen Reflexes (OKR), der vestiular-okuläre Reflex (VOR) und der Rotarod-Test wurden zur Beurteilung der motorischen Lernfähigkeit verwendet. Die Ergebnisse der GluA2-carboxy Endstation modifizierten Einschlagsmäuse zeigten jedoch eine normale Anpassung des VOR und des OKR, obwohl PF-LTD fehlte. In diesem Bericht wurde die Induktion von LTD nur mit einer Art Stimulationsprotokoll bei Raumtemperatur versucht. So wurden Bedingungen zur Induzieren von Kleinhirn-LTD in den gleichen Einschlagsmutanten mit verschiedenen Protokollen bei nahezu physiologischer Temperatur untersucht. Schließlich fanden wir Stimulationsprotokolle, mit denen LTD bei diesen genmanipulierten Mäusen induziert werden konnte. In dieser Studie wird eine Reihe von Protokollen zur Bewertung der LTD-Induktion vorgeschlagen, die eine genauere Untersuchung des kausalen Zusammenhangs zwischen LTD und motorischem Lernen ermöglichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass experimentelle Bedingungen bei der Bewertung von LTD bei genmanipulierten Mäusen von entscheidender Bedeutung sind.

Introduction

Die synaptische Organisation der ausgeklügelten neuronalen Netzwerke des Kleinhirnkortex, bestehend aus PCs, molekularen Schicht-Interneuronen (Korb- und Stellatzellen), Golgi-Zellen, PFs aus Granulatzellen, Moosfasern und Kletterfasern (CFs), wurden aufgeklärt in Bezug auf Erregung/Hemmung und Divergenz/Konvergenz, und das gut organisierte Schaltplan diagramm hat vorgeschlagen, dass das Kleinhirn eine "neuronale Maschine"ist 1, obwohl es vorher keine Ahnung über den Zweck dieser "Maschine" gab. Später schlug Marr vor, dass die PFs-Eingabe in PCs ein dreischichtiges assoziatives Lernnetzwerk2bilden sollte. Er schlug auch vor, dass jeder CF eine zerebrale Anweisung für Elementarbewegung2vermittelt. Er ging davon aus, dass die gleichzeitige Aktivierung von PFs und CF die PF-PC-Synapsenaktivität verbessern und eine langfristige Potenzierung (LTP) der PF-PC-Synapse verursachen würde. Andererseits ging Albus davon aus, dass die synchrone Aktivierung von PFs und CF zu LTD an den PF-PC Synapsen3führte. Beide oben genannten Studien interpretieren das Kleinhirn als einzigartiges Speichergerät, dessen Einbindung in das kleinhirnförmige kortikale Netzwerk zur Bildung des Marr-Albus-Modelllernmaschinenmodells führt.

Nach diesen theoretischen Vorhersagen deuten zwei Beweislinien auf das Vorhandensein synaptischer Plastizität im Kleinhirn hin. Die erste Beweislinie wurde von der anatomischen Organisation des Flocculus vorgeschlagen; hier konvergieren MF-Wege vestibulären Organursprungs und CF-Wege retinalen Ursprungs auf den PCs4. Dieses einzigartige Konvergenzmuster legt nahe, dass eine synaptische Plastizität, die im Flocculus auftritt, die bemerkenswerte Anpassungsfähigkeit des vestibulo-okulären Reflexes verursacht. Zweitens stützten die Aufzeichnung der PCs-Antwort im Flocculus und die Läsion des Flocculus auch die obige Hypothese5,6,7. Darüber hinausstützte das PC-Entladungsmuster während der Anpassung der Handbewegung 8 eines Affen die synaptische Plastizitätshypothese, insbesondere Albus' LTD-Hypothese3.

Um die Art der synaptischen Plastizität direkt zu bestimmen, wurde gezeigt, dass die wiederholte Konjunktivstimulation (Cjs) eines Bündels von PFs und des CF, das den PC in vivo spezifisch innerviert, LTD für die Transmissionswirksamkeit der PF-PC-Synapsen9induzierte. 10,11. In den anschließenden In-vitro-Explorationen mit einem Kleinhirnschnitt12 und kultivierten PCs, Konjunktion von kokultivierter Granulatzellstimulation und Olivzellenstimulation13 oder Konjunktion iontophoretisch angewendeter Glutamat- und somatisch Depolarisation14,15 verursacht LTD. Der der LTD-Induktion zugrunde liegende Signaltransduktionsmechanismus wurde ebenfalls intensiv mit In-vitro-Präparaten16,17untersucht.

Anpassungen des VOR und des OKR wurden häufig zur quantitativen Bewertung von Genmanipulationseffekten auf das kleinhirnmotorische Lernen verwendet, da sich der vestibule-zerebellare Kortex als wesentlicher Ursprung beim adaptiven Lernen des VOR18 erwiesen hat. ,19,20 und die OKR19,21 Die Korrelation zwischen Versagen der LTD-Induktion und Beeinträchtigung des verhaltensmotorischen Lernens wurde als Beweis dafür genommen, dass LTD eine wesentliche Rolle bei der Lernmechanismen22. Diese Ansichten werden kollektiv als die LTD-Hypothese des motorischen Lernens oder Marr-Albus-Ito-Hypothese23,24,25,26bezeichnet.

Adaptives Lernen der Augenbewegung wurde mit ähnlichen Protokollen gemessen, während verschiedene experimentelle Bedingungen verwendet wurden, um LTD in der Scheibenvorbereitung27,28,29,30,31 zu induzieren. . Kürzlich berichteten Schonewille et al.26, dass einige genmanipulierte Mäuse normales motorisches Lernen zeigten, aber die Kleinhirnscheiben zeigten keine LTD und kamen so zu dem Schluss, dass LTD für das motorische Lernen nicht wesentlich sei. Die Induktion von LTD wurde jedoch nur mit einer Art von Protokoll bei Raumtemperatur versucht. Daher verwendeten wir verschiedene Arten von LTD-induzierenden Protokollen unter Aufzeichnungsbedingungen bei etwa 30 °C, und wir bestätigten, dass die LTD zuverlässig in den genmanipulierten Mäusen induziert wurde, indem diese Protokolle bei nahe physiologischen Temperaturen32verwendet wurden.

Es bleiben jedoch einige Fragen zu den grundlegenden Eigenschaften der konjunktiven Stimulation. Die erste ist die Beziehung zwischen der Form der komplexen Spitze und der Amplitude von LTD. Zweitens war in Verbindung mit PF-Stimulation und somatischer Depolarisation, ob die Anzahl der eingesetzten Reize notwendig war oder nicht, schwer zu fassen war. In der vorliegenden Studie wurden diese Fragen mit Wildtyp-Mäusen (WT) untersucht.

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Protocol

Alle Versuchsverfahren wurden vom RIKEN-Ausschuss für die Pflege und Verwendung von Tieren in Experimenten genehmigt. Mäuse wurden in der Tieranlage des RIKEN Center for Brain Science unter gut kontrollierter Temperatur (23–25 °C) und Feuchtigkeit (45%–65%) gehalten. Bedingungen. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche WT-Mäuse (C57BL/6, 3–6 Monate) verwendet.

1. Vorbereitung von Lösungen, die in den Experimenten verwendet werden

HINWEIS: Alle Lösungen sollten in metallfreiem Reinstwasser (Widerstand > 18,2 Mio. Euro) und anderen Verunreinigungen (Gesamt-Biokohlenstoff (TOC) < 5,0 ppb) hergestellt werden. Arbeitende künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) zum Schneiden und Aufnehmen werden am Tag des Experiments frisch aus einem 10-fachen (x10) ACSF-Bestand hergestellt. Blasen Sie die Lösungen vor Gebrauch mit 5%CO2/ 95%O2 Gasgemisch. Der pH-Wert von ACSF wird auf 7,4 x 0,1 und die Osmolarität um 315 x 5 mOsm/kg durch Zugabe von Reinstwasser eingestellt.

  1. Bereiten Sie 10x Bestand an ACSF mit 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2PO4und 260 mM NaHCO3vor. Diese Lösung kann bei 4 °C gelagert werden.
  2. Vorbereiten von Arbeits-ACSF mit 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM Mg2SO4, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 und 20 mM Glukose.
    1. Fügen Sie zunächst 1 ml 2 M CaCl2 Lösung gefolgt von 1 ml 1 M Mg2SO4 Lösung in ca. 800 ml Reinstwasser, um Niederschläge zu vermeiden. Dann 100 ml 10x ACSF und Glukose hinzufügen. Schließlich machen Sie ein Gesamtvolumen von 1.000 ml durch Zugabe von Reinstwasser.
  3. Bereiten Sie 3,3% Agar für die Behandlung des Gehirns. 1 g Agar in 30 ml 0,9% NaCl-Lösung auflösen und in einer Mikrowelle bis zum Kochen erhitzen. Rühren, um zu mischen, dann gießen Sie es in eine sterile 4 cm x 10 cm Kunststoff-Box und lassen Sie zu erstarren. Bewahren Sie die Agarplatte(8mm Dicke) im Kühlschrank auf.
  4. Bereiten Sie die interne Lösung vor.
    1. Bereiten Sie die K+-basierte interne Lösung mit 60 mM KCl, 60 mM K-Gluconat, 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP und 30 mM HEPES (pH 7,2) vor.
      HINWEIS: Niedrige Konzentration (0,3 mM) von EGTA, einem langsamen Ca2+-Chelat, wird hinzugefügt, um möglicherweise kontaminierte Ca2+ in reinem Wasser zu chelaten, aber diese niedrige Konzentration von EGTA in der internen Lösung blockiert niemals die Induktion von LTD (Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5) während der Vollzellaufzeichnung. Gemessener osmotischer Druck beträgt 285 mOsm/kg.
    2. Bereiten Sie die Cs+-basierte interne Lösung mit 60 mM CsCl, 46 mM D-Gluconat, 27 mM Tetraethylammoniumchlorid (TEA-Cl), 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP und 30 mM HEPES (pH 7,2, angepasst mit CsOH) vor.
      HINWEIS: Cs+ blockiert spannungsabhängige K-Kanäle und verbessert die Raumklemmbedingungen bei entfernten Dendriten durch Erhöhung der Längenkonstante. Gemessener osmotischer Druck beträgt 285 mOsm/kg.
    3. Bereiten Sie 200 L Aliquots der Lösungen vor und lagern Sie sie bei -30 °C.

2. Gehirnsektion und Trimmen

  1. Kühlen und sauerstoffhaltigen zwei 50 ml Becher von ACSF auf Eis, bis die Temperatur unter 4 °C liegt. Fügen Sie 50 l Tetrodotoxin (TTX, 1 mM) in einen der eiskalten Becher von ACSF ein und reservieren Sie ihn für scheibenschneidende Scheiben. Um Maus-Kleinhirnscheibe zu erhalten, die ltd-induzierende Fähigkeit vorbehält, ist die Zugabe von TTX zum normalen ACSF notwendig.
  2. Kühlen Sie die Metall-Probenschale ab, indem Sie einen Eisbadbereich der Schneidkammer mit Eis füllen.
  3. Gießen Sie 1 ml Isofluran in ein Anästhesisierungsglas(ca.1000 ml) und legen Sie dann eine Maus für 30–45 s hinein. Stellen Sie sicher, dass die Maus tief beästhebt ist, indem Sie ihre Unfähigkeit bestätigen, auf mechanische Stimulation zu reagieren.
  4. Enthaupten Sie die Maus mit einer chirurgischen Schere. Halten Sie den Kopf und schneiden Sie die oberflächliche Haut entlang der Mittellinie mit einer ophthalmologischen Schere. Ziehen Sie die Haut, indem Sie mit den Fingern halten, um die Schädeloberfläche weit zu belichten.
  5. Schneiden Sie den Schädel horizontal entlang einer Linie aus dem großen spinokerebellären Loch direkt über Ohr und Auge mit einer ophthalmologischen Schere. Schneiden Sie den Schädel entlang einer Linie über beiden Augen und entfernen Sie, um den Schädel zu isolieren.
  6. Schneiden Sie das Gehirn in der Mitte des Großhirns mit einem Skalpell, dann isolieren Sie den kaudalen Teil des Gehirns einschließlich des Kleinhirns vom Schädel. Tauchen Sie es in einen eiskalten Becher von ACSF ein. Normalerweise sollte die Gesamtzeit von der Enthauptung bis zum Eintauchen des Hirnblocks in das vorgekühlte Becherglas von ACSF weniger als 60 s betragen.
  7. Die Position der sprudelnden Schläuche sollte so eingestellt werden, dass der Hirnblock im Becher nicht umgerührt wird. Mechanische Schäden können während der Aufnahme zu Schwellungen der Scheibe führen. Lassen Sie es für mindestens 7 min und lassen Sie das Gehirn abkühlen.
  8. Um den Hirnblock zu schneiden, schneiden Sie ein rechteckiges Agarstück (2 cm x 2 cm) von einer großen Agarplatte (4 cm x 10 cm, bei 4 °C gelagert) und legen Sie es auf ein Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren.
  9. Drehen Sie das Agarstück auf dem Filterpapier auf den Kopf, und legen Sie das Agarstück dann auf ein Filterpapier auf ein vorgekühltes Metallprobenfach (16 cm x 20 cm). Nehmen Sie den Gehirnblock mit einem Spachtel und absorbieren übermäßige Flüssigkeit um sie herum mit einem Stück Filterpapier.
  10. Montieren Sie den Hirnblock mit Kleber (medizinischer Cyanoacrylat-Sofortkleber) auf den Agarblock. Achten Sie darauf, den Boden (ventrale Seite) des Hirnblocks an den Agar zu befestigen.
  11. Schneiden Sie die rechte Hemisphäre mit einer Klinge aus. Stellen Sie sicher, dass die Seite der Schnittebene so parallel wie möglich zur dendritischen Ebene des PCs verläuft, da diese Seite an der Oberfläche der Probenschale befestigt ist. Schneiden und entfernen Sie die andere Seite der Hemisphäre. Dann schneiden Sie das Gehirn zwischen dem überlegenen und dem minderwertigen Colliculi und schneiden Sie das Rückenmark ab.
  12. Kleben Sie die rechte Seite des getrimmten Kleinhirns mit dem Agarblock auf das vorgekühlte Probentablett. Überschüssigen Kleber mit dem flachen Teil eines Spachtels um das Kleinhirn verteilen, um zu verhindern, dass überschüssiger Kleber an der Kleinhirnoberfläche befestigt wird. Neigen Sie das Metalltablett und gießen Sie ACSF, um den Kleber zu fixieren und den überschüssigen Kleber wegzuwaschen.

3. Gehirn-Slicing

  1. Richten Sie die Probe so aus, dass sich die Dorsalseite des Kleinhirns auf der Vorderseite befindet. Gießen Sie eiskaltes Schneiden ACSF, mit 1 M TTX, ausreichend, um das Kleinhirn vollständig einzutauchen. Legen Sie eine Gasröhre in den ACSF und beginnen Sie mit dem Gasgemisch O2/CO2 zu sprudeln.
  2. Entfernen Sie die Arachnoide Mater mit einer feinen Pinzette unter dem Fernglas. Schneiden Sie den Kleinhirn-Pedunkel mit einer Klinge, und entfernen Sie das Hirnstamm und Agar-Block. Drehen Sie das Tablett um 180°, so dass die dorsale Oberfläche des Kleinhirns einer Rasierklinge gegenübersteht.
  3. Stellen Sie die Klinge ein, und passen Sie die erste Schnittposition an. Stellen Sie die Vibratome-Slicing-Parameter auf Folgendes ein: Amplitude auf 5,5, Frequenz auf 85 Hz, Geschwindigkeit auf 3–4 und Scheibendicke auf 300 m.
  4. Die Kleinhirnscheibe auf einem Nylonnetz in einen Acryl-Inkubator übertragen und vollständig in den sauerstoffreichen ACSF eintauchen. Der Inkubator sollte in ein Wasserbad gelegt werden, das eine Temperatur bei 26 °C hält.
  5. Bewahren Sie die Scheiben mindestens 1 h auf, um die Wiederherstellung des Schadens während des Schneidens zu ermöglichen.

4. Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahme

HINWEIS: Eine Patch-Clamp-Aufzeichnung erfordert folgendes Gerät: ein aufrechtes Mikroskop mit Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (IR-DIC)-Optik, ein Patch-Clamp-Verstärker, Datendigitalisierer, Digitalstimulator, Isolator, Computer, Software zur Datenerfassung und Analyse, motorisierter Manipulator, Mikroskopplattform, Vibrationsisolationstisch, Faraday-Käfig, Lösungsheizung, Peristaltikpumpen und Elektrodenzieher.

  1. Fügen Sie Picrotoxin (0,1 mM) zu ACSF hinzu und lösen Sie es mit Ultraschall für 3 min.
  2. Durchdringen Sie eine Aufnahmekammer mit Picrotoxin-haltigen,O2-CO2-gesättigten ACSF mit einer Rate von 2 ml/min. Halten Sie die Temperatur der Aufnahmekammer bei ca. 30 °C.
  3. Machen Sie eine Aufnahmeelektrode, indem Sie eine Borosilikatglaskapillare mit Filament (Außendurchmesser = 1,5 mm) mit einem Abzieher mit 4 Schritten ziehen. Der Spitzendurchmesser sollte etwa 1 m betragen.
  4. Machen Sie eine stimulierende Elektrode, indem Sie die gleiche Kapillare mit dem Puller mit 2 Schritten ziehen, dann brechen, um eine feine Spitze zu produzieren, indem Sie die Spitze gegen einen Eisenblock unter einem Binokularmikroskop schlagen. Der endgültige Durchmesser sollte 3–5 m betragen.
  5. Übertragen Sie die Kleinhirnscheibe in die Aufnahmekammer und fixieren Sie sie mit einem Pt-Gewicht mit Nylonfäden. Füllen Sie eine stimulierende Elektrode mit ACSF.
  6. Zur Stimulation der PFs legen Sie die stimulierende Elektrode auf die Oberfläche der Molekülschicht, etwa 50 m von der Purkinje-Zellschicht entfernt.
  7. Zur Stimulation des CF die stimulierende Elektrode an der Unterseite der Purkinje-Zellschicht (Schritte 5.3, 5.4) platzieren.
  8. Filter K+-basiert oder Cs+-basierte interne Lösung mit einem 0,45-m-Filter. Verwenden Sie einen Mikrolader, um eine Aufnahmeelektrode mit 8 L interner Lösung zu füllen.
  9. Wenden Sie einen schwachen positiven Druck auf die Aufnahmeelektrode an, bevor Sie sie in den ACSF eintauchen. Sein Widerstand sollte 2–4 Mio. betragen und das flüssige Anschlusspotential korrigiert werden.
  10. Nähern Sie sich dem gesunden, hellen Zellkörper des PCs mit der Aufnahmeelektrode. Drücken Sie die Oberfläche der Purkinje-Zelle leicht, stoppen Sie die Anwendung von positivem Druck, als nächstes unterdruck, bis eine Giga-Ohm-Dichtung bilden. Richten Sie dann die Ganzzellenkonfiguration unter Negativem Druck ein.
  11. Halten Sie das Membranpotential bei -70 mV und wenden Sie -2 mV Puls (Dauer, 100 ms) bei 0,1 Hz an, um Eingangswiderstand, Reihenwiderstand und Eingangskapazität kontinuierlich zu überwachen. Verwenden Sie nicht die Widerstandskompensation der Serie. Verwerfen Sie Daten, wenn der Serienwiderstand um mehr als 15 % variiert.

5. Induktion von LTD

  1. Stimulieren Sie die molekulare Schicht mit einem Puls (Dauer, 0,1 ms). Identifizieren Sie die PF-exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSC) durch Anwendung eines Doppelpulsreizes (Interspike-Intervall (ISI) von 50 ms). Das PF-EPSC sollte gepaarte Pulserleichterungen und eine allmähliche Erhöhung der Amplitude im Verhältnis zur Erhöhung der Stimulationsintensität aufweisen.
  2. Zeichnen Sie das Testverhalten des PF-EPSC auf, indem Sie einen einzigen Impuls bei 0,1 Hz anwenden. Passen Sie die Intensität des Stimulus so an, dass die evozierte EPSC-Amplitude etwa 200 pA beträgt. Vermeiden Sie eine Verunreinigung des Stroms durch den spannungsabhängigen Ionenkanal.
  3. Stimulieren Sie das CF am unteren Rand der Purkinje-Zellschicht, und identifizieren Sie das EPSC, das durch die CF-Aktivierung ausgelöst wird (durch Anwendung eines Doppelpulsreizs). Der CF-EPSC sollte eine gepaarte Pulsdepression und eine Alles-oder-Nichts-Manier entsprechend der Erhöhung der Stimulationsintensität aufweisen. Für die LTD-Induktion sollte ein einziger Stimulus verwendet werden.
  4. LTD-induzierendes Protokoll 1
    1. Mit einer Elektrode, die K+-basierte interne Lösung unter Stromklemmenbedingungen enthält, wenden Sie einen einzelnen PF-Stimulus und einen einzelnen CF-Stimulus gleichzeitig bei 1 Hz für 5 min (300 Impulse) an (Abbildung 1A).
  5. LTD-induzierendes Protokoll 2
    1. Mit einer elektrodenhaltigen K+-basierten internen Lösung unter Stromklemmenbedingungen doppelPF-Stimuli (ISI von 50 ms) und einzelnen CF-Stimulus anwenden, da der zweite PF-Stimulus mit CF-Stimuli bei 1 Hz für 5 min zusammenfällt(Abbildung 1B).
  6. LTD-induzierendes Protokoll 3
    1. Mit einer Elektroden, die Cs+-basierte interne Lösung unter Spannungsklemmenbedingungen enthält, einen doppelten PF-Stimulus (ISI von 50 ms) und einen einzelnen depolarisierenden Spannungsschritt (-70 bis 0 mV, 50 ms) auf das Soma bei 1 Hz für 3 min auftragen, so dass der zweite PF-Stimulus entspricht dem Beginn des depolarisierenden Spannungsschritts (Abbildung 1C).
  7. LTD-induzierendes Protokoll-4
    1. Mit einer Elektrode, die Cs+-basierte interne Lösung unter Spannungsklemmenbedingungen enthält, die PF-Stimuli (5x bei 100 Hz) und einen einzelnen depolarisierenden Spannungsschritt (-70 bis 0 mV, 50 ms) gleichzeitig auf das Soma bei 0,5 Hz auftragen (Abbildung 1D ).

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Representative Results

Vier Protokolle wurden in dieser Studie verwendet, um Kleinhirn-LTD zu induzieren. In den ersten beiden Protokollen (Protokoll 1 und 2) wurde die Konjunktion der PF-Stimulation und der CF-Stimulation unter stromlastigen Bedingungen angewendet. In den beiden anderen Protokollen (Protokoll 3 und 4) wurde die somatische Depolarisation durch die CF-Stimulation unter Spannungsklemme ersetzt. Spannungsspuren oder Stromspuren bei der Konjunktivstimulation wurden verglichen (Abbildung 2).

Konjunktion von 1 PF-Stimulation und 1 CF-Stimulation unter Stromklemmbedingungen (Protokoll-1) wurden konventionell für die Scheibenvorbereitung26,27verwendet. Die Form der komplexen Spitze, die vom Cj ausgelöst wurde, ähnelte der, die allein durch die CF-Stimulation ausgelöst wurde, mit dem ersten steilen Spikelet gefolgt von 2 bis 3 Spikelets(Abbildung 2A). Eine ähnlich geformte komplexe Spitze wurde während der Stimulation mit Protokoll 2 beobachtet, nämlich 1 PF-Stimulation wurde 50 ms später durch eine konjunktive zweite PF- und CF-Stimulation gefolgt (Abbildung 2B). Unter Spannungsklemmenbedingungen mit einer Cs+-basierten internen Lösung wurden konjunktion einer 2 PF Stimulation und somatische Depolarisation angewendet (Protokoll 3) (Abbildung 2C). Der ersten PF-Stimulation folgte 50 ms später eine gleichzeitige Anwendung einer zweiten PF-Stimulation und somatische Depolarisation. Bei der somatischen Depolarisation von -70 bis 0 mV wurde ein Innenstrom ausgelöst. Auch ein Schwanzstrom wurde nach der Repolarisation evoziert. Manchmal wurde eine sich wiederholende Erzeugung eines inneren Stroms beobachtet, die die Ca-Spike-Aktivität in der abgelegenen dendritischen Region widerspiegeln würde, in der das Membranpotential trotz der Verwendung einer Cs+-basierteninternen Lösung nicht ausreichend geklemmt war ( Abbildung 2C). Schließlich wurden 5 PF-Stimuli bei 100 Hz gleichzeitig mit der somatischen Depolarisation unter Spannungsklemmenbedingungen gegeben (Protokoll 4). Auch hier wurde während der Depolarisation eine sich wiederholende Erzeugung von Innerenströmen ausgelöst und nach der Repolarisation ein Schwanzstrom ausgelöst. Das Timing der sich wiederholenden Erzeugung des Innenstroms wurde nicht mit den PF-Stimuli synchronisiert (Abbildung 2D). Manchmal setzte sich die sich wiederholende Erzeugung des inneren Stroms nach der Repolarisation fort.

Wie für die LTD induziert durch Protokolle-1 und -2, Reduktion der EPSC-Amplitude während der 25-min nach dem Beginn von Cj gemessen wurde über einen relativ weiten Bereichverstreut 32. Im Vergleich zur stabilen Form des PF-EPSP war die Form der komplexen Spitze von Zelle zu Zelle recht variabel. Da Spikelets in einer komplexen Spitze die Ca2+-Kanalaktivierung33reflektierten, wurde die Form einer komplexen Spitze, wie Amplitude oder Steilheit von Spikelets, die die AMPlitude von LTD beeinflusste, mit der komplexen Spitze untersucht, die durch Protokoll 1 ausgelöst wurde. Da die Form der komplexen Spitzen, die durch Protokoll 2 ausgelöst wurden, mit dem PF-EPSP kontaminiert waren, haben wir diese Daten nicht analysiert. Erstens wurde die Summe aller Spikelets (1–4)-Amplitude mit der Amplitude der LTD korreliert (--EPSC %) (Abbildung 3A,B). Der Korrelationskoeffizient (r) betrug 0,28, war aber statistisch nicht signifikant (p > 0,5). Da spikelets 2–4 mehr von der Ca2+-Komponente34enthielten, wurde die Summe der Spikelet (2–4)-Amplitude mit der LTD-Amplitude korreliert. Die Korrelation schien stärker zu sein (r = 0,67), aber immer noch nicht statistisch signifikant (p > 0,1) (Abbildung 3C). Als nächstes wurde der Maximalwert von dVm/dt (maximale Steigerungsrate [MRR]) jedes Spikelets berechnet (Abbildung 3D), da das Produkt der Membrankapazität (Cm) und dVm/dt grob die Membranströme35widerspiegelt. Die Korrelation zwischen dem Produkt des Cm und der Summe der MRRs von Spikelets (1–4) und der LTD-Amplitude wurde untersucht (Abbildung 3E), und r betrug 0,18 (p > 0,9). Die Korrelation zwischen dem Produkt des Cm und der Summe der MRR von Spikelets (2–4) zeigte eine etwas stärkere r (0,36), war aber nicht signifikant (p > 0 .6) (Abbildung 3F).

Unter Spannungsklemmenbedingungen, Protokoll 3 mit 180 Cjs effizient induziert LTD (Abbildung 4B)32. Ob jedoch eine geringere Anzahl von Reizen TATSÄCHLICH LTD induzieren kann, bleibt unbekannt. So wurden 60 Cjs bei 1 Hz für 1 min angewendet. Etwa 10 min nach Cj wurde die EPSC-Amplitude unterdrückt, jedoch erholte sie sich nach 15 min nach Cj-Beginn. Dies deutet darauf hin, dass 60 Mal Cjs bei 1 Hz nicht ausreichten, um LTD zu induzieren (Abbildung 4A). Darüber hinaus hat die Wiederholung der somatischen Depolarisation allein (180-mal) nicht zu LTD (Abbildung 4B)32induziert.

Das Protokoll 4 wurde ursprünglich von Steinberg et al.30 für junge Mäuse verwendet (P14–21). LTD wurde Berichten zufolge von 30 Cjs bei 0,5 Hz bei RT im wilden Typ Kleinhirn induziert. Wenn jedoch 30 Cjs auf die erwachsene Mäuse Kleinhirnscheibe (3-6 Monate) bei etwa 30 °C angewendet wurden, wurde keine LTD induziert (Abbildung 5A). Im Gegensatz dazu wurde bei Anwendung von 90 Cjs die übliche Amplitude von LTD beobachtet (Abbildung 5B)32. Auch hier hat die somatische Depolarisation allein (90 Mal bei 0,5 Hz) nicht zu LTD induzieren (Abbildung 5B).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung von Protokollen, die LTD in PF-PC-Synapse induzieren. (A) Protokoll 1 Cj. 1 PF und 1 CF-Stimuli werden unter Stromklemmenbedingungen gleichzeitig 300 Mal bei 1 Hz (5 min) angewendet. Elektrode für die Ganzzellaufnahme enthält K+-basierteinterne Lösung. (B) Protokoll 2 Cj. 2 PF und 1 CF Reize werden gleichzeitig 300 mal bei 1 Hz (5 min) unter Stromklemmen aufgebracht. Elektrode enthält K+-basierte interne Lösung. (C) Protokoll 3 Cj. 2 PF und somatische Depolarisation (-70 bis 0 mV, 50 ms) werden 180 Mal bei 1 Hz (3 min) unter Spannungsklemme angewendet, so dass der zweite PF-Stimulus gleichzeitig mit dem Beginn der somatischen Depolarisation angewendet wird. Elektrode enthält Cs+-basierte interne Lösung. (D). Protokoll 4 Cj. 5 PF bei 100 Hz und somatische Depolarisation werden 90 Mal bei 0,5 Hz (3 min) unter Spannungsklemme gleichzeitig angewendet. Elektrode enthält Cs+-basierte interne Lösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Spannungs- oder Stromspuren des PCs während der Konjunktionsstimulation. (A) Membranpotentialspur, die durch Protokoll 1 Cj. (B) Membranpotentialspur hervorgerufen wird, die durch Protokoll 2 Cj. (C) Membranstromspur entlockt wird, die durch Protokoll 3 Cj. (D) Membranstromspur entsteht, die durch Protokoll 4 Cj entsteht. Vertikale Balken = 10 mV (A und B), 1 nA (C und D). Horizontale Leiste = 20 ms. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Beziehung zwischen Spikelet einer komplexen Spitze und LTD-Amplitude. (A) Repräsentative Spur einer komplexen Spitze, die durch Protokoll 1 ausgelöst wurde. Pfeile zeigen Spitzen von Spikelets (1-4) an. Skalenbalken = 20 mV. (B) Verhältnis zwischen der Summe der Amplitude von Spikelets (1–4) und der LTD-Amplitude (-EPSC %) (r = 0,28, p > 0,5). (C) Verhältnis zwischen der Summe der Amplitude von Spikelets (2–4) und der LTD-Amplitude (r = 0,67, p > 0,1). (D) Repräsentative Spur differenzierter komplexer Spitzen, die in A. Pfeile dargestellt sind, zeigen Spitzen von dVm/dt von Spikelets an. Skalenstäbe = 5 ms, 50 V/s. (E) Verhältnis zwischen Produkten des Cm und der Summe der MRR von Spikelets (1–4) und Amplitude von LTD (--EPSC %) (r = 0,18, p > 0,7). (F) Verhältnis zwischen dem Produkt des Cm und der Summe der MRR von Spikelets (2–4) und Amplitude von LTD (r = 0,36, p > 0,4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Auswirkungen der Anzahl der Wiederholungen auf die LTD-Induktion mit Protokoll-3 Cj. (A) Ausfall der LTD-Induktion durch Protokoll-3 Cj, Wiederholung war 60 bei 1 Hz. Mittlere PF-EPSC-Amplitude aufgezeichnet vor und nach Protokoll-3 Cj (schwarze Spalte am unteren Rand). Die AMPlitude PF-EPSC wurde durch die vor Cj aufgezeichneten normalisiert. Gefülltes Symbol zeigt die mittlere EPSC-Amplitude an. Fehlerbalken bezeichnen SEM. Einschub: überlagerte PF-EPSC-Spuren (oben) wurden aufgezeichnet, bevor (markiert 1) und 25–29 min nach Cj-Stim-Beginn (markiert 2). Jede Ablaufverfolgung stellt den Durchschnitt von 6 Datensätzen dar. Skalenbalken = 100 pA, 10 ms . (B) Rotes Symbol: LTD induziert durch Protokoll 3 Cj, Wiederholung war 180 mal bei 1 Hz. Blaues Symbol: keine Konjunktionstimulation, aber somatische Depolarisation wurde 180 Mal bei 1 Hz angewendet. LTD wurde nicht induziert. Einset: Überlagerte PF-EPSC-Spuren (oben) wurden vor (markiert 3) und 25–29 min nach Cj-Stim-Beginn (markiert 4) aufgezeichnet. Jede Ablaufverfolgung stellt den Durchschnitt von 6 Datensätzen dar. Skalenbalken = 100 pA, 10 ms. Die in B dargestellten Daten sind die gleichen, die in Abbildung 3B von Yamaguchi et al.32verwendet werden. (C). Zusammenfassung der mittleren PF-EPSC-Amplitude, die in 25–29 min nach Beginn von Cj. Depol aufgezeichnet wurde: Depolarisation. Numerisches Zeichen in Klammern stellt die Anzahl der Zellen dar. x60 = 60-mal, x180 = 180-mal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Auswirkungen der Anzahl der Wiederholungen auf die LTD-Induktion mit Protokoll 4 Cj. (A) Ausfall der LTD-Induktion durch Protokoll 4 Cj, Wiederholung war 30 mal bei 0,5 Hz. Mittlere PF-EPSC Amplitude aufgezeichnet vor und nach Protokoll-4 Cj (schwarze Spalte am unteren R. Gefülltes Symbol gibt die mittlere EPSC-Amplitude an. Fehlerbalken bezeichnen SEM. Einschub: überlagerte PF-EPSC-Spuren (oben) wurden aufgezeichnet, bevor (markiert 1) und 25–29 min nach Cj-Stim-Beginn (markiert 2). Jede Ablaufverfolgung stellt den Durchschnitt von 6 Datensätzen dar. Skalenbalken = 100 pA, 10 ms. (B) Rotes Symbol: LTD induziert durch Protokoll 4 Cj., blaues Symbol: keine Konjunktionsstimulation, sondern somatische Depolarisation wurde 180 Mal bei 0,5 Hz angewendet. LTD wurde nicht induziert. Einset: Überlagerte PF-EPSC-Spuren (oben) wurden vor (markiert 3) und 25–29 min nach Cj-Stim-Beginn (markiert 4) aufgezeichnet. Skalenbalken = 100 pA, 10 ms. Die in B dargestellten Daten sind die gleichen, die in Abbildung 4B von Yamaguchi et al. verwendetwerden. 32. (C). Zusammenfassung der mittleren PF-EPSC-Amplitude, die in 25-29 min nach Beginn von Cj. Depol aufgezeichnet wurde: Depolarisation. Numerisches Zeichen in Klammern stellt die Anzahl der Zellen dar. x30 = 30-mal, x90 = 90-mal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Unterschiede zwischen den vier Protokollen

In den LTD-induzierenden Protokollen 1 und 2 reicht Cjs 300 mal bei 1 Hz aus, um Kleinhirn-LTD zu induzieren. Die Stimulationshäufigkeit des CF schien sich in einem physiologischen Bereich zu befinden, da die komplexe Spike-Feuerrate bei alarmierten erwachsenen Mäusen (P60) 1,25 Hz36betrug. Die CF-Stimulation allein verursachte jedoch keine langfristige Plastizität in der PF-CF-Synapse, wie sie in den Protokollen 1 und 2 (Abbildung 4, Abbildung 5) verwendet wird, obwohl CF-Stimulation allein bei höherfrequentinduzierter LTD24. Die Form der komplexen Spitze, die in Protokoll 1 hervorgerufen wurde, hatte auch keine signifikante Beziehung zur LTD-Amplitude (Abbildung 3). Vielleicht spiegelt die Form der komplexen Spitze die gemittelte Ca2+-Konzentration wider, stellte aber nicht die lokale Ca2+-Konzentrationin einer Verzweigung dar, in der LTD induziert wurde.

In Bezug auf die PF-Stimulation, obwohl 1 PF-Stimulation wurde konventionell verwendet, um Kleinhirn-LTD26,27zu induzieren, neigte die Granulatzelle dazu, im Burst-Modus in vivo37zu feuern. Daher wären mehrfache Aktivierungen des PF besser als eine einzelne PF-Stimulation, um das physiologische Brennmuster nachzuahmen, und die mGluR1-Aktivierung hing von der Anzahl und Häufigkeit des PF-Feuers38ab. Daher würde Protokoll-2 PKC intensiver aktivieren als Protokoll-1. Bei einigen mutierten GluA2-Knock-in-Mäusen (K882A) reichte nur Protokoll-2 aus, um LTD im Vergleich zu Protokoll 132zu induzieren, was darauf hindeutet, dass eine höhere Konzentration von aktiviertem PKC erforderlich war, um LTD für diese spezielle GluA2-Mutation zu induzieren.

Mehrere Stimulationen des PF würden die Inzidenz der LTD-Induktion erhöhen, aber die Aktivierung eines spannungsabhängigen Ca2+-Kanals über CF-Stimulation oder somatische Depolarisation war weiterhin erforderlich. Um die Aktivierung eines spannungsabhängigen Ca2+-Kanals am PC-Dendritzurzu zu erhöhen, wo der PF stimuliert wurde, wurde der Zellkörper des PCs unter spannungsklemmenbedingungen30depolarisiert. Bei Verwendung einer Cs+-basierten internen Lösung erhöhte sich der Eingangswiderstand deutlichum 32, was auf eine Erhöhung der Kabelkonstante hindeutet. Dadurch würde die Anzahl der aktivierten Ca2+-Kanäle im distalen Bereich des PC-Dendriten erhöht. Bei einigen GluA2-Mutantenmäusen (7), 2PF-Stimulation + somatische Depolarisation (Protokoll 3) oder 5 PF-Stimulation + somatische Depolarisation (Protokoll 4) konnte LTD induzieren. Umgekehrt wurde kein LTD-Phänomen durch Protokoll 1 oder 2 Stimulation beobachtet. Es kann sein, dass die somatische Depolarisation unter Spannungsklemmenbedingungen mit Cs+-interne Lösung aktivierte spannungsabhängige Ca2+-Kanäle effektiver abläuft als die Aktivierung durch die CF-Stimulation unter Strom-Klemmen-Bedingungen mit Der k+-basierten internen Lösung, und dies kann zu einer nicht additiven Erhöhung von [Ca2+]in39 führen und eine anschließende robuste PKC-Aktivierung, die für LTD erforderlich ist.

Möglicher Kompensationsmechanismus für LTD bei genmanipulierten Tieren

Theoretische Studie geht von einer All-or-none-Typaktivierung von PKC nach LTD-Induktion40aus, aber in experimentellen Ergebnissen mit einigen genmanipulierten Tieren wie GluA2-Knock-in-Mäusen wurde gezeigt, dass die Aktivierung von PKC je nach LTD-Induktion variierte. Protokolle32. Unter 4 verschiedenen Protokollen waren die Protokolle 3 und 4 das effektivste Induktionsprotokoll zur Aktivierung von PKC, gefolgt von Protokoll 2 und das schwächste Protokoll 1. Bei genmanipulierten Tieren könnten Ausgleichsmechanismen LTD32verursachen. Solche Kompensationsmechanismen können eine geringere Empfindlichkeit gegenüber aktiviertem PKC haben. Wenn dies der Fall ist, sind mehrere Sätze von LTD-induzierenden Protokollen erforderlich, darunter eines, das PKC stärker als herkömmliche Protokolle aktivieren kann, um die LTD-Induktionsfähigkeit bei genmanipulierten Tieren zu bewerten. Obwohl die normale Induktion von LTD mit Cs+-basierter interner Lösung in kultivierten PCs15 oder PCs in Slices30gemeldet wird, ist eine Cs+-basierte interne Lösung nicht physiologisch. Die Aktivierung eines spannungsabhängigen Ca2+-Kanals an einem entfernten Dendrit ist jedoch aufgrund der möglichen mechanischen Beschädigungen während der Vorbereitung und Aufzeichnung, die zu einer Abnahme der längenkonstant. Um die Aktivierung von Ca2+-Kanälenim PF-stimulierenden dendritischen Bereich zu gewährleisten, ist es daher notwendig, ein Protokoll zu verwenden, das die Längenkonstante mit einer Cs+-internen Lösung erhöht.

Andere Versuchsbedingungen

Andere Faktoren sollten auch berücksichtigt werden, wenn synaptische Plastizität und tierisches Verhalten parallel untersucht werden, wie z. B. Die Übereinstimmung des Tieralters und die Aufzeichnung der Temperatur in vitro, da Signaltransduktionsratenkonstanten und Rezeptorenhandel hochtemperaturempfindlich sind. Tatsächlich reduzierte das motorische Lernen in vivo die Anzahl der oberflächenausgedrückten AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren41 und die Größe des asynchronen Mini-EPSC an der PF-PC-Synapse42. Idealerweise sollte die Ganzzell-Patchklemmenaufzeichnung bei 37 °C erfolgen, eine stabile Langzeitaufzeichnung ist jedoch bei 37 °C schwierig. Daher wurden alle elektrophysiologischen Aufnahmen in dieser Studie bei etwa 30 °C durchgeführt. Obwohl diese Temperatur niedriger als die physiologische Temperatur ist, würde sie immer noch günstigere Bedingungen bieten, um synaptische Eigenschaften, die in vitro analysiert wurden, mit der Fähigkeit des Verhaltens zu vergleichen. Dieser Unterschied bei den Aufzeichnungstemperaturen könnte ein weiterer Faktor sein, der dazu führt, dass diese Ergebnisse vom vorherigen Bericht26abweichen. Darüber hinaus ist die Beurteilung der Konstanz der passiven Membraneigenschaften32 und der intrinsischen Erregbarkeit43,44 auch bei der Untersuchung der synaptischen Plastizität wichtig.

Um den kausalen Zusammenhang zwischen synaptischer Plastizität und tierischem Verhalten bei genmanipulierten Tieren zu untersuchen, würde die Bewertung der synaptischen Plastizität in vitro eine sorgfältige Kontrolle der Versuchsbedingungen wie der Verwendung von Temperatur Regulierung und verschiedene Arten von Protokollen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken A. Oba für ihre technische Hilfe. Diese Forschung wurde teilweise durch Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 an K.Y. unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 152 Synaptische Plastizität LTD Gehirnscheibe Ganzzellaufnahme Maus Purkinje-Zelle Kleinhirn Parallelfaser Kletterfaser
Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben
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Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).

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